PL205545B1

PL205545B1 - Sposób uzyskiwania estrogenów z moczu klaczy

Info

Publication number: PL205545B1
Application number: PL368904A
Authority: PL
Inventors: Heinz-Helmer Rasche; Olaf Rupp
Original assignee: Solvay Pharm Gmbh
Priority date: 2001-12-01
Filing date: 2002-11-27
Publication date: 2010-04-30
Also published as: AR037670A1; CN1286472C; HUP0402194A2; JP2005511703A; ATE339215T1; NO331790B1; EP1453527B1; AU2002352161A1; CA2468933A1; EP1453527A2; DE50208167D1; WO2003048183A2; HK1073241A1; AU2002352161B2; WO2003048183A3; DK1453527T3; BR0214607A; RU2308955C2; CN1589150A; TW200300693A

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy uzyskiwania naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu źrebnych klaczy.

Estrogeny stosuje się w medycynie do hormonalnej terapii zastępczej. Mieszaniny estrogenów stosuje się w szczególności do leczenia i zapobiegania dolegliwościom okresu przekwitania po naturalnej lub wywołanej sztucznie menopauzie. Naturalne mieszaniny sprzężonych estrogenów, jakie występują w moczu źrebnych klaczy, okazały się w tym wypadku szczególnie skuteczne i dobrze znoszone przez pacjentki.

Rozpuszczona zawartość części stałych w moczu źrebnych klaczy (= pregnant mares urine, w skrócie określana dalej jako „PMU), może naturalnie wahać się w szerokich granicach i ogólnie mieści się w zakresie od 40 do 90 g suchej substancji na litr. Obok mocznika i pozostałych zwykłych substancji zawartych w moczu, w substancji stałej PMU zawarte są składniki fenolowe w ilościach od około 2 do 5% wagowych w przeliczeniu na substancję stałą. Wśród tych fenolowych składników znajdują się krezole i dihydro-3,4-bis[(3-hydroksyfenylo)metylo]-2(3H)-furanon, znany jako HPMF. Mogą one występować w postaci wolnej lub sprzężonej. W PMU zawarta jest naturalna mieszanina estrogenów, która występuje przeważnie w postaci sprzężonej, np., w postaci soli sodowej półestru kwasu siarkowego (w skrócie określana dalej jako „sól siarczanowa). Zawartość sprzężonych estrogenów (w przeliczeniu na sól siarczanową estrogenów) może wynosić między 0.3 a 1% wagowych w przeliczeniu na substancję suchą .

Z publikacji WO 98/08526 znany jest już odpowiedni sposób, za pomoc ą którego z PMU, przez ekstrakcję w fazie stałej, na semipolarnej, w szczególności na niejonowej semipolarnej polimerowej żywicy adsorpcyjnej można uzyskać zubożoną w fenolowe składniki moczu, w dużej mierze uwolnioną od składników krezolowych i HPMF, praktycznie całą zawartość naturalnych estrogenów. Ekstrakt ten nadaje się jako surowiec do wytwarzania leków, które zawierają naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów, jako substancję czynną.

Uzyskana naturalna mieszanina sprzężonych estrogenów, aby można było ją stosować jako składnik czynny leków, musi jednak spełniać określone farmaceutyczne normy, np., odpowiadać normom ustalonym w USP (United States Pharmacopeia/ Farmakopei Stanów Zjednoczonych) lub Farmakopei Europejskiej (European Pharmacopeia). Zawartość wolnych estrogenów w przeliczeniu na substancje stałą także nie powinna przekraczać określonych granic. Mieszaniny sprzężonych estrogenów uzyskiwane z PMU sposobem według publikacji WO 98/08526 zwykle spełniają wymagania ustanowione przez normy farmaceutyczne.

Okazało się jednak, że wymagane normy farmaceutyczne, przykładowo podane wyżej wartości graniczne maksymalnie tolerowanych zawartości wolnych estrogenów, często nie mogą być zachowane, jeśli do uzyskiwania naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów zastosuje się „zestarzały mocz, np., PMU przechowywany przez dłuższy czas i/lub ewentualnie przechowywany lub transportowany w podwyższonej temperaturze. To starzenie PMU związane jest przypuszczalnie z tym, że, w zależności do warunków składowania i/lub transportu, zawartość sprzężonych estrogenów może zmniejszać się z czasem lub w podwyższonej temperaturze, podczas gdy zawartość niepożądanych wolnych estrogenów równocześnie rośnie. Początkowy skład naturalnej mieszaniny estrogenów w przypadku moczu zestarzałego może zmieniać się w niekorzystny sposób w stosunku do moczu świeżego. W przypadku naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów uzyskiwanej sposobem według publikacji WO 98/08526, obok ewentualnie zmienionego składu zestarzałego surowca powstaje często niebezpieczeństwo, że uzyskany ekstrakt nie będzie już odpowiadał ustalonym wymaganiom norm farmaceutycznych, dotyczących zwłaszcza maksymalnych tolerowanych zawartości wolnych estrogenów. Szczególnie niekorzystne jest w tym wypadku, że szarże uzyskiwane z zestarzałego PMU nie mogą być już zastosowane do wytwarzania preparatów farmaceutycznych wraz cennym samym przez się ekstraktem mieszaniny sprzężonych estrogenów - substancji czynnych i dlatego muszą być wyrzucane. Strata cennej naturalnej farmaceutycznej substancji czynnej, ze względu na pracochłonne i ograniczone tylko do okresu ciąży zbieranie PMU i związane z tym warunki zaopatrzeniowe, jest w dużej mierze niezadowalająca w praktyce i z punktu widzenia gospodarczego.

Zadaniem niniejszego wynalazku jest więc dlatego opracowanie technicznie i ekonomicznie optymalnego sposobu uzyskiwania naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów zubożonej w fenolowe składniki moczu z PMU, w którym w sposób bezpieczny i bez brakowania można by było stosować, jako surowiec, także zestarzały PMU, tzn. PMU przechowywany przez dłuższy czas i/lub składoPL 205 545 B1 wany i/lub przechowywany w podwyższonej temperaturze, który ewentualnie może wykazywać zwiększoną zawartość wolnych estrogenów, i przy którego stosowaniu, naturalna mieszanina sprzężonych estrogenów uzyskiwana z tego PMU wykazywałaby dobre zawartości substancji czynnych i spełniała ustalone normy farmaceutyczne, zwłaszcza w odniesieniu do maksymalnych tolerowanych zawartości wolnych estrogenów.

Obecnie znaleziono sposób, za pomocą którego w niespodziewanie prosty sposób można uzyskiwać mieszaninę sprzężonych estrogenów także z zestarzałego PMU, tzn. w szczególności z PMU wykazującego zwiększone zawartości wolnych estrogenów, przy czym uzyskana mieszanina sprzężonych estrogenów wykazuje wysoką jakość produktu i bezpiecznie spełnia wymagania norm farmaceutycznych, w szczególności także w odniesieniu do maksymalnie tolerowanych zawartości wolnych estrogenów.

Sposób według wynalazku wywodzi się ze sposobu opisanego w publikacji WO 98/08526, który do uzyskiwania naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów zubożonej w fenolowe składniki moczu wykorzystuje PMU. Zgodnie z tym, wynalazek dotyczy sposobu uzyskiwania naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów zubożonej w fenolowe składniki moczu z moczu źrebnych klaczy, w którym:

a) mocz, ewentualnie uwolniony od składników śluzowych i stałych, zatężony koncentrat moczu lub zatężony przesącz po filtracji membranowej moczu, kontaktuje się z semipolarną polimerową żywicą adsorpcyjną, w ilości wystarczającej do adsorpcji mieszaniny sprzężonych estrogenów zawartej w moczu i oddziela się semipolarną polimerową żywicę adsorpcyjną obciążoną mieszaniną sprzężonych estrogenów od pozostałości moczu,

b) semipolarną polimerową żywicę adsorpcyjną obciążoną mieszaniną sprzężonych estrogenów przemywa się wodą myjącą o pH nastawionym na przynajmniej 12,0, w szczególności od 12,5 do 14,0,

c) przemytą żywicę adsorpcyjną kontaktuje się z cieczą wymywającą w ilości wystarczającej do desorpcji zaadsorbowanej naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów, która stanowi organiczny rozpuszczalnik mieszający się z wodą z grupy mieszających się z wodą eterów, niższych alkanowi i niż szych ketonów lub mieszaninę rozpuszczalnika mieszają cego się z wodą i wody ewentualnie o odczynie nastawionym w zakresie alkalicznym i oddziela się eluat zawierają cy naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów od żywicy adsorpcyjnej i ewentualnie zatęża, przy czym sposób według wynalazku w stosunku do sposobu ze znanego stanu techniki odznacza się tym, że między etapami sposobu b) i c) przeprowadza się dodatkowy etap wymywania, w którym semipolarną polimerową żywicę adsorpcyjną obciążoną mieszaniną sprzężonych estrogenów wymywa się wodą.

Przygotowanie szarż do znanych jako takie etapów sposobu a), b) i c) oraz zastosowanie eluatu otrzymanego w etapie c), który zawiera naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów, zostało już generalnie opisane w publikacji Międzynarodowego Zgłoszenia Patentowego WO 98/08526 a więc jest znane fachowcom z tego opublikowanego zgłoszenia patentowego. Treść tej publikacji WO 98/08526 staje się także częścią przedmiotu niniejszego zgłoszenia jako ujawnienie. Dalsze szczegóły dotyczące ogólnego sposobu postępowania i stosowanych materiałów zostały zestawione w części dotyczącej przykładów niniejszego zgłoszenia. Można przykładowo stosować semipolarne, w szczególności semipolarne niejonowe, żywice adsorpcyjne według publikacji WO 98/8526. Ponadto w sposobie według niniejszego wynalazku, razem z etapem międzyoperacyjnego wymywania, możliwe jest także stosowanie innych żywic adsorpcyjnych bez ujemnego wpływu na jakość produktu, względnie zachowywanie norm farmaceutycznych. Żywice adsorpcyjne stosowane w ramach niniejszego wynalazku zostaną bliżej objaśnione poniżej w dalszej części opisu.

Według wynalazku, semipolarną żywicę adsorpcyjną, obciążoną mieszaniną sprzężonych estrogenów, otrzymaną w etapie a), po następującym dalej etapie b) wymywa się wodą w etapie mycia międzyoperacyjnego. Ilość wody myjącej wybiera się tak, żeby eluat otrzymany w następującym dalej etapie c) zawierał mieszaninę sprzężonych estrogenów, która będzie spełniać wymagania dotyczące najwyższych zawartości wolnych estrogenów, aby można ją było stosować jako składnik czynny dla leków. Jako odpowiednie okazało się przykładowo zastosowanie 2 do 8, korzystnie 3 do 5 objętości wody myjącej w stosunku do jednej objętości złoża żywicy adsorpcyjnej. W tym wypadku wodę myjącą przepuszcza się odpowiednio przez reaktor zawierający żywicę adsorpcyjną z szybkościami przepływu od 3 do 10, korzystnie 5 do 7 części objętościowych wody myjącej na 1 część objętościową żywicy adsorpcyjnej na godzinę.

PL 205 545 B1

Wyraźnie nieoczekiwane jest to, że rzekomo proste mycie żywicy adsorpcyjnej wodą, przeprowadzone między etapami b) i c), także przy stosowaniu zestarzałego PMU prowadzi do tego rodzaju optymalizacji norm farmaceutycznych naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów uzyskiwanej jako ekstrakt substancji czynnej, jaka została stwierdzona według wynalazku. W szczególności, jest bardzo nieoczekiwane, że można przede wszystkim w sposób pewny tak zmniejszyć podwyższoną zawartość wolnych estrogenów zawartych w zestarzałym PMU, że w etapie c) można, jako eluat, uzyskać mieszaninę naturalnych sprzężonych estrogenów, która spełnia wysokie wymagania norm farmaceutycznych, w szczególności wymagania ustanowione w USP lub Farmakopei Europejskiej, a zwł aszcza, ż e takż e z zestarzał ego PMU moż na uzyskać jakoś ciowo i iloś ciowo wysokowartoś ciowy ekstrakt, zawierający naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów. Te ekstrakty substancji czynnej utrzymują w sposób bezpieczny maksymalnie tolerowane najwyższe zawartości wolnych estrogenów niezależnie od „starości i pochodzenia stosowanego PMU i okazują się być korzystnym i pełnowartościowym surowcem do wytwarzania leków. Także i w trudnych warunkach można w ten sposób uniknąć niepożądanej i niekorzystnej ekonomicznie straty cennego surowca farmaceutycznego, jakim jest w tym wypadku mieszanina naturalnych sprzężonych estrogenów.

Jako dalsza korzyść w sposobie według niniejszego wynalazku, okazało się, że eluat uzyskiwany w etapie c), w porównaniu do stanu techniki, wykazuje zwiększoną zawartość łączną hormonów w przeliczeniu na substancję stałą. Dzię ki temu uzyskuje się, np., znacznie lepszą jakość produktu w odniesieniu do zawartoś ci substancji czynnej.

W korzystnej postaci wykonania sposobu według wynalazku etap wymywania mię dzyoperacyjnego przeprowadza się w temperaturach poniżej temperatury pokojowej, w szczególności w temperaturach między 0°C a 10°, ponieważ okazało się, że w ten sposób można zmniejszyć straty hormonów, względnie substancji czynnych uwarunkowane przez dodatkowe mycie międzyoperacyjne.

Jako temperatury pokojowe rozumie się zwykle temperatury otoczenia, np., temperatury, które leżą między 20°C a 30°C. Jest bardzo celowe, aby sposób realizować przy temperaturach rzeczywiście 0°C, względnie zbliżonych do 0°C. W praktyce zalecane jest, aby pracować w temperaturach bliskich powyżej 0°C i zabezpieczać zachowanie wymienionego zakresu temperatury przez stosowanie odpowiednich środków. Można tu spotkać zwykłe typowe przedsięwzięcia podejmowane dla obniżania temperatury, np., stosowanie chłodzonych reaktorów, schładzanie materiałów i/lub schładzanie surowców, takich jak PMU. Jako temperatury 0°C względnie zbliżone do 0°C, z punktu widzenia niniejszego wynalazku z praktycznego punktu widzenia można traktować temperatury od 0°C do około 5°C, w szczególności od 0°C do około 3°C.

Aby możliwą stratę hormonów podczas mycia międzyoperacyjnego zachować na poziomie tak małym jak to możliwe, według tego wariantu wynalazku, wodę myjącą o odczynie alkalicznym stosowaną podczas mycia międzyoperacyjnego i/lub także stosowaną podczas etapu b) schładza się wstępnie do temperatur poniżej temperatury otoczenia, w szczególności do temperatur między 0°C a 10°C. Dalsze odpowiednie wzglę dnie korzystne zakresy temperatur wynoszą jak to poprzednio podano, czyli od 0°C do około 5°C, w szczególności od 0°C do około 3°C. Korzystnie pracuje się w temperaturze 0°C względnie zbliżonej do 0°C, to znaczy korzystne jest, aby wodę myjącą o odczynie alkalicznym stosowaną podczas mycia międzyoperacyjnego i/lub także stosowaną podczas etapu b) schładzać wstępnie do temperatury zbliżonej do temperatury powyżej 0°C. Przez zastosowanie schłodzonej wody myjącej nastawionej na odczyn alkaliczny w etapie b) uzyskuje się już tego typu schłodzenie lub zachowanie stanu ochłodzenia żywicy adsorpcyjnej, że przy zastosowaniu schłodzonej wody myjącej do międzyoperacyjnego mycia unika się, np., występowania jej niepożądanego ponownego ogrzewania. Dlatego korzystnie oba etapy, tzn. mycie międzyoperacyjne i poprzedzający etap b) przeprowadza się w tym samym zakresie temperatur, np., w temperaturach poniżej temperatury pokojowej, w szczególności w temperaturach między 0°C a 10°C, a korzystnie w zakresie temperatur, jaki został podany wyżej.

W przedstawionym wyżej wariancie wynalazku, w którym sposób realizuje się w temperaturach poniżej temperatury pokojowej, może być potrzebne, aby wszystkie stosowane urządzenia, takie jak reaktory do przyjmowania semipolarnej żywicy adsorpcyjnej lub reaktory już ją zawierające i/lub do stosowanego PMU schładzane były wstępnie odpowiednio do temperatur poniżej temperatury pokojowej, w szczególności do temperatur między 0°C a 10°C, a korzystnie do zakresu temperatur, jaki został podany wyżej.

Jako środki do adsorpcji w sposobie według niniejszego wynalazku nadają się polimerowe żywice adsorpcyjne. Szczególnie korzystnymi żywicami adsorpcyjnymi są semipolarne, w szczePL 205 545 B1 gólności niejonowe semipolarne polimerowe żywice adsorpcyjne. Semipolarnymi polimerowymi żywicami adsorpcyjnymi, stosowanymi jako środki do adsorpcji, są korzystnie porowate organiczne niejonowe polimery, które w odróżnieniu do nie polarnych hydrofobowych polimerowych żywic do adsorpcji posiadają pośrednią polarność powierzchni aktywnej żywicy w zakresie od 1,0 do 3,0, w szczególności 1,5 do 2,0 debaja i nieco bardziej hydrofilową budowę, przykładowo żywice z polimerowych estrów kwasów karboksylowych. Celowo stosuje się makroporowate semipolarne żywice o korzystnie makroporowatej budowie i o przeciętnej średnicy porów w zakresie od 50 do 150, korzystnie 70 do 100 angstremów i powierzchni właściwej w zakresie od 300 do 900, korzystnie 400 do 500 m²/g. Jako szczególnie korzystne okazały się makroporowate usieciowane alifatyczne żywice z polimerowych estrów kwasów karboksylowych, w szczególności usieciowane żywice z poli(estrów akrylowych), takie jak np., Amberlite XAD-7^R firmy Rohm i Haas, które są niejonowymi semipolarnymi żywicami adsorpcyjnymi.

Obok wymienionych środków adsorpcyjnych można stosować także i inne żywice adsorpcyjne. Jako żywice adsorpcyjne nadają się przy tym zarówno nie polarne, semipolarne jak i polarne żywice adsorpcyjne. Ilości moczu, które można przepompowywać przez żywicę, należy w tym wypadku określać każdorazowo w zależności od pojemności adsorpcyjnej. Przykładami stosowanych typów żywic adsorpcyjnych są typy spotykane w handlu takie jak polimerowe adsorbenty typu Amberlitu o szkielecie podstawowym ze styrenu i diwinylobenzenu (np., typy XAD-1180, XAD-2, XAD-4, XAD-16), o szkielecie podstawowym z estrów akrylowych (np. XAD-7) lub o silnie polarnym szkielecie podstawowym, zawierającym azot i tlen (np., XAD-12). Innymi żywicami adsorpcyjnymi są żywice Dowex (kopolimery styrenu i diwinyloenzenu), takie jak np., Dowex 112, Dowex Optipore, Dowex Optipore V 493; Lewatit'y (usieciowane polistyreny), np., Lewatit OC 1064, Lewatit OC 1066 lub Lewatit OC 1163, poliaminowe anionowe żywice jonowymienne np., żywice Dowex. Korzystnymi żywicami adsorpcyjnymi są w szczególności XAD-7, XAD-16 (typ HP), XAD 118 i Dowex Optipore, korzystnie Dowex Optipore V 493 oraz Lewatit 'y OC 1064, OC 1066 i OC 1163.

Sposób według wynalazku, jak to już opisano poprzednio, oferuje szereg korzyści i ulepszeń w stosunku do stanu techniki. I tak, wynalazek umożliwia stosowanie także zestarzałego PMU, który może wykazywać także zwiększony udział wolnych estrogenów, bez zagrożenia dla zachowania norm farmaceutycznych. Sposób według wynalazku wykazuje więc dlatego także korzyści ekonomiczne, ponieważ znacznie obniża się dzięki temu niebezpieczeństwo straty cennych substancji czynnych bez zachowania norm farmaceutycznych, np., z zawartością wolnych estrogenów w już nie tolerowanych granicach. Sposoby według wynalazku dostarczają składników czynnych o podwyższonej jakości, ze zwiększoną zawartością hormonów w przeliczeniu na substancję stałą. Te składniki czynne nadają się doskonale do wytwarzania leków, które zawierają mieszaninę naturalnych sprzężonych estrogenów, jako substancję czynną.

Podane dalej przykłady powinny bliżej objaśniać wynalazek, bez ograniczenia jego zakresu.

P r z y k ł a d y

W następujących dalej przykładach zostaną podane ogólne sposoby postępowania dla uzyskania ekstraktów substancji czynnych z PMU, które zawierają naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów zawartych w PMU i są silnie zubożone w fenolowe składniki moczu. Okazało się, że można uzyskiwać jakościowy ekstrakt o wysokiej zawartości substancji czynnej, także i z zestarzałego PPU, który może wykazywać zwiększony udział wolnych estrogenów.

Sposób według publikacji WO 98/08526

W sposobie według wynalazku, jak i w sposobie według WO 98/08526, można stosować PMU jako taki, koncentrat uzyskany z niego przez zatężanie lub przesącz uzyskany z niego przez filtrację membranową. Zebrany mocz uwalnia się najpierw w znany sposób od substancji śluzowych i substancji stałych. Można go pozostawić odpowiednio do odstania substancji stałych i śluzu i oddzielić te substancje znanymi sposobami oddzielania, przykładowo przez dekantację, separację i/lub filtrację. Tak więc, można PMU przykładowo wprowadzić do znanego urządzenia do rozdzielania, np., separatora, urządzenia do filtracji lub urządzenia do sedymentacji. Jako urządzenie do rozdzielania może służyć np., złoże piaskowe lub też można stosować znane separatory znajdujące się w handlu, takie jak np., separatory dyszowe lub komorowe. Można stosować także według życzenia, urządzenie do mikrofiltracji lub ultrafiltracji, przy stosowaniu których równocześnie można uzyskać oddzielenie zarazków i wirusów z filtrowanego PMU.

PL 205 545 B1

Jeśli to potrzebne, do moczu można dodać środka konserwującego, środka zarazkobójczego, środka bakteriobójczego i/lub środka przeciwczerwiowego.

Jeśli zamiast PMU powinien być stosowany zatężony przesącz z filtracji PMU, to można go uzyskiwać z PMU znanymi sposobami filtracji membranowej. Zawartość substancji stałych w przesączu i jego skład mogą zmieniać się w zależności od zastosowanego PMU i membrany stosowanej podczas filtracji, przykładowo wielkości jej porów oraz warunków filtracji. Podczas stosowania membrany do nanofiltracji można przykładowo w przybliżeniu bez strat uzyskać zatężenie zawartości estrogenów w przesączu z PMU z usunięciem do 50% wagowych niskocząsteczkowych składników moczu. W sposobie według wynalazku można stosować przesącze, które zostały zatężone do stosunku około 1:10, przykładowo w stosunku 1:7 i których objętość może być zatężona do około 1/10, przykładowo około 1/7 początkowej objętości PMU.

Semipolarne polimerowe żywice adsorpcyjne stosowane w etapie a) są porowatymi organicznymi niejonowymi polimerami, które w przeciwieństwie do nie polarnych hydrofobowych polimerowych żywic adsorpcyjnych posiadają pośrednią polarność powierzchni aktywnej żywicy w zakresie od 1,0 do 3,0, w szczególności 1,5 do 2,0 debaja i nieco bardziej hydrofilową budowę , przykładowo żywice z polimerowych estrów kwasów karboksylowych. Odpowiednio stosuje się makroporowate semipolarne żywice o korzystnie makroporowatej budowie i o przeciętnej średnicy porów w zakresie od 50 do 150, korzystnie 70 do 100 angstremów i powierzchni właściwej w zakresie od 300 do 900, korzystnie 400 do 500 m²/g. Jako szczególnie korzystne okazały się makroporowate usieciowane alifatyczne żywice z polimerowych alifatycznych estrów kwasów karboksylowych, w szczególności usieciowane żywice z poli(estrów akrylowych), takie jak np., Amberlite XAD-7^R firmy Rohm i Haas.

Adsorpcję sprzężonych estrogenów na semipolarnych żywicach adsorpcyjnych sposobem według WO 98/08526 jak i według niniejszego wynalazku, można realizować przez kontaktowanie PMU lub jego przesączu z żywicą adsorpcyjną, wprowadzając mocz do reaktora zawierającego żywicę adsorpcyjną i utrzymując ją w kontakcie z żywicą adsorpcyjną przez czas wystarczający do adsorpcji zawartości estrogenów. Po przeprowadzeniu adsorpcji sprzężonych estrogenów na semipolarnej żywicy adsorpcyjnej, można oddzielić żywicę adsorpcyjną z obciążoną na niej mieszaniną sprzężonych estrogenów od pozostałej cieczy z moczu w znany sposób. Mocz można przeprowadzać odpowiednio przez kolumnę zawierającą żywicę adsorpcyjną z taką szybkością przepływu, żeby czas kontaktu wystarczył do adsorpcji zawartości estrogenów. Odpowiednie są przykładowo szybkości przepływu, które odpowiadają przepływowi 3 do 10, korzystnie 5 do 7 części objętościowych PMU na 1 część objętościową żywicy adsorpcyjnej na godzinę. Szybkość przepływu moczu przez reaktor można nastawiać odpowiednio poprzez pracę przy nadciśnieniu lub podciśnieniu. Ilości semipolarnej żywicy adsorpcyjnej do stosowania mogą zmieniać się w zależ noś ci od typu stosowanej ż ywicy adsorpcyjnej i iloś ci zawartoś ci substancji stał ych w moczu. Przy stosowaniu PMU można przykładowo jedną część objętościową żywicy adsorpcyjnej, np., usieciowanej żywicy adsorpcyjnej z alifatycznego poli(estru kwasu karboksylowego) obciążać do 80 częściami objętościowymi przygotowanego wstępnie PMU, bez wykrywania znaczniejszych ilości estrogenu w odpływającej cieczy z moczu. Przy zastosowaniu koncentratu PMU lub przesączu z filtracji membranowej pojemność obciążania żywicy adsorpcyjnej naturalnie zmniejsza się w zakresie, w jakim są one zatężone. Moż na więc przykładowo jedną część obję toś ciową usieciowanej żywicy adsorpcyjnej z alifatycznego poli(estru kwasu karboksylowego) obciążać cieczą z moczu w iloś ci odpowiadają cej 20 do 80 części obję toś ciowych, korzystnie 30 do 50 części objętościowych PMU.

Semipolarną żywicę adsorpcyjną obciążoną mieszaniną sprzężonych estrogenów myje się w etapie b) wodą myją c ą o pH nastawionym na przynajmniej 12,0, w szczególnoś ci od 12,5 do 14, korzystnie około 12,5 do 13,5. Jako wodę myjącą można stosować wodne roztwory obojętnych substancji zasadowych rozpuszczalnych w cieczy z moczu, które są wystarczająco silne, aby uzyskać pH przynajmniej 12,5. Jako rozpuszczalne w wodzie substancje zasadowe, obojętne w stosunku do semipolarnych żywic adsorpcyjnych nadają się korzystnie nieorganiczne zasady rozpuszczalne w wodzie, takie jak wodorotlenki metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, w szczególności wodorotlenek sodu. Woda myją ca zawiera odpowiednio tylko taką ilość substancji zasadowej, która jest potrzebna do uzyskania żądanego pH, korzystnie około 13. Ilość wody myjącej wybiera się tak, aby wystarczyła ona do znacznego usunięcia fenolowych składników moczu, bez równoczesnego wymywania godnych wzmianki ilości sprzężonych estrogenów. Jako

PL 205 545 B1 odpowiednie okazało się przykładowo zastosowanie 2 do 10, w szczególności 4 do 6 objętości złoża cieczy myjącej na objętość złoża żywicy adsorpcyjnej. Wodę myjącą przepuszcza się przy tym odpowiednio przez reaktor zawierający żywicę adsorpcyjną z szybkością przepływu 3 do 10, korzystnie 4 do 7 części objętościowych wody myjącej na 1 część objętościową żywicy adsorpcyjnej na godzinę.

Wymytą żywicę adsorpcyjną, obciążoną mieszaniną sprzężonych estrogenów obrabia się następnie w etapie c) wystarczającą ilością cieczy do wymywania mieszaniny sprzężonych estrogenów i odzyskuje się z eluatu zawartą tam naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów z PMU. Ciecz do wymywania stosowana według wynalazku stanowi rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą z grupy eterów, niższych alkanoli i niższych alifatycznych ketonów mieszających się z wodą lub mieszaninę takiego rozpuszczalnika mieszającego się z wodą i wody o pH ewentualnie nastawionym na zakres alkaliczny. Jako składniki eterowe cieczy do wymywania nadają się etery cykliczne mieszające się z wodą, takie jak tetrahydrofuran lub dioksan oraz także etery o otwartym pierścieniu mieszające się z wodą, takie przykładowo, jak eter dimetylowy glikolu etylenowego (= monoglyme), eter dimetylowy glikolu dietylenowego (= diglyme), lub etylooksyetylooksyetanol (= carbitol). Jako niższe alkanole nadają się alkohole alkilowe mieszające się z wodą , zawierają ce 1 do 4, korzystnie 1 do 3 atomów wę gla, w szczególnoś ci etanol lub izopropanol. Jako niższe ketony alifatyczne nadają się ketony mieszające się z wodą, zawierające 3 do 5 atomów węgla, w szczególnoś ci aceton. Jako szczególnie korzystne okazał y się ciecze do wymywania, w których rozpuszczalnikiem organicznym jest etanol. Jako ciecze do wymywania celowo stosuje się mieszaniny z wyżej wymienionego organicznego rozpuszczalnika mieszającego się z wodą i wody, o pH nastawionym celowo na zakres alkaliczny. Wartość pH tego rodzaju cieczy do wymywania zawierającej wodę leży w zakresie od obojętnego do alkalicznego do 13.0 i może wynosić korzystnie około 10 do 12. Jako składniki rozpuszczalnikowe w cieczach do wymywania zawierających wodę wybiera się rozpuszczalnik trwały w danym zakresie pH. Jako składnik rozpuszczalnikowy w cieczach alkalicznych zawierających wodę o wartościach pH od około 10 do 12 nadają się niższe alkohole, korzystnie etanol. Żądany zakres pH środka do wymywania zawierającego wodę nastawia się przez dodanie odpowiedniej ilości obojętnej substancji zasadowej rozpuszczalnej w wodzie, korzystnie zasady nieorganicznej, przykładowo wodorotlenku metalu alkalicznego lub metalu ziem alkalicznych, w szczególności wodorotlenku sodu. W cieczach do wymywania zawierających wodę stosunek objętościowy rozpuszczalnika mieszającego się z wodą do wody może leżeć w zakresie 40:60 do 20:80, korzystnie około 30:70. Stosowana ilość środka wymywającego może wynosić około 3 do 10, w szczególności około 4 do 6 wielokrotności objętości złoża żywicy adsorpcyjnej. Ciecz do wymywania przepuszcza się odpowiednio przez reaktor zawierający żywicę adsorpcyjną obciążoną estrogenami z taką szybkością, żeby czas kontaktu wystarczył do całkowitego wymycia mieszaniny sprzężonych estrogenów. Przy zastosowaniu mieszaniny etanolu z wodą w stosunku 30:70 odpowiednie są przykładowo szybkości przepływu 3 do 10, korzystnie 5 do 7 części objętościowych cieczy wymywającej na 1 część objętościową żywicy adsorpcyjnej na godzinę. Wymywanie prowadzi się celowo w zakresie temperatur do około 60°C, korzystnie około 40 do 50°C. Jeśli to potrzebne, szybkość przepływu reguluje się pracując pod nieco zwiększonym ciśnieniem, np., przy nadciśnieniu do 0,2 bara (0,02 MPa) a odciek wyłapuje się w wielu frakcjach. Zawartości sprzężonych estrogenów i fenolowych składników moczu, takich jak krezole i HPMF w poszczególnych frakcjach można oznaczyć w znany sposób przez wysokosprawną chromatografię cieczową (= high performance liquid chromatography, w skrócie „HPLC).

Podczas wymywania otrzymuje się najpierw słabo zabarwioną do bezbarwnej frakcję przegonu, praktycznie nie zawierającą estrogenów, której ilość odpowiada ogólnie około jednej objętości złoża. Główna ilość sprzężonych estrogenów, przykładowo między 80 a 99% sprzężonych estrogenów zawartych w wyjściowym PMU, znajduje się w następujących dalej głównych frakcjach eluatu zabarwionych na ciemnożółto - brązowo, których ilość ogólnie odpowiada 2 do 4 objętościom złoża. W następujących dalej frakcjach pogonu zawarte są ogólnie tylko ślady sprzężonych estrogenów. Jeśli otrzymuje się frakcje pogonu, które zawierają jeszcze zawartość sprzężonych estrogenów powyżej 10% wagowych w przeliczeniu na suchą substancję i mniej niż 0,6% wagowych krezoli i HPMF w przeliczeniu na suchą substancję, można je dołączyć do głównych frakcji eluatu zawierających estrogeny w celu dalszej obróbki.

PL 205 545 B1

P r z y k ł a d 1 (przykład porównawczy)

a) Adsorpcja zawartości estrogenów z PMU na semipolarnej żywicy adsorpcyjnej z poli(estru akrylowego)

Kolumnę o wysokości 220 mm o średnicy 40 mm napełnia się 300 ml semipolarnej żywicy adsorpcyjnej ze spęczniałego poli(estru akrylowego) (= Amberlite XAD-7 firmy Rohm i Haas, średnica ziaren 0,3 do 1,2 mm, moment dipolowy 1,8 debaja, przeciętna średnica porów 80 angstremów, powierzchnia właściwa około 450 m²/g w stanie suchym). Przez kolumnę w temperaturze pokojowej przepuszcza się 10,5 l (= 35 objętości złoża) PMU przefiltrowanego w urządzeniu do ultrafiltracji (zawartości estrogenów i krezolu oznaczone metodą HPLC patrz następująca dalej tabela dla przykładu) z przeciętną szybkością przepływu 24 ml/min (= 4,8 objętości złoża na godzinę). Zawartość estrogenów z PMU zostaje całkowicie zaadsorbowana na tak załadowanej kolumnie z żywicą adsorpcyjną. Odpływającą ciecz z moczu bada się metodą HPLC na zawartość sprzężonych estrogenów (w przeliczeniu na sól siarczanową estronu) i okazuje się ona praktycznie nie zawierać estrogenów. Odciek wyrzuca się.

b) Mycie kolumny z obciążoną żywicą adsorpcyjną

Kolumnę z obciążoną żywicą adsorpcyjną myje się 1,5 l wodnego roztworu wodorotlenku sodu o pH 13. W tym celu, alkaliczną wodę myjącą przepuszcza się przez kolumnę ze średnią szybkością przepływu 24,6 ml/min (= 4,9 objętości złoża na godzinę). Opływającą ciecz myjącą bada się metodą HPLC na zawartość estrogenów i krezolu. Badanie pokazuje, że podczas fazy wymywania wymyte zostaje mniej niż 5% łącznej ilości estrogenu podawanego na kolumnę.

c) Desorpcja sprzężonych estrogenów z wymytej kolumny z żywicą adsorpcyjną

1,5 litra cieczy wymywającej (etanol/woda, 30:70) przepuszcza się z szybkością przepływu 25 ml/min (= 5,0 objętości złoża na godzinę) przez kolumnę ogrzaną do temperatury wymywania podanej w tabeli dotyczącej przykładu. Odpływający eluat wyłapuje się w postaci 5 frakcji. Frakcje każdorazowo mają objętość 300 ml (= 1 objętość złoża) i podaje się je badaniu na zawartość soli siarczanowej estronu i krezolu metodą HPLC.

Pierwsza frakcja zawiera tylko ślady soli siarczanowej estronu. Eluat wydaje się bezbarwny do zabarwionego na lekko żółty. W dalszych frakcjach 2 do 4 zawarte jest następnie około 80 do 98% łącznej ilości sprzężonych estrogenów zaadsorbowanych na kolumnie. Eluaty mają w tym wypadku intensywnie ciemnobrązowe odcienie. Ostatnie frakcje zawierają tylko niewielkie ilości soli siarczanowej estrogenu, co jest także widoczne przez zmniejszenie intensywności barwy.

Dla głównych frakcji, które są frakcjami zawierającymi główne ilości sprzężonych estrogenów, w następującej dalej tabeli podane zostały każdorazowo zawartości w % wagowych TS (w przeliczeniu na substancję suchą) udziału soli siarczanowej estronu i krezolu oznaczane metodą HPLC. Te frakcje stanowią ekstrakty nadające się do dalszej obróbki galenowej.

d) Regeneracja kolumny z żywicą adsorpcyjną

W celu regeneracji, kolumnę wymywa się najpierw za pomocą 600 ml nastawionej na pH=12 mieszaniny woda - etanol o stężeniu 50% etanolu, następnie 600 ml nastawionej na pH=12 mieszaniny woda - etanol o stężeniu 70% etanolu, następnie 600 ml wodnego roztworu cytrynianu sodu o stężeniu 10% a następnie 600 ml wody destylowanej. Całą regenerację przeprowadza się w temperaturze około 45°C. Kolumnę można ładować i regenerować wielokrotnie, przykładowo do 40 razy.

P r z y k ł a d 2 (sposób według wynalazku)

Powtarza się przykładl z międzyoperacyjnym wymywaniem między etapami b) i c) podanego sposobu.

Mycie międzyoperacyjne

Obciążoną kolumnę z żywicą adsorpcyjną wymywa się za pomocą 900 ml wody. W tym celu przez kolumnę przepuszcza się obojętną wodę myjącą z szybkością przepływu średnio 25,0 ml/min (= 5,0 objętości złoża na godzinę).

Odpływającą wodę myjącą bada się na zawartość soli sodowej estronu i krezolu za pomocą HPLC. Badanie pokazuje, że podczas tej fazy mycia wymywany jest tylko niewielki udział (maksymalnie tylko około kilku procent) łącznej ilości estrogenów podawanych na kolumnę. Według wynalazku zmniejsza się jednak także udział wolnych estrogenów podczas stosowania sposobu według wynalazku (patrz przykład 4).

PL 205 545 B1

T a b e l a 1: Wyniki dla przykładu porównawczego 1 i przykładu 2 według wynalazku

Numer przykładu	1	2
1	2	3
Etap a)
Wyjściowy PMU estron mg/ml		86,4	92,3
ekwilina mg/ml		57,0	57,0
krezol mg/ml		1191,1	877,6
Etap b)
Woda myjąca = wodny roztwór NaOH	pH 13	pH 13
Mycie międzyoperacyjne
woda myjąca = woda Frakcja wymywana 1:	Porównawczy:
estron mg/ml		nie przeprowadzano	0,0
ekwilina mg/ml		mycia	20,9
krezol mg/ml		międzyoperacyjnego	18,0
Frakcja wymywana 2:
estron mg/ml			125,0
ekwilina mg/ml			0,0
krezol mg/ml			0,0
Frakcja wymywana 3:
estron mg/ml			290,6
ekwilina mg/ml			138,0
krezol mg/ml			31,5
Etap sposobu c)
Ciecz wymywająca	etanol/woda 30:70	etanol/woda 30:70
Temperatura wymywania	45°C	45°C
Frakcja eluatu 1:	% wagowe TS	4,3	0,2
estron mg/ml	(% wagowe TS)	0,0 (0,00)	342,7 (17,14)
ekwilina mg/ml	(% wagowe TS)	24,8 (0,06)	182,6 (9,13)
Frakcja eluatu 2:	% wagowe TS	1,9	0,9
estron mg/ml	(% wagowe TS)	2788,6 (14,68)	2053,5 (22,81)
ekwilina mg/ml	(% wagowe TS)	1258,0 (8,04)	1120,1 (12,45)
Frakcja eluatu 3:	% wagowe TS	0,2	0,2
estron mg/ml	(% wagowe TS)	193,2 (9,66)	38,9 (1,95)
ekwilina mg/ml	(% wagowe TS)	99,8 (4,99)	19,8 (0,99)
Frakcja eluatu 4:	% wagowe TS	0,1	0,1
estron mg/ml	(% wagowe TS)	7,1 (0,71)	0,0 (0,00)
ekwilina mg/ml	(% wagowe TS)	9,3 (0,93)	0,0 (0,00)

P r z y k ł a d 3 (sposób według wynalazku z chłodzeniem)

Zmniejszenie strat hormonów podczas obojętnego mycia

Pracuje się jak w przykładach 1 i 2, jednak stosując chłodzenie. Chłodzenie służy do zminimalizowania strat hormonów podczas mycia międzyoperacyjnego. Jeśli mycie międzyoperacyjne, zamiast w temperaturze pokojowej, przeprowadza się wodą o temperaturze lodu, to straty hormonów można obniżyć o około 50%, w szczególności, gdy temperatura w sposobie wynosi rzeczywiście 0°C względnie w pobliżu 0°C. W tym celu zaleca się dodawanie nie tylko wody o temperaturze lodu, która ze

PL 205 545 B1 względu na to, że zawartość kolumny ma temperaturę otoczenia, może szybko się ogrzać, lecz o wiele lepiej, chłodzenie całej kolumny do temperatury 0°C.

Przeprowadzenie doświadczenia

Temperaturę kolumny 0°C, wymaganą do mycia międzyoperacyjnego, uzyskuje się przez chodzenie podczas poprzedzającego mycia zasadowego, to znaczy mycie zasadowe przebiega już w 0°C. Podawanie 5 objętości złoża zasadowej cieczy myjącej o temperaturze 0°C jest przy tym wystarczające do schłodzenia zawartości kolumny od temperatury otoczenia do 0°C. Następujące po tym mycie międzyoperacyjne może przebiegać w tym wypadku w 0°C. Obok zminimalizowania straty hormonów bada się także możliwy wpływ temperatury na oddzielanie krezolu podczas mycia zasadowego.

Dla bezpośredniego porównania przeprowadza się dwa doświadczenia:

P r z y k ł a d 3a:

Mycie zasadowe i mycie międzyoperacyjne w temperaturze pokojowej .

P r z y k ł a d 3b:

Mycie zasadowe i mycie międzyoperacyjne w temperaturze 0°C.

Wszystkie inne etapy prowadzi się standardowym sposobem, jaki opisano wyżej dla sposobu według WO 98/8526 lub w przykładach 1 i 2.

Wyniki doświadczenia:

Tabela III podaje parametry doświadczeń i wyniki doświadczeń w temperaturze pokojowej i z zastosowaniem obróbki w temperaturze 0°C.

Z wyników doświadczeń można wyraźnie zauważyć, że:

a) na zasadowe mycie, tzn., oddzielanie krezolu, nie wpływa się w ujemny sposób przez obniżenie temperatury do 0°C. Oddzielanie krezolu przebiega ilościowo. Tabela III podaje pogląd na tę sprawę.

b) Straty hormonów podczas mycia międzyoperacyjnego obniżyły się o około 50% przez obniżenie temperatury. Tabela II podaje pogląd na tę sprawę.

T a b e l a II: Strata hormonów i jej minimalizowanie przez mycie międzyoperacyjne w 0°C.

Numer przykładu	3a	3b
	Temperatura pokojowa (T = ok. 25°C)	Temperatura wody z lodem (T = ok. 0°C)
estron	2,7% wag.	1,8% wag.
ekwilina	3,4% wag.	1,4% wag.

Podawanie ługu sodowego o temperaturze około 0°C podczas zasadowego mycia daje więc prostą możliwość obniżenia strat hormonów podczas mycia międzyoperacyjnego bez równoczesnego ujemnego wpływu na oddzielanie krezolu przez pracę w temperaturze około 0°C.

Obniżenie temperatury podczas mycia międzyoperacyjnego do około 0°C umożliwia zminimalizowanie, tzn. zmniejszenie nieuniknionych strat hormonów podczas dodatkowego mycia międzyoperacyjnego o około 50%.

Obróbkę cieplną kolumny podczas mycia międzyoperacyjnego można uzyskać w prosty sposób, gdy zasadowe mycie przeprowadzane przed myciem międzyoperacyjnym przebiega także w temperaturze 0°C. Przez obniżenie temperatury nie wpływa się ujemnie na oddzielanie krezolu przebiegające podczas zasadowego mycia.

T a b e l a III: Realizacja sposobu według wynalazku w temperaturze pokojowej i z zastosowaniem chłodzenia

Numer przykładu	1	2
	Temperatura pokojowa	Temperatura wody z lodem
	(T = ok. 25°C)	(T = ok. 0°C)
1	2	3
Etap a)
Wyjściowy PMU estron mg/ml	64,9	65,4
ekwilina mg/ml	57,9	57,6
krezol mg/ml	329,0	333,0

PL 205 545 B1 cd. tabeli III

1	2	3
Etap b)
Woda myjąca = wodny roztwór NaOH	pH 13	pH 13
Frakcja wymywana 1: estron mg/ml	4,4	1,7
ekwilina mg/ml	0,0	1,6
krezol mg/ml Frakcja wymywana 2:	55,1	51,6
estron mg/ml	28,8	27,9
ekwilina mg/ml	31,5	24,8
krezol mg/ml Frakcja wymywana 3:	6942,5	7011,0
estron mg/ml	0,0	0,0
ekwilina mg/ml	11,5	18,3
krezol mg/ml Frakcja wymywana 4:	2215,2	2774,0
estron mg/ml	0,0	0,6
ekwilina mg/ml	0,0	3,2
krezol mg/ml Frakcja wymywana 5:	280,6	268,6
estron mg/ml	0,0	0,0
ekwilina mg/ml	0,0	0,0
krezol mg/ml	76,6	44,1
Straty hormonów we frakcjach 1-5 estron	1,5%	1,3%
ekwilina	2,1%	2,4%

Mycie międzyoperacyjne Woda myjąca = woda Frakcja wymywana 1: estron mg/ml	0,0	0,0
ekwilina mg/ml	0,0	0,0
krezol mg/ml	22,8	19,4
Frakcja wymywana 2: estron mg/ml	13,3	8,2
ekwilina mg/ml	9,7	5,9
krezol mg/ml	33,2	11,8
Frakcja wymywana 3: estron mg/ml	48,0	32,0
ekwilina mg/ml	58,3	23,3
krezol mg/ml	76,0	0,0
Straty hormonów we frakcjach 1-3 estron	2,7%	1,8%
ekwilina	3,4%	1,4%

Etap sposobu c)
Ciecz wymywająca	etanol/woda 30:70	etanol/woda 30:70
Temperatura wymywania	45°C	45°C
Frakcja eluatu 1:
% wagowe TS	0,2	0,2
estron mg/ml (% wagowe TS)	76,0 (3,80)	58,0(2,9)
ekwilina mg/ml (% wagowe TS)	65,8 (3,29)	48,2 (2,41)

PL 205 545 B1 cd. tabeli III

1	2	3
Frakcja eluatu 2:	% wagowe TS	1,0	0,9
estron mg/ml	(% wagowe TS)	1237,0 (12,37)	1145,6 (12,73)
ekwilina mg/ml	(% wagowe TS)	1093,8 (10,94)	1135,0 (12,61)
Frakcja eluatu 3:	% wagowe TS	0,4	0,5
estron mg/ml	(% wagowe TS)	607,8 (15,20)	840,0 (16,80)
ekwilina mg/ml	(% wagowe TS)	524,7 (13,12)	748,4 (14,97)
Frakcja eluatu 4:	% wagowe TS	0,1	0,1
estron mg/ml	(% wagowe TS)	84,6 (8,46)	144,6 (14,46)
ekwilina mg/ml	(% wagowe TS)	58,2 (5,82)	107,4 (10,74)
krezol mg/l	(% wagowe TS)	0,0 (0,00)	0,0 (0,00)
Frakcja eluatu 5:	% wagowe TS	0,1	0,1
estron mg/ml	(% wagowe TS)	21,1 (2,11)	34,3 (3,43)
ekwilina mg/ml	(% wagowe TS)	7,5 (0,75)	17,9 (1,79)
Frakcja eluatu 6: estron mg/ml	(% wagowe TS)	9,0	15,2
ekwilina mg/ml	(% wagowe TS)	0,0	3,4

P r z y k ł a d 4 (zmniejszenie zawartości wolnych hormonów)

Zgodnie ze sposobami postępowania z poprzednich przykładów 1 do 3 bada się, jak zmniejsza się zawartość wolnych hormonów przy zastosowaniu sposobu według wynalazku. Wyniki zostały przedstawione w następującej dalej tabeli IVa (dla przykładu porównawczego (bez mycia międzyoperacyjnego) i IVb (doświadczenie według wynalazku z myciem międzyoperacyjnym).

T a b e l a IV: Minimalizacja wolnych hormonów:

T a b e l a IVa: Przykład porównawczy bez mycia międzyoperacyjnego

	Zawartość wolnych estrogenów w koncentracie	Łączna zawartość sprzężonych estrogenów w przeliczeniu na zawartość substancji stałej w koncentracie
	(% wagowy)	(% wagowy)
Doświadczenie 1	3,21	3,2
Doświadczenie 2	3,67	4,4
Doświadczenie 3	2,38	9,2
Doświadczenie 4	4,14	12,2
Doświadczenie 5	4,03	9,9

T a b e l a IVb: Przykład z myciem międzyoperacyjnym (według wynalazku)

	Zawartość wolnych estrogenów w koncentracie	Łączna zawartość sprzężonych estrogenów w przeliczeniu na zawartość substancji stałej w koncentracie
	(% wagowy)	(% wagowy)
Doświadczenie 6	0,0	25,2
Doświadczenie 7	0,77	17,2
Doświadczenie 8	0,35	23,9
Doświadczenie 9	0,20	29,3
Doświadczenie 10	0,0	27,7

PL 205 545 B1

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób uzyskiwania naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów, zubożonej w fenolowe składniki moczu, z moczu źrebnych klaczy, w którym:

a) mocz, ewentualnie uwolniony od składników śluzowych i stałych, zatężony koncentrat moczu lub zatężony przesącz po filtracji membranowej moczu, kontaktuje się z polimerową żywicą adsorpcyjną, w ilości wystarczającej do adsorpcji mieszaniny sprzężonych estrogenów zawartej w moczu i oddziela się polimerową żywicę adsorpcyjną obciążoną mieszaniną sprzężonych estrogenów od pozostałości moczu,

b) polimerową żywicę adsorpcyjną obciążoną mieszaniną sprzężonych estrogenów przemywa się wodą myjącą o pH nastawionym na przynajmniej 12,0,

c) przemytą żywicę adsorpcyjną kontaktuje się z cieczą wymywającą, w ilości wystarczającej do desorpcji zaadsorbowanej naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów, która stanowi organiczny rozpuszczalnik mieszający się z wodą z grupy mieszających się z wodą eterów, niższych alkanowi i niż szych ketonów lub mieszaninę rozpuszczalnika mieszają cego się z wodą i wody ewentualnie o odczynie nastawionym w zakresie alkalicznym i oddziela się eluat zawierają cy naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów od żywicy adsorpcyjnej i ewentualnie zatęża, znamienny tym, że między etapami sposobu b) i c) przeprowadza się dodatkowy etap wymywania, w którym polimerową żywicę adsorpcyjną obciążoną mieszaniną sprzężonych estrogenów wymywa się wodą.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap wymywania przeprowadza się w temperaturach poniżej temperatury pokojowej, w szczególności w temperaturach między 0°C a 10°C, korzystnie w temperaturach nieco powyżej 0°C.
3. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrz., znamienny tym, że wodę stosowaną do etapu wymywania międzyoperacyjnego schładza się do temperatur poniżej temperatury pokojowej, w szczególności do temperatur między 0°C a 10°C, korzystnie do temperatur nieco powyż ej 0°C.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosowaną w etapie b) wodę, której odczyn nastawiony jest na odczyn alkaliczny schładza się do temperatur poniżej temperatury pokojowej, w szczególnoś ci do temperatur mię dzy 0°C a 10°C, korzystnie do temperatur nieco powyż ej 0°C.
5. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrz., znamienny tym, że etap wymywania międzyoperacyjnego i poprzedzający go etap b) przeprowadza się w temperaturach poniżej temperatury pokojowej, w szczególności w temperaturach między 0°C a 10°C, korzystnie w temperaturach nieco powyżej 0°C.
6. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrz., znamienny tym, że stosowane urządzenia, takie jak reaktory do przyjmowania polimerowej żywicy adsorpcyjnej lub reaktory już ją zawierające i/lub stosowany PMU wykorzystuje się w stanie schłodzonym do temperatur poniżej temperatury pokojowej, w szczególności do temperatur między 0°C a 10°C, korzystnie do temperatur nieco powyżej 0°C.
7. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrz., znamienny tym, że jako polimerową żywicę adsorpcyjną stosuje się semipolarną żywicę adsorpcyjną, korzystnie niejonową semipolarną żywicę adsorpcyjną.