PL202575B1 - Sposób wytwarzania kwasu L-2-amino-4-(hydroksymetylofosfinylo)masłowego oraz drobnoustroje - Google Patents
Sposób wytwarzania kwasu L-2-amino-4-(hydroksymetylofosfinylo)masłowego oraz drobnoustrojeInfo
- Publication number
- PL202575B1 PL202575B1 PL353460A PL35346000A PL202575B1 PL 202575 B1 PL202575 B1 PL 202575B1 PL 353460 A PL353460 A PL 353460A PL 35346000 A PL35346000 A PL 35346000A PL 202575 B1 PL202575 B1 PL 202575B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- aspartate
- reaction
- pyruvate
- acid
- esters
- Prior art date
Links
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 title claims abstract description 26
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 title claims abstract description 25
- 238000005891 transamination reaction Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 49
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 15
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 39
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 19
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 15
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 claims description 13
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 12
- 108030002081 Aspartate transaminases Proteins 0.000 claims description 11
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 10
- ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-N phosphinic acid Chemical class O[PH2]=O ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 6
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 6
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 6
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 claims description 5
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-L oxaloacetate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CC(=O)C([O-])=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 4
- YJTNHDYMQPHXFO-UHFFFAOYSA-N 4-(hydroxymethylphosphinyl)-2-oxobutyric acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(=O)C(O)=O YJTNHDYMQPHXFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FNJQGUKETYGBGL-BYPYZUCNSA-N OC(=O)[C@@H](N)CCP(=O)CO Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCP(=O)CO FNJQGUKETYGBGL-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 claims description 3
- WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxypropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC(C)=O WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HXOYWJCDYVODON-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(hydroxymethyl)-3-methoxyphenoxy]butanoic acid Chemical compound COC1=CC(OCCCC(O)=O)=CC=C1CO HXOYWJCDYVODON-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N acetyl dihydrogen phosphate Chemical compound CC(=O)OP(O)(O)=O LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001733 carboxylic acid esters Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 claims description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 150000004715 keto acids Chemical class 0.000 abstract description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 34
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 17
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 8
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 8
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- -1 L-PPT compound Chemical class 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 4
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 102100035923 4-aminobutyrate aminotransferase, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 3
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 108010060511 4-Aminobutyrate Transaminase Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 2
- BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N butan-2-ol Chemical compound CCC(C)O BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004296 chiral HPLC Methods 0.000 description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003864 humus Substances 0.000 description 2
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2r,3s,4r,5s)-5-[(1r,2r,3s,5r,6s)-3,5-diamino-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol;sulfuric ac Chemical compound OS(O)(=O)=O.N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 2-oxoglutarate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC(=O)C([O-])=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108030000921 4-aminobutyrate-2-oxoglutarate transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102100036608 Aspartate aminotransferase, cytoplasmic Human genes 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical class OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910014033 C-OH Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910014570 C—OH Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000008557 D-aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910004619 Na2MoO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000003857 carboxamides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N cyclohexanol Chemical compound OC1CCCCC1 HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000004675 formic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hcl hcl Chemical compound Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930182852 proteinogenic amino acid Natural products 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 1
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 150000003899 tartaric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania kwasu L-2-amino-4-(hydroksymetylofosfinylo)masłowego L-fosfinotrycyny, L-PPT) oraz drobnoustrojów. Związek L-PPT, jego sole i niektóre ich pochodne są chwastobójczo skutecznymi nieproteinogennymi aminokwasami, ich solami lub ich pochodnymi (DE-A-2717440). Postać L jest biologicznie czynna, podczas gdy postać D praktycznie nie wykazuje czynności (DE-A-2856260).
Wiadomo, że transaminazy dzięki swej dużej stereoselektywności i stosunkowo szerokiej specyficzności substratowej są szczególnie odpowiednie do użycia w chiralnej, enzymatycznej syntezie aminokwasów z ich odpowiednich prekursorów, ketokwasów. Wadą stosowania transaminaz w technice jest jednak to, że ich stała równowagi wynosi około 1, toteż żądany produkt może powstawać z wydajnoś cią tylko 50% (US-A-4 826 766). W EP-A-0 344 683 i w US-A-5 221 737 opisano wytwarzanie chwastobójczo czynnej substancji o nazwie L-fosfinotrycyna [kwas L-homoalanin-4-ylo(metylo)fosfinowy, kwas L-2-amino-4-(hydroksymetylofosfinylo)masłowy, L-PPT)], nieproteinogennego aminokwasu, przez transaminowanie odpowiedniego ketokwasu [kwasu (2-okso-4-((hydroksy)(metylo)fosfinoilo)masłowego, PPO)] z użyciem transaminazy 4-aminomaślan : 2-ketoglutaran (transaminaza GABA, EC 2.6.1.19) z Escherichia coli. Dla ilościowej przemiany potrzebny był wysoki molowy nadmiar donora grupy aminowej, glutaminianu, co utrudniało oczyszczanie produktu reakcji.
Możliwym rozwiązaniem tego problemu jest zastosowanie asparaginianu jako donora grupy aminowej, ponieważ odpowiedni szczawianooctan ketokwasu jest w środowisku wodnym nietrwały i samorzutnie ulega dekarboksylacji do pirogronianu. Przez usuwanie produktu reakcji ze ś rodowiska reakcji przesuwa się jej równowagę tak, że nie może zajść żadna reakcja odwrotna i można uzyskać przemianę ilościową także przy równomolowych ilościach ketokwasu i donorowego aminokwasu. Taki sposób opisano np. w EP-A-0 135 846.
Wykorzystanie tej zasady w enzymatycznej syntezie L-fosfinotrycyny było jednak do tej pory niemożliwe, ponieważ asparaginian nie akceptuje transaminazy GABA jako donora grupy aminowej, a nie był a znana ż adna inna transaminaza o równoczesnej specyficznoś ci wzglę dem L-fosfinotrycyny i asparaginianu.
Pewnym ułatwieniem było zaproponowanie sprzężonego układu dwóch enzymów składającego się z transaminazy specyficznej względem PPT i transaminazy glutaminian : szczawianooctan (GOT, EC 2.6.1.1) (EP-A-0 249 188 i EP-A-0 477 902). Przy prowadzeniu tej reakcji potrzebny w syntezie L-PPT glutaminian odzyskuje się z asparaginianu z użyciem GOT. Sama transaminaza asparaginianowa nie wykazuje żadnej specyficzności względem L-PPT/PPO. Samorzutna przemiana szczawianooctanu w pirogronian powoduje także przesunięcia równowagi całej reakcji w kierunku syntezy L-PPT. Produkt można otrzymać z wydajnością ilościową przy użyciu równomolowych ilości PPO i asparaginianu i przy wyraź nym niedomiarze glutaminianu.
W przypadku układu sprzężonych enzymów można wyraźnie zmniejszyć nadmiar donorowych aminokwasów w roztworze substratów w stosunku do akceptorowego ketokwasu PPO, co ułatwia obróbkę roztworu produktu. Jednakże przy prowadzeniu sprzężonej reakcji w dalszym ciągu jest konieczne stosowanie glutaminianu, który w równowadze z ketoglutaranem pozostaje w produkcie reakcji lub musi być oddzielony drogą kosztownego oczyszczania od aminokwasu L-PPT o bardzo podobnej budowie. Ponadto optymalizacja prowadzenia reakcji z dwoma enzymami z uwzględnieniem różnych parametrów kinetycznych jest trudniejsza niż w przypadku jednego enzymu.
Znane transaminazy asparaginianowe, takie jak np. GOT, nie wykazują żadnej reakcji wobec PPO, jednak nieoczekiwanie odkryto pewne transaminazy asparaginianowe pochodzące z drobnoustrojów, które z wysoką specyficznością akceptują jako substrat również L-PPT/PPO. Te enzymy katalizują bezpośrednie przeniesienie grupy α-aminowej asparaginianu do PPO.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem sposób wytwarzania kwasu L-2-amino-4-(hydroksymetylofosfinylo)masłowego (L-fosfinotrycyny, L-PPT) o wzorze (I), jego pochodnych wybranych z grupy obejmującej estry i amidy kwasu karboksylowego i estry kwasu fosfinowego, i/lub ich soli
PL 202 575 B1 z kwasu 4-(hydroksymetylofosfinylo)-2-oksomasłowego (HMPB, PPO) o wzorze (II)
h3c P—ch2—ch2—c C-OH (II)
OH jego pochodnych wybranych z grupy obejmującej estry i amidy kwasu karboksylowego i estry kwasu fosfinowego i/lub ich soli jako akceptora, drogą enzymatycznego transaminowania w obecności asparaginianu jako donora, charakteryzujący się tym, że transaminowanie prowadzi się w obecności jednej lub większej liczby termostabilnych transaminaz asparaginianowych (Asp-TA) specyficznych względem akceptora, z wytworzeniem szczawianooctanu i związku o wzorze (I), jego pochodnych i/lub soli.
Korzystnie reakcję asparaginianu jako donora i związku o wzorze II, jego pochodnych wybranych z grupy obejmującej estry i amidy ugrupowania kwasu karboksylowego i estry ugrupowania kwasu fosfinowego i/lub soli jako akceptora prowadzi się w obecności jednej lub większej liczby termostabilnych transaminaz asparaginianowych specyficznych wobec akceptora.
Również korzystnie jest, aby specyficzne wobec akceptora termostabilne transaminazy asparaginianowe wykazywały nieznaczną specyficzność substratowa wobec pirogronianu, co umożliwia uniknięcie tworzenia się alaniny jako produktu ubocznego.
W korzystnym sposobie obecny pirogronian usuwa się z mieszaniny reakcyjnej drogą fizyczną , chemiczną i/lub enzymatyczną.
Korzystniej, reakcję pirogronianu z wytworzeniem acetylomleczanu prowadzi się w obecności jednej lub większej liczby syntaz acetylomleczanowych (ALS).
Także korzystniej reakcję pirogronianu z wytworzeniem acetaldehydu prowadzi się w obecności dekarboksylazy pirogronianowej.
W innej korzystnej odmianie reakcję pirogronianu z wytworzeniem acetylofosforanu prowadzi się w obecności oksydazy pirogronianowej.
Najkorzystniej reakcję pirogronianu prowadzi się w obecności termostabilnego enzymu.
Korzystny jest także sposób, w którym jedną lub większą liczbę transaminaz stosuje się w postaci unieruchomionej.
Przedmiotem wynalazku jest także drobnoustrój o numerze dostępu DSM 13353, drobnoustrój o numerze dostę pu DMS 13354, drobnoustrój o numerze dostę pu DSM 13355 oraz drobnoustrój o numerze dostę pu DSM 13356.
Sole L-PPT są na ogół solami kwasów nieorganicznych i/lub organicznych, albo mono- i disolami zasad nieorganicznych i/lub organicznych. Sole z kwasami (sole addycyjne z kwasami) to np. sole z kwasami nieorganicznymi, takimi jak kwas solny (chlorowodorek) lub kwas siarkowy (siarczany), lub kwas węglowy (węglany, wodorowęglany), albo z kwasami organicznymi, takimi jak kwas octowy (octany), kwas mrówkowy (mrówczany), kwas propionowy (propioniany) lub kwas winowy (winiany). Sole z zasadami to np. sole metali alkalicznych i sole metali ziem alkalicznych, sole amonowe, sole z aminami organicznymi, takimi jak aminy pierwszorzędowe, drugorzędowe lub trzeciorzędowe i czwartorzę dowe sole amoniowe.
Pochodnymi są np. estry L-PPT, zestryfikowane w ugrupowaniu kwasu fosfinowego, np. zestryfikowane C1-C12-alkanolami, takimi jak metanol, etanol, n-propanol, izopropanol, n-, izo- i sec- lub tertbutanol, albo C3-C6-cykloalkanolami, takimi jak cykloheksanol. Pochodnymi są także estry L-PPT, które alternatywnie lub dodatkowo są zestryfikowane w ugrupowaniu kwasu karboksylowego, np. wyżej wymienionymi alkoholami. Pochodnymi są także karboksyamid L-PPT i jego pochodne, ewentualnie N-alkilo- lub N,N-dialkiloamidy, korzystnie o 1-4 atomach węgla w części alkilowej.
Pochodnymi PPO są np. jego sole z zasadami nieorganicznymi i/lub organicznymi, przy czym odpowiednimi zasadami są zasady wymienione powyżej w odniesieniu do L-PPT. Pochodnymi są także np. estry PPO zestryfikowane w ugrupowaniu kwasu karboksylowego, w ugrupowaniu kwasu fosfinowego lub w obu ugrupowaniach. Odpowiednimi alkoholami do tworzenia grup estrowych są alkohole wymienione powyżej w odniesieniu do estrów L-PPT, a korzystnie wymienione alkanole. Pochodnymi są również karboksyamid PPO i jego pochodne zestryfikowane w ugrupowaniu kwasu fosfinowego i ewentualnie odpowiednie N-alkilo- lub N,N-dialkiloamidy.
PL 202 575 B1
Asparaginian korzystnie oznacza kwas L-asparaginowy lub jego sole, korzystnie sole metali alkalicznych. Jako asparaginian można także stosować kwas L-asparaginowy w mieszaninie z kwasem D-asparaginowym, np. jako racemiczny kwas D,L-asparaginowy.
Oba substraty (donor i akceptor) stosuje się np. w stosunku molowym 0,5-2:1 (w przeliczeniu na kwas L-asparaginowy : PPO), korzystnie 0,75-1,5:1, a zwłaszcza w stosunku w przybliżeniu równomolowym. W przypadku stosowania mieszanin kwasów L- i D-asparaginowych (soli) decydujące znaczenie ma molowa ilość kwasu L-asparaginowego (soli). Pochodne PPO stosuje się w molowej ilości odpowiadającej ilości PPO. Obecność glutaminianu w roztworze substratów nie jest konieczna. Niektóre z odkrytych enzymów wykazują doskonałą termostabilność. Dzięki temu można prowadzić proces w szerokim zakresie temperatury, np. w temperaturze 10-95°C, korzystnie 40-90°C, a zwłaszcza 60--85°C. W przypadku enzymów nie wykazujących szczególnej termostabilności, korzystnym zakresem temperatury jest 20-70°C, a zwłaszcza 30-40°C.
Szybkość reakcji można znacznie przyśpieszyć dzięki użyciu stosunkowo wysokiej temperatury, co ponadto umożliwia przebieg reakcji w stężonych roztworach substratu (10%) z wysoką wydajnością przestrzenno-czasową. Reakcję prowadzi się korzystnie przy wartości pH 6,5-10, korzystniej 7-9, a zwł aszcza 7,5-8,5, w odpowiednim ukł adzie buforowym o wartoś ci pKa 7-9, w buforze fosforanowym lub buforze Tris. Nieoczekiwanie te scharakteryzowane biochemicznie enzymy nie wykazują żadnej specyficzności względem GABA, a zatem różnią się wyraźnie od znanych transaminaz specyficznych względem L-PPT/PPO.
Szczególnie wysoki stopień przemiany w reakcji uzyskuje się, gdy unika się powstawania alaniny podczas transaminowania, względnie gdy jest ono minimalne. W tym celu można ewentualnie użyć optymalnych odmian ASP-TA bez specyficzności substratowej względem pirogronianu. Alternatywnie pirogronian można usunąć drogą fizyczną, np. z użyciem selektywnie przepuszczalnych błon i/lub drogą chemiczną lub enzymatyczną, np. drogą reakcji mieszaniny reakcyjnej z dekarboksylazą pirogronianową, oksydazą pirogronianową lub syntazą acetylomleczanową (patrz np. Taylor i inni TIBTECH (1998) tom 16, 412-418; Fotheringham i inni, CHIMICA OGGI/chemistry today (1997), 9/10, 33-38; WO 98/53088). Oczyszczenie produktu, L-PPT, z roztworu reakcyjnego można ewentualnie prowadzić znanymi i zwykłymi sposobami, np. przez ekstrakcję ketonem metylowo-izobutylowym lub drogą chromatografii kationowymiennej, np. z użyciem Amberlite® IR 120 (wytwórca Sigma).
Sposób według wynalazku objaśniono bliżej w poniższych przykładach, a wynalazek zdefiniowano w zastrzeżeniach patentowych. Poniższe przykłady nie ograniczają jednak istoty wynalazku.
P r z y k ł a d y
1.) Wyodrębnianie z gleby drobnoustrojów o aktywności transaminazy asparaginianowej specyficznej względem L-PPT
Porcję 1 g różnych próbek gleby (humus, glinka, piasek z wydm Schwanheimer, Frankfurt) ekstrahowano 10 ml 10 mM buforu (fosforan sodu o pH = 7,0) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Wyodrębnionymi z ekstraktów wzbogaconymi hodowlami zaszczepiono następującą pożywkę:
mM glukoza mM bursztynian mM gliceryna mM PPO mM kwas L-asparaginowy ml/l roztworu A ml/l roztworu B
Roztwór A: 50 g/l K2HPO4
Roztwór B: 2,5 g/l MgSO4
0,5 g/l NaCl ml/l roztworu podstawowego zawierającego:
g/l FeSO4 x 7 H2O
0,22 g/l MnSO4 x H2O
0,1 g/l H3BO3
0,1 g/l Na2MoO4 x 2 H2O
0,18 g/l ZnSO4 x 7 H2O
0,16 g/l CuSO4 x 5 H2O
0,1 g/l CoCl2 x 6 H2O ml/l 1N HCl
PL 202 575 B1
Hodowle inkubowano przez 3-5 dni w inkubatorze obrotowym przy prędkości obrotowej 200 obrotów/minutę i w temperaturze 28°C. Jedną z badanych próbek podłoża (humus) nasycono drobnoustrojami, które mogły rosnąć z kwasem L-asparaginowym jako jedynym źródłem azotu. Hodowlę pasażowano kilkakrotnie w tej samej pożywce, a następnie dla wyizolowania poszczególnych monoklonów naniesiono ją na płytki z pożywką agarową o tym samym składzie. Po inkubacji przez 3-5 dni w temperaturze 28°C wyizolowano ogółem 100 monokolonii i ponownie zaszczepiono w pł ynnej pożywce (jak wyżej). Rozdzielanie na płytkach agarowych powtórzono jeszcze dwukrotnie dla uzyskania pewności, że otrzymano czyste hodowle. Po tych etapach selekcji uzyskano 20 indywidualnych szczepów, które mogły wzrastać w obecności kwasu L-asparaginowego jako jedynego źródła azotu.
Dla testów aktywności transaminazy asparaginianowej względem PPO pobrano porcje hodowli szczepów jak wyżej (2 ml). Porcje 400 μΐ hodowli poddawano permeacji z 0,5% toluenem i 0,5% etanolem przez 30 minut w temperaturze 37°C. Osad komórek przeprowadzono w postać suspensji w 50 μl mieszaniny reakcyjnej składającej się z 50 mM PPO, 50 mM kwasu L-asparaginowego, 50 mM Tris/HCl o pH = 8,0 i 10 μM fosforanu pirydoksalu i inkubowano przez noc w temperaturze 28°C.
Dla jakościowego oznaczenia PPT ciecz znad osadu reakcyjnego rozcieńczono w stosunku 1:5 wodą i zanalizowano porcje o objętości 5 μl drogą chromatografii cienkowarstwowej na płytkach celulozowych do HPTLC (Merck), z elucją n-butanolem:kwasem octowym:wodą = 60 : 15 : 25. Aminokwasy uwidoczniono przez zabarwienie ninhydryną. W przypadku czterech szczepów (DSM 13353, DSM 13354, DSM 13355, DSM 13356; wszystkie szczepy zdeponowano w „Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH”) można było udowodnić powstanie fosfinotrycyny. Czystość enancjomeryczną produktu reakcji zbadano drogą chiralnej HPLC [z użyciem kolumny rozdzielczej Chirex® (D) z penicyloaminą jako matrycą (wytwórca Phenomenex)] (eluent: 2 mM CUSO4, 10% metanol, szybkość przepływu: 0,5 ml/min., detekcja UV: 254 nm, czas retencji: L-PPT: około 17 minut, D-PPT: około 21 minut). We wszystkich czterech przebadanych próbkach testowych wykazano jako produkt reakcji L-PPT i brak D-PPT jako produktu reakcji.
W celu wytworzenia L-PPT drogą bioprzemiany i ilościowej analizy przebiegu reakcji umieszczono jednolitrowe porcje hodowli szczepów bakterii z gleby, DSM 13354, DSM 13355 i DSM 13356, w wyżej opisanej pożywce, na 48 godzin w temperaturze 28°C. Komórki zebrano przez odwirowanie, przemyto je jednokrotnie 10 mM NaCl i 10 mM fosforanu sodu o pH = 7,5, a następnie zliofilizowano przez noc.
Dla przeprowadzenia bioprzemiany porcję 200 mg suchej masy komórek wyżej określonych szczepów bakterii glebowych przeprowadzono w stan suspensji w 10 ml następującego roztworu substratów:
100 mM PPO
200 mM kwas L-asparaginowy
100 mM Tris/HCl, pH = 8,0 mM fosforan pirydoksalu
Osady inkubowano w inkubatorze obrotowym przy prędkości obrotowej 200 obrotów/minutę i w temperaturze 37°C. Po 1,2, 4, 8, 24 i 30 godzinach pobierano 200 μl próbki i analizowano je metodą HPLC wyżej opisanym sposobem. Wyniki pomiarów dla L-PPT i kwasu L-asparaginowego podano w tabeli 1. Osiągnięty maksymalny stopień przemiany [wytworzony L-PPT/PPO w substracie x 100] wynosił około 59% (DSM 13355).
T a b e l a 1
Przebieg reakcji transaminowania PPO/asparaginian drogą bioprzemiany z użyciem wyizolowanych drobnoustrojów glebowych
| Szczep | Czas reakcji [godziny]* | L-PPT [mM] | Kwas asparaginowy [mM] |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| DSM 13354 | 1 | 3,9 | 174,0 |
| 2 | 5,7 | 150,0 | |
| 4 | 10,3 | 100,0 | |
| 8 | 23,8 | 30,3 | |
| 24 | 38,3 | 0 | |
| 30 | 48,4 | 0 |
PL 202 575 B1 cd. tabeli 1
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| DSM 13355 | 1 | 4,5 | 143,1 |
| 2 | 7,7 | 122,7 | |
| 4 | 11,1 | 98,8 | |
| 8 | 24,8 | 76,4 | |
| 24 | 44,9 | 17,2 | |
| 30 | 59,1 | 9,8 | |
| DSM 13356 | 1 | 5,7 | 138,1 |
| 2 | 8,4 | 124,4 | |
| 4 | 12,5 | 95,9 | |
| 8 | 27,5 | 58,8 | |
| 24 | 51,3 | 14,3 | |
| 30 | 49,6 | 7,2 |
*: temperatura reakcji: 37°C
2.) Dowód bezpośredniego transaminowania PPO/asparaginian z użyciem preparatów enzymów transaminaz
Wszystkie 7 różnych dostępnych na rynku transaminaz przetestowano pod kątem transaminowania PPO/asparaginian. Zastosowano transaminazy pochodzenia drobnoustrojowego (termostabilne transaminazy AMN-001-01, -001-02, -001-03, -001-04, -001-05, zawarte w transaminazowym zestawie testowym Diversa CAT# AMN-001 (1998)) transaminazę glutaminian : szczawianooctan (GOT) i transaminazę glutaminian : pirogronian (GPT, Sigma).
Preparaty enzymowe rozpuszczono do stężenia białka 5 mg/ml w 50 mM buforu Tris/HCl o pH = 8,0, a nastę pnie dializowano przez noc w temperaturze 4°C w takim samym buforze.
W wyniku takiej obróbki preparatów enzymowych ewentualnie obecne donory i akceptory grup aminowych, które mogą działać jako środki przenoszące podczas transaminowania, zostają usunięte.
Stężenie roztworów enzymów doprowadzono następnie do 1 mg/ml i w porcjach 50 μΐ inkubowano je w buforze reakcyjnym składającym się z 50 mM PPO, 50 mM kwasu L-asparaginowego, 50 mM Tris/HCl o pH = 8,0 i 10 μM fosforanu pirydoksalu przez 1 godzinę w temperaturze optymalnej dla enzymu.
Próbki z enzymami analizowano drogą chromatografii cienkowarstwowej i chiralnej HPLC sposobem opisanym w przykładzie 1. W przypadku dwóch termostabilnych enzymów, AMN-001-03 i AMN-001-04 (temperatura reakcji: 80°C) wykazano enancjoselektywne powstawanie L-PPT przez transaminowanie kwasu L-asparaginowego. Wszystkie inne testowane enzymy nie wykazywały żadnej reaktywności.
3.) Ilościowe badanie transaminowania PPO/asparaginian z użyciem termostabilnej transaminazy AMN-001-03
Dla dokładniejszego scharakteryzowania reakcji syntezy L-PPT wybrano transaminazę AMN-001-03, z uwagi na jej wyższą aktywność specyficzną.
Inkubowano 1 ml roztworu substratu składającego się z 40 mM PPO, 48 mM kwasu L-asparaginowego, 50 mM Tris/HCl o pH = 8,0 i 0,1 mM fosforanu z 1 mg transaminazy AMN-001-03 w temperaturze 80°C.
Dla analizy przebiegu reakcji pobierano w okresie 24 godzin podwielokrotne próbki o objętości 50 μl i zamrażano je w temperaturze -20°C. PPT i asparaginian oznaczano w analizatorze aminokwasów (Biotronic LC 5001).
Wyniki przedstawiono w tabeli 2.
W wybranych warunkach równowagę reakcji syntezy L-PPT osiągnięto po 2-4 godzinach. Zastosowany donor grupy aminowej, kwas L-asparaginowy, został po 7 godzinach całkowicie zużyty. Osiągnięto stopień przemiany [wytworzony L-PPT/PPO w substracie x 100] około 75%.
PL 202 575 B1
T a b e l a 2
Przebieg reakcji transaminowania PPO/asparaginian z użyciem transaminazy AMN-001-03
| Czas reakcji [godziny]* | L-PPT [mM] | Asparaginian [mM] |
| 0 | 0 | 53,4 |
| 1 | 9,5 | 47,8 |
| 2 | 20,8 | 33,8 |
| 4 | 25,7 | 12,5 |
| 7 | 29,7 | 0 |
| 24 | 28,1 | 0,4 |
*: temperatura reakcji: 80°C
4.) Enzymatyczna synteza chiralna L-PPT z PPO i asparaginianu z użyciem częściowo oczyszczonej termostabilnej transaminazy AMN-001-03
W próbie syntezy zastosowano częściowo oczyszczoną transaminazę AMN-001-03 o specyficznej aktywności 107 nkat/mg białka (1 nkat = 1 nmol asparaginianu/sekundę).
Roztwór reakcyjny o objętości 1 ml zawierał 552 mM PPO (10%), 700 mM kwasu L-asparaginowego, 0,1 mM fosforanu pirydoksalu, przy pH =8,0 nastawionym z użyciem KHCO3, i 11,5 mg enzymu.
Mieszaninę inkubowano w temperaturze 80°C. Pobieranie próbek i ich analizowanie prowadzono sposobem opisanym w przykładzie 3.
Wyniki zestawiono w tabeli 3. W tej próbie równowagę reakcji osiągnięto już po 1 godzinie. Donor grupy aminowej, kwas L-asparaginowy, został po 4 godzinach prawie całkowicie zużyty. Stopień przemiany wynosił około 52%, a wydajność przestrzenno-czasowa wynosiła 4,5 [g L-PPT/g biokatalizatora/godzinę].
W próbce równoległ ej z takim samym roztworem substratu i stężeniem enzymów, ale przy temperaturze reakcji 60°C, osiągnięto podobny stopień przemiany przy wyraźnie zmniejszonej szybkości reakcji.
Wydajność przestrzenno-czasowa wyniosła tylko 0,95 [g L-PPT/g biokatalizatora/godzinę]. Wyniki te potwierdzają duże znaczenie wysokiej termostabilności transaminazy dla stopnia przemiany i skutecznego prowadzenia reakcji.
Umiarkowany stopień przemiany 52% spowodowany jest głównie tworzeniem się produktu ubocznego, alaniny, przez transaminowanie pirogronianu.
Znacznie wyższe stopnie przemiany uzyskuje się przy unikaniu powstawania alaniny podczas reakcji.
T a b e l a 3
Wytwarzanie L-PPT przez transaminowanie z użyciem częściowo oczyszczonej termostabilnej transaminazy AMN-001-03
| Czas reakcji [godziny]* | L-PPT [mM] | Asparaginian [mM] | Alanina [mM] |
| 0 | 0 | 700,0 | 0 |
| 0,5 | 155,3 | 405,8 | 0 |
| 1 | 286,4 | 193,1 | 98,7 |
| 2 | 288,5 | 15,2 | 181,5 |
| 4 | 284,0 | 1,9 | 284,1 |
| 8 | 251,9 | 1,3 | 234,5 |
*: temperatura reakcji: 80°C
Claims (13)
1. Sposób wytwarzania kwasu L-2-amino-4-(hydroksymetylofosfinylo)masłowego (L-fosfinotrycyny, L-PPT) o wzorze (I), jego pochodnych wybranych z grupy obejmującej estry i amidy kwasu karboksylowego i estry kwasu fosfinowego i/lub ich soli z kwasu 4-(hydroksymetylofosfinylo)-2-oksomasłowego (HMPB, PPO) o wzorze (II) ίϊ ίί h3c—| — ch2— ch2-C-C-OH (II)
OH jego pochodnych wybranych z grupy obejmującej estry i amidy kwasu karboksylowego i estry kwasu fosfinowego, i/lub ich soli jako akceptora, drogą enzymatycznego transaminowania w obecności asparaginianu jako donora, znamienny tym, że transaminowanie prowadzi się w obecności jednej lub większej liczby termostabilnych transaminaz asparaginianowych (Asp-TA) specyficznych względem akceptora, z wytworzeniem szczawianooctanu i związku o wzorze (I), jego pochodnych i/lub soli.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję asparaginianu jako donora i związku o wzorze II, jego pochodnych wybranych z grupy obejmują cej estry i amidy ugrupowania kwasu karboksylowego i estry ugrupowania kwasu fosfinowego, i/lub soli jako akceptora prowadzi się w obecności jednej lub większej liczby termostabilnych transaminaz asparaginianowych specyficznych wobec akceptora.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że specyficzne wobec akceptora termostabilne transaminazy asparaginianowe wykazują nieznaczną specyficzność substratowa wobec pirogronianu, co umożliwia uniknięcie tworzenia się alaniny jako produktu ubocznego.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że obecny pirogronian usuwa się z mieszaniny reakcyjnej drogą fizyczną, chemiczną i/lub enzymatyczną.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że reakcję pirogronianu z wytworzeniem acetylomleczanu prowadzi się w obecności jednej lub większej liczby syntaz acetylomleczanowych (ALS).
6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że reakcję pirogronianu z wytworzeniem acetaldehydu prowadzi się w obecności dekarboksylazy pirogronianowej.
7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że reakcję pirogronianu z wytworzeniem acetylofosforanu prowadzi się w obecności oksydazy pirogronianowej.
8. Sposób według zastrz. 5 albo 6, albo 7, znamienny tym, że reakcję pirogronianu prowadzi się w obecności termostabilnego enzymu.
9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, znamienny tym, że jedną lub większą liczbę transaminaz stosuje się w postaci unieruchomionej.
10. Drobnoustrój o numerze dostępu DSM 13353.
11. Drobnoustrój o numerze dostępu DMS 13354.
12. Drobnoustrój o numerze dostępu DSM 13355.
13. Drobnoustrój o numerze dostępu DSM 13356.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19919848A DE19919848A1 (de) | 1999-04-30 | 1999-04-30 | Verfahren zur Herstellung von L-Phosphinothricin durch enzymatische Transaminierung mit Aspartat |
| PCT/EP2000/002809 WO2000066760A1 (de) | 1999-04-30 | 2000-03-30 | Verfahren zur herstellung von l-phosphinothricin durch enzymatische transaminierung mit aspartat |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL353460A1 PL353460A1 (pl) | 2003-11-17 |
| PL202575B1 true PL202575B1 (pl) | 2009-07-31 |
Family
ID=7906505
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL353460A PL202575B1 (pl) | 1999-04-30 | 2000-03-30 | Sposób wytwarzania kwasu L-2-amino-4-(hydroksymetylofosfinylo)masłowego oraz drobnoustroje |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6936444B1 (pl) |
| EP (1) | EP1177310B1 (pl) |
| JP (1) | JP2003528572A (pl) |
| KR (1) | KR100810169B1 (pl) |
| CN (1) | CN1284858C (pl) |
| AT (1) | ATE287965T1 (pl) |
| AU (1) | AU768315B2 (pl) |
| BR (1) | BR0010199A (pl) |
| CA (1) | CA2370109C (pl) |
| CZ (1) | CZ20013901A3 (pl) |
| DE (2) | DE19919848A1 (pl) |
| DK (1) | DK1177310T3 (pl) |
| ES (1) | ES2235865T3 (pl) |
| HU (1) | HU228395B1 (pl) |
| IL (2) | IL145925A0 (pl) |
| MX (1) | MXPA01011016A (pl) |
| NZ (1) | NZ515088A (pl) |
| PL (1) | PL202575B1 (pl) |
| RU (1) | RU2275428C2 (pl) |
| SK (1) | SK286456B6 (pl) |
| UA (1) | UA75331C2 (pl) |
| WO (1) | WO2000066760A1 (pl) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7772426B2 (en) | 2005-03-29 | 2010-08-10 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Method for producing L-2-amino-4-(hydroxymethylphosphinyl)-butanoic acid |
| EP1818411A1 (en) * | 2006-02-13 | 2007-08-15 | Lonza AG | Process for the preparation of optically active chiral amines |
| WO2007100101A1 (ja) * | 2006-03-02 | 2007-09-07 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子およびｌ－ホスフィノスリシンの製造方法 |
| BRPI0716080B8 (pt) | 2006-09-04 | 2018-02-14 | Meiji Seika Kaisha | processo para produção de ácidos (aminofosfinil) butanóicos oticamente ativos |
| WO2008035687A1 (en) | 2006-09-20 | 2008-03-27 | Meiji Seika Kaisha Ltd. | METHOD FOR PRODUCING PHOSPHORUS-CONTAINING α-AMINO ACID AND PRODUCTION INTERMEDIATE THEREOF |
| CN101641363A (zh) | 2007-03-23 | 2010-02-03 | 明治制果株式会社 | 含磷的α-酮酸的制造方法 |
| HUE052297T2 (hu) | 2009-01-08 | 2021-04-28 | Codexis Inc | Transzamináz polipeptidek |
| JP5707344B2 (ja) | 2009-02-26 | 2015-04-30 | コデクシス， インコーポレイテッド | トランスアミナーゼ生体触媒 |
| WO2011005477A1 (en) | 2009-06-22 | 2011-01-13 | Codexis, Inc. | Transaminase reactions |
| US8981142B2 (en) | 2010-04-14 | 2015-03-17 | Strategic Enzyme Applications, Inc. | Process of producing phosphinothricin employing nitrilases |
| HUE038434T2 (hu) | 2010-06-17 | 2018-10-29 | Codexis Inc | Biokatalizátorok és módszerek (S)-3(1-aminoetil)-fenol szintéziséhez |
| EP2606139B1 (en) | 2010-08-16 | 2015-07-15 | Codexis, Inc. | Biocatalysts and methods for the synthesis of (1r,2r)-2-(3,4-dimethoxyphenethoxy)cyclohexanamine |
| CN105603015B (zh) * | 2016-01-22 | 2018-12-11 | 浙江大学 | 一种l-草铵膦的生产方法 |
| IL261271B2 (en) | 2016-03-02 | 2025-03-01 | Agrimetis Llc | Methods for preparing L-glucosinate |
| CN106916857B (zh) * | 2017-03-09 | 2019-08-27 | 浙江大学 | 一种生产l-草铵膦的方法 |
| CN107119084B (zh) * | 2017-03-23 | 2019-12-17 | 浙江大学 | 一种利用转氨酶和乙烯合成酶生产l-草铵膦的方法 |
| CN110343676B (zh) | 2018-04-03 | 2020-06-23 | 上海弈柯莱生物医药科技有限公司 | 一种l-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用 |
| US12559777B2 (en) | 2018-09-05 | 2026-02-24 | Basf Se | Methods for improving yields of L-glufosinate |
| CN109369711A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-02-22 | 洪湖市泰科技有限公司 | 一种l-草胺膦关键中间体的合成新方法 |
| CN111019916B (zh) | 2018-11-23 | 2020-12-08 | 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 | 一种d-氨基酸氧化酶突变体及其应用 |
| CN111979208B (zh) | 2019-05-23 | 2023-01-10 | 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 | 一种l-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用 |
| CN112725298B (zh) | 2020-12-31 | 2022-12-06 | 浙江工业大学 | 一种机器学习基因挖掘方法及氨基转位用草铵膦脱氢酶突变体 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2717440C2 (de) | 1976-05-17 | 1984-04-05 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Unkrautbekämpfung mit [(3-Amino-3-carboxy)-propyl-1]-methylphosphinsäure-Derivaten |
| GB2011416B (en) | 1977-12-28 | 1982-10-20 | Meiji Seika Kaisha | Herbicidal compositions |
| HU193902B (en) * | 1983-09-01 | 1987-12-28 | Genetics Inst | Process for preparing l-amino acids by means of transamination |
| US4826766A (en) | 1985-09-23 | 1989-05-02 | Genetics Institute, Inc. | Production of amino acids using coupled aminotransferases |
| EP0533216B1 (de) * | 1986-06-04 | 2000-03-22 | Hoechst Schering AgrEvo GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-tertiär-Leucin durch Transaminierung |
| AU599985B2 (en) * | 1986-06-09 | 1990-08-02 | Meiji Seika Kaisha Ltd. | New process for the production of L-2-amino-4- (hydroxymethyl-phosphinyl)-butyric acid |
| DE3818851A1 (de) | 1988-06-03 | 1989-12-14 | Hoechst Ag | Neue transaminase, ihre herstellung und ihre verwendung |
| EP0349965A3 (en) * | 1988-07-04 | 1990-06-13 | Meiji Seika Kaisha Ltd. | Novel genes encoding transaminase |
| DE3932015A1 (de) | 1988-12-15 | 1991-04-04 | Hoechst Ag | Gen und genstruktur, codierend fuer eine aminotransferase, mikroorganismen, die dieses gen exprimieren, und transaminierungsverfahren unter verwendung des expressionsprodukts |
| DE4030578A1 (de) * | 1990-09-27 | 1992-04-16 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von l-phosphinothricin durch eine gekoppelte enzymatische reaktion |
| US5962283A (en) | 1995-12-07 | 1999-10-05 | Diversa Corporation | Transminases and amnotransferases |
| US6197558B1 (en) * | 1997-05-19 | 2001-03-06 | Nsc Technologies | Transaminase biotransformation process |
-
1999
- 1999-04-30 DE DE19919848A patent/DE19919848A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-03-30 PL PL353460A patent/PL202575B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-03-30 CA CA002370109A patent/CA2370109C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-30 SK SK1562-2001A patent/SK286456B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-03-30 KR KR1020017013902A patent/KR100810169B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-30 EP EP00926778A patent/EP1177310B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-30 AU AU45408/00A patent/AU768315B2/en not_active Ceased
- 2000-03-30 IL IL14592500A patent/IL145925A0/xx active IP Right Grant
- 2000-03-30 NZ NZ515088A patent/NZ515088A/xx unknown
- 2000-03-30 UA UA2001118183A patent/UA75331C2/uk unknown
- 2000-03-30 ES ES00926778T patent/ES2235865T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-30 CN CNB008069735A patent/CN1284858C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-30 HU HU0200948A patent/HU228395B1/hu unknown
- 2000-03-30 MX MXPA01011016A patent/MXPA01011016A/es active IP Right Grant
- 2000-03-30 JP JP2000615782A patent/JP2003528572A/ja active Pending
- 2000-03-30 AT AT00926778T patent/ATE287965T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-03-30 WO PCT/EP2000/002809 patent/WO2000066760A1/de not_active Ceased
- 2000-03-30 CZ CZ20013901A patent/CZ20013901A3/cs unknown
- 2000-03-30 DK DK00926778T patent/DK1177310T3/da active
- 2000-03-30 DE DE50009364T patent/DE50009364D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-30 RU RU2001132581/13A patent/RU2275428C2/ru active
- 2000-03-30 BR BR0010199-0A patent/BR0010199A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-06-30 US US10/018,331 patent/US6936444B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-10-14 IL IL145925A patent/IL145925A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| UA75331C2 (en) | 2006-04-17 |
| RU2275428C2 (ru) | 2006-04-27 |
| MXPA01011016A (es) | 2002-05-06 |
| HUP0200948A2 (hu) | 2002-07-29 |
| ATE287965T1 (de) | 2005-02-15 |
| CZ20013901A3 (cs) | 2002-02-13 |
| IL145925A0 (en) | 2002-07-25 |
| IL145925A (en) | 2007-05-15 |
| EP1177310A1 (de) | 2002-02-06 |
| EP1177310B1 (de) | 2005-01-26 |
| WO2000066760A1 (de) | 2000-11-09 |
| DE19919848A1 (de) | 2000-11-02 |
| PL353460A1 (pl) | 2003-11-17 |
| ES2235865T3 (es) | 2005-07-16 |
| HU228395B1 (en) | 2013-03-28 |
| DK1177310T3 (da) | 2005-04-11 |
| US6936444B1 (en) | 2005-08-30 |
| CA2370109A1 (en) | 2000-11-09 |
| CN1349561A (zh) | 2002-05-15 |
| AU4540800A (en) | 2000-11-17 |
| NZ515088A (en) | 2003-06-30 |
| BR0010199A (pt) | 2002-01-08 |
| SK15622001A3 (sk) | 2002-06-04 |
| KR100810169B1 (ko) | 2008-03-06 |
| CA2370109C (en) | 2009-07-07 |
| AU768315B2 (en) | 2003-12-11 |
| JP2003528572A (ja) | 2003-09-30 |
| KR20010112473A (ko) | 2001-12-20 |
| CN1284858C (zh) | 2006-11-15 |
| SK286456B6 (sk) | 2008-10-07 |
| DE50009364D1 (de) | 2005-03-03 |
| HUP0200948A3 (en) | 2010-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL202575B1 (pl) | Sposób wytwarzania kwasu L-2-amino-4-(hydroksymetylofosfinylo)masłowego oraz drobnoustroje | |
| US5962281A (en) | Process for preparing L-tertiary-leucine and L-phosphinothricine by transamination | |
| EP0404146B1 (en) | Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines | |
| HK1008052B (en) | Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines | |
| US5516660A (en) | Microorganisms, their use and method of producing L-α-amino acids | |
| EP0857790A1 (en) | Process for producing optically active amino compounds | |
| US5108914A (en) | Process for the synthesis of l-alpha-amino acids | |
| JP2026511215A (ja) | Ｌ－グルホシネート又はその塩の調製プロセス | |
| EP0315786A1 (en) | Process for the preparation of a d-alfa-amino acid from the corresponding alfa-keto acid | |
| SK280218B6 (sk) | Spôsob enantiomérneho obohacovania a stereoselektí | |
| JPWO1997015682A1 (ja) | 光学活性なアミノ化合物の製造方法 | |
| CZ355697A3 (cs) | Způsob stereoselektivní syntézy jedné chirální formy aminu | |
| JPH0870878A (ja) | トロポロニルアラニンの製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20100330 |