PL203128B1

PL203128B1 - Liposom zawierający taksan i zastosowanie liposomu kationowego

Info

Publication number: PL203128B1
Application number: PL354721A
Authority: PL
Inventors: Donald M. Mcdonald; John W. Mclean; Gavin O. Thurston
Original assignee: Univ California
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2009-08-31
Also published as: PL354721A1; MXPA02002579A; BR0013866A; EE200200127A; KR20030038530A; US20100226970A1; HK1046506B; WO2001017508A1; IL148372A0; KR100591767B1; CZ2002850A3; CA2383412C; EA005923B1; CA2383412A1; EP1210065A1; HUP0202669A3; JP2003514768A; AU782714B2; AU7122900A; CN1378443A

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest liposom zawierający taksan i zastosowanie liposomu kationowego. Zastosowanie liposomu kationowego obejmuje tworzenie kompozycji do leczenia chorób angiogenicznych, zmniejszania tworzenia płytek miażdżycowych i do leczenia raka.

Podstawa wynalazku

Niniejszy wynalazek można zastosować do leczenia i diagnozowania szeregu różnorodnych chorób i nieprawidłowości, w tym do leczenia raka, gojenia ran i szeregu różnorodnych przewlekłych chorób zapalnych. Ogólnie, każda z wymienionych chorób jest obecnie leczona bezpośrednio sposobami fizycznymi takimi jak chirurgiczne usuwanie tkanki nowotworowej, zszywanie ran i chirurgiczne usuwanie stawów objętych zmianami zapalnymi. Ponadto, każdą z nich można leczyć sposobami chemicznymi. Chemoterapia jest stosowana przy nowotworach, hormony są podawane przy gojeniu rany a leki przeciwzapalne są podawane do leczenia przewlekłych stanów zapalnych. Takie i podobne leczenie dotyczy, zasadniczo, bezpośredniego leczenia tkanki nowotworowej, zranionej lub będącej w stanie zapalnym. W celu uł atwienia zrozumienia tego w jaki sposób niniejszy wynalazek ró ż ni się od tradycyjnych form leczenia przedstawiono opis aktualnych technologii leczenia w tych dziedzinach.

Leczenia raka

Termin „rak obejmuje spektrum chorób różniących się leczeniem, prognozowaniem i możliwościami wyleczenia. Podejście do diagnozowania i leczenia zależy od miejsca pochodzenia nowotworu, zasięgu rozprzestrzenienia, zajętych rakiem miejsc, stanu fizjologicznego pacjenta oraz rokowania. Zdiagnozowany nowotwór jest zazwyczaj „określany co do jego stadium, w procesie wymagającym użycia technik chirurgicznych, badania fizycznego, histopatologicznego, zobrazowania oraz oceny laboratoryjnej w celu określenia zasięgu choroby oraz podziału populacji pacjentów chorych na raka na grupy według zmniejszającego się prawdopodobieństwa wyleczenia. Systemy takie wykorzystuje się zarówno w planowaniu leczenia jak i określaniu rokowań dla pacjentów (Stockdale (1996) „Principles of Cancer Patient Management, In: Scientific American Medicine, tom. 3, 'Dale, D.C. i Federman, D. D. (wyd.), Scientific Amercan Press, Nowy Jork). Typ oraz stadium raka określa, które z trzech zasadniczych typów leczenia będzie zastosowane: zabieg operacyjny, radioterapia i chemoterapia. Można także wybrać agresywną, mieszaną formę leczenia. W tym celu, usunięcie pierwotnego nowotworu można przeprowadzić zabiegiem chirurgicznym a pozostające komórki leczyć za pomocą radioterapii czy chemoterapii (Rosenberg (1985) New Engl. J. Med.). Zabieg operacyjny odgrywa główną rolę w diagnostyce i leczeniu raka. Zasadniczo, podejście chirurgiczne jest wymagane w przypadku biopsji i zabieg operacyjny jest ostatecznym sposobem leczenia dla większości pacjentów z nowotworem. Zabieg operacyjny stosowany jest także do zmniejszenia masy nowotworu, usuwania przerzutów, w nagłych przypadkach medycznych, w leczeniu paliatywnym oraz w rehabilitacji. Chociaż pierwotne techniki chirurgiczne w leczeniu raka wymagały rozwinięcia dziedziny operacji w których dokonuje się resekcji nowotworów w bezpośrednim uwidocznieniu, aktualne techniki pozwalają na przeprowadzanie pewnych resekcji sposobami wykorzystującymi endoskopię. W leczeniu raka na pierwszym miejscu brane jest pod uwagę ryzyko operacji (Stockdale, F., powyżej).

Radioterapia odgrywa ważną rolę zarówno w leczeniu podstawowym jak i paliatywnym nowotworu. Można stosować zarówno teleterapię (radioterapia megawoltarzowa) jak brachyterapię (radioterapia jelitowa i dojamowa). Promieniowanie elektromagnetyczne w formie promieniowania X jest najpowszechniej stosowane w teleterapii przy leczeniu powszechnych nowotworów złośliwych, lecz używane jest także promieniowanie gamma, forma promieniowania elektromagnetycznego podobnego do promieniowania X, lecz emitowanego przez radioizotopy radu, kobaltu i innych pierwiastków. Radioterapia przekazuje energię do tkanek w postaci pojedynczych pakietów energii, zwanych fotonami, które niszczą zarówno tkanki złośliwe jak i normalne poprzez wytwarzanie jonizacji wewnątrz komórek. Celem dla jonów jest najczęściej DNA; radioterapia wykorzystuje fakt, że promieniowanie nie niszczy jednakowo tkanek złośliwych i normalnych - szybko dzielące się komórki są bardziej wrażliwe na niszczenie DNA niż komórki w spoczynku (Pass (1993) J. Natl. Cancer Instit. 85:443-56). Z radioterapią łączą się wyjątkowe korzyści jak również ważne toksyczności. Promieniowanie jest preferowane w pewnych anatomicznych obszarach (np. ś ródpiersie), gdzie promieniowanie moż e być jedyną moż liwością przeprowadzenia leczenia lokalnego a także promieniowanie może być jedyną możliwością przeprowadzenia leczenia lokalnego jeśli rozmieszczenie nowotworu jest rozległe. Promieniowanie można także wykorzystać kiedy pacjent nie akceptuje przeprowadzenia zabiegu operacyjnego lub kiedy stan medyczny pacjenta zabrania stosowania procedur chirurgicznych. Leczenie promieniowaPL 203 128 B1 niem powoduje uszkodzenie tkanki, które może prowadzić do wczesnych lub późnych skutków promieniowania. Skutki wczesne (ostra toksyczność radioterapii) obejmują rumień skóry, łuszczenie się, zapalenie przełyku, mdłości, łysienie oraz mielosupresja (supresja rdzenia) podczas gdy późne skutki obejmują nekrozę i zwłóknienie tkanki oraz zazwyczaj określają ograniczoną toksyczność radioterapii (Stockdale, F., powyżej).

Prawie wszystkie czynniki chemoterapeutyczne używane aktualnie zmieniają syntezą DNA, zaopatrywanie w prekursory do syntezy DNA i RNA czy mitozę a tym samym interferują z docelowymi proliferującymi komórkami (Stockdale, F., „Cancer growth and chemotherapy, powyżej). Badania na nowotworach zwierzęcych oraz próby kliniczne na ludziach pokazały, że kombinacje leków dają wyższy wskaźnik rzeczywistej obiektywnej odpowiedzi i dłuższe przeżycie niż w przypadku czynników pojedynczych (Frei (1972) Cancer Res. 32:2593-2607). Terapia z kombinacją leków wykorzystuje różne mechanizmy działania i możliwości cytotoksyczne wielu lekarstw włączając czynniki alkilujące, antymetabolity i antybiotyki (Devita i wsp., (1975) Cancer 35:98-110). Warunki fizjologiczne pacjenta, charakterystyka wzrostu nowotworu, heterogenność populacji komórek nowotworowych oraz oporność nowotworu na wiele leków wpływa na skuteczność chemoterapii. Zasadniczo, chemoterapia nie jest wymierzona w określony cel (chociaż takie techniki też rozwinięto, np. Pastan (1986) Cell 47:641-648) i może prowadzić do efektów ubocznych takich jak zahamowanie czynności szpiku, zapalenie żołądka i jelit, mdłości, łysienie, uszkodzenie wątroby i płuc czy bezpłodność.

Gojenie rany

Gojenie rany jest złożonym i przewlekłym procesem naprawy i przemodelowania tkanki wymagającym wielu różnych typów komórek, który wymaga subtelnie regulowanej kontroli kaskad różnych reakcji chemicznych dla zbalansowania procesów regeneracyjnych. Gojenie rany zazwyczaj dzieli się na trzy fazy: zapalenie, proliferację i dojrzewanie (Waldorf i wsp. (1995) Adv. Dermatol. 10:77-96). Proces obejmuje migrację różnych typów komórek w region rany, stymulację wzrostu komórek nabłonkowych i fibroblastów, powstawanie nowych naczyń krwionośnych oraz tworzenia macierzy zewnątrz-komórkowej. Prawidłowe funkcjonowanie tych procesów zależy od aktywności biologicznej różnych cytokin (Bennett i wsp. (1993) Am. J. Surg. 165:728-37). Czynnikami wpływającymi na proces gojenia rany są odżywianie, system immunologiczny tlen, objętość krwi, zakażenie, immunosupresja oraz obniżona liczba czerwonych krwinek (Witney (1989) Heart Lung 18: 466-474).

Jakość i szybkość procesu gojenia rany zazwyczaj zależą od typu i zasięgu rany pierwotnej. Przy leczeniu ran stosuje się trzy zasadnicze typy procesów z których każdy jest skierowany na gojenie zniszczonej tkanki. Zamknięcie ran najczęściej osiągane jest poprzez szycie, chociaż można także stosować plastry, łączenie klamerkami czy koagulację elektryczną (Weeless, C.R., 1996, Weeless' Textbook of Orthopaedics) (Garrett i wsp. (1984) J. Hand. Surg. 9(5):683-92). Plastry skórne i różne szwy dają pewne korzyści i niedogodności w pierwotnym zamykaniu ran. Plastry skórne wywołują mniejszą reakcję zapalną lecz nie zamykają podnabłonkowej przestrzeni rany podczas gdy reakcja zapalna i następujące bliznowacenie wywołane różnymi szwami zależą od rozmiaru igły do szycia, średnicy materiału do szycia oraz od tego czy jest to nić jednowłóknowa czy pleciona (Simpson, (1977) Laryngoscope 87:792-816).

O tym czy w ranie rozwinie się infekcja decyduje rozmiar inokulum z mikroorganizmów, wirulentność organizmów oraz mechanizmy obronne skierowane przeciwko mikroorganizmom. Zatem, w leczeniu ran wartość terapeutyczną mog ą posiadać antybiotyki (Edlich (1986) Emergency Medical Clinics of North America 4(3):561-80). Musi być znane działanie farmakologiczne każdego antybiotyku w celu wybrania prawidłowego antybiotyku, drogi jego podawania oraz uniknięcia skutków ubocznych (Simpson, powyżej). Ostatnie wyniki sugerują, że terapia antybiotykowa pozwala na szybszą proliferację i różnicowanie komórek a tym samym, że może być przydatna w zwiększaniu naprawy rany (Barrow i wsp. (1994) Respiration 61:231-5; Maeder i wsp. (1993) Paraplegia 31:639-44). Jako wspomagające antybiotykowe leczenie zakażonych ran stosowane są także enzymy proteolityczne (Rodeheaver i wsp. (1978) Am. J. Surg. 136 (3):379-82).

Proces gojenia rany można znacznie przyspieszyć poprzez podawanie domiejscowo różnych cytokin w tym bFGF, EGF, PDGF i TGF-beta, pojedynczo lub w kombinacji (Moulin, (1995) Eur. J. Cell. Biol. 68:1-7). Czynniki wzrostu przyciągają komórki do rany, stymulują ich proliferację i posiadają znaczący wpływ na gromadzenie macierzy zewnątrzkomórkowej. Od czasu rozwoju możliwości masowej produkcji tych cytokin dzięki technikom rekombinacyjnym wiele badań wykazało, że czynniki wzrostu zwiększają wszystkie aspekty gojenia tkanki w modelach z normalnym i zaburzonym procesem gojenia (np. Schultz i wsp. (1987) Science 235:350-2; Deuel i wsp. (1991) Annu. Rev.Med.

PL 203 128 B1

42:567-84). Chociaż wstępne próby kliniczne wykazały, że leczenie czynnikiem wzrostu prowadzi czasami do statystycznie znamiennej poprawy naprawy tkanki nie jest jasne czy wyniki te są znaczące klinicznie i sugerowano, że nowe próby kliniczne muszą skupić się na ukierunkowanych czynnikach wzrostowych na specyficzne typy zaburzonego procesu gojenia (Greenhalgh (1996) J. Trauma 41:159-67).

Zapalenie przewlekłe

W patogenezę chorób z zapaleniem przewlekłym zaangażowane są mechanizmy naturalnej, humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej (Seymour i wsp. (1979) J. Oral Pathol. 8:249-65). Choroby autoimmunologiczne wynikają z nieprawidłowego funkcjonowania limfocytów. Nieprawidłowości w funkcjonowaniu komórek T mogą być odpowiedzialne za choroby związane z odpowiedzią komórkową a aktywność komórek pomocniczych T w produkcji przeciwciał może przyczyniać się do tworzenia autoprzeciwciał. Centralną rolę komórek pomocniczych T w chorobie autoimmunologicznej potwierdza powiązanie tych chorób z pewnymi cząsteczkami HLA. Defekt jednego lub kilku etapów w utrzymywaniu tolerancji moż e prowadzi ć do odpowiedzi autoimmunologicznej (Robinson (1996) „Immunologic Tolerance and Autoimmunity, W Scientific American Medicine, wol. 2. Sekcja VI, Scientific American Press, Nowy Jork, str. 1-11).

Stosuje się szereg typów leczenia choroby autoimmunologicznej gdzie każdy skierowany jest na zmniejszenie odpowiedzi immunologicznej w zaatakowanej tkance. Przykładowo, leczenie reumatoidalnego zapalenia stawów, choroby autoimmunologicznej, wykorzystuje czynniki przeciwzapalne takie jak nie steroidowe czynniki przeciwzapalne (NSAID) czy glukokortykosteroidy, czynniki indukujące remisję jak sole złota i/lub leki immunosupresyjne jak cyklofosfamidy. Można także zastosować chirurgię ortopedyczną dla usunięcia stawów zniszczonych podczas procesu zapalnego (patrz Gilliland, B.C. i Mannik, M. 1983, „Rheumatoid Arthritis: w Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw Hill, Nowy Jork, str. 1977-1984). Ostatnia praca sugeruje możliwość nowych sposobów leczenia, także skierowanych na zaatakowaną tkankę takich jak użycie TNFa w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów (Brennan i wsp. (1995) Br. Med. Bull. 51:368-384).

Alergia odnosi się do stanów w których odpowiedź immunologiczna na czynniki środowiskowe wywołuje zapalenie i dysfunkcję narządu. Tak jak w chorobach immunologicznych wyniki sugerują oddziaływanie wielu składników systemu odpornościowego w chorobach alergicznych. Zróżnicowanie ekspresji chorób alergicznych wynika z różnych immunologicznych mechanizmów efektorowych, które wywołują specyficzne wzory uszkodzenia tkanki (Beer i wsp. (1996) „Allergy w Scientific American Medicine, wol. 2, sekcja VII, Scientific American Press, New York, str. 1-29). Cechy kliniczne każdej choroby alergicznej odzwierciedlają immunologiczną odpowiedź zapalną w dotkniętych chorobą narządach czy tkankach (np. astma odzwierciedla odpowiedź zapalną w drogach oddechowych).

Stosowanych jest szereg strategii leczenia immunologicznych chorób alergicznych gdzie wszystkie skierowane są na zmniejszenie odpowiedzi immunologicznej tkanki zapalnej. Przykładowo, przy leczeniu astmy terapia może wymagać kontroli środowiska, farmakoterapii i immunoterapii alergenem (Beer i wsp. (1996) „Allergy w Scientific American Medicine, tom. 2, sekcja VII, Scientific American Press, New York, str. 1-29) . W leczeniu astmy eliminacja czynnika ją wywołującego jest najskuteczniejszym sposobem zapobiegania zapaleniu. Jednakże, często nie jest to możliwe i w związku z tym stosuje się wiele klas leków. Obejmują one metyloksantyny (dla rozszerzenia oskrzelików), stymulatory adrenoergiczne (stymulacja receptorów α-adrenergicznych, rozszerzenia oskrzelików), glukokortykoidy (zmniejszenie zapalenia w płucach), chromony (obniżenie regulacji komórek tucznych, zmniejszenie zapalenia w płucach) oraz czynniki antycholinergiczne (rozszerzenia oskrzelików) (McFadden i wsp. „Lung disease caused by immunologic and environmental injury i Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw Hill, New York, str. 1512-1519). W celu zredukowania zapalenia w astmie zaleca się także odczulanie lub immunoterapię ekstraktami spodziewanych alergenów (McFadden i Austen op. Cit.; Jacquemin i Saint-Remy (1995) Ther. Immunol. 2:41-52).

Płytki miażdżycowe tętnic

Miażdżyca tętnic jest postępującym zwężaniem światła (kanału wewnętrznego) tętniczych naczyń krwionośnych wywołanym odkładaniem warstw płytek (tkanek tłuszczowej i włóknistej). Główne komplikacje związane z miażdżycą tętnic obejmują chorobę niedokrwienną serca, zawał mięśnia sercowego, udar oraz zgorzel kończyn i stanowią one ponad połowę rocznej umieralności w Stanach Zjednoczonych.

Naczynia składają się z trzech warstw: błony wewnętrznej, obejmującej śródbłonek i tkankę łączną od strony światła przewodu wewnętrznej błony sprężystej; warstwy środkowej ściany, zawieraPL 203 128 B1 jącej komórki mięśni gładkich oraz w błonie sprężystej naczynia włókien sprężystych a w dużych naczyniach naczyń; oraz przydance naczynia, która jest zewnętrzną warstwą ściany naczynia i obejmuje otoczkę z tkanki łącznej złożonej z fibroblastów, małych naczyń i nerwów. Miażdżyca tętnic może pojawić się w dowolnej tętnicy. W tętnicach wieńcowych może wywoływać ataki serca, w tętnicach mózgu może wywoływać udar, a w tętnicach obwodowych może wywoływać zgorzel kończyn. Miażdżyca tętnic jest złożonym procesem i nie wiadomo dokładnie jak się zaczyna i co ją wywołuje. Jednakże, uważa się, że uszkodzenie śródbłonka jest pierwszym etapem w tworzeniu zmian miażdżycowych i moż e być wywoł ywana przez uszkodzenie hemodynamiczne, hipercholesterolemię , nadciś nienie czy złożoną chorobę odpornościową. Uszkodzenie śródbłonka prowadzi do odkładania cholesterolu i lipidów, zgrubienia błony wewnętrznej, proliferacji komórek mięśni gładkich oraz tworzenia włókien tkanki łącznej. Stopniowo, gromadzenie się złogów tłuszczu oraz proliferacja komórek mięśni gładkich prowadzi do tworzenia płytek, które w końcu zwężają i blokują tętnicę.

Opisywano powstawanie nowych naczyń w błonie wewnętrznej zmian miażdżycowych u ludzi lecz ich rola w postępowaniu miażdżycy tętnic jest niejasna. Moulton i wsp. (1999) Circulation 99:1726-1732; Isner (1999) Circulation 99:1653-1655; Depre i wsp. (1996) Catheterization i Cardiovascular Diagnosis 39:215-220.

Umieralność ogólna w odniesieniu do miażdżycy tętnic i pokrewnych patologii jasno pokazuje, że aktualne leczenie jest niewłaściwe. Najważniejszym czynnikiem wywołującym przypadki miażdżycy jest wysokie stężenie w osoczu krwi cholesterolu w formie lipoprotein o niskiej gęstości. Aktualne sposoby leczenia obejmują leki hamujące system enzymów wątroby syntetyzujący cholesterol.

Natomiast jak opisano w UPSPN 5,837,682 angiotensynę lub fragmenty angiotensyny można zastosować do leczenia niepożądanej angiogenezy. Publikacja WO 00/42735 dotyczy zastosowania kompleksów DNA/kationowy lipid do stymulowania angiogenezy. USPN 5,837,283 dotyczy zastosowania liposomów zawierających substancje zmieniające angiogenezę. Klauber i wsp., ((1997) Cancer Res. 57:81-86) dotyczy Taxolu jako inhibitora mikrotubul. Klauber rozważa zastosowanie Taxolu jako preparatu Cremophor.

Aktualne leczenia-immunologia

Opisane powyżej schematy leczenia mają zróżnicowany stopień powodzenia. Ponieważ poziom sukcesu w wielu przypadkach daleki jest od doskonałego, prowadzone są badania mające na celu znalezienie lepszego leczenia. Jeden z obiecujących obszarów badań odnosi się do działania na system odpornościowy. Dzięki zastosowaniu inżynierii genetycznej i/lub stymulacji chemicznej możliwe jest zmodyfikowanie i/lub stymulowanie odpowiedzi immunologicznych tak, że system odpornościowy jaki posiada organizm leczy chorobę np. przeciwciała niszczące komórki nowotworowe. Taki typ leczenia różni się od opisanych powyżej tym, że wykorzystuje procesy biologiczne do walki z chorobą. Jednakże, leczenie jest stale leczeniem bezpośrednim gdzie wytworzone przeciwciała bezpośrednio atakują komórki nowotworowe. Niniejszy wynalazek może być wykorzystany do leczenia wymagającego zasadniczego odejścia od normalnego leczenia dzięki temu, że niniejszy wynalazek nie wymaga bezpośredniego oddziaływania na komórki nowotworowe, uszkodzone lub zapalne.

Uważa się również, że przynajmniej teoretycznie, możliwe jest leczenie raka czy zapalenia, któremu towarzyszy proces angiogenezy poprzez hamowanie tego procesu angiogenezy. Typowy przykład takiego sposobu myślenia dotyczący tego problemu przedyskutowano w publikacji PCT WO 95/25543, opublikowanej 28 września 1995. Zgłoszenie to opisuje hamowanie angiogenezy poprzez podawanie przeciwciała wiążącego się z antygenem, o którym uważa się, że jest obecny na powierzchni angiogenicznych komórek śródbłonka.

Szczegółowo zgłoszenie opisuje podawanie przeciwciała, które wiąże się z α_νβ₃, który jest receptorem błonowym uważanym za pośredniczący w oddziaływaniach komórka-komórka i komórka-macierz zewnątrzkomórkowa donoszących się zasadniczo do przypadków adhezji komórkowej. Uważa się, że leczenie poprzez blokowanie tego receptora hamuje angiogenezę i w ten sposób może dojść do wyleczenia nowotworu czy zapalenia.

Przedmiotem wynalazku jest liposom zawierający taksan, charakteryzujący się tym, że wspomniany liposom jest liposomem kationowym i zawiera:

(i) co najmniej jeden kationowy lipid w ilości większej niż 5 mol%;

(ii) ewentualnie co najmniej jeden obojętny lipid; i (iii) taksan w ilości mniejszej niż 20 mol%, przy czym zawartość kryształów taksanu w liposomie jest mniejsza niż 10% ilości taksanu.

PL 203 128 B1

Korzystnie liposom według wynalazku zawiera taksan w ilości od 0,5 do 20 mol%, także korzystnie zawiera taksan w ilości od 2,0 mol% do 10 mol%, ewentualnie zawiera taksan w ilości od 1,0 mol% do 5 mol%.

W innym korzystnym rozwiązaniu liposom zawiera co najmniej jeden kationowy lipid w ilości od 20 mol% do 99 mol%, bardziej korzystnie zawiera co najmniej jeden kationowy lipid w ilości od 40 mol% do 98 mol%.

W kolejnym korzystnym rozwiązaniu liposom zawiera co najmniej jeden obojętny lipid w ilości od 1 mol% do 80 mol%, ewentualnie zawiera co najmniej jeden obojętny lipid w ilości od 2 mol% do 50 mol%, lub także korzystnie zawiera co najmniej jeden obojętny lipid w ilości od 40 mol% do 50 mol%.

W innym korzystnym rozwiązaniu liposom zawiera kryształy taksanu w ilości mniejszej niż 5%, lub ewentualnie w ilości mniejszej niż 2%, lub też w ilości mniejszej niż 0,5%.

Zawarty w liposomie według wynalazku wspomniany taksan jest farmaceutycznie akceptowalną pochodną i jest wybrany z paklitakselu, docetakselu, 10-desacetylowego analogu paklitakselu, 3'N-desbenzoilo-3'N-t-butoksykarbonylowego analogu paklitakselu, galaktozowej lub mannozowej pochodnej taksanu, piperazynowej pochodnej taksanu, 6-tio lub sulfanemidowej pochodnej taksanu i taksanu przyłączonego do czą steczki hydrofobowej.

Korzystnie w liposomie według wynalazku taksanem jest paklitaksel, lub także korzystnie taksanem jest docetaksel.

Liposom według wynalazku jest jednowarstwowy i ma średnicę w zakresie 20 nm do 400 nm. Średnica może także wynosić od 50 nm do 300 nm.

Taksan w liposomie według wynalazku jest w lipidowej warstwie bimolekularnej liposomu. Wspomniany taksan może też korzystnie znajdować się w przedziale wodnym liposomu.

Liposom według wynalazku zawiera ponadto wykrywalny znacznik. Korzystnie wykrywalny znacznik jest radioaktywnym znacznikiem, fluorescencyjnym znacznikiem, histochemicznie lub immunohistochemicznie wykrywalną substancją lub wykrywalnym barwnikiem.

Liposom według wynalazku zawiera DOTAP, DOPC i paklitaksel w stosunku molowym 50:47:3.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie liposomu kationowego według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chorób angiogenicznych.

W takim rozwiązaniu wspomniany liposom jest podawany do układu krążenia przez wstrzyknięcie.

Następnym wynalazkiem jest zastosowanie liposomu kationowego według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zmniejszania tworzenia się płytek miażdżycowych. W tym rozwiązaniu wspomniany liposom korzystnie jest podawany do układu krążenia przez wstrzyknięcie.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie liposomu kationowego według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia raka. W tym rozwiązaniu wspomniany liposom jest podawany do układu krążenia przez wstrzyknięcie.

Liposom według wynalazku służy do selektywnego dostarczania czynników do angiogenicznych komórek śródbłonka. Metoda ta wymaga wstrzyknięcia do układu krążenia, a zwłaszcza dotętniczo, liposomów kationowych (lub kompleksów polinukleotyd/lipid), które obejmują lipidy kationowe oraz składnik, który pobudza lub hamuje angiogenezę i/lub obejmuje wykrywalny znacznik. Po podaniu, liposomy kationowe selektywnie wiążą się z angiogenicznymi komórkami śródbłonka co oznacza, że wiążą się z angiogenicznymi komórkami nabłonka dwa lub więcej razy silniej (korzystnie dziesięć i więcej razy silnie) niż wiążą się z odpowiednimi komórkami śródbłonka w spoczynku nie przechodzącymi angiogenezy. Kiedy liposomy (lub kompleksy polinukleotyd/lipid) są już związane z angiogenicznymi komórkami śródbłonka są następnie pobierane przez komórkę śródbłonka i wywierają pożądany efekt. Substancja taka może uszkadzać komórkę śródbłonka, może pobudzać dalszą angiogenezę, pobudzać krzepnięcie i/lub znakowanie komórki śródbłonka tak, że może być wykryta odpowiednimi sposobami. Substancja, która działa na angiogeniczną komórkę śródbłonka może być sekwencją nukleotydową taką jak DNA kodujący białko, które po wyrażeniu pobudza lub hamuje angiogenezę. Sekwencja nukleotydowa korzystnie jest zawarta w wektorze funkcjonalnie będąc połączona z promotorem, który korzystnie jest aktywny jedynie w angiogenicznych komórkach śródbłonka lub który może być aktywowany w tych komórkach poprzez podanie związku, który umożliwia włączenie lub wyłączenie genu poprzez aktywację promotora.

Zastosowanie liposomu kationowego pozwala na zrealizowanie sposobu selektywnego działania na angiogeniczne komórki śródbłonka, tym samym hamującego lub pobudzającego angiogenezę.

Możliwe jest również diagnozowanie miejsca angiogenezy poprzez podawanie liposomów kationowych zawierających wykrywalny znacznik, gdzie liposomy są zaprojektowane tak aby selektywnie

PL 203 128 B1 wiązały się z angiogenicznymi komórkami śródbłonka a nie wiązały się z odpowiadającymi im komórkami śródbłonka które nie przechodzą angiogenezy.

Wynalazek dostarcza liposomów kationowych, które to liposomy zawierają lipidy kationowe oraz związki, mające specyficzne przeznaczenie i są zaprojektowane tak aby hamować lub pobudzać angiogenezę. Związki te mogą być związkami rozpuszczalnymi w wodzie lub mogą łatwo tworzyć zawiesiny wodne lub mogą być lipido-zgodnymi i mogą być włączone w warstwy lipidowe. Wynalazek pozwala na analizowanie angiogenicznych komórek śródbłonka poprzez znakowanie komórek wykrywalnym znacznikiem, tym samym umożliwia oddzielenia angiogenicznych komórek śródbłonka od otaczających komórek dla dalszego hodowania i/lub analizy.

Liposom kationowy według wynalazku pozwala na dostarczenie metody niszczenia niepożądanego guza poprzez dostarczenie cytotoksycznego składnika do angiogenicznych komórek śródbłonka z nowotworu, gdzie składnik ten niszczy angiogeniczne komórki śródbłonka a następnie niszczy komórki guza.

Innym celem wynalazku jest selektywne działanie na angiogeniczne komórki śródbłonka poprzez dostarczanie kompleksu lipid kationowy/DNA do angiogenicznych komórek śródbłonka, gdzie DNA jest przyłączony do promotora, który jest selektywnie aktywowany w środowisku, które jest związane z angiogenicznymi komórkami śródbłonka tzn. promotor nie jest aktywowany w spoczynkowych komórkach śródbłonka.

Liposom kationowy według wynalazku stosowany w kompozycji farmaceutycznej pozwala na redukowanie tworzenia płytek miażdżycowych tętnic w naczyniu krwionośnym poprzez dostarczenie kompleksu lipidu kationowego zawierającego substancję, która redukuje angiogenezę, tym samym redukując tworzenie płytek.

Liposomy kationowe według wynalazku selektywnie wiążą się z angiogenicznymi komórkami śródbłonka z wyższą preferencją (dwa lub więcej razy silniej a korzystnie dziesięć i więcej razy silnie) niż wiążą się z odpowiednimi komórkami śródbłonka nie przechodzącymi angiogenezy.

Korzyścią wynalazku jest to, że liposomy kationowe można stosować do precyzyjnego dostarczania małych ilości toksycznych związków do komórek śródbłonka, które komórki są uszkadzane w taki sposób (np. zabijane), ż e naczynie krwionoś ne jest niszczone lub staje się nieczynne poprzez powstanie w nim skrzepu krwi i następuje przerwanie dostarczania pożywienia do otaczających tkanek, (takich jak komórki guza) co uszkadza tkankę (np. uszkodzenie litego guza).

Inną korzyścią według wynalazku jest to, że liposomy kationowe według wynalazku można stosować do hamowania angiogenezy związanej z nowotworami złośliwymi lub łagodnymi z postępującą angiogenezą.

Liposomy kationowe według wynalazku można zastosować także do dostarczania skierowanego miejscowo, składników pobudzających angiogenezę a tym samym wzmacniających gojenie rany.

Ważną zaletą niniejszego wynalazku jest to, że wiele klas chorób i/lub nieprawidłowości można leczyć bez bezpośredniego leczenia tkanki związanej z nieprawidłowością np. poprzez hamowanie angiogenezy przerwane jest dostarczanie krwi do guza i nowotwór jest zabijany bez jakiegokolwiek bezpośredniego oddziaływania na komórki nowotworu.

Krótki opis rysunków.

Figura 1 jest mikrografią fluorescencyjną pokazującą wychwyt kompleksów DDAB:cholesterol-DNA wyznakowanych CM-DiI o czerwonej fluorescencji w angiogenicznych naczyniach krwionośnych z pęcherzyków jajnikowych normalnej myszy (odcinek skali: 60 μm);

Figura 2 jest mikrografią fluorescencyjną pokazującą wychwyt kompleksów DDAB:cholesterol-DNA wyznakowanych CM-DiI o czerwonej fluorescencji w angiogenicznych naczyniach krwionośnych w skrawku raka trzustki u myszy RIP1-Tag5 naczynia wybarwione lektyną o zielonej fluorescencji (odcinek skali: 40 μm);

Figura 3 jest mikrografią fluorescencyjną w niskim powiększeniu pokazującą niewielkie lub brak wychwytu kompleksów DDAB:cholesterol-DNA wyznakowanych Texas-Red (żółto-pomarańczowe) w naczyniach krwionośnych wysp trzustkowych normalnej myszy (odcinek skali: 150 nm);

Figura 4 jest mikrografią fluorescencyjną w niskim powiększeniu pokazującą wychwyt kompleksów DDAB:cholesterol-DNA wyznakowanych Texas-Red (żółto-pomarańczowe) w naczyniach krwionośnych raka trzustki u myszy RIP1-Tag2 (odcinek skali: 150 nm);

Figura 5 jest mikrografią konfokalną pokazującą niewielki lub brak wychwytu liposomów DOTAP:cholesterol wyznakowanych Texas-Red (czerwono-pomarańczowe) w naczyniach normalnych wysp trzustkowych wybarwionych (zielony) fluorescencyjną lektyną (odcinek skali: 50 nm);

PL 203 128 B1

Figura 6 pokazuje mikrografię konfokalną wychwytu liposomów DOTAP:cholesterol wyznakowanych Texas-Red (czerwono-pomarańczowe) w raku trzustki u myszy RIP1-Tag2. Naczynia wybarwiono poprzez perfuzję fluorescencyjnej lektyny Lycopersicon esculentum (zielony) po wstrzyknięciu dożylnie liposomów (odcinek skali: 50 μm);

Figura 7 pokazuje mikrografię konfokalną wychwytu liposomów DOTAP:cholesterol wyznakowanych Texas-Red (czerwono-pomarańczowe) w raku trzustki u myszy RIP1-Tag2. Naczynia wybarwiono poprzez perfuzję fluorescencyjnej lektyny Lycopersicon esculentum (zielony) po dożylnym wstrzyknięciu liposomów (odcinek skali: 50 μm);

Figura 8 pokazuje mikrografię konfokalną wychwytu liposomów DOTAP:cholesterol wyznakowanych Texas-Red (czerwono-pomarańczowe) w raku trzustki u myszy RIP1-Tag2. Naczynia wybarwiono poprzez perfuzję fluorescencyjnej lektyny z Lycopersicon esculentum (zielony) po dożylnym wstrzyknięciu liposomów. Miejsca możliwego wzrostu naczynia charakteryzuje intensywne pobieranie (odcinek skali: 50 μm);

Figura 9 jest mikrografią konfokalną pokazującą niewielki wychwyt liposomów DOTAP:cholesterol wyznakowanych Texas-Red (czerwono-pomarańczowe) w normalnych naczyniach w tchawicy myszy wolnych od patogenu wybarwionych na zielono fluorescencyjną lektyną (odcinek skali: 50 μm);

Figura 10 pokazuje mikrografię konfokalną wychwytu liposomów DOTAP:cholesterol wyznakowanych Texas-Red (czerwono-pomarańczowe) w angiogenicznych naczyniach krwionośnych w tchawicy myszy z infekcją Mycoplasma pulmonis (odcinek skali: 50 nm):

Figura 11 jest wykresem pokazującym ilość wychwycownych liposomów DOTAP:cholesterol wyznakowanych Texas-Red przez naczynia krwionośne tchawic mysich wolnych od patogenu (normalne) oraz zainfekowanych Mycoplasma pulmonis oszacowaną na podstawie pomiaru intensywności fluorescencji liposomów 4 godz. po wstrzyknięciu dożylnym. Pomiary wykonywano przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 410. Zainfekowane myszy zaszczepiano donosowo organizmami M. pulmonis i badano 4 tygodnie później. Gwiazdki oznaczają różnice znaczące statystycznie (P < 0,05, średnia SE, n=4 myszy na grupę);

Figura 12 jest mikrografią transmisji elektronów pokazującą liposomy DOTAP:cholesterol związane z komórką śródbłonka w tchawicy myszy zainfekowanej M. pulmonis (odcinek skali: 50 μm);

Figura 13 jest mikrografią transmisji elektronów pokazującą liposomy DOTAP:cholesterol pobierane przez komórkę śródbłonka w tchawicy myszy zainfekowanej M. pulmonis (odcinek skali: 80 μm);

Figura 14 jest mikrografią fluorescencyjną pokazującą związanie liposomów kationowych paklitakselowych z komórką śródbłonka wyściełającego tchawicę myszy wolnej od patogenu (panel A) oraz tchawicy myszy zainfekowanej M. pulmonis (panel B).

Szczegółowy opis korzystnych wykonań

Należy odnotować, że zarówno w opisie jak i w załączonych zastrzeżeniach, formy pojedyncze obejmują także formy liczby mnogiej jeśli z kontekstu nie wynika inaczej. Zatem, określenie „liposom obejmuje mieszaniny i duże liczby takich liposomów, określenie „czynnik obejmuje dużą liczbę czynników i ich mieszaniny a określenie „sposób obejmuje jedną lub kilka metod czy etapów opisanego tu typu.

Dopóki nie będzie inaczej zdefiniowane, stosowane tu terminy techniczne i naukowe mają takie samo znaczenie jak powszechnie jest rozumiane przez specjalistów z dziedziny do której należy niniejszy wynalazek.

Definicje

Terminy „traktowanie, „poddawanie działaniu, „traktować i im podobne ogólnie oznacza uzyskiwanie wpływu farmakologicznego i/lub fizjologicznego. Wpływ może być profilaktyczny w znaczeniu całkowitego lub częściowego zapobiegania chorobie czy jej objawom i/lub może być terapeutyczny w znaczeniu częściowej lub całkowitej stabilizacji lub wyleczenia choroby i/lub niepomyślnych skutków przypisywanych chorobie. Stosowany tu termin „traktowanie obejmuje dowolne leczenie choroby ssaków w szczególności człowieka i obejmuje:

(a) zapobieganie pojawienia się choroby czy objawów u pacjenta, który może być predysponowany do choroby czy objawów lecz u którego jeszcze ich nie zdiagnozowano;

(b) hamowanie objawów choroby, tzn. zatrzymanie jej rozwoju lub (c) złagodzenie objawów choroby, tzn. regresji choroby lub objawów.

Stosowany tu termin „sól dopuszczona farmaceutycznie odnosi się do soli, która zapewnia pożądaną aktywność biologiczną związku macierzystego i nie daje żadnych niepożądanych skutków

PL 203 128 B1 toksycznych. Przykłady takich soli obejmują lecz nie wyłącznie (a) sole kwasów utworzone z kwasów nieorganicznych, przykładowo, kwasu chlorowodorowego, kwasu bromowodorowego, kwasu siarkowego, kwasu fosforowego, kwasu azotowego i im podobnym oraz sole utworzone z kwasów organicznych, przykładowo, kwasu octowego, kwasu szczawiowego, kwasu winowego, kwasu bursztynowego, kwasu maleinowego, kwasu fumarowego, kwasu glukonowego, kwasu cytrynowego, kwasu jabłkowego, kwasu askorbinowego, kwasu benzoesowego, kwasu garbnikowego, kwasu pamoikowego, kwasu alginowego, kwasu poliglutaminowego, kwasu naftalenosulfonowego, kwasu naftalenodisulfonowego, kwasu poligalakturonowego; (b) sole z wielowartościowymi kationami takimi jak cynk, wapń, bizmut, bar, magnez, glin, miedź, kobalt, nikiel, kadm i podobne oraz (c) sole utworzone z kationów organicznych wytworzonych z N.N'-dibenzyloetylenodiaminy czy etylenodiaminy i (d) kombinacji (a) i (b) czy (c) np. soli cynkowej kwasu garbnikowego i podobnych.

Termin „angiogeneza odnosi się do procesu unaczynienia tkanki, który wymaga rozwoju nowych naczyń. Angiogeneza odbywa się dzięki jednemu z trzech mechanizmów: (1) nowego unaczynienia, gdzie komórki śródbłonka migrujące z istniejących wcześniej naczyń zaczynają tworzyć nowe naczynia; (2) waskulogenezy, gdzie naczynia są tworzone z komórek prekursorowych de novo; lub (3) rozprzestrzeniania się naczyń, gdzie istniejące małe naczynia powiększają swoją średnicę tworząc większe naczynia (Blood i wsp. (1990) Biochem. Biophys. Acta. 1032:89-118).

Angiogeneza jest istotnym procesem w normalnych procesach wzrostu noworodka oraz w kobiecym układzie rozrodczym podczas cyklu wzrostu ciałka żółtego (patrz Moses i wsp. (1990) Science 248:1408-10). W normalnych warunkach, wszystkie procesy wymagane do tworzenia nowych czy remodelowania istniejących lub nowych naczyń krwionośnych są procesami samoograniczającymi się i ekspansja specyficznych typów komórek jest kontrolowana i zgodna.

Angiogeneza jest także związana z gojeniem ran oraz z patogenezą dużej liczby chorób klinicznych w tym zapalenie tkanki, zapalenie stawów, astmę, powstawanie nowotworów, retynopatię cukrzycową i inne stany. Objawy kliniczne związane z angiogenezą określane są chorobami angiogenicznymi (Folkman i wsp. (1987) Science 235:442-7).

Wiele eksperymentów sugeruje, ze tkanki mogą wytwarzać czynniki angiogeniczne, które pobudzają angiogenezę w warunkach słabego dostarczania krwi zarówno w warunkach normalnych jak i patologicznych. Czynniki te i związki różnią się specyficznością komórkową i mechanizmami poprzez które indukują wzrost nowych naczyń krwionośnych. Czynniki te działają poprzez różne mechanizmy. Przykładowo, mogą indukować migrację i proliferację komórek śródbłonka lub stymulować produkcję kolagenazy (patrz Klagsbrun i wsp. (1991) nn. Rev. Physiol. 53:217-39). Istnieje szereg testów biologicznych pozwalających na bezpośrednie określenie aktywności angiogenicznych (Wilting i wsp. 1991) Anat. Embriol (BerI) 183:259-71).

Zaproponowano, że inhibitory angiogenezy mogą być przydatne w leczeniu chorób. Przykładowo, zaburzając angiogenezę mogą ograniczać wzrost nowotworu. Zaproponowano szereg sposobów hamowania angiogenezy w tym (1) hamowanie uwalniania czynników angiogenicznych, (2) neutralizację czynników angiogenicznych przy użyciu przeciwciał monoklonalnych i (3) hamowanie odpowiedzi komórek śródbłonka (Folkman i wsp. (1992) Seminars in Cancer Biology 3:89-96), poprzez użycie czynników antyangiogenicznych, cząsteczek o których wiadomo, że hamują angiogenezę. Opisano szereg inhibitorów komórek śródbłonka takich jak inhibitory kolagenazy, inhibitory cyklu metabolicznego błony podstawnej, steroidy angiostatyczne, inhibitory pochodzące z grzybów, faktor 4 z płytek krwi, trombospondyna, leki przeciwko zapaleniu stawów takie jak penicyloamina i interferon alfa, wśród innych (patrz (Folkman i wsp. (1992) Seminars in Cancer Biology 3:89-96; przykładowo patrz Stępień i wsp. (1996) J. Endocrinol. 150:99-106; Maione i wsp. (1990) Science 247:77-9).

Termin „komórki śródbłonka oznacza komórki tworzące śródbłonek, pojedynczą warstwę prostych komórek łuskowatych wyścielających wewnętrzną powierzchnię układu krążenia. Komórki te zachowują zdolność podziału komórkowego chociaż w normalnych warunkach proliferują bardzo wolno, przechodząc podział komórkowy możliwe, że raz w roku. Proliferację komórek śródbłonka można wykazać poprzez znakowanie komórek znajdujących się w fazie S przy użyciu [³H] tymidyny. W normalnych naczyniach ilość wyznakowanych komórek śródbłonka jest wyjątkowo wysoka w punktach rozgałęzień w tętnicach, gdzie wydaje się, że turbulencje i tarcie stymulują obrót metaboliczny. (Goss, (1978) The Physiology of Growth, Academic Press, New York, str. 120-137). Normalne komórki śródbłonka pozostają w stanie spoczynku tzn. nie dzielą się i jako takie są odróżnialne od angiogenicznych komórek śródbłonka jak opisano powyżej.

PL 203 128 B1

Komórki śródbłonka mają także zdolność migracji, procesu ważnego dla angiogenezy. Komórki śródbłonka tworzą nowe kapilary in vivo, tam gdzie istnieje na nie zapotrzebowanie, jak podczas naprawy rany czy tam gdzie istnieje dostrzegalne na nie zapotrzebowanie jak przy tworzeniu nowotworu. Tworzenie nowych naczyń nazywano angiogenezą i wymaga ono cząsteczek (czynników angiogenicznych), które mogą być mitogenami lub chemoatraktantami dla komórek śródbłonka (Klagsburn, powyżej). Podczas angiogenezy, komórki śródbłonka mogą migrować z istniejących kapilar w celu rozpoczęcia tworzenia nowego naczynia (Speidel, Am. J. Anat. 52:1-79). Badania in vitro potwierdzają zarówno proliferację jak migrację komórek śródbłonka; komórki śródbłonka umieszczone w hodowli mogą proliferować i spontanicznie rozwijać się w kapilarne rurki (Folkman i wsp. (1980) Nature 288:551-56).

Terminy „angiogeniczne komórki śródbłonka i „komórki przechodzące angiogenezę oraz im podobne są tu stosowane wymiennie w znaczeniu komórek śródbłonka (jak zdefiniowano powyżej) przechodzących angiogenezę (jak zdefiniowano powyżej). Zatem, angiogeniczne komórki śródbłonka są komórkami śródbłonka, które proliferują z szybkością znacznie przewyższającą tę w normalnych warunkach, gdzie komórki przechodzą podział komórkowy w przybliżeniu raz na rok. Szybkość różnicowania z normalnej proliferacji komórek śródbłonka może być 2x, 5x czy 10x lub więcej niż normalna proliferacja i może różnić się znacząco w zależności od czynników takich jak wiek i stan pacjenta, typ nowotworu, typ rany itp. Różnica w stopniu proliferacji pomiędzy normalnymi komórkami śródbłonka i angiogenicznymi komórkami śródbłonka jest mierzalna i biorąc pod uwagę znaczenie biologiczne dwa typy komórek są rozróżnialne przez niniejszy wynalazek tzn. angiogeniczne komórki śródbłonka są rozróżnialne od odpowiadających, normalnych, w stanie spoczynku komórek śródbłonka ze względu na preferencyjne wiązanie liposomów kationowych.

Terminy „odpowiadające komórki śródbłonka, „normalne lub pozostające w stanie spoczynku komórki śródbłonka oraz podobne są stosowane w odniesieniu do normalnych, spoczynkowych komórek śródbłonka obejmujących ten sam typ tkanki (w normalnych warunkach) gdzie niektóre z komórek śródbłonka przechodzą angiogenezę a niektóre z komórek śródbłonka pozostają w stanie spoczynku. W powiązaniu z niniejszym wynalazkiem. Angiogeniczne komórki śródbłonka są celem preferencyjnym i celuje się w nie pięć razy i korzystnie dziesięć razy więcej niż celuje się w odpowiadające komórki śródbłonka pozostające w stanie spoczynku.

Termin „lipid stosowany jest w znaczeniu konwencjonalnym jako termin ogólny obejmujący tłuszcze, lipidy, rozpuszczalne w alkoholu-eterze składniki protoplazmy, które nie są rozpuszczalne w wodzie. Do lipidów zaliczane są tłuszcze, tłuszcze ciekłe, olejki eteryczne, woski, steroidy, sterole, fosfolipidy, glikolipidy, sulfolipidy, aminolipidy, chromolipidy (lipochromy) i kwasy tłuszczowe. Termin obejmuje zarówno naturalnie występujące lipidy jak i wytwarzane syntetycznie. Korzystnymi lipidami związanymi z niniejszym wynalazkiem są: cholesterol, fosfolipidy, włączając fosfatydylocholiny i fosfatydyletanoaminy oraz sfingomieliny. Gdy są to kwasy tłuszczowe, powinny mieć 12-24 atomów węgla, zawierać do 6 wiązań nienasyconych (wiązania podwójne) i powinny być związane z łańcuchem głównym wiązaniami acylowymi lub eterowymi. Kiedy do łańcucha głównego jest przyłączony więcej niż jeden kwas tłuszczowy, powinny być one różne (asymetryczne) lub może być obecny tylko 1 łańcuch kwasu tłuszczowego np. lizolecytyna. Dopuszczane są także preparaty mieszane, w szczególności niekationowe lipidy pochodzące ze źródeł naturalnych, jak lecytyny (fosfatydylocholiny) oczyszczone z żółtka jaja, wołowego serca, mózgu czy wątroby lub z soji. Interesujące są także steroidy i sterole, w szczególności cholesterol i sterole podstawione w pozycji 3β.

Użyty tu termin „lipid kationowy obejmuje dowolny lipid według wynalazku (jak zdefiniowano powyżej), który jest lipidem kationowym. Lipid jest określany jako kationowy, kiedy ma pozytywny ładunek (w fizjologicznym pH) w czasie pomiaru stosowanym oprzyrządowaniem. Kiedy w lipidzie kationowym obecne są kwasy tłuszczowe powinny mieć 12-24 atomów węgla, zawierać do 6 wiązań nienasyconych (wiązania podwójne) i być związane z łańcuchem głównym wiązaniami acylowymi lub eterowymi; może także występować pojedynczy łańcuch kwasu tłuszczowego podłączony do łańcucha głównego. Kiedy do łańcucha głównego podłączonych jest więcej niż jeden kwasów tłuszczowych, powinny być one różne (asymetryczne). Dopuszczane są także preparaty mieszane.

Termin „liposom obejmuje dowolny kompartment zamknięty przez podwójną warstwę lipidową. Liposomy są także określane jako nośniki lipidowe. W celu utworzenia liposomu cząsteczki lipidowe obejmują wydłużone niepolarne (hydrofobowe) fragmenty oraz fragmenty polarne (hydrofilowe). Hydrofobowe i hydrofilowe fragmenty cząsteczki są korzystnie położone na dwóch końcach wydłużonej struktury molekularnej. Kiedy lipidy takie są rozproszone w wodzie spontanicznie tworzą błony dwuPL 203 128 B1 warstwowe określane jako lamele. Lamele składają się z dwóch jednowarstwowych warstw cząsteczek lipidowych z ich niepolarnymi (hydrofobowymi) powierzchniami stykającymi się jedna z drugą i ich polarnymi (hydrofilowymi) powierzchniami stykającymi się ze środowiskiem wodnym. Błony tworzone przez lipidy otaczają porcję fazy wodnej w sposób podobny jak błona komórkowa otacza zawartość komórki. Zatem, podwójna warstwa liposomowa jest podobna do błony komórkowej bez składników białkowych w błonie komórkowej. Użyty w połączeniu z niniejszym wynalazkiem termin liposom obejmuje multilamelarne liposomy, które ogólnie posiadają średnicę w zakresie 1 do 10 mikrometrów i zawierają dowolną z dwóch do setek koncentrycznych podwójnych warstw lipidowych zmieniających z warstwami fazy wodnej i takż e obejmują jednolamelarne pęcherzyki które zawierają pojedynczą warstwę i zasadniczo posiadają średnicę w zakresie około 20 do około 400 nanometrów (nm), około 50 do około 300 nm, około 300 do około 400 nm, około 100 do około 200 nm, które to pęcherzyki można wytwarzać poddając multilamelarne liposomy działaniu ultradźwięków, przez wyciskanie pod ciśnieniem poprzez błony posiadające pory o zdefiniowanej wielkości lub poprzez homogenizację pod wpływem wysokiego ciśnienia.

Korzystne liposomy obejmujące taksany będą jednolamelarnymi pęcherzykami posiadającymi jedną podwójną warstwę lipidową i średnicę w zakresie 25-400 nm. Korzystne są także pęcherzyki multilamelarne obejmujące taksan i posiadające średnicę w zakresie około 25 do około 400 nm.

Korzystne kompleksy liposomów polinukleotydowych (włączając DNA, RNA i syntetyczne analogi polinukleotydowe) będą wytwarzane z korzystnych liposomów. Będą wytwarzane kompleksy takie, że 1 μg polinukleotydu będzie obecny na każde 1-50 nmoli lipidu kationowego. Kiedy pożądany produkt będzie pochodzić z ekspresji kasetki genomowego DNA, optymalny stosunek polinukleotydu do lipidu kationowego jest wyznaczany doświadczalnie, poprzez wytworzenie serii preparatów w których standardowa ilość DNA jest mieszana z różnymi ilościami liposomu kationowego w zakresie opisanym powyżej. Preparaty te następnie podaje się in vivo i oznacza się określony preparat dający najwyższą ekspresję.

Liposomy kationowe można zdefiniować funkcjonalnie jako posiadające potencjał zeta wyższy ni ż 0 mV.

Użyty tu termin „liposomy kationowe obejmuje dowolny liposom jak określono powyżej, który jest kationem. Liposom jest określony jako kationowy, kiedy jest takim w fizjologicznym pH. Należy zauważyć, że sam liposom jest jednostką, która jest określona jako kationowa w takim znaczeniu, że liposom, który posiada mierzalny pozytywny ładunek w swoim fizjologicznym pH może, w środowisku in vivo, przyłączyć się do innych substancji. Te inne substancje mogą posiadać ładunek negatywny a więc w wyniku czego powstaje struktura nie posiadająca pozytywnego ładunku. Ładunek i/lub struktura liposomu według niniejszego wynalazku w środowisku in vivo nie są precyzyjnie określone. Jednakże, zgodnie z wynalazkiem liposom kationowy według wynalazku będzie wytwarzany przy użyciu co najmniej pewnych liposomów które same są kationowe. Liposom nie musi obejmować całkowicie lipidów kationowych lecz musi obejmować wystarczającą ilość lipidu kationowego, tak, że kiedy liposom jest wytworzony i umieszczony w środowisku in vivo w fizjologicznym pH liposom pierwotnie posiada pozytywny ładunek.

Termin „kompleks sekwencja nukleotydowa/lipid kationowy odnosi się do kombinacji sekwencji nukleotydowej, którą może być sekwencja RNA lub DNA, która jest w połączeniu z co najmniej lipidami kationowymi jak opisano powyżej i może zawierać lipidy neutralne. Po zmieszaniu sekwencji DNA i lipidów kationowych, będą spontanicznie tworzyć kompleksy, które nie są klasycznymi liposomami. Niniejszy wynalazek jest szczególnie skierowany na wytwarzanie specyficznych kompleksów sekwencja nukleotydowa/lipid kationowy, gdzie sekwencja nukleotydowa jest specyficznie przeznaczona do zaburzania działania angiogenicznych komórek śródbłonka. Przykładowo, sekwencja nukleotydowa może kodować białko, które zabija angiogeniczne komórki śródbłonka. Sekwencja jest korzystnie funkcjonalnie połączona z promotorem, który jest selektywnie aktywowany jedynie w środowisku angiogenicznej komórki śródbłonka, tzn. nie jest aktywowany w odpowiadającej, spoczynkowej komórce śródbłonka. Ponadto, kompleks może zawierać sekwencję, która jest sekwencją antysensowną, blokującą ekspresję materiału genetycznego w angiogenicznej komórce śródbłonka i tym samym uszkadza działanie i/lub zabija angiogeniczną komórkę śródbłonka. DNA może być plazmidem lub cząsteczką liniową. Kiedy pożądany jest produkt genu (albo samym transkryptem RNA albo przepisanym na białko) konieczna jest kasetka ekspresyjna, która składa się z sekwencji promotorowej DNA i sekwencji DNA kodującej produkt genu). Przy użyciu antysensów stosowane są w szczególności nukleotydy z wiązaniami innymi niż wiązania fosfodwuestrowe.

PL 203 128 B1

Termin „łączą się z odnosi się do działania liposomów kationowych według wynalazku, które pozostają w wystarczająco bliskiej odległości z angiogenicznymi komórkami śródbłonka przez wystarczająco długi okres czasu, tak, że liposom i/lub jego zawartość dostają się do komórki śródbłonka. Liposomy według wynalazku mogą łączyć się z angiogenicznymi komórkami śródbłonka w różnych warunkach, choć bardziej korzystnie łączą się z angiogeniczną komórką śródbłonka kiedy znajdują się w warunkach in vivo. Zatem, liposomy moż na modyfikować poprzez przyłączanie, wiązanie lub łączenie z innymi cząsteczkami czy materiałami obecnymi w krążeniu krwi przed związaniem z angiogeniczną komórką śródbłonka. Różne siły mogą być odpowiedzialne za związanie liposomów z angiogenicznymi komórkami śródbłonka takie jak niespecyficzne oddziaływania, które pojawiają się pomiędzy dowolnymi dwiema niespokrewnionymi cząsteczkami, tzn. innymi makrocząsteczkami niż ludzka albumina surowicza czy ludzka transferyna. Te międzycząsteczkowe siły można zaklasyfikować do czterech zasadniczych grup (1) elektrostatyczne; (2) wiązanie wodorowe; (3) hydrofobowe; i (4) Van der Waals'a. Siły elektrostatyczne powstają dzięki przyciąganiu pomiędzy grupami jonowymi o przeciwnych ładunkach takimi jak przeciwnie naładowane grupy na liposomie kationowym i grupy obecne na lub w angiogenicznej komórce śródbłonka. Siła przyciągania (F) jest odwrotnie proporcjonalna do kwadratu odległości (d) pomiędzy ładunkami. Siły wiązania wodorowego są dostarczane poprzez tworzenie odwracalnych mostków wodorowych pomiędzy grupami hydrofilowymi. Liposomy według wynalazku mogą zawierać grupy hydrofilowe takie jak -COOH i podobne grupy mogą być obecne na powierzchni komórek śródbłonka jak grupy -OH, -NH2. Siły te w dużym stopniu zależą od bliskiego położenia cząsteczek niosących te grupy. Siły hydrofobowe działają na zasadzie tej samej na jakiej kropelki oleju w wodzie łączą się tworząc pojedynczą dużą kroplę. Zatem, niepolarne grupy hydrofobowe takie jak obecne w liposomach według wynalazku mają skłonność do łączenia się w środowisku wodnym i mogą mieć skłonność do łączenia grupami hydrofobowymi obecnymi na powierzchni komórek śródbłonka. W końcu, są wytwarzane siły Van der Waals'a pomiędzy cząsteczkami, które zależą od oddziaływań pomiędzy zewnętrznymi chmurami elektronowymi.

Użyty tu termin „selektywne łączenie i „selektywne celowanie i podobne opisują właściwości liposomów kationowych według wynalazku, które powodują, że liposomy kationowe łączą się z angiogenicznymi komórkami śródbłonka, w wyższym stopniu niż ma to miejsce w przypadku liposomów kationowych, z normalnymi komórkami śródbłonka nie zaangażowanymi w proces angiogenezy. Zgodnie z wynalazkiem selektywne lub preferencyjne łączenie oznacza, że liposom będzie łączył się w pięć razy wyż szym stopniu z komórkami ś ródbł onka podlegają cym angiogenezie w porównaniu z normalnymi komórkami ś ródbłonka nie podlegającym angiogenezie. Bardziej korzystnie, preferencyjne lub selektywne łączenie wykazuje dziesięć razy lub wyższą selektywność pomiędzy angiogenicznymi komórkami śródbłonka i odpowiadającymi normalnymi komórkami śródbłonka.

Termin „rak odnosi się do choroby z nieodpowiednią proliferacją komórek. Zaburzenie to jest bardziej widoczne klinicznie kiedy masa tkanki nowotworowej upośledza funkcjonowanie ważnych życiowo narządów. Pojęcia opisujące wzrost normalnej tkanki dają się zastosować do tkanki złośliwej ponieważ tkanki normalna i złośliwa mogą mieć podobne cechy charakteryzujące wzrost, zarówno na poziomie pojedynczej komórki jak na poziomie tkanki. Rak jest tak samo chorobą o zaburzonej regulacji wzrostu tkankowego jak zaburzonej regulacji wzrostu komórkowego. Czas podwojenia odnosi się do czasu wymaganego aby tkanka czy nowotwór dwukrotnie powiększyły rozmiar lub liczbę komórek. Czas podwojenia klinicznie widocznego nowotworu jest zazwyczaj znacznie dłuższy niż czas cyklu komórkowego komórek tworzących nowotwór. Jednakże, inaczej niż w nowotworze, normalna wątroba, serce czy płuca u osób dorosłych nie mają czasu podwojenia ponieważ organy te pozostają w ustalonym stanie tak, że szybkość wytwarzania i śmierci komórek jest zrównoważ ona (Stockdale, (1996) „Cancer growth and chemotherapy w: Scientific American Medicine, vol. 3, Scientific American Press, Nowy Jork, str. 12-18). Wzrost nowotworów charakteryzuje się tym, że wytwarzanie nowych komórek przewyższa śmierć komórek; wydarzenia neoplastyczne prowadzą do wywoływania wzrostu u odsetka komórek macierzystych przechodzą cych samo-odnowę i do odpowiadającego spadku u odsetka komórek dojrzewających (McCulloch i wsp., (1982) Blood 59:601-608). Dla każ dej populacji nowotworowej istnieje czas podwojenia i można ustalić krzywą specyficznego wzrostu (Stockdale, powyżej). Wzór wzrostu w nowotworach można opisać poprzez krzywą gompertzjańską (Steel, (1977) Growth kinetics of tumors, Oxford University Press, Inc. Nowy Jork, str. 40), która pokazuje, że w czasie rozwoju raka, szybkość wzrostu jest początkowo bardzo szybka a następnie progresywnie maleje podczas gdy rozmiar wzrasta.

PL 203 128 B1

Załączone figury dostarczają jasnej wizualnej prezentacji wysoce selektywnego sposobu, w którym liposomy kationowe według wynalazku celują do angiogenicznych komórek śródbłonka. Podstawowa postać wynalazku dotyczy sposobu selektywnego oddziaływania na angiogeniczne komórki śródbłonka poprzez podawanie (korzystnie poprzez donaczyniowy zastrzyk, bardziej korzystnie zastrzyk dotętniczy) preparatu obejmującego farmaceutycznie dopuszczony nośnik oraz liposomy kationowe, które zawierają substancję lub DNA/kompleksy kationowe. Substancja może być związkiem, który hamuje angiogenezę, związkiem, który pobudza angiogenezę i/lub wykrywalnym znacznikiem. Liposomy kationowe w preparacie zastrzyku są wprowadzane do angiogenicznych komórek śródbłonka (poprzez endocytozę), wyścielających ściany angiogenicznych naczyń krwionośnych. Liposomy kationowe łączą się na wystarczający okres czasu z angiogenicznymi komórkami śródbłonka i w taki sposób, że liposomy same i/lub zawartość tych liposomów wchodzi do angiogenicznej komórki śródbłonka. Następnie składnik wchodzący do komórki może zahamować lub pobudzić angiogenezę lub po prostu wyznakować komórkę co pozwala na wykrywanie miejsca angiogenezy. Selektywność znakowania angiogenicznych komórek śródbłonka można zrozumieć w odniesieniu do załączonych rysunków.

Fig. 1 pokazuje fragment jajnika myszy posiadającego położony w nim duży okrągły pęcherzyk (na żółto). Ponieważ angiogeneza występuje w normalnym jajniku myszy, liposomy kationowe zawierające wykrywalny znacznik łączą się z angiogenicznymi komórkami śródbłonka rosnących naczyń krwionośnych pęcherzyka (czerwono-pomarańczowe). Jednakże na Fig. 1 nie jest możliwe jasne określenie, czy znacznik jest połączony jedynie z angiogenicznymi komórkami śródbłonka czy jest on połączony z całą tkanką w jajniku i pęcherzyku.

Fig. 2 jest fluorescencyjnym obrazem z mikroskopu elektronowego pokazującym przekrój raka trzustki u myszy której podano donaczyniowo zastrzyk z lipidami kationowymi (czerwono -pomarańczowe) według wynalazku zawierającymi wykrywalny znacznik. Angiogeneza z łatwością zachodzi w nowotworach. Zatem, zdjęcie to dostarcza pewnej wskazówki na to, że liposomy kationowe (czerwono-pomarańczowe) według wynalazku łączą się specyficznie z angiogenicznymi komórkami śródbłonka (zielone). Chociaż wyniki te nie pokazują dramatycznej specyficzności według wynalazku.

Porównanie Fig. 3 i 4 pokazuje zdolność do lokalizowania miejsca angiogenezy jak opisano w wynalazku. Fig. 3 jest zdjęciem pokazującym naczynia krwionośne w tkance normalnej trzustki u myszy. Tam występuje znacznie mniej znacznika w normalnych komórkach śródbłonka niż w odpowiadających angiogenicznych komórkach śródbłonka. Jest to przejrzyście pokazane przy porównaniu Fig. 3 z Fig. 4, która jest zdjęciem raka trzustki u myszy. Fig. 4 przejrzyście pokazuje wysoki stopień akumulacji znacznika (żółto-zielony) zawartego w liposomach kationowych w obszarze nowotworu. Dramatyczna różnica pomiędzy Fig. 3 i Fig. 4 wskazuje na wykorzystanie niniejszego wynalazku do jasnego i precyzyjnego zaznaczania miejsca nowotworu. Jednakże ze względu na to, że zbyt dużo znacznika jest związane angiogenicznymi naczyniami krwionośnymi na Fig. 4, może nie być możliwe pełne oszacowanie specyficzności liposomów kationowych dla preferencyjnie znakowanych angiogenicznych komórek śródbłonka.

Fig. 5 jest zdjęciem naczyń krwionośnych (zielone) w normalnej mysiej wysepce trzustki. Niewielka ilość zabarwienia czerwono-pomarańczowego wskazuje na ograniczone łączenie się lipidów kationowych z normalnymi komórkami śródbłonka wyściełającymi naczynia krwionośne tkanki trzustki.

Specyficzność liposomów kationowych zawierających wykrywalny znacznik jest przejrzyściej pokazana przy porównaniu Fig. 5 z Fig. 6. Fig. 6 jasno pokazuje znacznie wyższy stopień akumulacji znacznika w komórkach śródbłonka angiogenicznych naczyń krwionośnych w nowotworze trzustki u myszy.

Precyzyjna zdolność liposomów kationowych do znakowania angiogenicznych komórek śródbłonka jest dramatycznie pokazana na Fig. 7 i 8. Fig. 7 jasno pokazuje, że znacznik fluorescencyjny jest połączony jedynie z naczyniami krwionośnymi, tzn. znacznik nie przecieka ani nie migruje do otaczającej tkanki. Specyficzność jest dramatycznie pokazana na Fig. 8, która przejrzyście skupia się na liposomach kationowych wykrywanych w angiogenicznych komórkach śródbłonka pokazując, że znacznik jest specyficzny dla tych komórek i nie przecieka ani nie migruje do otaczającej tkanki.

Fig. 9 i 10 pokazują taki sam efekt jak pokazany powyżej lecz w innym modelu angiogenezy. Fig. od 1 do 8 pokazywały tkankę normalną lub rakową. Fig. 9 i 10, odpowiednio, pokazują tkankę normalną i zapalną z tchawicy u myszy. Bardziej szczegółowo, Fig. 9 pokazuje normalne naczynia krwionośne tchawicy np. wolna od patogenu tchawicę myszy. Fig. 10 pokazuje naczynia krwionośne tchawicy z pojawiającą się angiogenezą zaindukowaną infekcją. Wyższe stężenie wykrywalnego

PL 203 128 B1 znacznika na Fig. 10 widocznie wskazuje na to, że liposomy kationowe według wynalazku łączą się selektywnie z angiogenicznymi komórkami śródbłonka - specyficznie związanymi z komórkami śródbłonka tchawicy, w których zaindukowano angiogenezę poprzez infekcję.

Fig. 11 jest wykresem przedstawiającym specyficzność liposomów kationowych pomiędzy ich zdolnością do łączenia się z angiogenicznymi komórkami śródbłonka i odpowiadającymi normalnymi komórkami śródbłonka nie przechodzącymi angiogenezy. Jak pokazano na Fig. 11, liposomy kationowe według wynalazku (w tym doświadczeniu) wykazują w przybliżeniu 10x wyższe powinowactwo do angiogenicznych komórek śródbłonka w porównaniu z odpowiadającymi komórkami śródbłonka nie przechodzącymi angiogenezy.

Fig. 12 i 13 pokazują jak liposomy kationowe według wynalazku wchodzą do angiogenicznych komórek śródbłonka. Na Fig. 12, liposomy kationowe są w kontakcie z powierzchnią angiogenicznej komórki śródbłonka. Na Fig. 13, liposomy kationowe weszły do angiogenicznej komórki śródbłonka na drodze endocytozy i są obecne w komórce.

Fig. 14 pokazuje wychwyt preparatu liposomowego obejmującego paclitaksel w tchawicy wolnej od patogenu i zainfekowanej Mycoplasma pulmonis u myszy a dalej pokazuje, że liposomy kationowe preferencyjnie łączą się z i są pobierane przez angiogeniczne komórki śródbłonka w porównaniu z komórkami śródbłonka nie przechodzącymi angiogenezy.

Liposomy

Liposomy można z łatwością wytwarzać poprzez umieszczanie lipidów (jak określono powyżej) zawierających lipidy kationowe (jak określono powyżej) w roztworze wodnym i mieszanie przez okres czasu od kilku sekund do kilku godzin. Prosta procedura daje dużo multilamelarnych liposomów lub pęcherzyków o średnicy w zakresie od około 1 do 10 mikrometrów. Liposomy te składają się z dwóch lub kilkuset koncentrycznych podwójnych warstw lipidowych, które mogą przeplatać się z warstwami fazy wodnej we wnętrzu której znajdują się te lipidy. Faza wodna może zawierać substancje takie jak składniki hamujące angiogenezę, pobudzające angiogenezę czy wprowadzające wykrywalny znacznik. Substancja ta może być rozpuszczalna w wodzie lub może przynajmniej z łatwością być rozpraszana w wodzie. Alternatywnie substancje takie mogą znajdować się w podwójnej warstwie lipidowej. Substancje zawarte w podwójnej warstwie lipidowej mogą być substancjami hydrofobowymi.

Grubość warstwy wodnej a zatem całkowita ilość fazy wodnej zatrzymanej w liposomie zależy od równowagi sił odpychania elektrostatycznego pomiędzy lipidami z ładunkiem i siłami przyciągania Van der Waals'a pomiędzy podwójnymi warstwami jako całością. Zatem wodna przestrzeń (a więc objętość zatrzymanego materiału wodnego) wzrasta wraz ze wzrastającą proporcją lipidów z ładunkiem w błonie oraz malejącym stężeniem elektrolitów (jonów z ładunkiem) w fazie modnej.

Można wytwarzać liposomy o różnych rozmiarach. Utworzone małe liposomy czy pęcherzyki są jednolamelarne i posiadają wielkość w zakresie od około 20 do 400 nanometrów i mogą być wytwarzane poprzez poddawanie multilamelarnych pęcherzyków działaniu ultradźwięków, przez wyciskanie pod ciśnieniem poprzez błony posiadające pory o zdefiniowanej wielkości lub poprzez homogenizację pod wpływem wysokiego ciśnienia. Większe jednolamelarne liposomy posiadające wielkość średnicy w zakresie od około 0,1 do 1 μm można uzyskać kiedy lipid jest rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym lub w detergencie i rozpuszczający czynnik jest usuwany przez odparowanie czy dializę. Fuzja mniejszych jednolamelarnych liposomów metodami wymagającymi określonych lipidów czy ścisłych warunków dehydratacja-hydratacja może dawać jednolamelarne pęcherzyki tak duże jak komórka czy większe.

W celu utworzenia liposomów kationowych według wynalazku konieczne jest aby liposomy były wytwarzane przy użyciu przynajmniej jakiegoś lipidu kationowego. Jednakże liposomy kationowe według wynalazku nie muszą składać się wyłącznie z lipidów kationowych. Przykładowo, przy użyciu lipidów neutralnych w ilości około 45% i lipidów kationowych w ilości około 55% można wytworzyć lipidy kationowe, które są przydatne w związku z wynalazkiem i korzystnie znakują angiogeniczne komórki śródbłonka.

Liposomy kationowe według wynalazku, mogą zawierać substancję która wpływa na angiogenezę i mogą ponadto obejmować fluorofor czy inny znacznik i/lub czynnik rozpuszczalny w kompartmencie wodnym. Wytwarzanie liposomów kationowych obejmujących substancję, która wpływa na angiogenezę i/lub znacznik można przeprowadzić przy użyciu wielu standardowych metod, za pomocą których, przykładowo, roztwory propanu 1,2-dioleoilo-3-trimetylo amonowego (DOTAP), cholesterolu i Texas Red DHPE (N-(5-dimetyloaminonaftaleno-1-sulfonylo)-1,2-diheksadekanolilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina) są mieszane, odparowywane do sucha i powłoka lipidowa jest następnie poddaPL 203 128 B1 wana rehydratacji w 5% dekstrozie w celu wytworzenia pęcherzyków multilamelarnych (MLVs). Pęcherzyki takie są wyciskane przez filtry z błony poliwęglanowej co daje pęcherzyki jednolamelarne. Liposomy i substancje, które mają być zawarte, przykładowo DNA plazmidowy, są razem mieszane w określonym stosunku w roztworze 5% dekstrozy czy innej fizjologicznie dopuszczalnej zaróbki. Przydatne lipidy kationowe obejmują: DDAB, bromek dimetylodioktadecylu amonowego; siarczan metylu N-[1-(2,3-Dioloiloksy)propylo]-N,N,N-trimetyloamonowy; propany 1,2-diacylo-3-trimetyloamonowe, (włączając lecz nie jedynie dioleoil (DOTAP), dimirystoil, dipalmitoil, disearoil); propany 1,2-diacylo-3-dimetyloamonowe, (włączając lecz nie jedynie dioleoil, dimirystoil, dipalmitoil, disearoil); DOTMA, chlorek N-[1-[2,3-bis(oleoiloksy)]propylo]-N,N,N-trimetyloamonowy; DOGS, dioktadecyloamidoglicylospermina; DC-cholesterol, 3e-[N-(N',N'-dimetyloaminoetano)karbamoilo]- cholesterol; DOSPA, trifluorooctan 2,3-dioleoiloksy-N-(2(sperminokarboksyamido)etylo)-N,N-dimetylo-1-propanoaminiowy; 1,2-diacylo-sn-glicero-3-etylofosfocholiny (włączając lecz nie jedynie dioleoil (DOTAP), dilauroil, dimirystoil, dipalmitoil, distearoil, palmitoilo-oleoil); cholesterol β-alanylowy; CTAB, bromek amoniowy cetylu trimetylu; diC14-amidyna, N-t-butylo-N'-tetradecylo-3-tetradecyloaminopropionoamidyna; 14Dea2, chlorek dietanoloaminy O,O'-ditetradekanolilo-N-(trimetyloamonioacetylowej); DOSPER, 1,3-dioleoiloksy-2-(6-karboksy-spermilo)propyloamid; jodek N,N,N',N'-tetrametylo-N,N'-bis(2-hydroksyloetylo)-2,3-dioleoiloksy-1,4-butanodiamonowy; pochodne chlorku 1-[2-acyloksy)etylo]2-alkilo(alkenylo)-3-(2-hydroksyetylo)imidazoliniowego jak chlorek 1-[2-(9(Z)-oktadekenoiloksy)etylo]-2-(8(Z)-heptadekenylo-3-(2-hydroksyetylo)imidazoliniowy (DOTIM), chlorek 1-[2-(heksadakenoiloksy)etylo]-2-pentadecylo-3-(2-hydroksyetylo)imidazoliniowy (DPTIM); chlorek 1-[2-tetradekanoiloksy)etylo]-2-tridecylo-3-2(2-hydroksyetylo)imidazolinowy (DMTIM) - jak opisano w Solodin i wsp. (1995) Biochem. 43:13537-13544; związki pochodne czwartorzędowej soli amonowej 2,3-dialkiloksypropylu, zawierające cząstkę hydroksyalkilową w czwartorzędowej aminie, takie jak bromek 1,2-dioleilo-3-dimetylohydroksyetylu amonowego (DORI); bromek 1,2-dioleiloksypropylo-3-dimetylo-hydroksyetylu amonowego (DORIE); bromek 1,2-dioleiloksypropylo-3-dimetylohydroksypropylu amonowego (DORIE-HP); bromek 1,2-dioleiloksypropylo-3-dimetylohydroksybutylu amonowego (DORIE-HB); bromek 1,2-dioleiloksypropylo-3-dimetylohydroksypentylu amonowego (DORIE-HPe); bromek 1,2-dimirystyloksypropylo-3-dimetylohydroksyetylu amonowego (DMRIE); bromek 1,2-dipalmityloksypropylo-3-dimetylohydroksyetylu amonowego (DPRIE); bromek 1,2-disteryloksypropylo-3-dimetylo-hydroksyetylu amonowego (DSRIE) - JAK OPISANO NP. W Felgner i wsp. (1994) J. Biol. Chem 269:2550-2561. Wiele wspomnianych powyżej lipidów jest dostępnych handlowo w np. Avanti Polar Lipids, Inc.; Sigma Chemicals Co.; Molecular Probes. Inc.; Northerm Lipids, Inc.; Roche Molecular Biochemicals oraz Promega Corp.

Liposomy kationowe wytwarzane są z samych lipidów kationowych lub w domieszkach z innymi lipidami, w szczególności z neutralnymi lipidami takimi jak: cholesterol; 1,2-diacylo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy, (włączając lecz nie wyłącznie dioleoil (DOPE), 1,2-diacylo-sn-glicero-3-fosfocholiny; naturalną cholinę fosfatydylu (PC) z żółtka oraz podobne; syntetyczne choliny mono- i diacylowe (np. cholinę fosfatydylową monoacylu (MOPC) i fosfoetanoloaminy. Mogą być także włączone asymetryczne kwasy tłuszczowe, zarówno syntetyczne jak naturalne oraz preparaty mieszanin powyższych pochodnych diacylowych.

Liposomy opisanego powyżej typu oraz innych typów, można użyć według niniejszego wynalazku z liposomami zawierającymi substancję, która albo pobudza albo hamuje angiogenezę i/lub zawiera wykrywalny znacznik. Jednym z przykładów liposomów według wynalazku są liposomy kationowe zawierające rozpuszczalną w lipidzie lub rozpuszczalną w wodzie substancję, która hamuje angiogenezę. Składniki rozpuszczalne w lipidzie mogą znajdować się w podwójnej warstwie lipidowej. Poniżej dostarczony jest opis inhibitorów angiogenezy.

Czynniki hamujące angiogenezę

Heparyna wzmacnia angiogenezę i antagoniści heparyny mogą blokować odpowiedź angiogeniczną. Protamina, białko wiążące heparynę, wykazuje właściwości anty-angiogeniczne (Tylor i wsp. (1982) Nature 297:307-312) lecz nie jest przydatna klinicznie ponieważ wiadomo, że u ludzi wywołuje po podaniu reakcje anafilaktyczne. Innym czynnikiem anty-angiogenicznym jest białko wiążące heparynę, Major Basic Protein, które jest także wysoce toksyczne i dlatego nie jest stosowane u ludzi. Jednakże, ze względu na wysoki stopień selektywnego celowania uzyskanego według niniejszego wynalazku te i inne składniki hamujące angiogenezę lecz uważane za zbyt toksyczne dla użycia terapeutycznego u ludzi mogą być z powodzeniem przydatne ponieważ mogą być stosowane w bardzo małych ilościach.

PL 203 128 B1

Czynnik płytkowy krzepliwości 4 (PF4) wykazuje zarówno aktywność wiązania heparyny jak właściwości anty-angiogeniczne a ponieważ nie jest toksyczny tak jak inni antagoniści heparyny jest przydatny klinicznie. Chemiczne modyfikacje PF4, jak opisano w patencie USA nr 5112946, wzmacniają właściwości anty-angiogeniczne PF4. Modyfikacje te obejmują wytwarzanie analogów PF4 zmodyfikowanych poprzez ich wolne grupy aminowe fluoresceino-izotiocjanianem, mutanty PF4 ze specyficznie zmienioną budową strukturalną białka oraz produkcję fragmentów PF4, które zachowują właściwości anty-angiogeniczne. W szczególności, wzmocnioną aktywność angiogeniczną wykazują syntetyczne 13 aminokwasowe peptydy odpowiadające końcowi karboksylowemu PF4.

Wykazano, że różne steroidy hamują angiogenezę. Ta anty-angiogeniczna aktywność jest wzmocniona poprzez dodanie heparyny lub cząsteczek pokrewnych (Folkman i wsp. (1989) Science

243:1490-3). Tak zwane „steroidy angiostatyczne jak tetrahydrokoryzon mają zdolność blokowania angiogenezy i in vivo. Jako szczególnie silny stosowany był steroid angiostatyczny 6a-fluoro-17,21dihydroksy-16e-metylo-pregna-4,9-(11)-dieno-3,20-dion.

Wykazano, ze angiogenezę hamują leki modulujące metabolizm kolagenu. Analogi proliny specyficznie hamują syntezę kolagenu i hamują angiogenezę in vivo. Szczególnie anty-angiogeniczną aktywność w związku z nadającą aktywnością wykazują kwas L-azetydyno-2-karboksylowy (LACA), cis-hydroksyprolina (CHP), D,L-3,4-dehydroprolina (DHP) oraz tioprolina (TP) (Ingber i wsp. (1988) Lab. Invest. 59:44-51). Każdy z tych analogów wzmacnia także anty-angiogeniczny wpływ steroidów angiostatycznych oraz heparyny.

Ludzka trombospondyna, glikoproteina znaleziona w granulach alfa płytek krwi, hamuje angiogenezę w postaci trimeru, tetrameru czy fragmentów, jak opisano w patencie USA nr 5192744. Każda działa w formie glikozylowanej i wydaje się, że działa w formie nieglikozylowanej. Właściwości hamowania angiogenezy zaprezentowano przy pomocy delecji domeny wiążącej heparynę związanej z końcem aminowym i domeny wiążącej płytki znalezionej na końcu karboksylowym monomerycznego białka.

Peptydy wykazujące aktywność lamininy blokują angiogenezę i zapobiegają tworzeniu nadmiaru naczyń krwionośnych w tkance. Specyficznymi peptydami posiadającymi taką aktywność są: 1) tyrozyna-izoleucyna-glicyna-seryna-arginina; 2) prolina-aspartan-seryna-glicyna-arginina; i 3) cysteina-asparaginian-prolina-glicyna-tyrozyna-izoleucyna-glicyna-seryna-arginina. Wydaje się, że peptydy te wykazują swoją aktywność anty-angiogeniczną w formie cyklicznej.

Inne przykłady substancji hamujących angiogenezę obejmują ekstrakty z tkanki chrzęstnej wykazującej aktywność kolagenazy, białko pochodzącego z komórek układu siateczkowo-śródbłonkowego ((1985) Arch. Ophthalmol. 103:1870-1875), czynnik antynowotworowy indukowany w hodowlach komórek chrzęstnych (Takigawa i wsp. (1988) Protein, Nucleic Acids and Enzyme, 33:1803-7), leki przeciwzapalne jak indometacyna (Peterson i wsp. (1986) Anticanser Res. 6:251-3), inhibitory rybonukleaz (Shapiro i wsp. (1987) PNAS 84:2238-41), kompleksy polisacharydu siarkowego i peptydoglikanu np. JPA-S63 (1988)-119500), preparaty złota przeciw zapaleniu stawów, herbimycyna A (JPA-S63 (1988)-295509) oraz białka METH-1 i METH-2 (Vazquez i wsp. (1999) J. Biol. Chem. 274:23349-23357) oraz pochodne fumagiliny czy fumagilolu. Szereg pochodnych fumagilolu ma właściwości hamujące angiogenezę jak ujawniono w patencie USA nr 5202352. Powyższe referencje są włączone poprzez odniesienia w celu opisania i ujawnienia inhibitorów angiogenezy.

Taksany

Wynalazek dalej dostarcza liposomy kationowe, które zawierają taksany jako czynniki antyangiogeniczne. Liposomy takie mogą hamować angiogenezę i są zatem przydatne w leczeniu nowotworów, przewlekłych zapaleń oraz innych chorób związanych z angiogenezą.

„Taksany obejmują paklitaksel, jak również dowolne pochodne taksanu czy pro-leki, tak długo jak obserwowana jest wymagana aktywność tzn. angiogeneza w naczyniu krwionośnym hamowana jest przynajmniej około 2 razy, bardziej korzystnie przynajmniej około 5 razy, bardziej korzystnie przynajmniej około 10 razy jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej około 50 razy czy więcej w porównaniu z angiogenezą w naczyniu krwionośnym nie kontaktowanym z preparatem lipidu kationowego zawierającym taksan.

Specjaliści z łatwością mogą ocenić, stosując różne znane metody czy angiogeneza jest zahamowana. Metody takie obejmują, lecz nie wyłącznie, metody wymagające inwazji syntetycznej macierzy, in vitro czy in vivo, poprzez naczynia krwionośne w odpowiedzi na substancję, która pobudza angiogenezę (tzn. substancję pro-angiogeniczną), np. test typu „chorioallantoic membrane; test typu „cornea pocket oraz testy hamujące proliferację komórek śródbłonka. Metody takie opisano w literatuPL 203 128 B1 rze w tym, między innymi, Vazquez i wsp. (1999). Biol. Chem. 274:23349-23357 oraz Belotti i wsp.

(1996) Clin. Cancer Res. 2:1843-1849.

Taksan może zostać włączony do podwójnej warstwy lipidowej liposomu, może być obecny w kompartmencie wodnym liposomu lub w obu. Zgodnie z tym, w niektórych wykonaniach, wynalazek dostarcza liposom kationowy obejmujący lipidy kationowe oraz taksan w podwójnej warstwie lipidowej. W niektórych z tych wykonań, liposom kationowy dodatkowo obejmuje taksan w kompartmencie wodnym. W innych wykonaniach, wynalazek dostarcza liposomy kationowe obejmujące lipidy kationowe oraz taksan w kompartmencie wodnym. Taksany, które mogą występować w kompartmencie wodnym obejmują taksany rozpuszczalne w wodzie (np. pochodne hydroflowe). Taksany, które mogą być wprowadzone do podwójnej warstwy lipidowej liposomu kationowego obejmują taksany hydrofobowe i pochodne taksanów hydrofobowych.

Ogólnie, proporcja taksanu w preparatach liposomów kationowych według niniejszego wynalazku jest niższa niż około 20% molowych. W niektórych wykonaniach preparat liposomu kationowego obejmuje taksan w proporcji od około 0,5% molowych do około 20% molowych, w innych wykonaniach od około 2% molowych do około 10% molowych. W innych wykonaniach taksan jest obecny w około 1% molowym do około 5% molowych, a w jeszcze innych wykonaniach od około 1% molowego do 3% molowych. Kiedy taksan jest wprowadzony do liposomu kationowego w proporcji od około 0,5% molowych do około 20% molowych, od około 2% molowych do około 10% molowych, od około 1% molowego do około 5% molowych, od około 1% molowego do około 3% molowych, taksan zasadniczo nie oddziela się od podwójnej warstwy liposomowej i/lub zasadniczo nie tworzy kryształów taksanu w czasie przynajmniej około 0,5 godz., zasadniczo przynajmniej około 1 godz., zasadniczo przynajmniej około 2 godz., zazwyczaj przynajmniej około 24 godz., zazwyczaj przynajmniej około 48 godz. w temp. pomiędzy około 4EC i około 25EC. Wyższe proporcje taksanu można wprowadzać tak długo jak długo taksan nie oddzieli się od podwójnej warstwy liposomowej i/lub nie utworzy kryształów taksanu. Liposomy kationowe obejmujące taksan nie zawierają „zasadniczo kryształów taksanu, tzn. taksan obecny w liposomie kationowym zasadniczo w ilości poniżej około 10%, zazwyczaj poniżej około 5%, zazwyczaj poniżej około 2%, typowo poniżej około 1% i korzystnie poniżej około 0,5% jest w formie kryształów. Liposom kationowy, w którym taksan nie oddziela się od podwójnej warstwy lipidowej jest taki, w którym zasadniczo mniej niż 20%, zazwyczaj mniej niż 10%, zazwyczaj mniej niż 5%, typowo mniej niż 1% i korzystnie mniej niż około 0,5% taksanu oddzieliło się od podwójnej warstwy liposomowej.

Proporcja lipidu kationowego w preparacie liposom-taksan zasadniczo jest większa niż około 5% molowych, zazwyczaj większa niż około 10% molowych, bardziej typowo większa niż około 20% molowych. W niektórych wykonaniach, lipid kationowy jest obecny w preparacie liposom-taksan w proporcji od około 20% molowych do około 99% molowych. W innych wykonaniach, lipid kationowy jest obecny w proporcji od około 30% molowych do około 80% molowych, w innych wykonaniach od około 40% molowych do około 98% molowych a w innych wykonaniach od około 40% molowych do około 60% molowych. Poniżej opisane są kompozycje liposomowe stosowne do użycia przy dostarczaniu taksanu. Taksan może być także podłączony do hydrofobowej cząstki organicznej, takiej jak kwas tłuszczowy, fosfolipid i im podobnym i wprowadzony do liposomu. Takie pochodne taksanu zostały opisane i są stosowne do użycia według niniejszego wynalazku. Patrz, np. patent USA nr 5580899. Opisano preparaty fosfatydylocholiny zawierające taksol (patent USA nr 5683715).

Preparaty liposomu kationowego obejmujące taksan mają większe powinowactwo, preferencyjnie wiążą się i są wychwytywane przez komórki śródbłonka w naczyniach krwionośnych przechodzących angiogenezę (tzn. angiogeniczne komórki śródbłonka), tzn. liposomy kationowe obejmujące taksany są wychwytywane (tak, że taksan wchodzi do komórki) przez angiogeniczne komórki śródbłonka w ilości większej przynajmniej około 2 razy, bardziej korzystnie przynajmniej około 5 razy, bardziej korzystnie przynajmniej około 10 razy lub więcej niż ilość pobierana przez nie przechodzące angiogenezy komórki śródbłonka. Porównanie to jest zasadniczo wykonane na podstawie komórka do komórki, tzn. przeprowadzone jest bezpośrednie porównanie pomiędzy pobieraniem przez angiogeniczną komórką śródbłonka i komórką śródbłonka nie przechodzącą angiogenezy. Przykładowo, test określający stosunek wychwytu przez angiogeniczne versus nieangiogeniczne komórki śródbłonka przeprowadzany jest ex vivo, np. komórki są znakowane w zwierzętach in vivo, usuwane ze zwierząt, badane ex vivo pod kątem wychwytu preparatu liposomu kationowego. Przykład stosownej metody badania dostarczony jest w Przykładzie 5. W teście tym, zwierzę jest traktowane substancją znaną jako indukująca angiogenezę. Komórki śródbłonka są kontaktowane z preparatem liposom kationowy/taksan,

PL 203 128 B1 który obejmuje znacznik różny od znacznika stosowanego do znakowania wszystkich komórek śródbłonka. Po odpowiednim czasie, wszystkie komórki śródbłonka są wyznakowane fluorescencyjnym znacznikiem. Zwierze można poddać perfuzji środkiem utrwalającym przed, jednocześnie lub po wyznakowaniu komórek śródbłonka. Po odpowiednim czasie (np. od 1 min. do około 2 godz.) komórki śródbłonka są usuwane ze zwierzęcia i poprzez bezpośrednie uwidocznienie w mikroskopie konfokalnym porównywana jest proporcja komórek śródbłonka zawierających znacznik związany z preparatem liposom kationowy/taksan z proporcją komórek śródbłonka nie zawierającymi związanych ze znacznikiem liposomu kationowego/taksanu. Tą drogą można wykonać bezpośrednie porównanie komórki-z-komórką pomiędzy wychwytem przez angiogeniczne komórki śródbłonka z nieangiogenicznymi komórkami śródbłonka. To czy liposom kationowy jest preferencyjnie pobierany przez daną komórkę można określić przy użyciu dowolnej znanej metody, włączając użycie wyznakowanych lipidów i mikroskopii fluorescencyjnej, jak opisano w Przykładach. Metody wymagające, np. pomiaru wychwytu w homogenatach całych tkanek, nie są zasadniczo korzystne, ponieważ obecność dużej proporcji komórek nie będących komórkami śródbłonka może redukować sygnał do poziomu tła i tym samym może nie odzwierciedlać dokładnie różnicy pomiędzy wychwytem przez angiogeniczne komórki śródbłonka versus nieangiogeniczne komórki śródbłonka.

Do preparatów liposomu kationowego można wprowadzić lipid neutralny i, kiedy jest on obecny, może być w proporcji do około 1% molowego do około 80% molowych, zasadniczo od około 2% molowych do około 50% molowych, zazwyczaj od około 40% molowych do około 50% molowych. Można wprowadzić dowolny lipid neutralny, włączając, lecz nie wyłącznie, fosfatydyloetanoloaminę, włączając lecz nie wyłącznie, DOPE oraz fosfatydylocholinę, włączając lecz nie wyłącznie, PCjaja, DOPC i MOPC. Można także włączyć mieszaniny fosfatydyloetanoloaminy i fosfatydylocholiny.

Liposomy kationowe obejmujące taksan mogą dodatkowo zawierać wyznakowany znacznik, którego szeroka różnorodność jest znana specjalistom, jak tu opisano.

Przykład 5 dostarcza danych eksperymentalnych pokazujących celowanie do angiogenicznych komórek śródbłonka za pomocą liposomów kationowych zawierających paklitaksel. Zatem, w niektórych wykonaniach wynalazek dostarcza liposomy kationowe zawierające paklitaksel. W niektórych wykonaniach liposom kationowy obejmuje DOTAP:fosfatydylocholina jaja (PC):rodamina:DHPE:paclitaksel w stosunku molarnym 50:47:1:2. W innych wykonaniach liposom kationowy obejmuje DOTAP:PC jaja:paklitaksel w stosunku molarnym 50:48:2. W innych wykonaniach liposom kationowy obejmuje DOTAP:DOPC:paklitaksel w stosunku molarnym 50:47:3. W innych wykonaniach liposom kationowy obejmuje DOTAP:DOPE:pakiitaksel w stosunku molarnym 50:47:3. W innych wykonaniach liposom kationowy obejmuje DOTAP:MOPC:paklitaksel w stosunku molarnym 50:47:3.

Paklitaksel działa poprzez stabilizowanie struktur mikrotubularnych poprzez wiązanie z tubuliną. W dzielących się komórkach, może to prowadzić do tworzenia nieprawidłowych wrzecion mitotycznych. Dodatkowo, taksany mogą także posiadać aktywność anty-angiogeniczną (Belotti i wsp. (1996) Clin. Cancer Res. 2:1843-1849 oraz Klauber i wsp. (1997) Cancer Res. 57:81-86). Liposomy kationowe według wynalazku mogą obejmować dowolną substancję, która hamuje angiogenezę, włączając lecz nie wyłącznie, taksan, włączając lecz nie wyłącznie paclitaksel oraz dowolny z opisanych powyżej inhibitorów angiogenezy. Zatem w niektórych wykonaniach dostarczane są kompozycje liposomów kationowych, które obejmują taksan i jeden lub więcej substancji anty-angiogenicznych.

Paklitaksel jest wysoce zderywatyzowanym diterpenoidem (Wani i wsp. (1971) J. Am. Chem. Soc. 93:2325-2327), który uzyskano z zebranej i wysuszonej kory Taxus brevifolia (cis odmiana Pacific) i „Paklitaksel (który obejmuje analogi, preparaty i pochodne takie jak, przykładowo, docetaksel, TAXOLJ, TAXOTEREJ (preparaty docetakselu), 10-deacetylowe analogi paklitakselu i 3'N-desbenzoilo-3'N-t-butoksykarbonylowe analogi paklitakselu) może być z łatwością wytworzony przy użyciu technik znanych specjalistom (patrz także WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/100076; patent USA nr 5294637, 5283253, 5279949, 5274137, 5202448, 5200534, 5229529 oraz EP 590267) czy otrzymany z różnorodnych źródeł komercyjnych włączając przykładowo Sigma Chemical Co., St Louis, Mo (T7402 z Taxus brevifolia czy T-1912 z Taxus yannanensis).

Paklitaksel powinno się rozumieć nie tylko jako powszechną chemicznie dostępną formę paklitakselu lecz także jako analogi (np. taksoter, jak wspomniano powyżej) oraz koniugaty paklitakselu (np. paklitaksel-PEG, paklitaksel-dekstran czy paklitaksel-ksyloza).

Termin „taksan obejmuje także różnorodne znane pochodne, włączając zarówno pochodne hydrofilowe jak pochodne hydrofobowe. Pochodne taksanu obejmują, lecz nie wyłącznie, pochodne

PL 203 128 B1 galaktozowe i mannozowe opisane w Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym WO 99/18113, piperazynowe i inne pochodne opisane w WO 99/14209; pochodne taksanu opisane w WO 99/09021, WO 98/22451 i w patencie USA nr 5869680; pochodne 6-tio opisane w WO 98/28288; pochodne sulfenamidowe opisane w patencie USA nr 5821263 oraz pochodne taksolu opisane w patencie USA nr 5415869. Dodatkowo, termin obejmuje proleki zawierające poklitaksel, włączając te opisane w WO 98/58927; WO/98/13059 oraz w patencie USA nr 5824701.

Dalej termin „taksan obejmuje farmaceutycznie akceptowane sole taksanu.

Mieszaniny taksanów można wprowadzać do liposomów kationowych. Ponadto, liposom kationowy obejmujący taksan może dodatkowo obejmować jeden dodatkowy farmaceutycznie aktywny składnik lub więcej dodatkowych farmaceutycznie aktywnych składników, włączając czynnik (np. inny niż taksan), który hamuje angiogenezę i czynnik antynowotworowy.

Taksany można izolować ze źródeł naturalnych, można syntetyzować chemicznie czy uzyskiwać z komercyjmego źródła. Metody syntezy chemicznej są znane specjalistom, patrz np. patent USA nr 5580899.

Czynniki angiogeniczne

Szereg związków biologicznych stymuluje angiogenezę. Wykazano, że angiogenina jest silnym czynnikiem angiogenicznym w CAM kurczaka czy rogówce królika. Angiotropina, czynnik wyizolowany z monocytów krwi obwodowej, został zaproponowany jako innym czynnik angiogeniczny odgrywają cy rolę w normalnym gojeniu rany (Biochemistry 27:6282 (1988)). Również inne czynniki biorące udział w gojeniu rany takie jak fibryna indukują unaczynianie.

Inną klasą mediatorów angiogenezy są polipeptydowe czynniki angiogeniczne takie jak czynniki wzrostu, które obejmują kwaśne i zasadowe czynniki wzrostu fibroblastów (FGF), transformujący czynnik wzrostu alfa (TGFa) oraz czynnik wzrostu pochodzący z płytek (PDGF). Wykazano, że każda z tych cząsteczek indukuje angiogenezę in vivo. Innymi podobnymi cząsteczkami wykazującymi aktywność angiogeniczną są czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), czynnik martwicy nowotworu alfa (TNFa), transformujący czynnik wzrostu beta (TGFe) oraz czynniki wzrostu wiążące heparynę (HBGF).

Poza polipeptydowymi czynnikami angiogenicznymi opisano też inne czynniki angiogeniczne. Prostaglandyny E1 i E2, które są lipidowymi pochodnymi czynników angiogenicznych są dobrze znane jako przyciągające komórki zapalne posiadające angiogeniczne właściwości ((1982) J. Cancer Inst. 69:475-482)). Nikotynoamid wywołuje odpowiedź angiogeniczną w badaniach na rogówce kurczaka czy w teście w CAM kurczaka (Science 236:843-845 (1987)).

Wykrywalne znaczniki

Liposomy kationowe według wynalazku można użyć do dostarczania wykrywalnych znaczników dowolnego rodzaju. Znaczniki są albo rozpuszczalne w lipidzie stosowanym do wytworzenia liposomów albo są rozpuszczalne czy przynajmniej rozproszone w wodzie czy roztworze wodnym jak wodny roztwór soli czy roztwór dekstrozy. Znacznik może być znacznikiem radioaktywnym, znacznikiem fluorescencyjnym, substancją wykrywaną histochemicznie czy immunohistochemicznie lub wykrywalnym barwnikiem czy substancją wykrywalną przez obrazowanie w rezonansie magnetycznym. Znacznik może być obecny w dowolnej odpowiedniej ilości i może być zawarty w lub skompleksowany sam z liposomem lub wraz z substancją, która hamuje czy pobudza angiogenezę.

Dawkowanie

Ilość angiogenicznego inhibitora czy promotora podawana pacjentowi (którym może być dowolne zwierzę z układem krążenia z komórkami śródbłonka przechodzącymi angiogenezę) będzie się zmieniała w zależności od szerokiego zakresu czynników. Przykładowo, konieczne będzie dostarczanie zasadniczo większych dawek człowiekowi niżeli mniejszemu zwierzęciu. Ilość angiogenicznego inhibitora czy promotora będzie zależeć od rozmiaru, wieku, płci, wagi i innych warunków pacjenta jak również od siły podawanej substancji. Biorąc pod uwagę, że istnieje znaczne zróżnicowanie w określaniu dawki spodziewane jest, że specjaliści w dziedzinie potrafią, stosując niniejsze ujawnienie, z łatwością określić odpowiednie dawkowanie przez pierwsze podanie wyjątkowo małych ilości i zwiększanie dawki do uzyskania pożądanych wyników. Chociaż ilość dawki będzie bardzo zróżnicowana w zależności od czynników opisanych powyżej, ogólnie, niniejszy wynalazek daje możliwość podawania zasadniczo mniejszych ilości dowolnej substancji w porównaniu z systemami dostarczania, które celują w otaczającą tkankę np. celują do komórek nowotworowych.

Kompleksy - sekwencja nukleotydowa/lipid kationowy

Kiedy sekwencje nukleotydowe, włączając sekwencje DNA i RNA, występują w połączeniu z lipidami tworzą kompleksy. Poprzez wybranie określonej ilości sekwencji nukleotydowych i lipidów oraz

PL 203 128 B1 wybór określonych lipidów możliwe jest utworzenie kompleksów, które nie agregują razem in vitro. Ogólne informacje dotyczące tworzenia takich kompleksów opisane są w publikacji PCT WO 93/12240, opublikowanej 24 czerwca 1993, która jest tu włączona jako odnośnik, dla specyficznego ujawnienia i opisu tworzenia kompleksów sekwencja nukleotydowa/lipid. Na użytek niniejszego wynalazku sekwencje nukleotydowe są zaprojektowane tak aby wpływać na angiogeniczne komórki śródbłonka i nie wpływać na inne komórki a konkretnie nie wpływać na inne odpowiadające komórki śródbłonka, tzn. komórki śródbłonka w stanie spoczynku. Sekwencje DNA stosowane w połączeniu z niniejszym wynalazkiem są funkcjonalnie podłączone do promotorów a promotory te są zaprojektowane tak, że ekspresja sekwencji nukleotydowej jest uzyskiwana jedynie w środowisku angiogenicznej komórki śródbłonka. Po pierwsze, promotor może być promotorem aktywowanym, który ulega aktywacji po dostarczeniu sekwencji do angiogenicznej komórki śródbłonka. Bardziej korzystnie, promotor jest tak zaprojektowany, że jest aktywowany w konkretnym środowisku angiogenicznej komórki śródbłonka. Istnieje szereg naturalnie występujących zjawisk w środowisku angiogenicznej komórki śródbłonka, które nie występują w środowisku komórki śródbłonka pozostającej w spoczynku. Korzystając z zalety róż nic pomiędzy tymi dwoma typami komórek, promotor jest konkretnie zaprojektowany tak, aby był aktywowany jedynie w obecności angiogenicznej komórki śródbłonka.

Dzięki użyciu promotora specyficznego genu transkrypcja z kasetek DNA może być ograniczona do jednego lub wąskiego zakresu typów komórek. Komórki śródbłonka selektywnie wyrażają szereg białek dla których znane są geny i ich promotory. Pokazano, że promotory genów dla receptorów flt-1 i flk-1 czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), promotor genu dla czynnika von Willibrandt'a (VWF) oraz promotory genów rodziny te umożliwiają selektywną ekspresję w komórkach śródbłonka kiedy są podłączone do konstruktów genu reporterowego. Następujące publikacje są cytowane w celu ujawnienia i opisu promotorów aktywowanych w angiogenicznych komórkach śródbłonka.

Hatva i wsp. (1996) Am. J. Path. 143:763-75; Strawn i wsp. (1996) Cancer Res. 56:3540-5; Millauer i wsp. (1996) Cancer Res. 56:1615-20; Sato i wsp. (1996) Nature 376:70-4; Ozaki i wsp. (1996) Human Gene Therapy 13:1483-90; Ronicke i wsp. (1996) Circulation Res. 79:277-85; Shima i wsp. (1996) J. Biol. Chem. 271:3877-8; Morishita i wsp. (1995) J. Biol. Chem. 270:27948-53; Patterson i wsp. (1995) J. Biol. Chem. 270:23111-8; Korhonen i wsp. (1995) Blood 86:1828-35. Inne przydatne podejścia wymagają ekspresji kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej (TK) w komórkach śródbłonka a następnie traktowania prolekiem gancyklowirem (Ozaki (1996)).

Alternatywnie, sekwencja nukleotydowa może być sekwencją antysensowną, która będzie wiązała się z sekwencjami, które muszą ulegać ekspresji w angiogenicznej komórce śródbłonka tym samym blokując ekspresję naturalnie występujących sekwencji w angiogenicznej komórce śródbłonka, które są konieczne do przeżycia tej komórki.

Tworzenie się skrzepu

Inny aspekt według wynalazku, który można przeprowadzić przy użyciu liposomów lub kompleksów sekwencja nukleotydowa/lipid wymaga wytworzenia skrzepu krwi. Konkretnie, liposom czy kompleks według wynalazku jest tak zaprojektowany, że ma wpływ na angiogeniczne komórki śródbłonka w wyniku którego tworzą się skrzepy krwi w angiogenicznych naczyniach krwionośnych. Skrzepy krwi zapobiegają wypływu składników odżywczych i tlenu do pozostałości naczynia, co powoduje śmierć naczynia i otaczającej tkanki.

Podstawowa koncepcja tworzenia skrzepów w układzie naczyniowym nowotworu w celu wyeliminowania niepożądanego nowotworu została przeprowadzona przy użyciu przeciwciał celujących do naczyń nowotworu. Dzięki niniejszemu wynalazkowi możliwe byłoby osiągnięcie ulepszonych wyników przy użyciu lipidów kationowych, które to lipidy zawierają czynnik pobudzający kaskadę tworzącą skrzepliny. Przykładowo można tworzyć liposomy kationowe według wynalazku obejmujące czynnik tkanki ludzkiej (TF), który jest głównym białkiem inicjującym tworzenie skrzepliny (kaskada koagulacji krwi).

Komórki rakowe są zależne od dostarczania krwi. Miejscowe przerwanie układu naczyniowego nowotworu będzie prowadzić do lawiny śmierci komórek raka. Śródbłonek naczyń nowotworu pozostaje w bezpośrednim kontakcie z krwią. Jednakże, same komórki nowotworu znajdują się na zewnątrz strumienia krwi i w większej części, są słabo dostępne dla wielu materiałów wstrzykiwanych do układu krążenia. Aspekt ten jak inne aspekty według wynalazku działają w szczególności dobrze dzięki temu, że komórkami docelowymi są angiogeniczne komórki śródbłonka, które same nie podlegają transformacji tzn. są komórkami, o małym prawdopodobieństwie zajścia mutacji, które czynią je opornymi na terapię. W komórkach nowotworowych powstają znaczne mutacje, które często czynią je opornymi na terapię. Wyniki pokazujące zmniejszenie rozmiaru nowotworów przy użyciu przeciwciała ukierunkoPL 203 128 B1 wanego na cel były przedstawiane przez innych: Burrows i Thorpe (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8996-9000 oraz Huang i wsp. (1997) Science 275:547-550.

W celu utworzenia skrzepu w powiązaniu z niniejszym wynalazkiem, korzystne jest utworzenie kompleksu DNA/lipid kationowy. Kompleks będzie zawierać DNA kodujący białko takie jak czynnik tkanki ludzkiej, który jest głównym receptorem inicjującym kaskadę tworzenia skrzepliny (koagulacji krwi). Gen kodujący TF jest korzystnie funkcjonalnie podłączony do promotora aktywowanego w środowisku angiogenicznej komórki śródbłonka i nie aktywowanego w środowisku pozostającej w spoczynku komórki śródbłonka. Zatem lipidy kationowe z kompleksu będą wpływać na łączenie kompleksu z angiogenicznymi komórkami śródbłonka. A następnie kompleks będzie przenoszony do angiogenicznej komórki śródbłonka i DNA z kompleksu będzie wyrażany. Wytworzone białko będzie inicjować kaskadę koagulacji krwi. Kiedy skrzepy krwi są tworzone wewnątrz naczynia dalsze dostarczanie tlenu i składników odżywczych do otaczających komórek nowotworowych będzie odcięte. Po tym komórki nowotworu będą umierać. Różne odmiany czynnika tkanki ludzkiej takie jak skrócony ludzki czynnik tkanki (tTF) także można użyć dla zainicjowania krzepnięcia. Materiał genetyczny kodujący tTF czy inne znane czynniki (patrz powyżej Huang i wsp. odniesienia i publikacje tam cytowane).

Sposoby redukowania płytek miażdżycowych

Wynalazek dalej dostarcza sposoby redukowania płytek miażdżycowych u ssaka poprzez podawanie ssakowi lipidów kationowych i substancji redukującej angiogenezę i pozwolenie na połączenie kompozycji z angiogenicznymi komórkami śródbłonka z angiogenicznego naczynia krwionośnego przez czas i w sposób taki, że kompozycja wchodzi do angiogenicznych komórek gdzie substancja ta redukuje angiogenezę i w wyniku redukcji angiogenezy następuje zmniejszenie tworzenia płytek miażdżycowych. Substancje hamujące angiogenezę są omawiane bardziej szczegółowo gdzie indziej w tekście.

Termin „miażdżyca jest dobrze rozumiany przez specjalistów i oznacza chorobę dużych i średnich tętnic prowadzącej do postępującej akumulacji w błonie wewnętrznej naczyń komórek mięśni gładkich i lipidów. Ciągłe powiększanie się zmiany chorobowej (płytek) narusza inne warstwy ściany naczynia i zmniejsza jego światło. Użyty tu termin „redukujący płytki miażdżycowe oznacza, że płytka miażdżycowa czy zmiana chorobowa ma zmniejszony rozmiar przynajmniej o około 10%, bardziej korzystnie przynajmniej o około 25%, bardziej korzystnie przynajmniej o około 50%, jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej o około 75%, jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej o około 90%, kiedy liposom kationowy według wynalazku zawierający inhibitor angiogenezy jest podawany ssakowi posiadającemu taką zmianę chorobową, w porównaniu z taką płytką miażdżycową w ssaku kontrolnym poddawanym działaniu liposomu kationowego nie zawierającego czynnika anty-angiogenicznego. W niektórych wykonaniach, płytka miażdżycowa jest całkowicie usuwana. Zatem, dla użycia w sposobie redukowania płytki miażdżycowej w osobniku, ,,skuteczna terapeutycznie ilość czy „skuteczna ilość substancji, która hamuje czy redukuje angiogenezę jest taką ilością, że po podaniu osobnikowi zmniejsza wielkość płytki miażdżycowej przynajmniej o około 10%, bardziej korzystnie przynajmniej o około 25%, bardziej korzystnie przynajmniej o około 50%, jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej o około 75%, jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej o około 90% czy więcej, w porównaniu z wielkością utworzonej płytki w osobniku kontrolnym któremu nie podawano substancji.

Ustalenie, czy płytka miażdżycowa została zredukowana, można przeprowadzić za pomocą obrazowania radiograficznego przy użyciu dowolnej znanej metody, włączając opisaną w patencie USA nr 5807536; angiografii, gdzie do naczynia krwionośnego wprowadzany jest cewnik i czynnik kontrastowy, taki jak barwnik na bazie jodu, do obrazowania naczynia krwionośnego oraz obrazowania przy użyciu donaczyniowej sondy ultradźwiękowej. W doświadczeniach ze zwierzętami, sekcje naczynia krwionośnego można badać wizualnie pod kątem redukcji wielkości płytki. Patrz przykładowo, Moulton i wsp. (1999) Circulation 99:1726-1732.

W niektórych wykonaniach sposoby według niniejszego wynalazku prowadzą do redukcji jednej lub większej liczby następstw miażdżycy. Zatem, niniejszy wynalazek dostarcza sposobu redukcji stanów związanych z miażdżycą, włączając lecz nie wyłącznie chorobę niedokrwienną serca, zawał mięśnia sercowego, nawrót zwężenia, udar i choroba naczyń obwodowych. Określenie czy redukcja dotyczy jednego czy kilku stanów chorobowych można przeprowadzić za pomocą typowych metod szacunkowych, włączając lecz nie wyłącznie, oznaczenia elektrokardiograficzne, czy inne metody standardowe w dziedzinie.

Sposoby według niniejszego wynalazku dla redukowania płytki miażdżycowej są przydatne w zapobieganiu, hamowaniu czy zmniejszaniu prawdopodobieństwa nawrotu (ponownego tworzenia) płytki, którą usunięto stosując sposób według wynalazku czy inną metodą taką jak balonowa plastyka

PL 203 128 B1 naczynia czy operacja prowadząca do uzyskania przepływu omijającego wieńcowego. Zatem, w niektórych wykonaniach, sposoby obejmują etap usuwania płytki miażdżycowej z naczynia układu krwionośnego pacjenta; oraz podawanie pacjentowi skutecznej terapeutycznie ilości kompozycji obejmującej liposom kationowy i aktywny składnik hamujący angiogenezę. Kompozycję obejmującą liposom kationowy i aktywny składnik hamujący angiogenezę można podawać przed, w trakcie czy po usunięciu pacjentowi płytki.

Dowolny z liposomów kationowych, czy preparaty obejmujące opisany tu liposom kationowy, w połączeniu z dowolnym znanym inhibitorem (inhibitorami) angiogenezy, włączając te opisane tu, można użyć w metodach redukcji płytki miażdżycowej. Inhibitor angiogenezy-lipid kationowy można wytwarzać z farmaceutycznie dopuszczoną zaróbką. Farmaceutycznie dopuszczone zarobki są znane specjalistom i zostały opisane, przykładowo, w Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (1995) czy w późniejszych wydaniach, Mack Publishing Co., Easton, PA.

Modele doświadczalne angiogenezy

Niniejszy wynalazek ułatwiło wykorzystanie modeli angiogenezy u gryzoni. Przewlekłe choroby zapalne takie jak astma i zapalenie oskrzeli indukują remodelowanie tkanki i naczyń w błonie śluzowej. Do poznania patogenezy przewlekłego zapalenia dróg oddechowych wykorzystano model w którym przewlekłe zapalenie i remodelowanie tkanki występuje w tchawicach szczurów i myszy. Angiogeneza rozwija się w błonie śluzowej dróg oddechowych w wyniku infekcji Mycoplasma pulmonis. W modelu tym, organizmy Mycoplasma pulmonis wywołują trwałą infekcję w śródbłonka tchawicy i oskrzeli. Błona śluzowa dróg oddechowych szczurów zainfekowanych M. pulmonis wykazują szereg różnych nieprawidłowości: 1) zgrubienie śródbłonka i blaszki właściwej; 2) zmiany w kompozycji komórkowej śródbłonka; 3) angiogenezę; 4) wzrost wrażliwości naczyń angiogenicznych na substancje P pośredniczącą w zapaleniu w znaczeniu przepuszczalności plazmy; 5) indukowane substancją P przeciekanie z kapilar jak i z żyłek oraz 6) podniesioną liczbę receptorów dla substancji P (receptory NK1) na włośniczkowych komórkach śródbłonka. W modelu tym, angiogeneza jest pobudzana przez przewlekłe zapalenie i naczynia krwionośne są bardziej podatne na mediatory zapalenia.

Badania prowadzone przy użyciu perfuzji lektyn do barwienia powierzchni blaszki komórki śródbłonka ujawniły wielkość angiogenezy u szczurów z infekcją M. pulmonis. Wiele naczyń typu włośniczkowego jest obecnych w błonie śluzowej tchawicy zainfekowanych szczurów i naczynia te przeciekają po donaczyniowym wstrzyknięciu substancji P pośredniczącej w zapaleniu.

U myszy, M. pulmonis wywołuje ostre zapalenie płuc ze szczytem 6-9 dnia po zaszczepieniu dającym trwałą infekcję dróg oddechowych. Odpowiedź mysz na infekcję M. pulmonis w bardzo dużym stopniu zależy od szczepu: przykładowo myszy szczepu C3H wykazują wyższą umieralność i większą redukcję cytokiny-czynnika nekrotycznego nowotworu α niż szczepu C57BL. Opisano niektóre aspekty remodelowania błony śluzowej, jak rozrost nabłonka w drogach oddechowych myszy zainfekowanych M. pulmonis. W myszach C57BL/6 zainfekowanych donosowym zaszczepieniem M. pulmonis, liczba naczyń w tchawicy wzrasta dramatycznie w sposób widoczny poprzez wzrost nowych włośniczek. W szczepie tym, unaczynienie błony śluzowej tchawicy nie jest dłużej jednopłaszczyznowe i małe naczynia rosną pionowo do płaszczyzny błony śluzowej. Znaleziono szereg widocznych kiełków naczyniowych w regionach o zwiększonym unaczynieniu. Zatem, infekcja myszy C57BL/6 przez M. pulmonis wytwarza przewlekłe zapalenie dróg oddechowych z proliferacją śródbłonka, remodelowaniem naczyń i angiogeneza. Dla kontrastu, u myszy C3H/HeN zainfekowanych przez donosowe zaszczepienie M. pulmonis wzrasta liczba naczyniowych komórek śródbłonka w błonie śluzowej tchawicy lecz nie wzrasta liczba naczyń. Podwyższenie unaczynienia nie jest wynikiem wydłużenia czy wzrostu liczby naczyń lecz zależy od wzrostu średnicy naczynia a wzrost rozmiaru naczynia zależy od podwojenia liczby komórek śródbłonka. Wielkość poszczególnych komórek śródbłonka w zainfekowanych tchawicach nie wzrasta znacząco. Poziom krążących przeciwciał skierowanych przeciwko M. pulmonis jest podobny w obu szczepach myszy. Zatem, zainfekowanie mysz C3H/HeN przez M. pulmonis wytwarza przewlekłe zapalenie dróg oddechowych z remodelowaniem naczyń i proliferacją śródbłonka lecz bez znaczącego wzrostu liczby naczyń, podczas gdy myszy C57BL/6 charakteryzują się proliferacją śródbłonka i wytwarzaniem nowych naczyń.

W drugim modelu, angiogeneza pojawia się w nowotworach powstających w wyniku ekspresji transgenicznej wirusowego onkogenu SV40. Model myszy transgenicznej „RIP-Tag dostarcza możliwości badania zmian fenotypowych w angiogenicznych komórkach śródbłonka w dobrze scharakteryzowanej progresji od normalnej tkanki do nowotworów. W modelu myszy transgenicznej „RIP-Tag, onkogen z wirusa SV40, duży antygen T (Tag) kontrolowany jest przez region promotora insuliny

PL 203 128 B1 szczura (RIP). Po wprowadzeniu do mysiego genomu konstrukt pozwala na indukcję ekspresji Tag specyficznie w wyspach trzustkowych komórek β, które są rozmieszczone w około 400 wyspach rozrzuconych w trzustce. Wszystkie z tych trzustkowych wysp wyrażają u myszy Tag, chociaż wyspy rozwijają się prawidłowo do wieku około 6 tygodni. Po przekroczeniu tego punktu około 50% wysp przechodzi rozrost. Niewielka frakcja takich rozrośniętych wysp (< 5%) rozwija się w nowotwór przez około 10 tygodni. Wydaje się, że zator w nowotworzeniu zostaje ominięty wówczas gdy nabywają zdolności indukowania angiogenezy: dlatego ta faza nowotworzenia została nazwana „włączeniem angiogenezy. Wydaje się, że podobne włączenie angiogenezy istnieje także w innych modelach nowotworzenia u myszy jak w wielu nowotworach ludzkich. Zatem model „RIP-Tag dostarcza scharakteryzowaną podbudowę do badania postępowania angiogenezy w nowotworach.

P r z y k ł a d y

Następujące przykłady przedstawione są w celu dostarczenia specjalistom pełnego ujawnienia i opisu w jaki sposób wytwarzać liposomy kationowe i jak stosować metody z użyciem takich liposomów i nie mają na celu ograniczenia zakresu dotyczącego wynalazku. Skupiono wysiłki na tym aby zapewnić dokładność w odniesieniu do stosowanych liczb (np. ilości, temperatury itd.) lecz niektóre błędy eksperymentalne i odchylenia powinny być uwzględnione. O ile nie podano inaczej, części są częściami wagowymi, masa cząsteczkowa jest masą średniej masy cząsteczkowej; temperatura jest podana w stopniach Celsjusza a ciśnienie jest ciśnieniem atmosferycznym lub bliskim jemu. Należy zauważyć, że każdy podany poniżej Przykład składa się z kilku doświadczeń, które przeprowadzono według procedur a wyniki są podsumowane. Specjaliści zauważą, że nie wszystkie doświadczenia dostarczyły pozytywne wyniki. Jednakże uważa się, że uzyskane wyniki przedstawiono dokładnie.

P r z y k ł a d 1

Rozmieszczenie liposomów kationowych w normalnych myszach

Liposomy i/lub DNA plazmidowy znakowano i określano rozmieszczenie w komórce wyznakowanych kompleksów w różnych okresach czasu po wstrzyknięciu donaczyniowym. Doświadczenia prowadzono na myszach wolnych od patogenu (masa ciała 20-25 g) obu płci.

Małe jednolamelarne pęcherzyki liposomów kationowych wytwarzano z lipidu kationowego DDAB lub DOTAP i lipidu neutralnego DOPE czy cholesterolu, wyznakowanych barwnikiem Texas Red lub karbocjaniną DiI czy CM-DiI o czerwonej fluorescencji a w niektórych przypadkach skompleksowanych z DNA plazmidowym zawierającym gen reporterowy taki jak lucyferaza czy β-galaktozydaza. Komórki śródbłonka znakowano przy użyciu fluorescencyjnej lektyny roślinnej fluoresceinaLycopersicon esculentum. Monocyty/makrofagi znakowano przy użyciu kulek fluorescencyjnych (Duke, 500 nm). Jądra komórkowe barwiono DAPI, YO-PRO czy barwnikiem Hoechst 33342.

Liposomy fluorescencyjne czy kompleksy liposom-DNA zawierające 10-60 μg DNA w do 300 μl wstrzykiwano nie uśpionym myszom przez żyłę ogonową. W niektórych doświadczeniach, 500 nm fluorescencyjnych kulek wstrzykiwano po podaniu kompleksów. Po od 5 min. do 24 godz. zwierzęta usypiano pentabarbitalem sodowym i poddawano perfuzji przez komorę lewą utrwalaczem (1% paraformaldehyd w roztworze soli buforowanym fosforanem) a następnie fluorescencyjną lektyną w celu wyznakowania powierzchni śródbłonka z układu naczyń. Po perfuzji, usuwano tkanki i preparowano albo w postaci całych osadzonych na szkiełku albo pociętych na skrawki przy użyciu Vibratomu lub mikrotomu. Dodatkowo, niektóre próbki poddawano obróbce do mikroskopii elektronowej. Tkanki badano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego. Dodatkowo, niektóre próbki badano w transmisyjnym mikroskopie elektronowym.

Wyniki: W myszach badanych po od 5 min. do 24 godz. po wstrzyknięciu, liposomy czy kompleksy liposom-DNA wyznakowane CM-DiI czy DiI były najobficiej obecne w płucach. Ponadto, największa ich liczba znajdowała się w komórkach śródbłonka włośniczek pęcherzykowych. Fluorescencja we włośniczkach pęcherzykowych była jednolicie rozmieszczona w całych płatach obu płuc. Dodatkowo, część fluorescencji CM-DiI czy DiI znajdowała się w naczyniowych monocytach/makrofagach.

Po płucach, największą liczbę wyznakowanych liposomów czy kompleksów posiadały wątroba czy śledziona. W organach tych, fluorescencja CM-DiI czy Dii lokalizowała się wspólnie z fluorescencyjnymi kulkami. W wątrobie, fluorescencja CM-DiI czy DiI i kulek występowała w komórkach Kupffera. W śledzionie w makrofagach.

Jajnik posiadał naczynia krwionośne mocno wyznakowane liposomami czy kompleksami wyznakowanymi CM-DiI czy DiI. Konkretnie, obserwowano, że komórki śródbłonka w angiogenicznych naczyniach krwionośnych dużych pęcherzyków i ciałka żółtego jajnika myszy pobierały liposomy

PL 203 128 B1

DDAB-cholesterol czy kompleksy liposom-DNA wyznakowane CM-DiI czy DiI po wstrzyknięciu donaczyniowym. Obserwacje te udokumentowano na zdjęciu (Fig. 1). Inne naczynia krwionośne jajnika zawierały stosunkowo mało wyznakowanych kompleksów. Wyniki te posłużyły do ustalenia, że angiogeniczne komórki śródbłonka korzystnie pobierają liposomy i kompleksy liposom-DNA, tzn. że liposomy kationowe stosowane w tym doświadczeniu znacznie bardziej łączyły się z komórką śródbłonka przychodzącą angiogenezę niż z komórkami nie przechodzącymi angiogenezy.

Wyznakowane liposomy czy kompleksy występowały bardzo obficie w komórkach śródbłonka w wysoce śródbłonkowych żyłkach (HEV) węzłów chłonnych czy drogach Peyer'a w jelicie cienkim, podczas gdy są rzadko rozsiane w komórkach śródbłonka włośniczek tych narządów limfoidalnych. Wyznakowane liposomy czy kompleksy były także liczne w włośniczkowych komórkach śródbłonka przedniej przysadki, mięśnia sercowego, przepony, kory nadnerczy i tkanki tłuszczowej.

Wyznakowane liposomy czy kompleksy występowały obficie w monocytach/makrofagach związanych z żyłkami pęcherza moczowego, macicy oraz przewodami jajowodu. Niektóre żyłki zawierały dużą liczbę wyznakowanych monocytów/makrofagów. Dodatkowo, wyznakowane były małe ilości komórek śródbłonka tętniczek, włośniczek i żyłek w tych organach.

Stosunkowo mało wyznakowanych lipidów czy kompleksów było związanych z komórkami śródbłonka włośniczek tylnej przysadki, istoty rdzennej nerki, kosmyków jelitowych (krętnicy), trzustki i rdzenia nadnerczy. Prawie nie znaleziono wyznakowanych liposomów czy kompleksów w komórkach śródbłonka mózgu, tarczycy, korze nerkowej, wyspach trzustki, tchawicy czy oskrzelikach z wyjątkiem przypadkowego monocyta/makrofaga.

Podsumowanie: Preparat liposomów DDAB-cholesterol czy kompleksów liposom-DNA wyznakowanych CM-DiI czy DiI użyty w tych badaniach znakował trzy główne typy komórek: komórki śródbłonka, makrofagi i monocyty. Wychwyt liposomów czy kompleksów było organo- i naczyniospecyficzne. Większość była wychwytywana przez włośniczkowe komórki śródbłonka płuc i makrofagi wątroby i śledziony. Włośniczkowe komórki śródbłonka jajnika, przedniej przysadki, serca, przepony, kory nadnerczy i tkanki tłuszczowej. Naczynia krwionośne wychwytywały liposomy czy kompleksy w jajniku w miejscach gdzie zachodził proces angiogenezy. Dodatkowo, wyznakowane były HEV węzłów chłonnych oraz drogi Peyer'a. Znakowanie komórek śródbłonka czy makrofagów w innych narządach było rzadsze i bardziej zmienne. Naczynia krwionośne mózgu, tarczycy, kory nerkowej, wysp trzustki, tchawicy czy oskrzelików nie były znakowane.

Dodatkowo, doświadczenia udokumentowały, że liposomy czy kompleksy nie wyciekają z układu naczyń w większości narządów. Chociaż, były znajdowane w występujących poza naczyniami komórkach śledziony, która posiada naczynia krwionośne z nieciągłym śródbłonkiem, nie znajdowano ich poza naczyniami w innych narządach.

W końcu, wysoki wychwyt liposomów kationowych i kompleksów liposom-DNA przez naczynia krwionośne dużych pęcherzyków jajnika i ciałka żółtego wskazuje na to, że komórki śródbłonka angiogenicznych naczyń krwionośnych były miejscami preferencyjnego pobierania.

P r z y k ł a d 2

Wychwyt liposomów DDAB:cholesterol czy kompleksów liposom-DNA w myszach RIP-Tag5

Wyniki doświadczeń z Przykładu 1 wskazywały na to, że angiogeniczne naczynia krwionośne w pęcherzykach i ciałku żółtym jajnika mają wysoki wychwyt liposomów kationowych i kompleksów liposom-DNA. Zatem, przeprowadzono doświadczenie w celu określenia czy komórki śródbłonka angiogenicznych naczyń krwionośnych raka wychwytują intensywnie liposomy kationowe czy kompleksy liposom-DNA.

Użyto modelu nowotworów transgenicznych myszy RIP-Tag5. Patrz, Hanahan (1985) Nature 315:115-22; oraz Hanahan i Folkman (1996) Cell 86:353-64. W modelu tym, oznaczonym jako RIPTag, onkogen z wirusa SV40, duży antygen T (Tag), kontrolowany jest przez region promotorowy insuliny szczura (RIP). Po wprowadzeniu do mysiego genomu konstrukt pozwala na indukcję ekspresji antygenu T specyficznie w wyspach trzustkowych komórek β.

Jedną z ważnych właściwości tego modelu jest to, że u każdej myszy RIP-Tag5 obecne są równocześnie różne stadia rozwoju nowotworu, a zatem różne stadia angiogenezy. Chociaż wszystkie z 300-400 wysp wyraża antygen T, wyspy początkowo rozwijają się prawidłowo. Jednakże w wieku 6 tygodni około połowy wysp przechodzi rozrost, a z nich niewielka ilość rozwija się w nowotwór przez 10 tygodni. Nowotworzenie pojawia się wspólnie z angiogenezą. Przekształcenie jest nazywane „włączeniem angiogenezy Folkman i wsp. (1989) Nature 339:58-61 oraz Hanahan i Folkman (1996) Cell

PL 203 128 B1

86:353-64. Wydaje się, że podobne włączenie angiogenezy istnieje w innych modelach nowotworzenia u myszy jak w wielu nowotworach ludzkich, Hanahan i Folkman (1996) Cell 86:353-64.

Stosowano metody i materiały jak w Przykładzie 1. Konkretnie, liposomy DDAB:cholesterol wyznakowane CM-DiI czy DiI wstrzykiwano donaczyniowo do jednej myszy niosącej nowotwór RIP-Tag5 oraz kompleksy DDAB:cholesterol-DNA wyznakowane CM-DiI czy DiI wstrzykiwano donaczyniowo do innej myszy niosącej nowotwór RIP-Tag5. Rozmieszczenie liposomów czy kompleksów angiogenicznych naczyń krwionośnych w rakach komórek wysp trzustki badano 24 godz. po podaniu preparatu i porównywano z naczyniami wysp trzustki normalnych myszy.

Wyniki: Zanotowano dwie nowe obserwacje: (1) liposomy czy kompleksy liposomowe były wychwytywane przez komórki śródbłonka angiogenicznych naczyń krwionośnych bez wyciekania przez śródbłonek oraz (2) wychwyt przez endosomy liposomów czy kompleksów był większy w komórkach śródbłonka angiogenicznych naczyń krwionośnych niż w komórkach śródbłonka normalnych naczyń wysp trzustki (Fig. 2 jest próbką tkanki).

Podsumowanie: Doświadczenie to dało wyniki zgodne z preferencyjnym wychwytem liposomów DDAB:cholesterol czy kompleksów liposom-DNA przez angiogeniczne naczynia nowotworowe. Przed powtórzeniem doświadczenia (1) zwiększono intensywność fluorescencji kompleksów liposom-DNA, (2) ulepszono sposoby lokalizacji miejsc wychwytu liposomów kationowych i kompleksów liposomDNA w rakach myszy RIP-Tag5 oraz (3) uzyskano większe powiązanie pomiędzy struktura i funkcją angiogenicznych naczyń krwionośnych w rakach komórek wysp trzustki w myszach RIP-Tag5.

P r z y k ł a d 3

Wychwyt kompleksów liposomów DDAB:cholesterol-DNA w myszach RIP-Tag2

Cel: Intensywność fluorescencji kompleksów liposom-DNA zwiększono przy użyciu barwnika Texas Red-DHPE w miejsce DiI; ulepszono sposób uzyskiwania trzustkowej lokalizacji miejsc wychwytywania fluorescencyjnych kompleksów liposom kationowy-DNA u myszy RIP-Tag2 i badano strukturę i funkcję angiogenicznych naczyń krwionośnych w rakach komórek wysp trzustki w myszach RIP-Tag2. Z tymi ulepszeniami przeprowadzono doświadczenia opisane w Przykładzie 2 w celu określenia jak są wychwytywane liposomy kationowe i kompleksy lipid-DNA.

Metody: Przygotowano małe jednolamelarne pęcherzyki liposomów kationowych DOTAP:cholesterol, wyznakowane barwnikiem Texas Red-DHPE. Kompleksy liposom-DNA wytwarzano w stosunku całkowity lipid:DNA jak 24:1 (nmoli/ng) w 5% glukozie, przy użyciu 60 ng plazmidowego DNA w 300 nl. Kompleksy (300 nl) wstrzykiwano do żyły ogonowej nie uśpionych myszy RIP-Tag2 C57BL/6 i nie uśpionych normalnych myszy C57BL/6.

Cztery godziny po wstrzyknięciu kompleksów zwierzęta usypiano przez wstrzyknięcie dootrzewnowo Nembutalu 50 mg/kg. Układ naczyń utrwalano przez perfuzję 1% paraformaldehydu poprzez aortę wstępującą i powierzchnię światła układu naczyń barwiono poprzez perfuzję lektyny o zielonej fluorescencji, Thurson i wsp. (1996) Am. J. Physiol. 271:H2547-2562. Całą tkankę osadzono na szkiełku lub osadzano na szkiełku skrawki pocięte przy użyciu Vibratomu Vectashiled i naczynia badano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss Axiophot lub mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 410 wyposażonego w laser kryptono-argonowy i zoptymalizowane fotopowieląjace rurki. Obrazy nagrywano na filmie Kodak Ektachrome (ASA 400) lub jako digitalne pliki obrazów konfokalnych.

Wyniki: Doświadczenie jasno pokazuje wysoki wychwyt kompleksów DOTAP:cholesterol-DNA wyznakowanych barwnikiem Texas Red przez angiogeniczne komórki śródbłonka w rakach trzustki myszy RIP-Tag2. Wychwyt przez naczynia nowotworowe znacznie przewyższa pobieranie kompleksów przez odpowiednie komórki śródbłonka normalnych wysp trzustki (porównaj Fig. 3 i 4) .

Nowotwory można z łatwością odróżnić od przylegających tkanek ponieważ mają silnie wyznakowane swoje naczynia krwionośne kompleksami liposomowymi o czerwonej fluorescencji. Geometria układu naczyń nowotworów jest różna, i ma zakres od typowego wzoru dla normalnych wysp do gęstej, krętej, zespolonej sieci sinusoidalnych naczyń wyraźnie większych i gęściej upakowanych niż normalne wyspy. W dalszym przypadku układ naczyń przypomina ten z ciałka żółtego. Intensywność barwienia naczyń nowotworowych w przybliżeniu odpowiadała wielkości nowotworu. Największe nowotwory były najsilniej wyznakowane. Niektóre naczynia w nowotworach o małej wielkości czy średniej posiadały przysadziste, ogniskowe, podobne do tętniaka wypustki. Miejsca te były szczególnie widoczne ze względu na obecność niezwykle licznych plamek wyznakowanych barwnikiem Texas Red, i przypuszcza się że były to endosomy. Wyznakowanie barwnikiem Texas Red tych miejsc było większe niż w przylegających naczyniach. Wydaje się, że struktury te mogą być pączkami włośniczek.

PL 203 128 B1

Struktur tych nie znaleziono w dużych nowotworach, które posiadały gęsty, kompleksowy układ naczyń, w których naczynia były jednolicie silnie wyznakowane.

Nie ma dowodów na wychodzenie spoza naczyń kompleksów wyznakowanych barwnikiem Texas Red w nowotworach. Także nie obserwowano kompleksów wyznakowanych barwnikiem Texas Red w zgrupowaniach erytrocytów poza naczyniami w nowotworach. Silne wyznakowanie układu naczyń przypomina to dla ciałka żółtego w jajniku we wczesnym stanie jego rozwoju.

P r z y k ł a d 4

Wychwyt liposomów kationowych i kompleksów liposom-DNA przez angiogeniczne naczynia krwionośne w nowotworach i przewlekłych zapaleniach

Cel: Prowadzono doświadczenia opisane w Przykładzie 3 w celu poszerzenia obserwacji na inne modele angiogenezy. Doświadczenia te także miały odpowiedzieć na pytanie czy DNA powinien być obecny w liposomach kationowych do celowania w angiogeniczne naczynia krwionośne. Badano cztery zwierzęce modele angiogenezy dla sprawdzenia czy istnieją preferencje w pobieraniu liposomów DOTAP:cholesterol lub kompleksów liposom-DNA przez angiogeniczne naczynia krwionośne.

Modele: Model nowotworu RIP-Tag2. Wytwarzano myszy transgeniczne C57BL/6 i fenotypowano po urodzeniu przy użyciu analizy PCR. Model myszy opisano powyżej.

Model nowotworu HPV. Wytwarzano myszy transgeniczne HPV (wirus ludzkiej brodawki) i fenotypowano po urodzeniu przy użyciu analizy PCR. Nie transgeniczne odrzuty stosowano jako kontrolę. W modelu tym, onkogen z wirusa ludzkiej brodawki znajdował się pod kontrolą regionu promotorowego keratyny 14. Po wprowadzeniu do mysiego genomu, konstrukt ulegał specyficznie indukowanej ekspresji w komórkach naskórka. Wszystkie myszy transgeniczne rozwijały dysplazję, której towarzyszyła angiogeneza w skórze, wyższych odcinków klatki piersiowej i uszu oraz niewielka ilość rozwiniętych nowotworów.

Model infekcji przy użyciu Mycoplasma pulmonis w myszach. Infekcja daje przewlekłe zapalenie dróg oddechowych której towarzyszyła angiogeneza błony śluzowej dróg oddechowych. Po uśpieniu (87 mg/kg ketaminy i 13 mg/kg ksylazyny wstrzykiwanych dootrzewnowo), wolne od patogenu, 8 tygodniowe samce i samice myszy C3H/HeN lub C57BL/6 (oba szczepy od Charles'a River'a) szczepiono donosowo 3x10⁴ jednostkami tworzącymi kolonie Mycoplasma pulmonis (szczep 5782C-UAB CT7) w objętości 50 μ!. Myszy wolne od patogenów stosowano jako kontrole i szczepiono sterylną pożywką.

Zainfekowane i kontrolne myszy umieszczano oddzielnie w klatkach w ograniczonych warunkach. Na końcu doświadczenia mierzono poziomy przeciwciał dla M.pulmonis w surowicy. Myszy badano 1 do 8 tygodni po infekcji.

Model infekcji przy użyciu Mycoplasma pulmonis w myszach. Tak jak u myszy infekcja wywołuje przewlekłą chorobę dróg oddechowych, której jedną z cech jest angiogeneza błony śluzowej dróg oddechowych. Po uśpieniu (40 mg/kg ketaminy i 8 mg/kg ksylazyny wstrzykiwanych dootrzewnowo), wolne od patogenu, 8 tygodniowe samce szczurów Wistar (od Charles'a River'a) szczepiono donosowo dziennie, przez trzy kolejne dni zawiesiną Mycoplasma pulmonis szczepu 5782C4 w objętości 200 μΚ Szczury wolne od patogenów stosowano jako kontrole i szczepiono pożywką. Zainfekowane i kontrolne myszy umieszczano oddzielnie w klatkach w ograniczonych warunkach. Na końcu doświadczenia mierzono poziomy przeciwciał dla M. pulmonis oraz innych patogenów w surowicy (Microbiological Associates, Bethesda, MD).

Metody: liposomy kationowe DOTAP:cholesterol, wyznakowane barwnikiem Texas Red-DHPE wytwarzano jak opisano w przykładzie 3. Liposomy wstrzykiwano do żyły ogonowej myszy w dawce 360 nmoli całkowitego lipidu w objętości 100 μl w 5% glukozie. Szczury nastrzykiwano przez żyłę udową. Kompleksy liposom-DNA wytwarzano w stosunku całkowity lipid-DNA 24:1 w 5% glukozie, przy użyciu 60 μg DNA plazmidowego w 200-300 μΚ Liposomy lub kompleksy (200-300 μΓ) wstrzykiwano do żyły ogonowej nie uśpionych myszy RIP-Tag2, HPV czy zainfekowanych M.pulmonis. Nie transgeniczne lub wolne od patogenu zwierzęta stosowano odpowiednio jako kontrole.

min. lub 4 godz. po wstrzyknięciu myszy lub szczury usypiano przez wstrzyknięcie dootrzewnowo Nembutalu 50 mg/kg. Układ naczyń utrwalano przez perfuzję 1% paraformaldehydu poprzez aortę wstępującą i powierzchnię światła układu naczyń barwiono poprzez perfuzję lektyny o zielonej fluorescencji, Thurson i wsp. (1996) Am. J. Physiol. 271 :H2547-2562. Całą tkankę osadzono na szkiełku lub osadzano na szkiełku skrawki pocięte przy użyciu Vibratomu naczynia badano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss lub mikroskopu konfokalnego.

Ilość wychwyconych liposomów fluorescencyjnych czy kompleksów określano poprzez mikroskopie konfokalną. Streszczając, serię 12 obrazów konfokalnych oddzielonych o 2,5 um w osi ogniPL 203 128 B1 skowej (z) zbierano w dogłowowym regionie tchawicy w kanałach z fluoresceiną i barwnikiem Texas Red przy użyciu obiektywu 20x NA 0,6 (Zeiss) i standaryzowano ustawienia dla wielkości otworka konfokalnego, wzmocnienia rurki fotopowielacza i siły lasera. Projekcje wytwarzano z serii obrazów pokazujących oddzielnie naczynia (fluoresceina-L.esculantum) i liposomy (Texas Red). Przy użyciu oprogramowania konfokalnego, na obrazach naczyń określano regiony o wielkości średnio 200 μm²a następnie mierzono średnią fluorescencję odpowiednich regionów obrazów liposomów. Intensywność tła ustalano poprzez pomiar fluorescencji w wyselekcjonowanych regionach przylegających do naczyń. Wykonano pomiary na 25 naczyniach na tchawicę i 4 tchawicach na grupę (n=4). Znaczące różnice szacowano testem t Student'a.

Preparaty tkanek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej obrabiano jak opisano wcześniej w McDonald (1994) Am. J. Physiol. 266:L61-L83. Streszczając, po perfuzji pierwszym utrwalaczem (3% glutaraldehyd w 75 mM buforze kokodylanu, pH 7,1, plus 1% sacharoza, 4% PVP, 0,05% CaCl2 i 0,075% H2O2) przez 5 min w temp. pokojowej przeprowadzano perfuzję drugim utrwalaczem (3% glutaraldehyd w 75 mM buforze kokodylanu, pH 7,1 zawierającym 0,05% CaCl2, 1% sacharozę, 4% PVP) przez 5 min. Tkanki pozostawiano do utrwalenia in situ przez 1 godz. w temp. pokojowej a następnie utrwalacz usuwano i pozostawiano przez noc w drugim utrwalaczu w 4°C. Tkanki skrawano żyletką lub cięto przy pomocy mikrotomu do tkanek, po utrwaleniu w osmie (2% OsO4 w 100 mM buforze kokodylanowym, pH 7,4 przez 18 godz. w 4°C), płukano H2O (18 godz. 4°C) i barwiono całość octanem uranylu (wodny roztwór, 37°C przez 48 godz.). Tkanki odwadniano acetonem, infiltrowano i zatapiano w żywicy epoksydowej. Ultra cienki skrawki uzyskiwano poprzez cięcie w ultramikrotomie, osadzano na pojedynczych okienkach z siateczką i badano w mikroskopie elektronowym Zeiss EM-10.

Wyniki: Badania wykazały, że liposomy DOTAP-cholesterol wyznakowane barwnikiem Texas Red przy braku DNA, selektywnie znakują angiogeniczne komórki śródbłonka w rakach myszy RIPTag2, podobnie do wcześniejszych odkryć, DOTAP-cholesterol-DNA wyznakowanych barwnikiem Texas Red i kompleksów DDAB-cholesterol-DNA wyznakowanych DiI. To oraz kolejne doświadczenia na myszach RIP-Tag2 potwierdziły, że pobieranie liposomów kationowych przez angiogeniczne naczynia krwionośne rozrośniętych wysp i nowotworów jest znacznie większe w porównaniu z normalnymi naczyniami (Fig. 5, 6, 7 i 8). W niektórych naczyniach rozrośniętych wysp i małych nowotworów liposomy były wychwytywane przez komórki śródbłonka jedynie regionów ogniskowych (Fig. 8), podczas gdy większe nowotwory wychwytują w sposób bardziej uogólniony (Fig. 6). Regiony ogniskowe pobierania uważane są za miejsca powstawania nowych naczyń (Fig. 8 ).

Ponieważ takie właściwości liposomów kationowych czy kompleksów liposom-DNA mają potencjalne praktyczne znaczenie przy selektywnym dostarczaniu substancji do angiogenicznych komórek śródbłonka wydaje się pożądane określenie czy te właściwości dla angiogenicznych komórek śródbłonka w nowotworach są wspólne dla komórek śródbłonka z innych miejsc patologicznej angiogenezy. Pytanie adresowano do doświadczeń gdzie pobieranie liposomów DOTAP:cholesterol wyznakowanych barwnikiem Texas Red przez angiogeniczne komórki śródbłonka badano w tchawicy myszy z infekcją Mycoplasma pulmonis, która powoduje przewlekłe zapalenie dróg oddechowych, którego jedną z cech jest angiogeneza (porównaj Fig. 9 i 10). Angiogeniczne komórki śródbłonka w regionach przewlekłego zapalenia znaleziono w miejscach zazwyczaj wyższego pobierania liposomów kationowych (Fig. 10). Konkretnie, naczynia w tchawicach myszy zainfekowanych M. pulmonis charakteryzują się zazwyczaj większym pobieraniem. Badania w mikroskopie konfokalnym angiogenicznych naczyń krwionośnych wykazały, że zainfekowane myszy mają 20- do 30- razy większy wychwyt niż kontrole (Fig. 11). Niektóre z naczyń angiogenicznych mają 100 razy wyższy wychwytem. Badania przy użyciu mikroskopii konfokalnej i elektronowej angiogenicznych komórek śródbłonka w myszach zainfekowanych M. pulmonis sugerują, że liposomy kationowe najpierw łączą się z (Fig. 12) a następnie są pobierane do endosomów (Fig. 13).

Podobnie liposomy kationowe były intensywnie wychwytywane przez angiogeniczne naczynia krwionośne w pęcherzykach jajnika i ciałku żółtym u myszy, w dysplastycznej skórze myszy transgenicznych HPV i tchawicach szczurów z angiogeneza związaną z infekcja M. pulmonis.

Podsumowanie: Doświadczenia te potwierdziły, że liposomy kationowe i kompleksy liposomDNA preferencyjnie znakują angiogeniczne komórki śródbłonka nowotworów i miejsc przewlekłego zapalenia.

P r z y k ł a d 5

Wychwyt liposomów kationowych zawierających paclitaksel przez angiogeniczne naczynia krwionośne w przewlekłym zapaleniu

PL 203 128 B1

Myszy C3H/HeN infekowano Mycoplasma pulmonis jak opisano w Przykładzie 4. Kontrolę stanowiły myszy wolne od patogenu. Zainfekowane i kontrolne myszy umieszczano oddzielnie w klatkach w warunkach ograniczenia. Siedem dni po infekcji, myszom wstrzykiwano dożylnie preparat małych jednolamelarnych liposomów złożony z DOTAP:PCjaja:rodamina DHPErpaclitaksel (stosunek molowy 50:47:1:2) w objętości 150 μl (150 μl wstrzykniętych do żyły ogonowej z 10 mM roztworu całkowitego lipidu (zawierającego paclitaksel); całkowita dawka 26 μg paclitakselu na mysz). Dwadzieścia min. po wstrzyknięciu liposomów myszom wstrzykiwano dożylnie lektynę z Lycopersicon esculentum wyznakowaną fluorescencyjnie dla wybarwienia komórek śródbłonka w całym ciele. Natychmiast po tym, myszy poddawano perfuzji poprzez układ naczyniowy utrwalaczem, jak opisano w Przykładzie 4. W ten sposób, liposomy kationowe można było zidentyfikować poprzez ich czerwoną fluorescencję a naczynia krwionośne poprzez ich zieloną fluorescencję. Ilość pobranych fluorescencyjnych liposomów zawierających paklitaksel mierzono przy pomocy mikroskopii konfokalnej skrawków tkanki jak opisano w Przykładzie 4.

Wyniki: Badanie tkanek myszy wolnych od patogenu wykazało, że liposomy kationowe zawierające paklitaksel były intensywnie wychwytywane przez komórki śródbłonka w naczyniach krwionośnych układu oddechowego w tchawicy zainfekowanych myszy. Jak pokazano na Fig. 14 obserwowano niewielkie pobieranie w naczyniach krwionośnych tchawicy nie zainfekowanych myszy. Obserwacje te potwierdzają, że liposomy zawierające paklitaksel mają takie same właściwości celowania jak liposomy bez paklitakselu.

Claims

1. Liposom zawierający taksan, znamienny tym, że wspomniany liposom jest liposomem kationowym i zawiera:

(i) co najmniej jeden kationowy lipid w ilości większej niż 5 mol%;

2. Liposom według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera taksan w ilości od 0,5 do 20 mol%.

3. Liposom według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera taksan w ilości od 2,0 mol% do 10 mol%.

4. Liposom według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera taksan w ilości od 1,0 mol% do 5 mol%.

5. Liposom według zastrz. 1-4, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden kationowy lipid w ilości od 20 mol% do 99 mol%.

6. Liposom według zastrz. 1-6, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden kationowy lipid w ilości od 40 mol% do 98 mol%.

7. Liposom według zastrz. 1-6, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden obojętny lipid w ilości od 1 mol% do 80 mol%.

8. Liposom według zastrz. 1-6, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden obojętny lipid w ilo ś ci od 2 mol% do 50 mol%.

9. Liposom według zastrz. 1-6, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden obojętny lipid w ilo ś ci od 40 mol% do 50 mol%.

10. Liposom według zastrz. 1-9, znamienny tym, że zawiera kryształy taksanu w ilości mniejszej niż 5%.

11. Liposom według zastrz. 1-9, znamienny tym, że zawiera kryształy taksanu w ilości mniejszej niż 2%.

12. Liposom według zastrz. 1-9, znamienny tym, że zawiera kryształy taksanu w ilości mniejszej niż 0,5%.

13. Liposom według zastrz. 1-12, znamienny tym, wspomniany taksan jest farmaceutycznie akceptowalną pochodną i jest wybrany z paklitakselu, docetakselu, 10-desacetylowego analogu paklitakselu, 3'N-desbenzoilo-3'N-t-butoksykarbonylowego analogu paklitakselu, galaktozowej lub mannozowej pochodnej taksanu, piperazynowej pochodnej taksanu, 6-tio lub sulfanemidowej pochodnej taksanu i taksanu przyłączonego do cząsteczki hydrofobowej.

14. Liposom według zastrz. 1-12, znamienny tym, że wspomnianym taksanem jest paklitaksel.

PL 203 128 B1

15. Liposom według zastrz. 1-12, znamienny tym, że wspomnianym taksanem jest docetaksel.

16. Liposom według zastrz. 1-15, znamienny tym, że wspomniany liposom jest jednowarstwowy i ma średnicę w zakresie 20 nm do 400 nm.

17. Liposom według zastrz. 1-15, znamienny tym, że wspomniany liposom jest jednowarstwowy i ma średnicę w zakresie 50 nm do 300 nm.

18. Liposom według zastrz. 1-17, znamienny tym, że wspomniany taksan jest w lip[idowej warstwie bimolekularnej liposomu.

19. Liposom według zastrz. 1-17, znamienny tym, że wspomniany taksan jest w przedziale wodnym liposomu.

20. Liposom według zastrz. 1-19, znamienny tym, że zawiera ponadto wykrywalny znacznik.

21. Liposom według zastrz. 1-20, znamienny tym, że wykrywalny znacznik jest radioaktywnym znacznikiem, fluorescencyjnym znacznikiem, histochemicznie lub immunohistochemicznie wykrywalną substancją lub wykrywalnym barwnikiem.

22. Liposom według zastrz. 1, znamienny tym, że liposom zawiera DOTAP, DOPC i paklitaksel w stosunku molowym 50:47:3.

23. Zastosowanie liposomu kationowego jak zdefiniowano w zastrz. 1-22 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chorób angiogenicznych.

24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że wspomniany liposom jest podawany do układu krążenia przez wstrzyknięcie.

25. Zastosowanie liposomu kationowego jak zdefiniowano w zastrz. 1-22 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zmniejszania tworzenia się płytek miażdżycowych.

26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że wspomniany liposom jest podawany do układu krążenia przez wstrzyknięcie.

27. Zastosowanie liposomu kationowego jak zdefiniowano w zastrz. 1-22 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia raka.

28. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że wspomniany liposom jest podawany do układu krążenia przez wstrzyknięcie.