PL204925B1

PL204925B1 - Sposób mierzenia aktywności syntaz NO, sposób identyfikowania modulatorów syntazy tlenku azotu(II) oraz zastosowanie kationowymiennych membran stanowiących płytki filtracyjne

Info

Publication number: PL204925B1
Application number: PL366053A
Authority: PL
Inventors: Hagen-Heinrich Hennies; Bernd Sundermann
Original assignee: Gruenenthal Gmbh
Priority date: 2000-09-06
Filing date: 2001-09-04
Publication date: 2010-02-26
Also published as: CA2417076C; EP1315832A2; JP2004522417A; HUP0303657A2; NZ525058A; US7045307B2; DE10043845A1; MXPA03001767A; WO2002020831A2; ES2240513T3; WO2002020831A3; HUP0303657A3; EP1315832B1; AU8771101A; PL366053A1; CA2417076A1; US20040002129A1; ATE297472T1; PT1315832E; AU2001287711B2

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu mierzenia aktywności syntaz NO [(syntaz tlenku azotu(II)], odnośnego sposobu identyfikowania modulatorów syntaz NO, zwłaszcza wykorzystania go w metodzie HTS (ang. high throughput screening) i zastosowania odpowiednich kationowymiennych membran stanowiących płytki filtracyjne.

Już od ponad 100 lat wiedza lekarska obejmuje swym zakresem stosowanie nitrogliceryny do leczenia wieńcowych chorób serca. Dopiero jednak od 15 lat rozpoznano, że działanie to należy odnieść do tworzenia tlenku azotu(II) (NO). Od tego czasu znaczenie tej cząsteczki można wyczytać z wciąż zwię kszającej się ilości publikacji. Zwłaszcza z farmakologicznego punktu widzenia dużego znaczenia nabierają szlaki syntezy NO, a w szczególności wykrywanie związków modulujących syntezę NO.

NO tworzony jest przez syntazy tlenku azotu(II) (syn. syntazy NO, EC 1.14.13.39) (w dalszej części niniejszego opisu określane skrótowo jako NOS). Enzymy te katalizują utlenianie Largininy do L-cytruliny i NO poprzez N^G-hydroksyargininę. Syntazy NO w postaci monomerycznej wykazują masę cząsteczkową mieszczącą się w zakresie od 125 do 155 kDa, jednakże aktywne są jedynie w postaci homodimerów. Pod względem budowy cząsteczkowej syntazy NO bardzo przypominają reduktazy cytochromu P450. Znane są różne klasy syntaz NO (izoenzymy):

• NOS indukowane przez cytokiny lub LPS = iNOS, oraz • NOS konstytutywne aktywowane przez Ca²⁺ = cNOS, które dalej dzielą się na nastę pują ce podtypy:

- ś ródbł onkowe NOS = eNOS,

- neuronowe NOS = nNOS.

W odnośnym piśmiennictwie podawane są liczne przykłady sposobów umożliwiających zmierzenie aktywności znanych izoenzymów NOS.

Z tych najbardziej znanych sposobów wymienić można sposoby następujące:

1) Oddzielenie produktu końcowego, cytruliny, przy pomocy chromatografii kolumnowej.

NOS

[³H] L-arginina -> [³H] L-cytrulina + NO

NADPH

Materiał enzymatyczny przeprowadza się po zakończeniu reakcji poprzez oddzielne kolumny wymieniaczy kationowych. Potem następuje elucja [³H]L-cytruliny i oznaczenie eluatu przy użyciu licznika cząstek beta (ang. β-counter). Wada tej metody polega na tym, że dla każdego przypadku użycia enzymu musi być wykonana osobna chromatografia kolumnowa (na przykład, w przypadku 96-jamkowej płytki do mikromiareczkowania (MTP) trzeba użyć 96 kolumn chromatograficznych).

Metoda według: D.S. Bredt i S.H. Snyder, Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 682 (1990).

2) Oznaczenie NO2 przy użyciu odczynnika Griessa.

Oprócz cytruliny, produktem reakcji przeprowadzonej z udziałem NOS (p. reakcja 1) jest także tlenek azotu(II), NO, który jednakże jest nietrwały i od razu wchodzi w dalszą reakcję:

NO + O2 2 NO2

NO2 + H2O NO2^- + NO3^- + 2H+.

Powstały NO3^- trzeba zredukować do NO2^-. Można tego dokonać przez zastosowanie kadmu lub na drodze enzymatycznej, z dodaniem reduktazy azotanowej. Ponieważ obecny w nadmiarze NADPH wywodzący się z użycia NOS, przeszkadza zachodzeniu reakcji Griessa z NO2^-, te równoważniki redukcji należy usunąć. Można to przeprowadzić metodą enzymatyczną, za pomocą wprowadzenia dehydrogenazy mleczanowej/pirogronianu. Po dodaniu odczynnika Griessa (1% sulfanilamid; 0,1% dichlorowodorek naftylenodiaminy; 5% H3PO4) powstaje barwnik azowy o barwie purpurowej, który można oznaczyć przy 543 nm.

Reakcja Griessa ma przebieg następujący:

PL 204 925 B1

Piśmiennictwo: L.C. Green, D.A. Wagner, J. Glogowski, P.L. Skipper, J.S. Wishnok, S.R. Tannenbaum [Anal. Biochem., 126, 131 (1982)].

Wadą tej metody pomiaru jest to, że w celu zrealizowania pomiaru aktywności NOS trzeba przeprowadzić kilka etapów reakcji, przy czym wszystkie te etapy należy zrealizować oddzielnie.

3) Pomiar chemiluminiscencji.

Wytworzony w reakcji z udziałem NOS, oprócz cytruliny, NO reaguje do NO2^- i NO3^- [patrz reakcja 2)]. Jednakże, w celu przeprowadzenia pomiaru chemiluminiscencji należy NO2^- i NO3^- z powrotem przekształcić w NO. Dokonuje się tego na drodze reakcji z ozonem:

NO + O3 NO2* + O2

NO₂* NO₂ + hv.

Piśmiennictwo: A. Archer, FASEB Journal, 7, 349 (1993).

Wadą tej metody jest to, że z jednej strony także i tu trzeba przeprowadzić reakcję kilkuetapową, a z drugiej to, że wskutek swego krótkiego okresu półtrwania ozon potrzebny do zajścia reakcji musi być wytwarzany w sposób bezpośredni.

4) Oznaczenie cGMP przy użyciu cyklazy guanylanowej podatnej na stymulowanie przez NO.

W tym przypadku z ilości cGMP wnioskuje się o aktywnoś ci cyklazy guanylowej. Ponieważ cyklaza guanylowa aktywowana jest przez NO, uwzględniając ilość powstałego NO można wnioskować o aktywności NOS.

Piśmiennictwo: M. Fellisch, E:a: Noack, Eur. J. Pharmacol., 139, 19 (1987); Meyer, Schmidt,

Humbert, Bohme, Biochem. Biophys. Research Commun., 164, 678 (1989).

Wadą tej metody jest to, że chodzi w niej o sprzężoną reakcję enzymatyczną. Pomijając już fakt, że sprzężone reakcje enzymatyczne najczęściej nie umożliwiają zmierzenia szybkości początkowej, substraty dla klarownego liniowego oznaczenia szybkości reakcji muszą występować w stężeniu mieszczącym się w zakresie nasycenia enzymów (~100 Km). Może to stanowić znaczny czynnik kosztowy. W przypadku tej reakcji, zresztą, aktywność cyklazy guanylowej nie jest stała, ponieważ stymulowana jest dopiero przez NO tworzony w trakcie zachodzenia sprzężonej reakcji.

Na podstawie występującego w nowoczesnym doświadczalnictwie farmaceutycznym zapotrzebowania na możliwość przeprowadzenia dużej liczby pomiarów w jak najkrótszym czasie, zwłaszcza przebadania dużej ilości rozmaitych substancji, tak zwanych bibliotek (ang. libraries), w celu wyszukania poszczególnych substancji o możliwej aktywności fizjologicznej, wykorzystuje się wysokowydajne badanie przesiewowe, tak zwaną metodę HTS (ang. high throughput screnning method). Stosuje się w niej metody badania, które nadają się do zautomatyzowania i dają się przeprowadzić w sposób prosty i szybki, a zatem, zwłaszcza, z minimalną tylko ilością prostych, dających się zautomatyzować etapów badawczych, bez manualnych etapów pośrednich. Wystarcza tu tak zwany „proces zgrubny, który musi dostarczyć jedynie odpowiedzi „tak-nie, to też, w tym zakresie pomiary w obrębie liniowej początkowej szybkości reakcji enzymatycznej nie są niezbędnie potrzebne. Czasochłonne manipulacje, takie jak pobieranie podwielokrotnych porcji, dalsze inkubacje ze sprzężonymi reakcjami (enzyma4

PL 204 925 B1 tycznymi), etapy wirowania, nie dające się zautomatyzować, z góry wykluczają pracę w systemie HTS. A jednocześnie, testy muszą być niezawodne, jeśli chodzi o wyniki badań . Dlatego też , dla przeprowadzenia próby metodą HTS rozstrzygające znaczenie ma dokładność testu, a to oznacza, że iloraz sygnału i szumu (ang. „signal-to-noise ratio) powinien być możliwie wysoki, dzięki czemu precyzja wyniku nie musi być okupiona koniecznością wykonywania dwu-, trzy- a nawet czterokrotnych oznaczeń, co byłoby przeciwstawne, skądinąd, wysokiej przepustowości testowania substancji.

Wszystkie poprzednio przytoczone reakcje 1) - 4) nie są kompatybilne z HTS, ponieważ przewidują prowadzenie sprzężonych reakcji enzymatycznych i pobieranie podwielokrotnych porcji, obejmują etapy wirowań, rozdziału na kolumnach chromatograficznych itd., a wszystko to jest sprzeczne z metodą „high throughput screening. Nakład czasu, względnie ilość etapów procesu, konieczne dla uzyskania niezbędnej dokładności, są dla metody HTS zbyt kosztowne, przy czym sposoby te w wysokim stopniu nie są podatne na zautomatyzowanie.

Zadanie niniejszego wynalazku polegało więc na tym, aby opracować uproszczony sposób mierzenia aktywności syntaz NO, zwłaszcza sposób identyfikowania modulatorów syntaz NO. W szczególności, sposób ten powinien nadawać się do wykorzystania w metodzie HTS.

Zadanie to zostało rozwiązane przez opracowanie sposobu mierzenia aktywności syntaz NO, obejmującego następujące etapy:

(a) inkubacja syntazy NO ze znakowaną argininą jako substratem w naczyniu reakcyjnym, (b) oddzielanie znakowanej argininy od znakowanej cytruliny powstałej jako produkt reakcji enzymatycznej, w trakcie trwania reakcji, aż do jej zakończenia, (c) pomiar ilości każdorazowo oddzielonej argininy, polegającego według wynalazku na tym, że oddzielanie następuje poprzez kationowymienną membranę stanowiącą płytkę filtracyjną.

W rozumieniu niniejszego wynalazku, uż ywane w niniejszym opisie poszczególne następujące określania mają poniżej podane znaczenie.

• Inkubacja. Wprowadzenie i pozostawienie materiału biologicznego, w tym przypadku enzymu, NOS, w podłożu, do którego, w określonych warunkach, dodaje się (lub dodano) dalsze związki, takie jak, na przykład, substrat enzymu. Przy tym, dobiera się właściwe (najczęściej zbliżone do fizjologicznych) warunki w celu osiągnięcia określonego skutku, w tym przypadku przebiegu reakcji enzymatycznej, polegającej na katalizowanym przez NOS przekształceniu argininy w cytrulinę i NO. Odpowiednie warunki uzyskuje się, na przykład, za pomocą stosownej regulacji temperatury, pH, doboru koenzymów względnie kofaktorów i/lub czasu reakcji itd.

• Naczynie reakcyjne. Przez okreś lenie to rozumie się naczynie, w którym może przebiegać reakcja chemiczna prowadzona w warunkach kontrolowanych, a także rozdział oparty na wiązaniu lub na innych siłach fizycznych, a więc naczynie takie jak „Eppendorf-cup, płytka Petriego lub butla do hodowli, probówka, probówka wirówkowa lub jamka (ang. „well) znajdująca się w płytce do mikromiareczkowania. Przy tym, naczynie reakcyjne może także być podzielone selektywnie przepuszczalnymi membranami na przedziały i/lub zwłaszcza nie musi być koniecznie zamknięte w sposób nieprzepuszczalny dla cieczy, także od spodu naczynia. Tak więc, naczynia reakcyjne mogą stanowić kolumienki lub płytki do mikromiareczkowania, z jednej strony (najczęściej od spodu) zamknięte selektywnie przepuszczalna membraną, na przykład, membraną stanowiącą płytkę filtracyjną. W jednym i tym samym naczyniu reakcyjnym odbywa się inkubacja (etap a)), jak również, korzystnie, rozdzielanie (etap b)).

• Rozdzielanie. Rozumie się przez to dokonywane w określonym miejscu oddzielenie argininy od cytruliny, w wyniku którego (w przeciwieństwie do stanu, w którym obie te substancje równomiernie, w określonym wzajemnym stosunku ilościowym, występują w środowisku inkubacyjnym) powstają oddzielne obszary, przy czym w jednym z tych obszarów skoncentrowana jest prawie w całości arginina, natomiast cytrulina, w porównaniu z poprzednim swym stężeniem, prawie całkowicie jest nieobecna, utrzymując się w drugim ze wspomnianych obszarów. Rozdział może nastąpić, na przykład, na podstawie fizycznej, przy zastosowaniu filtrów rozdzielających według wielkości cząsteczek lub mas cząsteczkowych, na zasadzie różnic w ładunkach (wymieniacze kationowe, chromatografia, przyłożenie napięcia), albo, na przykład, przez wirowanie. W sposobie według niniejszego wynalazku, rozdział następuje dzięki wykorzystaniu membrany stanowiącej płytkę filtracyjną.

• (Cząsteczka) znakowana. Przez znakowanie rozumie się nadanie cząsteczce cechy mierzalności, na przykład przez sprzężenie jej z inną cząsteczką pomagająca wysłaniu sygnału pomiarowego (na przykład, fluorescencja, luminiscencja, jon metalu), albo dzięki zastosowaniu przy jej syntezie atomów radioaktywnych (znakowanie radioaktywne).

PL 204 925 B1 • W trakcie trwania reakcji, aż do momentu jej zakoń czenia, (tj. do chwili, w której jeszcze wzrasta stężenie cytruliny.

Rozumie się przez to punkt czasowy, do którego reakcja biegnie jeszcze w kierunku tworzenia cytruliny, a więc nie jest to moment osiągnięcia punktu końcowego.

• Mierzenie. Przez mierzenie rozumieć należ y kwantyfikowanie znakowanej substancji przy pomocy odpowiedniego sprzętu.

• Membrana stanowi ą ca pł ytkę filtracyjną . Jest to pł aska membrana, swoista pł ytka filtracyjna, a wię c okreś lona przepuszczalna granica faz, zdolna do tego, aby sączyć pł yny, a zatem zatrzymywać pewne składniki tych płynów. W opisywanym przypadku, jako sposób oddzielania substratu od produktu końcowego wybrano stosowanie membrany stanowiącej płytkę filtracyjną, dzięki czemu w jednym prostym etapie sączenia odbywa się ilościowy rozdział substratu i produktów końcowych, bez konieczności odbierania pojedynczych frakcji elucyjnych. Dzięki temu prostemu „etapowi sączenia uzyskuje się wysoką dokładność przerobu i zbyteczne staje dwu- lub trzykrotne oznaczanie. Dopiero wprowadzenia takiej membrany stanowiącej płytkę filtracyjną umożliwia skuteczne zastosowanie sposobu, na przykład w HTS, a także, ogólnie, przy dokonywaniu prostych i nieskomplikowanych oznaczeń aktywności NOS. Szczególnie korzystnie, jako substratu, używa się znakowanej L-argininy, co prowadzi, między innymi, do tworzenia się L-cytruliny, jako jednego z produktów reakcji. Poza tym, porównanie oznaczeń wartości IC50 różnych znanych inhibitorów NOS, uzyskanych metodą Bredta i Snydera (1990) powyż ej przytoczoną (w pkt. 1 oceny dotychczasowego stanu techniki), a wię c za pomocą „oddzielenia produktu końcowego, cytruliny, przy pomocy chromatografii kolumnowej, i uzyskanych sposobem według niniejszego wynalazku, także i z tego punktu widzenia potwierdza, że sposób według niniejszego wynalazku, pomimo swej prostoty jest precyzyjny i wartościowy i pod względem jakości nieoczekiwanie może w pełni konkurować z kosztowną, standardową metodą Bredta i Snydera (1990). W szczególnie korzystnej postaci wykonania niniejszego wynalazku, omawiany proces przeprowadza się tak, że w co najmniej jednym z naczyń reakcyjnych, do środowiska inkubacyjnego w etapie (a) wprowadza się substancję poddawaną badaniu na to, czy stanowi ona modulator, zwłaszcza aktywator lub inhibitor, korzystnie inhibitor, syntazy NO. W ten sposób, wykonanie objęte jest jednym testem skriningowym (ang. „screening assay), w którym poszczególne substancje zostają przebadane pod względem skuteczności fizjologicznej. Przy tym, przez „modulator rozumie się cząsteczkę wpływającą na zachowanie się (tutaj NOS), zwłaszcza jeśli chodzi o zwiększenie aktywności („aktywator) lub zmniejszenie aktywności („inhibitor), prowadzące do całkowitej blokady.

W szczególności sposób identyfikowania modulatorów syntazy NO obejmuje następujące etapy:

(a) inkubacja poddawanej badaniu substancji, w stosownych warunkach, z syntazą NO i znakowaną argininą jako substratem w jednym i tym samym naczyniu reakcyjnym, (b) oddzielanie znakowanej argininy od znakowanej cytruliny, równocześnie powstałej jako produkt reakcji enzymatycznej, w trakcie trwania reakcji, aż do momentu jej zakończenia, (c) pomiar ilości każdorazowo oddzielonej argininy, polegający według wynalazku na tym, że oddzielenia dokonuje się z zastosowaniem membrany stanowiącej płytkę filtracyjną. Przy tym, przez „substancję poddawana badaniu rozumie się zwłaszcza związek małocząsteczkowy, którego wpływ na aktywność NOS ma zostać zbadany.

W szczególności stosuje się sposób skriningu, przy pomocy którego można, na przykład, zidentyfikować poszczególne substancje wybrane z danej biblioteki (ang. library), stanowiące modulatory NOS, a zatem związki potencjalnie interesujące z farmakologicznego punktu widzenia. Przy tym, przez „substancję poddawana badaniu rozumie się zwłaszcza związki małocząsteczkowe, których wpływ na aktywność NOS ma zostać zbadany. Szczególnie korzystne jest posłużenie się omawianym sposobem do identyfikowania aktywatorów lub inhibitorów, korzystnie inhibitorów, syntaz NO.

Następnie, zgodnie z korzystną postacią wykonania sposobu według niniejszego wynalazku, przy oddzielaniu zgodnie z etapem ((b), z naczynia reakcyjnego usuwa się podłoże inkubacyjne. Przez „podłoże inkubacyjne rozumie się tu podłoże, w którym odbywa się inkubacja zgodnie z etapem (a) i w którym rozpuszczone są: substrat (znakowana arginina), NOS, powstające produkty (a więc znakowana cytrulina i NO) oraz produkty wtórne, oraz koenzymy bądź kofaktory, i które to środowisko, razem z tymi rozpuszczonymi, ewentualnie zawieszonymi w nim substancjami, tworzy „środowisko inkubacyjne zgodnie z etapem (a). Przy tym, szczególnie korzystne jest usunięcie w znacznej mierze, zwłaszcza prawie cał kowite, korzystnie zupełne usunię cie podł oża inkubacyjnego. Rozumie się przez to, zwłaszcza, także usunięcie poprzez membranę stanowiącą płytkę filtracyjną, przy czym „w znacznej mierze oznacza, że pozostały tylko niewielkie, kroplowe ilości podłoża,

PL 204 925 B1 „prawie całkowite oznacza, że tylko membrana stanowiąca płytkę filtracyjną zawiera jeszcze nieznaczną ilość podłoża inkubacyjnego, a „zupełne oznacza, że podłoże zostało usunięte albo przez wymycie z membrany stanowiącej płytkę filtracyjną, albo za pomocą suszenia. Następnie, korzystnie przy usuwaniu podłoża inkubacyjnego oddziela się od podłoża inkubacyjnego znakowaną argininę. Przez stosowane w niniejszym opisie określenie „produkty wtórne rozumie się powstałe z produktów reakcji dalsze produkty, na przykład, w szczególności, NO2^- lub NO3^-. „Koenzymem jest związek małocząsteczkowy, nie proteinogenny, potrzebny tylko przejściowo i związany luźno z enzymem jako kosubstrat, na przykład NADPH. „Kofaktory jest to określenie zbiorcze odnoszące się do substancji małocząsteczkowych, których obecność jest, lub może być, potrzebna dla zajścia reakcji enzymatycznych, na przykład Ca²⁺, kalmodulina.

W zwią zku z dokonywaniem rozdział u zgodnie z etapem (b), w dalszym cią gu korzystnie od znakowanej argininy oddziela się dodatkowo kofaktory względnie koenzymy, syntazę NO i produkty wtórne i/lub syntazę NO. Przy tym, rozumie się, że oddzielenie dotyczy (oprócz substratu) także substancji dodanych do podłoża inkubacyjnego w środowisku inkubacyjnym zgodnie z etapem (a). Ponieważ substancje te najczęściej są rozpuszczalne w wodzie, zbiega się to przeważnie z usunięciem podłoża inkubacyjnego.

Jeśli chodzi o membranę stanowiącą płytkę filtracyjną, szczególnie korzystnie stosuje się w sposobie według wynalazku membrany stanowią ce pł ytki filtracyjne bę dą ce wymieniaczami kationowymi. Wymieniaczami kationowymi są substancje, które na zasadzie wymiany pobierają z cieczy równoważne ilości obcych kationów. Dalej, membrany stanowiące płytki filtracyjne korzystnie mogą być filtrami papierowymi lub filtrami tekstylnymi lub też mogą być wykonane z innych porowatych lub kanalikowych materiałów stałych, takich jak, na przykład, metal, szkło lub tworzywo ceramiczne, albo mogą materiały te zawierać.

Korzystnymi grupami funkcyjnymi w stosowanych zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku kationowymiennych membranach stanowiących płytki filtracyjne są grupy fosforanowe, węglanowe, fosfonianowe, siarczanowe i/lub sulfonianowe, korzystnie grupy fosforanowe.

Przy tym, membrany stanowiące płytki filtracyjne, w przypadku filtrów papierowych, mają grubość mieszczącą się w zakresie od 10,00 mm do 0,10 mm, korzystnie w zakresie od 1,00 mm do 0,15 mm, zwłaszcza od 0,50 mm do 0,20 mm, korzystnie wynoszącą 0,23 mm. Następnie, membrany stanowiące płytkę filtracyjną są wymieniaczami kationowymi o zdolności wymiennej wynoszącej > 1,0 μeq/cm², zwłaszcza > 10,0 μeq/cm², korzystnie > 18,0 μeq/cm². Oprócz tego, omawiane płytki filtracyjne wykazują prędkość przepływu wynoszącą > 100 mm/30 min, korzystnie 125 mm/30 min.

W szczególnie korzystnym sposobie wykonania niniejszego wynalazku etap (a) przeprowadza się równolegle w większej ilości naczyń reakcyjnych, w przybliżeniu w tym samym czasie, korzystnie w tym samym czasie, i/lub etap (b) przeprowadza się równolegle w większej ilości naczyń reakcyjnych, w przybliżeniu w tym samym czasie, korzystnie w tym samym czasie, zwłaszcza w odniesieniu do początku inkubacji w etapie (a) i/lub początku rozdzielania zgodnie z etapem (b). Przy tym, szczególnie korzystne jest, gdy naczynia reakcyjne są ze sobą w pewien sposób związane, przy czym dotyczy to w pierwszym rzędzie jamek (ang. wells) znajdujących się w płytce do mikromiareczkowania. Rozumie się tu, że „jamki są to zagłębienia (dołki) w płytce do mikromiareczkowania, przyjmujące środowisko inkubacyjne lub próbki. Odpowiednimi płytkami do mikromiareczkowania, nadającymi się do zastosowania w sposobie według wynalazku, są zwłaszcza takie płytki, które zawierają < 96 jamek, korzystnie 24 lub 48 jamek lub > 96 jamek, zwłaszcza 96, 384, 864 lub 1536 jamek.

Następnie, zastosowane w sposobie według wynalazku naczynia reakcyjne dla etapu (a) i/lub etapu (b) korzystnie mają objętość nadającą się do przyjęcia < 2 ml, zwłaszcza < 1 ml, korzystnie < 1 ml, < 800 μ!, < 350 μί, < 300 ul, < 250 μ!, < 200 μ!, < 150 μί, < 100 μ!, < 50 μί, < 30 μί, lub < 5 μί.

W szczególnie korzystnym sposobie wykonania niniejszego wynalazku, rozdzielenie zgodnie z etapem (b) następuje przez ode-ssanie podłoża inkubacyjnego z etapu (a) poprzez membranę stanowiącą płytkę filtracyjną. W takim przypadku, do przeciwnej (w stosunku do środowiska inkubacyjnego) strony membrany stanowiącej płytkę filtracyjną przykłada się podciśnienie. Przez „podłoże inkubacyjne rozumie się tu podłoże, w którym odbywa się inkubacja zgodnie z etapem (a) i w którym rozpuszczone są: substrat, NOS, produkty oraz produkty wtórne, jak również koenzymy względnie kofaktory. Zgodnie z dalszym, szczególnie korzystnym sposobem wykonania wynalazku, po rozdzieleniu zgodnie z etapem (b), frakcję zawierającą znakowaną cytrulinę oddzieloną od znakowanej argininy, odrzuca się. Przy tym przez „frakcję rozumie się część ogólnej ilości środowiska inkubacyjnego sprzed rozdziału, w tym przypadku podłoża inkubacyjnego z określonymi rozpuszczonymi składnikami.

PL 204 925 B1

Tak więc, „frakcja oznacza tę część podłoża, w którym znakowana cytrulina znajduje się w dużej mierze, a znakowanej argininy z wyjściowego środowiska inkubacji (prawie) zupełnie nie ma. Właśnie oba te dwa ostatnie sposoby wykonania wynalazku ułatwiają w znacznym stopniu stosowanie i automatyzację testu i przyczyniają się do tego, że sposób według wynalazku nadaje się do wykorzystania w metodzie HTS.

Jeszcze inny korzystny sposób wykonania wynalazku polega na tym, że po rozdzieleniu zgodnie z etapem (b), oddzielony substrat znajduje się na, lub w, membranie stanowiącej płytkę filtracyjną, przy czym, korzystnie, jest on z nią związany. Szczególnie korzystnie, znakowanie substratu, poprzez radioaktywność, fluorescencję, luminiscencję lub zmiany widma względnie barwy, umożliwia dokonanie pomiaru substratu. Zgodnie ze szczególnie korzystnym sposobem wykonania wynalazku, mierzenie substratu odbywa się w liczniku scyntylacyjnym po podaniu płynu scyntylacyjnego na membranę stanowiącą płytkę filtracyjną. Przy tym, w szczególności, rozumie się, że zgodnie ze szczególnie korzystnym sposobem wykonania niniejszego wynalazku, po dokonaniu rozdziału zgodnie z etapem (b), membranę stanowiącą płytkę filtracyjną, na której znajduje się znakowana arginina, albo pojedynczo, albo w obrębie płytki do mikromiareczkowania (obejmującej wszystkie membrany stanowiące płytki filtracyjne) poddaje się suszeniu, na przykład w suszarce szafkowej. Następnie, płytki do mikromiareczkowania (MTP) zamyka się od strony tylnej, natomiast poszczególne membrany stanowiące płytki filtracyjne przeprowadza do naczyń scyntylacyjnych. Potem, membrany stanowiące płytki filtracyjne zalewa się płynem scyntylacyjnym, zamyka (MTP zamyka się od strony przedniej) i poddaje zliczaniu w liczniku (scyntylacyjnym).

Dalszy korzystny wariant sposobu wykonania wynalazku polega na tym, że etap (a) i etap (b) przeprowadza się w różnych naczyniach reakcyjnych. Także ten wariant szczególnie dobrze nadaje się do zastosowania w metodzie HTS. Należy przez to rozumieć w szczególności to, że środowisko inkubacyjne według etapu (a) przenosi się do innego naczynia, które np. zawiera membranę stanowiącą płytkę filtracyjną, i wykonuje się etap (b). I tak np. przeprowadza się równolegle środowiska inkubacyjne z jednej płytki do mikromiareczkowania do innej płytki do mikromiareczkowania, której jamki na dnie zawierają membranę stanowiącą płytkę filtracyjną (na przykład w postaci wymieniacza jonowego) zamocowaną przy pomocy sitka przepuszczalnego dla cieczy. Tu właśnie może odbyć się rozdział, przez przyłożenie podciśnienia do spodniej strony membrany stanowiącej płytkę filtracyjną, przy czym podłoże inkubacyjne, na przykład razem ze znakowaną cytruliną, zostaje odessane, a znakowana arginina pozostaje na dnie jamki, na membranie stanowiącej płytkę filtracyjną lub w niej.

Dalszy szczególnie interesujący wariant sposobu wykonania wynalazku przewiduje, że po rozdzieleniu zgodnie z etapem (b) następuje etap przemywania, korzystnie < 3 razy, zwłaszcza 1 raz, korzystnie wodą lub buforem, zwłaszcza o objętości < 10 ml, zwłaszcza < 5 ml, korzystnie < 3 ml, zwłaszcza < 2 ml. Objętość cieczy użytej do przemywania odnosi się do ilości rozdzielonego (etap b) środowiska inkubacyjnego według etapu (a), korzystnie do naczynia reakcyjnego. Także i to rozwiązanie może polepszyć stosowanie sposobu w metodzie HTS, a zwłaszcza umożliwić większą dokładność testu. Przy tym objętość użyta do przemywania może być wyraźnie większa od objętości naczynia reakcyjnego, jeżeli tylko równolegle z wprowadzaniem cieczy do przemywania następuje jej odbieranie, na przykład za pomocą odsysania. W przeciwnym przypadku, objętość frakcji przemywających korzystnie odpowiada maksymalnej objętości naczynia reakcyjnego, w którym przeprowadza się etap (b).

Korzystny sposób wykonania wynalazku przewiduje, że jako syntazę NO stosuje się zrekombinowaną syntazę NO, przy czym syntaza NO ma charakter specyficznego podtypu (izoenzymu) i stanowi zwłaszcza swoistą dla człowieka, szczura lub myszy eNOS, iNOS lub nNOS, zwłaszcza także α-względnie β-nNOS. Rozumie się przy tym, że „zrekombinowaną NOS oznacza NOS utworzoną na drodze manipulacji wykonanej metodą inżynierii genetycznej. I tak np., wychodząc z sekwencji sklonowanego genu NOS można zbudować zrekombinowaną konstrukcję DNA, przykładowo wektor do klonowania lub lepiej wektor ekspresyjny. Wektorem takim transformuje się komórkę, w której, następnie, w specjalnych warunkach hodowli, następuje ekspresja genu i utworzenia białka, a mianowicie zrekombinowanej NOS. Przy tym, użyte tu określenia mają następujące znaczenie:

- (zrekombinowana) konstrukcja DNA: ogólne określenie każdego rodzaju cząsteczki DNA powstałej w wyniku in vitro połączenia cząsteczek DNA;

- wektor do klonowania: ogólne określenie cząsteczek kwasu nukleinowego, służących przy klonowaniu jako nośniki obcych genów lub części tych genów;

PL 204 925 B1

- wektor ekspresyjny: okreś lenie specjalnie skonstruowanych wektorów do klonowania, które po wprowadzeniu do właściwej komórki-gospodarza umożliwiają transkrypcję i translację wklonowanego w wektor obcego genu.

Jednakże, szczególnie korzystne jest to, że zastosowana w sposobie według niniejszego wynalazku syntaza NO stanowi fragment surowego ekstraktu (w dalszej części niniejszego opisu nazywanego niekiedy „surowym ekstraktem NOS) z tkanki kręgowca, korzystnie ssaka. Przy tym, surowy ekstrakt może być uzyskany z gryzoni, i/lub pochodzić z ośrodkowego układu nerwowego (niem. ZNS) i/lub stanowić supernatant otrzymany z homogenatu, zwłaszcza z homogenatu móżdżka szczurzego lub mysiego. W tym celu pobiera się tkankę z ZNS (ośrodkowego układu nerwowego) gryzonia, korzystnie szczura lub myszy, korzystnie móżdżek, homogenizuje, wiruje i supernatantu używa jako neuronowego surowego ekstraktu NOS. W zamieszczonej poniżej części opisu „ Rysunki i przykłady podany jest przykład odpowiedniego sposobu otrzymywania tego materiału.

Następnie, korzystnie zastosowana ilość białka w środowisku inkubacyjnym zgodnie z etapem (a) przypadająca na 1 mm² membrany stanowiącej płytkę filtracyjną użytej w etapie (b) może wynosić najwyżej < 5,0 μg, zwłaszcza < 2,5 μg, korzystnie < 1,0 μg. Podane ilości białka są to wartości doświadczalne, powyżej których membrany stanowiące płytki filtracyjne ulegają zatkaniu w trakcie dokonywania rozdziału, zwłaszcza w przypadku odsysania.

Oczyszczone NOS (także, na przykład, enzym zrekombinowany) potrzebują, oprócz substratu i koenzymu NADPH, jeszcze dalszych koenzymów/kofaktorów, takich jak tetrahydrobiopteryna (BH4), FAD, FMN, kalmodulina (CaM) i CA⁺⁺ [A.J. Hobbs, A. Higgs, S. Moncada, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 39,191 (1999)]. Następnie, korzystnie, w sposobie według niniejszego wynalazku do środowiska inkubacyjnego zgodnie z etapem (a) wprowadza się kofaktory względnie koenzymy i/lub NADPH. W szczególności, do środowiska inkubacyjnego dołącza się kalmodulinę, Ca²⁺, tetrahydrobiopterynę, FAD i/lub FMN. W celu utrzymania kosztów przeprowadzania badań metodą HTS na możliwie najniższym poziomie, testy można, alternatywnie, wykonywać przy użyciu już wspomnianego surowego ekstraktu NOS, dzięki czemu można zrezygnować z dodania dużej części wspomnianych powyżej koenzymów. Oznacza to, że przy zastosowaniu wyżej wspomnianego neuronowego surowego ekstraktu NOS można zrezygnować ze stosowania BH4, CaM, FAD i FMN. Stąd też, szczególnie korzystnie, przy stosowaniu wyżej opisanego surowego ekstraktu NOS do środowiska inkubacyjnego dodaje się NaDPH i Ca²⁺, zwłaszcza jako jedyne kofaktory bądź koenzymy. Właśnie taki wariant sposobu wykonania niniejszego wynalazku jest korzystny pod względem obniżki kosztów.

Następnie, korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się środowisko inkubacyjne znajdujące się w buforze jako podłożu inkubacyjnym, a inkubacja w etapie (a) odbywa się w temperaturze pokojowej, w temperaturze 37°C, w temperaturze 25°C w temperaturze 10°C lub w temperaturze 4°C, korzystnie w temperaturze pokojowej.

Następnie, szczególnie korzystnie czas oddzielania zgodnie z etapem (b) mieści się w zakresie 1-600 minut, zwłaszcza w zakresie 3-120 minut, korzystnie 5-60 minut, licząc od początku inkubacji zgodnie z etapem (a). Długości te zależą zwłaszcza od aktywności użytej NOS.

W szczególnie korzystnej postaci wykonania wynalazku, sposób według wynalazku jest odpowiedni do zastosowania w skanowaniu wysokoprzepustowym HTS, a to oznacza, ze sposób ten jest szczególnie prosty, odtwarzalny i dobrze nadaje się do zautomatyzowania.

Rozstrzygającym kryterium, jeśli chodzi o jakość metody badawczej (testu, ang. assay), zwłaszcza w przypadku HTS, jest iloraz sygnału i szumu (ang. signal-to-noise ratio), a więc stosunek niższych sygnałów pomiarowych do przeciętnego szumu tła (bez sygnału). Należy dążyć do zachowania szczególnie wysokiego tego stosunku. Osiąga się to właśnie w sposobie według wynalazku. Wartości tego ilorazu, zwłaszcza w korzystnych sposobach wykonania wynalazku, wynoszą > 4, zwłaszcza > 5, korzystnie > 6 lub > 10.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kationowymiennych membran stanowiących płytki filtracyjne w sposobie, w którym zachodzi reakcja chemiczna z udziałem NOS. W szczególności, rozumie się przez to, w tym przypadku, przemiany enzymatyczne, na przykład z udziałem argininy, ale także i inne reakcje, w których może uczestniczyć NOS jako enzym. Przy tym szczególnie korzystne jest to, że wspomniany sposób służy do mierzenia aktywności syntaz NO i/lub identyfikowania modulatorów syntaz NO, korzystnie aktywatorów lub inhibitorów, a zwłaszcza to (co jest szczególnie wyróżniające, jeśli chodzi o sposób według niniejszego wynalazku), że mieści się on w ramach metody HTS.

PL 204 925 B1

Następujące przykłady i rysunki powinny objaśnić wynalazek bez ograniczania przedmiotu i zakresu wynalazku w jakikolwiek sposób.

Rysunki i przykłady

Fig. 1 pokazuje poddane graficznej obróbce wyniki testu skriningowego według przykładu 4 i w nawiązaniu do tabeli 3. Przy tym osie x i y odpowiadają alfanumerycznemu podziałowi 96-jamkowejkowej płytki do mikromiareczkowania, a oś z zmierzonym „corrected counts per minutę (ccpm), skorygowanym o tło licznika i współczynnik wygaszania, policzonym w liczniku rozpadom radioaktywnym/min.

P r z y k ł a d 1

Ogólny sposób postępowania w teście HTS-NOS

W teście HTS-NOS stosuje się jako substrat radioaktywną argininę. Objętość testową można dobrać odpowiednio do rodzaju płytek do mikromiareczkowania (MTP) w zakresie od 25 μl do 250 μΕ W zależności od użytego źródła enzymu dołącza się kofaktory i koenzymy. Inkubację całego materiału w tej płytce do mikromiareczkowania (ang. assay-MTP) zgodnie z etapem (a) prowadzi się w temperaturze pokojowej i trwa ona, odpowiednio do zastosowanej aktywności enzymu (ang. units) od 5 do 60 minut. Po zakończeniu inkubacji (etap (a)) płytkę umieszcza się w zbieraczu komórek (ang.-niem. Zellharvester), wyposażonym w MTP, mającej jako dno filtrujące membranę kationowymienną (ang. filter-MTP). Wszystkie materiały z „assay-MTP przenosi się na tę płytkę „filter-MTP i odsysa poprzez kationowymienną płytkę filtracyjną, obciążony grupami fosforanowymi filtr papierowy. Następnie, płytkę „filter-MTP przemywa się buforem i wodą. Przy pomocy takiego sposobu postępowania pozostała substratowa arginina zostaje związana z wymieniaczem kationowym, podczas gdy utworzona w wyniku reakcji enzymatycznej radioaktywna cytrulina ulega ilościowemu wymyciu. Po wysuszeniu płytki „filter-MTP i dodaniu płynu scyntylacyjnego można dokonać pomiaru argininy. Nie zahamowana reakcja NOS odzwierciedla się w nieznacznej tylko radioaktywności. Reakcja enzymatyczna zahamowana oznacza, że radioaktywna arginina nie przereagowała. Oznacza to, że na filtrze znajduje się wysoka radioaktywność.

Test może przebiegać przy stosowaniu bardzo niskich stężeń substratów (na przykład 50 nM). Ale także w takich warunkach, iloraz sygnału i szumu wynosi jeszcze ponad 6. Przy użyciu wyższych stężeń substratu można osiągnąć wartość ponad 10. Dzięki temu nadzwyczaj prostemu sposobowi [zawartość jednej płytki „assay-MTP odsysa się przez tylko jedną płytkę filtracyjną zawierającą wymieniacz kationowy (w płytce „filter-MPT), której radioaktywność poddaje się zmierzeniu] można w ciągu jedynie kilku dni przeszukać kilkaset tysięcy związków z danej biblioteki.

P r z y k ł a d 2

Przykładowe zastosowane materiały

- Arginina, L-2,3,4-³H]-monochlorowodorek; Best.-Nr. NET-1123, NEN

- CaCl2, bezwodny; Best.-Nr. 2388.1000; Merck

- 1,4-Ditiotreitol (DTT), Best.-Nr. 708984;ROCHE

- Na2EDTA-dihydrat; Best.-Nr. 03680; FLUKA

- HEPES, Best.-Nr. H-3375; SIGMA

- NADPH, sól tetrasodowa; Best.-Nr. 1585363; ROCHE

- TRIS; BEST.-Nr. 93349; FLUKA

Bufor do preparatyki enzymu: 50 mM Tris-HCl z 1 mM EDTA; pH buforu nastawiono w temperaturze 4°C na 7,4.

Bufor inkubacyjny (podłoże inkubacyjne): 50 mM HEPES z 1 mM EDTA; 1,25 mM CaCl2 i 1 mM ditiotreitol; pH buforu nastawiono w temperaturze 25°C na 7,4.

Środek do przemywania: H2O.

P r z y k ł a d 3

Preparatyka enzymu

Jako tkanki wyjściowej używa się móżdżków szczurzych. Na jeden szczurzy móżdżek dodaje się 1 ml buforu do preparatyki enzymu (4°C). Zwierzęta znieczula się i uśmierca, po czym wypreparowuje się tkankę mózgową, móżdżek i rozdrabnia w homogenizatorze Polytron w ciągu 1 min przy 6000 obr/min i

Wirowanie w temperaturze 4°C w ciągu 15 min przy 20000 x g i

Supernatant dekantuje się i zamraża w temperaturze -80°C, w porcjach (osad odrzuca się).

W tych warunkach supernatant zawierający nNOS jest przez dłuższy czas trwały, jednakże tylko jeden raz może być rozmrożony i już więcej nie można go zamrażać.

PL 204 925 B1

P r z y k ł a d 4

Przykład wykonania testu HTS-NOS według przykładów 1-3

a) Środowisko inkubacyjne (etap (a)).

Stosuje się 96-jamkowe MTP o pojemności jednej jamki wynoszącej < 250 gl. Kolejność pipetowania: patrz tabela 1.

T a b e | a 1

Substancja	Molowość środowiska	gl	Białko w środowisku*
Bufor inkubacyjny	—	100	—
Substancja testowana	zmienna; korzystnie 10⁵ M	ilość zmienna; korzystnie 20 gl	—
NaDPH	0,5 mM	20	-
Enzym (patrz: przykład 3)	-	ilość zmienna; maksymalna objętość roztworu enzymu = 50 gl	ilość zmienna, maksymalna nadająca się do użycia = 100 gg
[³H] Substrat	zmienna; korzystnie 50 nM	ilość zmienna; korzystnie 10 gl	—
Objętość końcowa	maksymalnie 250 gl	—

* Oznaczenie białka metodą O.H. Lowry'ego i in. [J. Bio|. Chem., 193, 265 (1951)].

Po zakończeniu pipetowania, na wspomnianą MTP („assay-MTP) nakłada się przykrywkę. Inkubacja w temperaturze 25°C, odpowiadającej temperaturze pokojowej (ang., niem. RT), każdorazowo trwa od 5 do 60 minut, w za|eżności od i|ości i aktywności użytego enzymu.

b) Etap odsysania (etap (b)).

Następnie, zawartość płytki „assay-MTP przenosi się (na przykład przy użyciu 96-jamkowego zbieracza komórek do 96-jamkowej kationowymiennej płytki MTP (ang. „fi|ter-MTP) i dokonuje się odessania i jednorazowego przemycia przy użyciu 200 m| H2O (z jednej wanienki).

c) Etap pomiaru (etap (c)).

Następnie, płytkę suszy się w ciągu godziny, w temperaturze 60°C, w suszarce szafkowej. Stronę spodnią płytki „fi|ter-MTP szcze|nie zamyka się z zastosowaniem „back sea|”. Do każdej jamki wpipetowuje się po 35 μ| scynty|atora, po czym górną stronę płytki zamyka się z zastosowaniem „top sea|. Po odczekaniu godziny, płytkę można skierować do pomiaru w |iczniku cząstek beta (pomiaru można dokonać także znacznie później, ponieważ sygnał pomiarowy pozostaje stabi|ny przez dłuższy czas).

W metodzie HTS za|eca się połączyć ze sobą podłoże inkubacyjne, NADPH i roztwór enzymu jeszcze przed rozpoczęciem etapu pipetowania, aby nie być zmuszonym do wykonywania trzech osobnych operacji pipetowania, które są czynnościami czasochłonnymi. Dzięki takiemu skoncentrowaniu czynności, można także zmniejszyć objętość testową.

P r z y k ł ad 5

Zastosowanie sposobu według przykładów 2 - 4 do skriningu

Użyto następujących materiałów:

T a b e | a 2

Serocluster®	Płytka do mikromiareczkowania przeznaczona do inkubacji (Assay-MTP); firma Costar®, 96 Weil, Polypropylen, Round Bottom, nr. kat. 3794 (Corning Costar Corporation, Cambridge, Ma, USA)
1	2
Unifilter®	Kationowymienna płytka filtracyjna w płytce do mikromiareczkowania (Filter-MTP); firma Whatman®, 96 Wells, 150 gl, Mesh Bottom. P81 Cellulose Phosphate Paper, nr kat. 7700-0512 (Whatman Inc., Clifton, NJ 07014, USA) Właściwości fizyczne: zdolność wymienna: 18,0 geq/cm²prędkość przepływu: 125 mm/30min grubość: 0,23 mm
Brandel®	96-well Cell Harvester, Typ MPXRI-96T (Brandel, Gaithhersburg, MD 20877, USA)

PL 204 925 B1 cd. tabeli 2

1	2
Wallac®	Trilux 1450 Microbeta, Liquid Scintillation and Luminiscence Counter (Wallac-ADL-GmbH, D-79111 Freiburg, Niemcy)
Enzym	Preparat z móżdżku szczurzego (patrz powyższy przykład 3)
TopSeal™	Firma Packard (Packard, Meriden, CT 06450, USA)
BackSeal	Firma Packard (Packard, Meriden, CT 06450, USA)
Scyntylator	Typ: Ultima Gold™ (Packard, Meriden, CT 06450, USA)

Substancje testowe: 1 x 10^-5 M w środowisku.

Wzorzec wewnętrzny: 7-nitroindazol, 1 x 10^-5 M w środowisku.

NADPH: 0,5 mM w środowisku.

[³H]Substrat: 50 nM w środowisku.

Czas inkubacji: 30 min w temperaturze pokojowej

Wszystkie inne parametry i etapy sposobu takie, jakie przytoczono poprzednio (patrz: powyższy przykład 4). W tabeli 3 pokazano serię eksperymentów, w której przetestowano 80 substancji (pozycje A2-A11; B2-B11; C2-C11; D2-D11; E2-E11; F2-F11; G2-G11, H2-H11). Przy tym, rozkład alfanumeryczny odpowiada 96-jamkowej płytce do miareczkowania, dzięki czemu mogą być podane zmierzone „corrected counts per minutę (ccpm), skorygowane o tło licznika i współczynnik wygaszania, policzone w liczniku rozpady radioaktywne/min.

Pełne środowiska, ale bez enzymu, wskazują na 100% wyjściową zawartość [³H]argininy. („Max = pozycje A1; B1, C1; A12; B12; C12).

₃

Pełne środowiska (z enzymem) wskazują na przemianę do [³H]cytruliny i NO, w ten sposób, że odjęta została zawartość [³H]argininy („Min = minimalna zawartość [³H]argininy = nie zahamowana reakcja enzymatyczna; pozycje D1; E1; F1; D12; E12 i F12). W przypadku aktywatorów NOS może to zostać jeszcze przekroczone, ponieważ wtedy przereagowuje większa ilość argininy, niż w przypadku enzymu nie modulowanego i na filtrze zostaje jeszcze mniej radioaktywności.

Jako wzorzec wewnętrzny (odnośnik) zastosowany jest inhibitor NOS 7-nitroindazol w stężeniu 1 x 10^-5 M („Ref = G1; H1; G12 i H12).

T a b e l a 3 Rozpoznawanie HIT

Badanie 80 substancji w teście NOS z zastosowaniem formatu 96-jamkowych płytek do mikromiareczkowania.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

MAX

Ob. 1

Ob. 9

Ob.17

Ob. 25

Ob. 33

Ob. 41

Ob. 49

Ob. 57

Ob. 65

Ob. 73

MAX

20023

10243

5016

5226

4551

4447

4813

5938

4715

5577

3615

19867

ccpm

3

MAX

Ob. 2

Ob. 10

Ob. 18

Ob. 26

Ob. 34

Ob. 42

Ob. 50

Ob. 58

Ob. 66

Ob. 74

MAX

19667

4395

4663

4328

5187

4490

9814

6821

5374

4343

4054

20613

ccpm

C

MAX

Ob. 3

Ob. 11

Ob. 19

Ob. 27

Ob. 35

Ob. 43

Ob. 51

Ob. 59

Ob. 67

Ob. 75

MAX

19536

13664

8407

5469

5442

4649

4994

4167

4529

3750

4236

18772

ccpm

D

MIN

Ob. 4

Ob. 12

Ob. 20

Ob. 28

Ob. 36

Ob. 44

Ob. 52

Ob. 60

Ob. 68

Ob. 76

MIN

3665

5265

4176

4363

3820

4112

4155

4337

3913

3502

4075

3620

ccpm

E

MIN

Ob. 5

Ob. 13

Ob. 21

Ob. 29

Ob. 37

Ob. 45

Ob. 53

Ob. 61

Ob. 69

Ob. 77

MIN

4308

4653

3695

4074

4822

3957

4131

4941

4430

3737

4131

3739

ccpm

PL 204 925 B1 cd. tabeli 3

F

MIN 3617 ccpm

Ob. 6 6273 ccpm

Ob. 14 3850 ccpm

Ob. 22 4224 ccpm

Ob. 30 3804 ccpm

Ob. 38 5737 ccpm

Ob. 46 4455 ccpm

Ob. 54 4959 ccpm

Ob. 62 5728 ccpm

Ob. 70 4124 ccpm

Ob. 78 3803 ccpm

MIN 3283 ccpm

G

Odn.

Ob. 7

Ob. 15

Ob. 23

Ob. 31

Ob. 39

Ob. 47

Ob. 55

Ob. 63

Ob. 71

Ob. 70

Odn.

13052

4568

4064

3918

4289

4512

4155

4767

4969

3909

3834

11294

ccpm

H

Odn.

Ob. 8

Ob. 16

Ob. 24

Ob. 32

Ob. 40

Ob. 48

Ob. 56

Ob. 64

Ob. 72

Ob. 80

Odn.

13797

4147

3466

3866

3922

4137

6057

4163

4592

3806

4135

12645

ccpm

W powyższej tabeli 3 użyto następujących oznaczeń skrótowych:

Odn. = odnośnik;

Ob. = obiekt (odnosi się do substancji badanej).

Z przebadanych 80 zwią zków trzy wykazują zahamowanie NOS (pozycje A2; C2 i B7; N = 1). Wartość średnia dla substancji wzorcowej, 7-nitroindazolu (= wzorca wewnętrznego, 1 x 10^-5 M w ś rodowisku) wynosi:

x = 12697 ± 1050 ccpm ⁽x ± SD; N = 4)

To stężenie 7-nitroindazolu dobiera się w sposób świadomy tak, że znajduje się ono w zakresie około 50 % zahamowania. Wartość średnia danych „Max (bez enzymu, wartość odniesieniowa dla 100 % [³H]argininy) przedstawia się następująco:

x = 19746 ± 607 ccpm (x ± SD; N = 6)

Wartość średnia danych „Min (nie zahamowana reakcja enzymatyczna) podaje następującą radioaktywność:

x = 3158 ± 334 ccpm (x ± SD; N = 6)

Jako łączny odcinek mierniczy wykorzystać można w tym przykładzie wartość 16558 ccpm (19746 - 3158 = 16588 ccpm).

P r z y k ł a d 6

Pomiar wartości IC50 różnych substancji odniesienia z porównaniem jednego ze sposobów według wynalazku ze sposobem pomiaru cytruliny używanym w dotychczasowym stanie techniki przy stosowaniu chromatografii kolumnowej [według D.S. Bredta i S.H. Snydera [Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 682 (1990)]. Pomiar cytruliny z zastosowaniem chromatografii kolumnowej przeprowadzono zgodnie z opisem podanym przez D.S. Bredta i S.H. Snydera [Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 682 - 685 (1990)], przy czym substrat, [³H]arginina, obecny był w środowisku w stężeniu wynoszącym 50 nM, a jako enzymu użyto syntazy nNOS wyizolowanej z móżdżka szczura, jak to opisano w powyższym przykładzie 3. Rozdziału dokonano metodą chromatografii kolumnowej.

Sposób postępowania według wynalazku odpowiadał sposobowi opisanemu w powyższym przykładzie 4, przy czym także i w tym przypadku substrat, [³H]arginina, występował w stężeniu wynoszącym 50 nM, a enzymem była nNOS wyizolowana z móżdżku szczura, jak opisano w powyższym przykładzie 3. Rozdziału dokonano sposobem według wynalazku z wykorzystaniem 96-jamkowych kationowymiennych płytek do mikromiareczkowania (MTP/ /filter-MTP).

W celu oznaczenia wartości IC-50, jako substancji testowych w obu porównywanych testach użyto następujących znanych inhibitorów NOS w rozmaitych stężeniach:

• 7-nitroindazol, • 1-(2-trifluorometylofenylo)imidazol (= TRIM), • N^G-monometylo-L-argina (=L-NMMA), • N5-(1-imino-3-butenylo)-L-ornityna (= vinyl-L-NIO), • N-[3-(aminometylo)benzylo]acetamidyna (= 1400W), • N5-[imino(propyloamino)metylo]-L-ornityna (= N-Pr-L-Arg). Otrzymane wyniki można zaczerpnąć z poniższej tabeli 4.

PL 204 925 B1

T a b e l a 4

Substancja	Wartości IC50 [pM]
Test cytrulinowy (według Bredta i Snydera) (1990)	Test argininowy według wynalazku (zgodnie z przykładem 4)
1	2
7-Nitroindazol	5,23	4,27
TRIM	> 100	> 100
L-NMMA	4,67	6,07
Vinyl-L-NIO	5,57	5,02
1400W	16,74	6,98
N-Pr-L-Arg	1,07	1,00

Jak widać z tabeli 4, wartości IC50 zmierzone dwoma różniącymi się sposobami leżą bardzo blisko siebie i w przypadku 6 substancji, w najbardziej niekorzystnym przypadku różnią się od siebie jedynie o współczynnik 2,4. Jest to oczywisty dowód na to, że obie te metody są całkowicie adekwatne, jeśli chodzi o oznaczanie IC50 i że sposób według wynalazku stanowi bardzo wartościową metodę oznaczania inhibicji NOS, oraz, że pod względem jakościowym porównywalny jest całkowicie z wymagającą bardzo dużych nakładów (z uwagi na konieczność przeprowadzania chromatografii kolumnowej) standardową metodą Bredta i Snydera (1990). Wielka zaleta postępowania sposobem według wynalazku, polega na fakcie, że jest on o wiele prostszy, dogodniejszy i nadający się do wykorzystania w metodzie HTS.

Claims

1. Sposób mierzenia aktywności syntaz NO obejmujący następujące etapy (a)-(c):

(a) inkubacja syntazy NO ze znakowaną argininą jako substratem w naczyniu reakcyjnym, (b) oddzielanie znakowanej argininy od znakowanej cytruliny powstałej jako produkt reakcji enzymatycznej, w trakcie trwania reakcji, aż do momentu jej zakończenia, (c) pomiar ilości każdorazowo oddzielonej argininy, znamienny tym, że oddzielanie następuje poprzez kationowymienną membranę stanowiącą płytkę filtracyjną.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do środowiska inkubacyjnego w co najmniej jednym naczyniu reakcyjnym, wprowadza się w etapie (a) substancję poddawaną badaniu na to, czy stanowi ona modulator, zwłaszcza aktywator lub inhibitor, korzystnie inhibitor, syntazy NO.

3. Sposób identyfikowania modulatorów syntazy tlenku azotu(II) obejmujący następujące etapy (a)-(c):

(a) inkubacja poddawanej badaniu substancji z syntazą NO i znakowaną argininą jako substratem w naczyniu reakcyjnym, (b) oddzielanie znakowanej argininy od znakowanej cytruliny, równocześnie powstałej jako produkt reakcji enzymatycznej, w trakcie trwania reakcji, aż do momentu jej zakończenia, (c) pomiar ilości każdorazowo oddzielonej argininy, znamienny tym, że oddzielenia dokonuje się z zastosowaniem kationowymiennej membrany stanowiącej płytkę filtracyjną.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wspomniany sposób służy do identyfikowania aktywatora lub inhibitora, korzystnie inhibitora, syntazy NO.

5. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że przy oddzielaniu zgodnie z etapem (b) z naczynia reakcyjnego usuwa się podłoże inkubacyjne.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że wspomniane podłoże inkubacyjne usuwa się w znacznej mierze, zwłaszcza prawie całkowicie, korzystnie zupełnie.

7. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że od podłoża inkubacyjnego oddziela się znakowaną argininę.

8. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że przy oddzielaniu zgodnie z etapem (b) od znakowanej argininy oddziela się dodatkowo kofaktory względnie koenzymy, syntazę, NO i produkty wtórne i/lub syntazę NO.

PL 204 925 B1

9. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że membrany stanowiące płytki filtracyjne są wymieniaczami kationowymi.

10. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że membrany stanowiące płytki filtracyjne są filtrami papierowymi lub filtrami tekstylnymi, albo są wykonane z innych porowatych lub kanalikowych materiałów stałych, takich jak, na przykład, metal, szkło lub tworzywo ceramiczne, albo zawierają te materiały.

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że grupy funkcyjne przeznaczone do wymiany kationów są utrwalone na membranach stanowiących płytki filtracyjne.

12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że grupy funkcyjne wymieniacza kationowego stanowią grupy fosforanowe, węglanowe, fosfonianowe, siarczanowe i/lub sulfonianowe, korzystnie grupy fosforanowe.

13. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że membrany płyt filtracyjnych stanowią filtry papierowe o grubości mieszczącej się w zakresie od 10,00 mm do 0,10 mm, korzystnie w zakresie od 1,00 mm do 0,15 mm, zwłaszcza od 0,50 mm do 0,20 mm, korzystnie wynoszącej 0,23 mm.

14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że membrany stanowiące płytki filtracyjne są wymieniaczami kationowymi o zdolności wymiennej wynoszącej > 1,0 μeq/cm², zwłaszcza > 10,0 μeq/cm², korzystnie > 18,0 μeq/cm².

15. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że etap (a) przeprowadza się równolegle w większej ilości naczyń reakcyjnych, w przybliżeniu w tym samym czasie, korzystnie w tym samym czasie, i/lub etap (b) przeprowadza się równolegle w większej ilości naczyń reakcyjnych, w przybliżeniu w tym samym czasie, korzystnie w tym samym czasie.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że naczynia reakcyjne są ze sobą związane, przy czym związanymi naczyniami są zwłaszcza jamki w płytce do mikromiareczkowania.

17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że płytka do mikromiareczkowania zawiera < 96 jamek, korzystnie 24 lub 48 jamek lub > 96 jamek, zwłaszcza 96, 384, 864 lub 1536 jamek.

18. Sposób według zastrz. 1 albo 3, albo 17, znamienny tym, że naczynia reakcyjne dla etapu (a) i/lub etapu (b) mają objętość nadającą się do przyjęcia < 2 ml, zwłaszcza < 1 ml, korzystnie < 1 ml, < 800 μί, < 350 μί, < 300 μί, < 250 μί, < 200 μί, < 150 μί, < 100 μί, < 50 μί, < 30 μί, lub 5 < μί.

19. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że oddzielanie zgodnie z etapem (b) następuje poprzez odessanie podłoża inkubacyjnego z etapu (a) poprzez membranę stanowiącą płytkę filtracyjną.

20. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że po oddzieleniu zgodnie z etapem (b) frakcję zawierająca znakowaną cytrulinę, oddzieloną od znakowanej argininy, odrzuca się.

21. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że po oddzieleniu zgodnie z etapem (b), oddzielona znakowana arginina występuje na lub w membranie stanowiącej płytkę filtracyjną.

22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że znakowana arginina jest związana.

23. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że znakowanie pozwala na zmierzenie argininy poprzez radioaktywność, fluorescencję, luminiscencję lub zmiany widma względnie barwy.

24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że mierzenie znakowanej argininy następuje w liczniku scyntylacyjnym po podaniu płynu scyntylacyjnego na membranę stanowiącą płytkę filtracyjną.

25. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że etap (a) i etap (b) przeprowadza się w różnych naczyniach reakcyjnych.

26. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że po oddzieleniu zgodnie z etapem (b) następuje etap przemywania, korzystnie < 3 razy, zwłaszcza 1 raz, korzystnie wodą lub buforem, zwłaszcza o objętości < 10 ml, zwłaszcza < 5 ml, korzystnie < 3 ml, w szczególności < 2 ml.

27. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że jako syntazę NO stosuje się zrekombinowaną syntazę NO.

28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że syntaza NO ma charakter specyficznego podtypu (izoenzymu) i jest swoistą zwłaszcza dla człowieka, szczura lub myszy syntazą eNOS, iNOS lub nNOS, zwłaszcza też syntazą α- bądź β-nNOS.

29. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że zastosowana syntaza NO stanowi fragment surowego ekstraktu z tkanki kręgowca, korzystnie ssaka.

30. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że surowy ekstrakt uzyskany został z gryzonia, i/lub pochodzi z ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i/lub stanowi supernatant otrzymany z homogenatu, zwłaszcza z homogenatu móżdżka szczurzego lub mysiego.

PL 204 925 B1

31. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że zastosowana ilość białka w środowisku inkubacyjnym zgodnie z etapem (a), przypadająca na 1 mm² membrany stanowiącej płytkę filtracyjną użytej w etapie (b) może wynosić najwyżej < 5,0 μg, zwłaszcza < 2,5 μg, korzystnie < 1,0 μg.

32. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że do środowiska inkubacyjnego, zgodnie z etapem (a) w zastrz. 1 lub 3, dodaje się kofaktory względnie koenzymy.

33. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że do środowiska inkubacyjnego dodaje się NADPH.

34. Sposób według zastrz. 32 albo 33, znamienny tym, że do środowiska inkubacyjnego dołącza się kalmodulinę, Ca²⁺, tetrahydrobiopterynę, FAD i/lub FMN.

35. Sposób według zastrz. 29 albo 30, znamienny tym, że do środowiska inkubacyjnego dołącza się NADPH i Ca²⁺.

36. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że stosuje się środowisko inkubacyjne zgodnie z etapem (a) w buforze jako podłożu inkubacyjnym.

37. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że inkubacja w etapie (a) zachodzi w temperaturze pokojowej, w temperaturze 37°C, w temperaturze 25°C, w temperaturze 10°C lub w temperaturze 4°C, korzystnie w temperaturze pokojowej.

38. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że oddzielanie według etapu (b) zachodzi w ciągu 1-600 min, zwłaszcza w ciągu 3-120 min, korzystnie w ciągu 5-60 min, po rozpoczęciu inkubacji według etapu (a).

39. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że jest on odpowiedni do stosowania w skanowaniu wysokoprzepustowym HTS (ang. „high throughput screening).

40. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że sposób ten wykazuje iloraz sygnału i szumu (ang. „signal-to-nosise ratio) > 4, zwłaszcza > 5, korzystnie > 6 lub > 10.

41. Zastosowanie kationowymiennych membran stanowiących płytki filtracyjne w sposobach mierzenia aktywności syntaz NO, w których kationowymienne membrany stosuje się do oddzielania znakowanej argininy.

42. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że wspomniany sposób służy do mierzenia aktywności syntaz NO i/lub identyfikowania modulatorów syntaz NO, korzystnie aktywatorów lub inhibitorów.

43. Zastosowanie według zastrz. 42, znamienne tym, że stosuje się sposób określony w zastrz. 1 albo 3.

44. Zastosowanie według zastrz. 41 albo 42, albo 43, znamienne tym, że stosuje się sposób z zakresu metody HTS.