ES2268125T3 - Procedimiento para la obtencion de estrogenos a partir de orina de yeguas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la obtención de una mezcla natural de estrógenos con- jugados, empobrecida en componentes fenólicos de la orina, a partir de la orina de yeguas preñadas, en el cual a) un líquido urinario, constituido eventualmente por un líquido urinario exento de sustancias mucilaginosas y sólidos, un concentrado de este líquido urinario, o un retentato de orina concentrado por filtración de este líquido urinario por membra- na, se pone en contacto con una cantidad de resina adsorbente polímera suficiente para la adsorción de la mezcla de estrógenos conjugados contenida en el líquido uri- nario, y se separa del líquido urinario remanente la resina adsorbente polímera carga- da con la mezcla de estrógenos conjugados, b) la resina adsorbente polímera cargada con la mezcla de estrógenos conjugados se lava con agua de lavado ajustada a un intervalo de pH de al menos 12, 0, y c) la resina adsorbente lavada se pone en contacto con una cantidad de lí- quido eluyente suficiente para la desorción de la mezcla de estrógenos conjugados adsorbida, estando constituido el líquido eluyente por un disolvente orgánico miscible con agua, seleccionado del grupo que comprende éteres, alcanoles inferiores y ceto- nas alifáticas inferiores miscibles con agua, o una mezcla del disolvente orgánico mis- cible con agua, con agua eventualmente alcalinizada, separándose de la resina adsor- bente un eluato que contiene la mezcla natural de estrógenos conjugados, que even- tualmente se concentra, caracterizado porque entre las etapas de procedimiento b) y c) se lleva a cabo un la- vado intermedio, durante el cual la resina adsorbente polímera cargada con la mezcla de estrógenos conjugados se lava con agua.
Description
Procedimiento para la obtención de estrógenos a
partir de orina de yeguas.
La presente invención se refiere a la obtención
de una mezcla natural de estrógenos conjugados a partir de la orina
de yeguas preñadas.
Los estrógenos se utilizan en medicina para la
terapia de sustitución hormonal. Se usan, en particular, mezclas de
estrógenos para el tratamiento y la profilaxis de los trastornos del
climaterio femenino que se producen después de una menopausia
natural o artificial, para cuyo tratamiento las mezclas naturales de
estrógenos conjugados que existen en la orina de yeguas preñadas han
resultado ser especialmente eficaces y bien toleradas.
La cantidad de sólidos disueltos en la orina de
yeguas preñadas (= pregnant mares' urine, abreviado en lo sucesivo
como PMU) puede variar naturalmente dentro de amplios límites y, en
general, se encuentra en un intervalo de 40 a 90 g de sustancia seca
por litro. Además de urea y otros componentes habituales de la
orina, las sustancias sólidas de la orina de yeguas preñadas
contienen componentes fenólicos en la proporción de aproximadamente
2 a 5% en peso con relación a la sustancia seca. Entre estos
componentes fenólicos se encuentran los cresoles y la
dihidro-3,4-bis[(3-hidroxifenil)metil]-2(3H)-furanona,
abreviada como HPMF. Estos pueden existir en forma libre o
conjugada. En la PMU está contenida una mezcla natural de
estrógenos, que existe preponderantemente en forma conjugada, por
ejemplo como sal sódica del semiéster de ácido sulfúrico (denominada
a continuación en forma abreviada como "sal sulfato"). El
contenido en estrógenos conjugados (calculado como sal sulfato de
estrógeno) puede hallarse entre 0,3 y 1% en peso, con relación a
sustancia seca.
En el documento WO 98/08526 ya se describe un
procedimiento adecuado mediante el cual, en una extracción en fase
sólida sobre una resina adsorbente semipolar, particularmente una
resina adsorbente polímera semipolar no iónica, puede obtenerse una
mezcla que contiene prácticamente en su totalidad el contenido de
estrógenos naturales de la orina de yeguas preñadas y que está
empobrecida en componentes fenólicos de la orina y, particularmente,
casi exenta de cresoles y HPMF. Este extracto es adecuado como
material de partida para la preparación de composiciones
farmacéuticas que contienen la mezcla natural de estrógenos
conjugados como componente activo.
Para poder ser utilizada como componente activo
para productos farmacéuticos, la mezcla natural de estrógenos
conjugados así obtenida debe cumplir, sin embargo, determinadas
especificaciones farmacéuticas, por ejemplo las especificaciones de
la USP (Farmacopea de los Estados Unidos) o de la Farmacopea
Europea. La concentración de estrógenos libres con relación a
sustancia seca tampoco debe superar determinados límites.
Normalmente, las especificaciones farmacéuticas exigidas son
cumplidas por la mezcla de estrógenos conjugados obtenida a partir
de la PMU por el procedimiento del documento WO 98/08526.
Sin embargo, se ha verificado que frecuentemente
no pueden cumplirse las especificaciones farmacéuticas exigidas, por
ejemplo el límite arriba citado del contenido máximo tolerable de
estrógenos libres, si para la obtención de la mezcla natural de
estrógenos conjugados se utiliza una orina "envejecida", por
ejemplo una PMU que ha sido almacenada o transportada durante un
tiempo prolongado y/o, eventualmente, a temperaturas más elevadas.
Este envejecimiento de la PMU probablemente se debe a que de acuerdo
a las condiciones de almacenaje y/o transporte el contenido en
estrógenos conjugados puede disminuir en función del tiempo o a
temperaturas elevadas, mientras que aumenta, en consecuencia, el
contenido en estrógenos libres indeseables. Por lo tanto, la
composición original de la mezcla natural de estrógenos puede
modificarse en forma inconveniente en la orina envejecida en
relación con la orina fresca. Para la mezcla natural de estrógenos
conjugados obtenida por el procedimiento según el documento WO
98/08526 existe frecuentemente el riesgo, con una composición
eventualmente modificada de un producto de partida envejecido, de
que el extracto obtenido ya no cumpla las especificaciones
farmacéuticas exigidas, particularmente el contenido máximo
tolerable de estrógenos libres. Un inconveniente particular reside
en que los lotes obtenidos a partir de PMU envejecida, y que
contienen el valioso extracto de sustancias activas de la mezcla de
estrógeno conjugados, ya no pueden ser utilizados para la
fabricación de una preparación farmacéutica y deben ser desechados.
La pérdida de una valiosa sustancia activa farmacéutica natural es
altamente insatisfactoria del punto de vista económico, teniendo en
cuenta la costosa recolección de PMU que solamente puede llevarse a
cabo en determinados períodos de la preñez, y las condiciones
marginales logísticas resultantes de ello en la práctica.
En consecuencia, la misión según la presente
invención es la de desarrollar un procedimiento técnica y
económicamente óptimo para la obtención de una mezcla natural de
estrógenos conjugados empobrecida en componentes fenólicos de la
orina, a partir de PMU, en el cual puede utilizarse como material de
partida, de forma segura y sin desperdicios, también una PMU
envejecida, es decir, una PMU que ha sido almacenada o transportada
durante períodos prolongados y/o a temperaturas elevadas, y que
eventualmente puede contener una mayor proporción de estrógenos
libres, procedimiento mediante el cual particularmente la mezcla
natural de estrógenos conjugados obtenida a partir de este tipo de
PMU tenga un buen contenido en sustancia activa y cumpla con las
especificaciones farmacéuticas exigidas, particularmente también en
lo que respecta al contenido máximo tolerable en estrógenos
libres.
libres.
Se ha hallado ahora un procedimiento mediante el
cual, de forma sorprendentemente sencilla, puede obtenerse una
mezcla de estrógenos conjugados, inclusive a partir de una PMU
envejecida, es decir, a partir de una orina que eventualmente tiene
mayor proporción de estrógenos libres, obteniéndose una mezcla de
estrógenos conjugados de alta calidad y que satisface eficazmente
las especificaciones farmacéuticas exigidas, particularmente también
en lo que respecta al contenido máximo tolerable en estrógenos
libres.
El procedimiento de acuerdo con la presente
invención se basa en el procedimiento descrito en el documento WO
98/08526, destinado a la obtención de una mezcla natural de
estrógenos conjugados empobrecida en componentes fenólicos de la
orina a partir de la PMU. En consecuencia, la invención se refiere a
un procedimiento para la obtención de una mezcla natural de
estrógenos conjugados empobrecida en componentes fenólicos de la
orina, a partir de la orina de yeguas preñadas, en el cual
a) un líquido urinario, que
eventualmente comprende un líquido urinario exento de sustancias
mucilaginosas y sólidos, un concentrado de este líquido urinario o
un retentato concentrado de este líquido urinario, obtenido por
filtración por membrana, se pone en contacto con una cantidad de una
resina adsorbente polímera semipolar suficiente para la adsorción
de la mezcla de estrógenos conjugados contenida en el líquido
urinario, separándose del resto de líquido urinario remanente la
resina adsorbente polímera semipolar cargada con la mezcla de
estrógenos conjugados.
b) la resina adsorbente polímera
semipolar cargada con la mezcla de estrógenos conjugados se lava con
un agua de lavado ajustada a un intervalo de pH de al menos 12,0,
particularmente de 12,5 hasta 14,0,
c) la resina adsorbente lavada se pone
en contacto con un líquido eluyente en cantidad suficiente para la
desorción de la mezcla de estrógenos conjugados adsorbida, en donde
el líquido eluyente está constituido por un disolvente orgánico
miscible con agua, seleccionado del grupo que comprende éteres,
alcanoles inferiores y cetonas alifáticas inferiores miscibles con
agua, o una mezcla del disolvente orgánico miscible con agua y agua
eventualmente alcalinizada, en donde se separa y, eventualmente, se
concentra a partir de la resina adsorbente un eluato que contiene la
mezcla natural de estrógenos conjugados, en donde el procedimiento
según la presente invención se distingue del procedimiento según el
estado de la técnica porque entre las etapas b) y c) se lleva a cabo
un lavado intermedio, en el cual la resina adsorbente semipolar
cargada con la mezcla de estrógenos conjugados se lava con agua.
La preparación de los lotes, las etapas de
procedimiento en sí conocidas a), b) y c), así como el uso del
eluato obtenido en la etapa de procedimiento c) que contiene una
mezcla de estrógenos conjugados naturales ya están descritas de
manera general en la solicitud de patente internacional WO 98/0826,
y por lo tanto son conocidas para los expertos en la técnica a
partir de esta solicitud de patente publicada. A los efectos de la
publicación, el contenido de este documento WO 98/08526 también se
incorpora en el objeto según la presente invención. Otras
particularidades del procedimiento general y los materiales a
utilizar se resumen en la sección de ejemplos de la presente
solicitud. Por ejemplo, de acuerdo con el documento WO 98/08526 se
pueden utilizar resinas adsorbentes semipolares, en especial resinas
adsorbentes semipolares no iónicas. Adicionalmente, y de forma
sorprendente, de acuerdo con el procedimiento según la presente
invención también es posible utilizar otras resinas adsorbentes
junto con el lavado intermedio según la presente invención, sin
afectar a la calidad del producto ni a las especificaciones
farmacéuticas que se deben satisfacer. Las resinas adsorbentes
utilizables dentro del contexto según la presente invención se
explican con mayor detalle más adelante en la descripción.
De acuerdo con la presente invención, la resina
adsorbente semipolar cargada con la mezcla de estrógenos conjugados
en la etapa de procedimiento a) se lava con agua en una etapa de
lavado intermedio subsiguiente a la etapa de procedimiento b). La
cantidad de agua de lavado se selecciona de tal manera que el eluato
obtenido en la etapa de procedimiento c) subsiguiente contenga una
mezcla de estrógenos conjugados que satisfaga las exigencias de
contenido máximo en estrógenos libres y que, por lo tanto, pueda ser
utilizada como componente activo para productos farmacéuticos. Ha
resultado conveniente, por ejemplo, el uso de 2 a 8, y
preferentemente de 3 a 5 volúmenes de lecho de agua de lavado por
volumen de lecho de resina adsorbente. El agua de lavado se hace
pasar convenientemente a través de un reactor que contiene la resina
adsorbente con una velocidad de circulación de 3 a 10 partes por
volumen, preferentemente 5 a 7 partes por volumen de agua de lavado
por 1 parte por volumen de resina adsorbente y por hora.
Debe considerarse particularmente sorprendente
el hecho de que una etapa de lavado con agua, aparentemente
sencilla, de la resina adsorbente entre las etapas de procedimiento
b) y c) produzca tal optimización de las especificaciones
farmacéuticas de la mezcla natural de estrógenos conjugados obtenida
como extracto de sustancias activas, incluso al utilizar PMU
envejecida, como se ha comprobado de acuerdo con la presente
invención. En especial, resulta muy sorprendente que la mayor
proporción de estrógenos libres que se observa, sobre todo en la PMU
envejecida, puede disminuirse con seguridad de tal manera que en la
etapa de procedimiento c) se obtiene como eluato una mezcla natural
de estrógenos conjugados que satisface las elevadas exigencias de
las especificaciones farmacéuticas, por ejemplo los requisitos
impuestos por la USP o la Farmacopea Europea, y que permite obtener
incluso a partir de PMU envejecida un extracto de sustancia activa
que contiene la mezcla natural de estrógenos conjugados y que
cualitativa y cuantitativamente es de elevada calidad. Estos
extractos de sustancia activa mantienen de manera segura el
contenido máximo tolerable en estrógenos libres, independientemente
del envejecimiento y procedencia de la PMU utilizada y, por lo
tanto, resulta un material de partida conveniente y valioso para la
preparación de productos farmacéuticos. Por lo tanto, incluso bajo
condiciones difíciles, es posible evitar la pérdida indeseable y
económicamente inconveniente de valiosas materias primas
farmacéuticas, como es, en este caso, la mezcla de estrógenos
conjugados
naturales.
naturales.
Otra ventaja del procedimiento según la presente
invención reside en que el eluato obtenido en la etapa de
procedimiento c) tiene un contenido total de hormonas, con respecto
a la sustancia seca, mayor que la que se obtiene según el estado de
la técnica. Esto permite obtener un producto de calidad,
notablemente mejorado, por ejemplo, en lo que se refiere al
contenido en sustancia activa.
En una realización conveniente del procedimiento
según la presente invención, el lavado intermedio se lleva a cabo a
temperaturas menores que la temperatura ambiente, particularmente a
temperaturas entre 0ºC y 10ºC, ya que se ha verificado que las
eventuales pérdidas de hormonas o sustancias activas, eventualmente
resultantes del lavado intermedio adicional, pueden disminuirse en
forma apreciable. Se considera como temperatura ambiente,
generalmente, la temperatura meteorológica, por ejemplo una
temperatura entre 20ºC y 30ºC. Es muy conveniente llevar a cabo el
procedimiento a temperaturas de 0ºC o próximas a 0ºC. Por lo tanto
en la práctica es conveniente trabajar a temperaturas superiores a,
pero muy cercanas a 0ºC. En la práctica, se recomienda, por lo
tanto, trabajar a temperaturas ligeramente superiores a 0ºC,
procurando los medios adecuados para mantener estos intervalos de
temperaturas. Para esto, se pueden aplicar los recursos habituales
para disminuir la temperatura, por ejemplo, la utilización de
reactores enfriados, de materiales enfriados y/o de materiales de
partida enfriados, tales como la PMU. Como temperatura de 0ºC o
cercana a 0ºC puede considerarse, desde el punto de vista práctico,
un intervalo de temperatura de 0ºC a 5ºC, particularmente 0ºC a
3ºC.
Para mantener al mínimo posible la pérdida de
hormonas durante el lavado intermedio, de acuerdo con esta variante
según la presente invención, el agua alcalinizada utilizada en el
lavado intermedio y/o en la etapa de procedimiento b) puede estar
preenfriada a temperaturas menores que la temperatura ambiente,
particularmente a temperaturas entre 0ºC y 10ºC. Otros intervalos de
temperatura convenientes o preferidos son las temperaturas arriba
indicadas de 0ºC hasta aproximadamente 5ºC, particularmente 0ºC
hasta aproximadamente 3ºC. Preferentemente, se trabaja a
temperaturas de 0ºC o próximas a 0ºC, es decir, preferentemente el
agua alcalinizada del lavado intermedio y/o el agua de lavado en la
etapa de procedimiento b) se preenfría a temperaturas mayores que,
pero próximas a 0ºC. Mediante el uso de agua de lavado alcalinizada
enfriada en la etapa de procedimiento b) ya se logra una especie de
pre-refrigeración o mantenimiento de la
refrigeración previa de la resina adsorbente, por ejemplo para
evitar que al utilizar agua de lavado enfriada para el lavado
intermedio se produzca un recalentamiento indeseable de la misma.
Preferentemente, el lavado intermedio y la etapa de procedimiento
precedente se llevan a cabo, por lo tanto, en el mismo intervalo de
temperatura, por ejemplo a temperaturas menores que la temperatura
ambiente y, en especial, a temperaturas entre 0ºC y 10ºC, o
preferentemente dentro de los intervalos de temperatura
anteriormente indicados.
En la presente variante de la invención, en la
cual el procedimiento se lleva a cabo a temperaturas menores que la
temperatura ambiente, puede ser deseable que todos los dispositivos
utilizados, tales como los reactores para contener la resina
adsorbente semipolar o los reactores que ya la contienen y/o la PMU
usada, se utilicen ya preenfriados a temperaturas menores que la
temperatura ambiente, particularmente a temperaturas entre 0ºC y
10ºC o en los intervalos de temperatura anteriormente indicados.
Como adsorbentes para el procedimiento según la
presente invención son adecuadas las resinas adsorbentes polímeras.
Las resinas adsorbentes particularmente preferidas son resinas
adsorbentes semipolares, particularmente resinas adsorbentes
polímeras semipolares no iónicas. Las resinas adsorbentes polímeras
semipolares utilizables como adsorbentes en el procedimiento según
la presente invención son, preferentemente, polímeros orgánicos
porosos no iónicos que, al contrario que las resinas adsorbentes
polímeras no polares hidrófobas, tienen una polaridad intermedia (=
por ejemplo, con un momento bipolar de la superficie activa de la
resina en el intervalo de 1,0 hasta 3,0, particularmente 1,5 hasta
2,0 Debyes) y que tienen una estructura algo más hidrófila, por
ejemplo, resinas de ésteres de ácidos policarboxílicos.
Convenientemente, se utilizan resinas semipolares macroporosas,
preferentemente con estructura macrorreticular, con un diámetro
promedio de poros en el intervalo de 50 a 150, y preferentemente 70
a 100 Angström, y una superficie específica en el intervalo de 300 a
900, y preferentemente 400 a 500 m^{2}/g. Han resultado
particularmente adecuadas las resinas de ésteres de ácidos
policarboxílicos alifáticos macroporosas transversalmente
reticuladas, particularmente resinas de ésteres poliacrílicos
transversalmente reticuladas, como por ejemplo, Amberlite
XAD-7^{R} de la empresa Rohm und Haas, que
representan resinas adsorbentes semipolares no iónicas.
Además de estos adsorbentes preferidos, también
pueden utilizarse otras resinas adsorbentes. Como resinas
adsorbentes son adecuadas tanto las resinas adsorbentes no polares,
las semipolares, como también las polares. La cantidad de orina que
puede ser bombeada a través del adsorbente debe determinarse
previamente sobre la base de la correspondiente capacidad
adsorbente. Como ejemplo de resinas adsorbentes utilizables se
pueden citar los tipos habituales en el comercio, tales como
adsorbentes Amberlite polímeros con estructuras fundamentales de
estireno-divinilbenceno (por ejemplo tipos
XAD-1180, XAD-2,
XAD-4, XAD-16), estructuras
fundamentales de éster acrílico (por ejemplo,
XAD-7), o con estructuras fundamentales de alta
polaridad que contienen nitrógeno y oxígeno (por ejemplo,
XAD-12). Otras resinas adsorbentes son resinas Dowex
(copolímeros de estireno y divinilbenceno), tales como, por ejemplo,
Dowex 112, Dowex Optipore, Dowex Optipore V 493; Lewatite
(poliestirenos reticulados), por ejemplo Lewatit OC 1064, Lewatit OC
1066, o Lewatit OC 1163, resinas de intercambio aniónicas
poliamínicas, tales como, por ejemplo, resinas Dowex. Resinas
adsorbentes convenientes son, en especial, XAD-7,
XAD-16 (tipo HP), XAD 118 y Dowex Optipore,
preferentemente como Dowex Optipore V 493, así como Lewatite OC
1064, OC 1066 y OC 1163.
El procedimiento según la presente invención,
como ya se ha descrito detalladamente más arriba, ofrece una serie
de ventajas y mejoras con relación al estado de la técnica. De esta
forma, la invención permite el uso también de PMU envejecida, que
también puede contener una mayor proporción de estrógenos libres,
sin que exista el riesgo de no poder mantener las especificaciones
farmacéuticas exigidas. El procedimiento según la presente
invención presenta, por lo tanto, también ventajas económicas porque
disminuye de manera destacable el riesgo de perder sustancias
activas valiosas al no mantener las especificaciones farmacéuticas,
por ejemplo, con contenidos no tolerables en estrógenos libres. El
procedimiento según la presente invención proporciona un componente
de sustancia activa de mayor calidad con un contenido en hormonas
incrementado con relación al contenido en sustancia seca. Este
componente de sustancia activa es excelente para la preparación de
productos farmacéuticos que contienen una mezcla de estrógenos
conjugados naturales.
Los siguientes ejemplos deben explicar más
detalladamente la invención, aunque sin limitar su alcance.
En los siguientes ejemplos se indican
especificaciones de trabajo generales para la obtención de extractos
de sustancia activa a partir de PMU que contienen la mezcla natural
de estrógenos conjugados contenidos en la PMU y que está
apreciablemente empobrecida en componentes fenólicos de la orina. Se
demuestra la manera en que, de acuerdo con la presente invención, se
puede obtener también a partir de PMU envejecida, que puede exhibir
una mayor proporción de estrógenos libres, un extracto de alta
calidad con elevados contenidos en sustancia activa.
En el procedimiento según la presente invención,
al igual que en el documento WO 98/08526, se puede utilizar como PMU
un concentrado obtenido por concentración, o un retentato obtenido
por filtración a través de una membrana. La orina acumulada se
depura, en primer lugar, de forma en sí convencional para separar
mucílagos y sólidos. Convenientemente, se dejan sedimentar los
sólidos y sustancias mucilaginosas y se les separa por métodos
convencionales, por ejemplo decantación, separación y/o filtración.
De este modo, la PMU se puede canalizar, por ejemplo, a través de un
dispositivo de separación convencional, por ejemplo un separador,
una instalación de filtración o un sedimentador. Como dispositivo de
separación se puede utilizar, por ejemplo, un lecho de arena o se
pueden utilizar separadores convencionales, por ejemplo, separadores
de tobera o de cámara. En caso deseado también puede utilizarse una
instalación de microfiltración o de ultrafiltración, cuyo uso
permite obtener simultáneamente la eliminación de la mayor parte de
microorganismos y virus de la PMU filtrada.
En caso deseado, se pueden agregar a la orina
conservantes, germicidas, bactericidas y/o antihelmínticos.
Si, en lugar de la PMU, se debe utilizar un
retentato de orina más concentrado, éste se puede obtener a partir
de la PMU mediante una filtración convencional por membrana. El
contenido en sólidos del retentato y su composición pueden variar de
acuerdo con la PMU utilizada y la membrana utilizada para la
filtración, por ejemplo, su tamaño de poros, así como las
condiciones de filtración. Por ejemplo, al utilizar una membrana de
nanofiltración puede obtenerse una concentración del contenido en
estrógenos prácticamente exento de pérdidas en el retentato de la
PMU, con la separación simultánea de hasta 50% en peso de las
sustancias de bajo peso molecular contenidas en la PMU. Para el
procedimiento según la presente invención se pueden utilizar
retentatos de PMU que se han concentrado en una proporción de
aproximadamente 1:10, por ejemplo una proporción de aproximadamente
1:7, y cuyo volumen, por lo tanto, puede estar disminuido hasta
aproximadamente 1/10, por ejemplo aproximadamente 1/7, con respecto
al volumen original de la PMU.
Las resinas adsorbentes polímeras semipolares
utilizables en la etapa de procedimiento a) son polímeros orgánicos
porosos no iónicos que, al contrario que las resinas adsorbentes
polímeras hidrófobas no polares, tienen una polaridad intermedia (=
por ejemplo, con un momento dipolar de la superficie activa de la
resina en el intervalo de 1,0 hasta 3,0, particularmente 1,5 a 2,0
Debyes), y que tienen una estructura algo más hidrófila, por
ejemplo, resinas de ésteres de ácidos policarboxílicos.
Convenientemente, se utilizan resinas semipolares macroporosas con
estructuras preferentemente macrorreticulares y con un diámetro
promedio de poros de 50 a 150 y, preferentemente, 70 a 100 Angström,
y una superficie específica en el intervalo de 300 a 900 y,
preferentemente, de 400 a 500 m^{2}/g. Han resultado
particularmente conveniente resinas de ésteres de ácidos
policarboxílicos alifáticos macroporosas, transversalmente
reticuladas, en especial resinas de éster poliacrílico
transversalmente reticuladas, como por ejemplo, Amberlite
XAD-7® de la empresa Rohm y Haas.
La adsorción de los estrógenos conjugados sobre
la resina adsorbente semipolar puede producirse de acuerdo con el
documento WO 98/08526, así como de acuerdo con el procedimiento
según la presente invención, por contactado de la PMU o su retentato
con la resina adsorbente, introduciendo el líquido urinario en un
reactor que contiene la resina adsorbente y manteniéndolo en
contacto con la resina adsorbente durante un tiempo suficiente para
la adsorción de su contenido de estrógenos. Una vez producida la
adsorción de los estrógenos conjugados sobre la resina adsorbente,
se puede separar de forma convencional la resina adsorbente cargada
con la mezcla de estrógenos conjugados del resto del líquido
urinario. Convenientemente, el líquido urinario se puede hacer
pasar a través de una columna que contiene la resina adsorbente con
una velocidad de circulación suficiente para obtener un tiempo de
contacto adecuado para la adsorción del contenido en estrógenos. Son
adecuadas, por ejemplo, velocidades de circulación de 3 a 10,
preferentemente 5 a 7 partes por volumen de PMU/1 parte en volumen
de resina adsorbente/hora. Convenientemente, la velocidad de
circulación del líquido urinario a través del reactor se puede
controlar trabajando con una reducida sobrepresión o depresión. La
cantidad de resina adsorbente semipolar que se utiliza puede variar
de acuerdo con el tipo de resina adsorbente utilizada y el contenido
en sólidos del líquido urinario. Con el empleo de PMU puede
cargarse, por ejemplo, una parte en volumen de resina adsorbente,
por ejemplo, resina adsorbente de éster de ácido policarboxílico
alifático transversalmente reticulada, con hasta 80 partes en
volumen de PMU pretratada, sin que existan cantidades destacables de
estrógenos en el líquido urinario efluente. Al utilizar un
concentrado de PMU o retentato de PMU, la capacidad de carga de la
resina adsorbente evidentemente se reduce en la medida en que éstos
han sido concentrados. Por ejemplo, una parte en volumen de resina
adsorbente de éster de ácido policarboxílico alifático
transversalmente reticulado se puede cargar con una cantidad de
líquido urinario correspondiente a 20 a 80, preferentemente 30 a 50
partes en volumen de PMU.
La resina adsorbente semipolar cargada con la
mezcla de estrógenos conjugados se lava en la etapa de procedimiento
b) con un agua de lavado ajustada a un intervalo de pH de al menos
12,0, en especial de 12,5 a 14, preferentemente de aproximadamente
12,5 a 13,5. Como agua de lavado se pueden utilizar soluciones
acuosas de sustancias básicas inertes solubles en el líquido
urinario, que son suficientemente fuertes para alcanzar un valor de
pH de al menos 12,5. Como sustancias básicas hidrosolubles inertes
con respecto a la resina adsorbente polímera semipolar resultan
adecuadas, preferentemente, bases inorgánicas hidrosolubles, tales
como hidróxidos de metal alcalino o alcalinotérreo, en especial
hidróxido sódico. Convenientemente, el agua de lavado contiene
solamente aquellas cantidades de sustancia básica necesarias para
alcanzar el valor de pH deseado, preferentemente pH 13
aproximadamente. La cantidad de agua de lavado se selecciona de
manera que sea suficiente para separar sustancialmente las
sustancias fenólicas contenidas en la orina, sin arrastrar
cantidades apreciables de estrógenos conjugados. Ha resultado
conveniente, por ejemplo, el uso de 2 a 10 y, particularmente, 4 a 6
volúmenes de lecho de agua de lavado por volumen de lecho de resina
adsorbente. El agua de lavado se conduce convenientemente a través
del reactor que contiene la resina adsorbente con una velocidad de
circulación de 3 a 10, y preferentemente 5 a 7 partes por volumen de
agua de lavado por una parte en volumen de resina
adsorbente/hora.
A continuación, en la etapa de procedimiento c)
se trata la resina adsorbente, lavada y cargada con la mezcla de
estrógenos conjugados, con una cantidad de líquido eluyente
suficiente para la elución de la mezcla de estrógenos conjugados,
obteniéndose un eluato que contiene la mezcla natural de estrógenos
conjugados de la PMU. El eluyente utilizado según la invención es un
disolvente orgánico miscible con agua, seleccionado del grupo que
comprende los éteres, alcanoles inferiores y cetonas alifáticas
inferiores miscibles con agua, o una mezcla de este disolvente
miscible con agua y agua eventualmente alcalinizada. Como
componentes etéreos del líquido de elución son adecuados éteres
cíclicos miscibles con agua, tales como tetrahidrofurano o dioxano,
o también éteres de cadena abierta miscibles con agua, tales como,
por ejemplo, éter dimetílico de etilenglicol (= monoglime), éter
dimetílico de dietilenglicol (= diglime), o
etiloxi-etiloxi-etanol (= carbitol).
Como alcanoles inferiores son adecuados los alcoholes alquílicos
miscibles con agua de 1 a 4, preferentemente de 1 a 3 átomos de
carbono, tales como etanol o isopropanol. Como cetonas alifáticas
inferiores son adecuadas las cetonas miscibles con agua de 3 a 5
átomos de carbono, en especial, acetona. Han resultado
particularmente convenientes los eluyentes en que el disolvente
orgánico es etanol. Convenientemente, se utilizan como eluyentes
mezclas de uno de los disolvente orgánicos miscibles con agua
anteriormente citados y agua eventualmente alcalinizada. El valor de
pH de estos eluyentes acuosos se encuentra en un intervalo desde
neutro hasta alcalino hasta pH 13 y puede ser, convenientemente, de
aproximadamente 10 a 12. Como componente disolvente en el eluyente
acuoso se elige un disolvente estable en el intervalo de pH
utilizado. Para los eluyentes alcalinos acuosos con valores de pH de
aproximadamente 10 a 12 resulta conveniente como componente
disolvente un alcanol inferior, preferentemente etanol. El valor de
pH deseado del eluyente acuoso se obtiene por adición de una
cantidad correspondiente de una sustancia básica inerte
hidrosoluble, preferentemente una base inorgánica, por ejemplo un
hidróxido de metal alcalino o alcalino-térreo,
particularmente hidróxido sódico. En los líquidos eluyentes acuosos
puede existir una relación volumétrica de disolvente orgánico
miscible con agua con respecto al agua en el intervalo de 40:60
hasta 20:80, preferentemente de aproximadamente 30:70. La cantidad
de eluyente utilizado puede ser de aproximadamente 3 a 10 y, en
especial, de aproximadamente 4 a 6 volúmenes de lecho por volumen de
lecho de resina adsorbente. Convenientemente, el eluyente se hace
pasar a través de un reactor que contiene la resina adsorbente
cargada con la mezcla de estrógenos, con una velocidad de
circulación adecuada para que el tiempo de contacto sea suficiente
para la elución completa de la mezcla de estrógenos conjugados. Al
utilizar una mezcla de etanol con agua en una relación volumétrica
de 30:70 son convenientes, por ejemplo, velocidades de circulación
de 3 a 10, preferentemente de 5 a 7 partes en volumen de eluyente
por parte en volumen de resina adsorbente y por hora.
Convenientemente, la elución se lleva a cabo en un intervalo de
temperatura desde temperatura ambiente hasta aproximadamente 60ºC,
preferentemente a aproximadamente 40 hasta 50ºC. En caso deseado, la
velocidad de circulación se regula trabajando a presión ligeramente
incrementada, por ejemplo con una sobrepresión hasta 0,2 bar, y
recogiendo el eluato en varias fracciones. Los contenidos en
estrógenos conjugados y componentes fenólicos de la orina, tales
como cresoles y HPMF, en las fracciones de eluato individuales se
pueden determinar de forma convencional mediante cromatografía de
fase líquida de alto rendimiento (abreviada como "HPLC").
Durante la elución se obtiene, en primer lugar,
una fracción previa incolora hasta débilmente coloreada,
prácticamente exenta de estrógenos, cuya cantidad corresponde
generalmente a aproximadamente un volumen de lecho. La cantidad
principal de estrógenos conjugados, por ejemplo entre 80 y 99% de
los estrógenos conjugados existentes en la PMU de partida, se
encuentra en las fracciones principales de eluato siguientes, con
una coloración que va desde amarillo oscuro hasta pardo, y cuya
cantidad comprende generalmente de 2 a 4 volúmenes de lecho. Las
fracciones siguientes generalmente sólo contienen trazas de
estrógenos conjugados. Si se obtienen fracciones posteriores que aun
muestran un contenido en estrógenos conjugados mayor que 10% en peso
con relación a sustancia seca, y menor que 0,6% con relación a
sustancia seca de cresoles y HPMF, éstas se pueden combinar con el
eluato principal rico en estrógenos para el procesamiento
siguiente.
(Ejemplo
comparativo)
Una columna de 220 mm de altura y de 40 mm de
diámetro se carga con 300 ml de una resina adsorbente de éster
poliacrílico semipolar hinchada en agua (= Amberlite
XAD-7 de la empresa Rohm y Haas, granulometría 0,3 a
1,2 mm, momento dipolar 1,8 Debye, diámetro promedio de poros 80
Angström, superficie específica de aproximadamente 450 m^{2}/g en
seco). A continuación, se hacen pasar a través de la columna, a
temperatura ambiente, 10,5 l (= 35 volúmenes de lecho) de una PMU
filtrada a través de una instalación de ultrafiltración (contenidos
en sal sulfato de estrona y cresol determinados por HPLC, véase la
tabla siguiente) con una velocidad de circulación media de 24 ml/min
(= 4,8 volúmenes de lecho por hora). El contenido de estrógenos de
la PMU queda totalmente adsorbido sobre la columna de resina
adsorbente semipolar cargada de esta forma. El líquido urinario
efluente se analiza por HPLC para verificar su contenido en
estrógenos conjugados (calculados como sal sulfato de estrona), y
demuestra estar prácticamente exento de estrógenos. El efluente se
desecha.
La columna de resina adsorbente cargada se lava
con 1,5 litros de una solución acuosa de hidróxido sódico con un
valor de pH de 13. A tal efecto, el agua de lavado alcalina se hace
pasar a través de la columna con una velocidad de circulación media
de 24,6 ml/min (= 4,9 volúmenes de lecho por hora). El líquido de
lavado efluente se analiza por HPLC para verificar el contenido en
sal sulfato de estrona y cresol. El análisis demuestra que durante
la fase de lavado se elimina menos de 5% de la cantidad total de
estrógenos cargados en la columna.
1,5 litros del líquido eluyente (etanol/agua
30:70) se hacen pasar a través de la columna precalentada a la
temperatura de elución indicada en la tabla, con un caudal de 25
ml/min (= 5,0 volumen de lecho por hora). El eluato efluente se
recoge en cinco fracciones. Cada fracción fue de 300 ml (= 1 volumen
de lecho), y se analizan mediante HPLC para determinar el contenido
en sal sulfato de estrona y cresol.
La primera fracción contiene solamente trazas de
sal sulfato de estrógeno. El eluato es incoloro hasta levemente
amarillo. En las fracciones siguientes 2 a 4 está contenida
aproximadamente 80 a 98% de la cantidad total de estrógenos
conjugados adsorbidos en la columna. Los eluatos tienen, en este
caso, un color pardo oscuro intenso. La última fracción contiene
solamente pequeñas cantidades de sal sulfato de estrógeno lo cual
también puede apreciarse claramente por la disminución de la
intensidad colorimétrica.
Para las fracciones que contienen la cantidad
principal de estrógenos conjugados están indicados en la tabla
siguiente el contenido en sustancia seca (TS) en % en peso y los
contenidos en sal sulfato de estrona y cresol, determinados por
HPLC. Estas fracciones son adecuadas como extractos para un
procesamiento galénico posterior.
Para la regeneración, la columna se lava, en
primer lugar, con 600 ml de una mezcla de etanol y agua con un pH
12, que contiene 50% de etanol y, luego, con 600 ml de una mezcla de
agua/etanol, ajustada a pH 12, que contiene 70% en etanol y
finalmente con 600 ml de una solución acuosa al 10% de citrato de
sodio y, por último, con 600 ml de agua destilada. Toda la
regeneración se lleva a cabo a una temperatura de 45ºC. La columna
se puede regenerar, cargar y regenerar nuevamente múltiples veces,
por ejemplo, hasta 40 veces.
(Procedimiento según la
invención)
El Ejemplo 1 se repite con el lavado intermedio
según la presente invención entre las etapas de procedimiento b) y
c).
La columna de resina adsorbente cargada se lava
con 900 ml de agua. A tal efecto, el agua de lavado neutra se hace
pasar a través de la columna con una velocidad de circulación media
de 25,0 ml/min (= 5,0 volumen de lecho por hora).
El líquido de lavado efluente se analiza
mediante HPLC para determinar el contenido en sal sulfato de estrona
y cresol. El análisis demuestra que durante esta fase de lavado
solamente se pierde una pequeña cantidad (como máximo, sólo algunos
porcentajes) de la cantidad total de estrógenos cargados en la
columna. De acuerdo con la invención, al llevar a cabo el
procedimiento según esta invención se reduce también la proporción
de estrógenos libres (véase el Ejemplo 4).
(Procedimiento según la invención
con
refrigeración)
Se trabaja como en los ejemplos 1 y 2, pero con
refrigeración. La refrigeración se lleva a cabo para minimizar las
pérdidas de hormonas durante el lavado intermedio. Si el lavado
intermedio se realiza con agua helada en lugar de agua a temperatura
ambiente, la pérdida de hormonas se puede reducir en hasta
aproximadamente 50%, en especial si en el procedimiento la
temperatura efectivamente es de 0ºC, o próxima a 0ºC. Es conveniente
no solamente agregar agua helada que, debido a la presencia del
contenido de la columna a temperatura ambiente, puede calentarse de
forma relativamente rápida, sino que es preferible refrigerar toda
la columna a 0ºC.
La temperatura de 0ºC de la columna necesaria
para el lavado intermedio se alcanza mediante la refrigeración
durante el lavado básico precedente, es decir, el lavado básico
precedente ya se lleva a cabo a 0ºC. La carga de hasta 5 volúmenes
de lecho a 0ºC durante el lavado básico ya ha sido suficiente para
disminuir el contenido de la columna desde la temperatura ambiente a
0ºC. El lavado intermedio subsiguiente puede llevarse a cabo
entonces a 0ºC. Además de la reducción al mínimo de las pérdidas de
hormonas, también se analizó la posible influencia de la temperatura
sobre la separación de cresol durante el lavado básico.
Para la comparación directa se llevaron a cabo
dos ensayos.
Ejemplo
3a
- Lavado básico y lavado intermedio a temperatura ambiente.
Ejemplo
3b
- Lavado básico y lavado intermedio a 0ºC.
Todas las restantes etapas se llevaron a cabo
como en el procedimiento normal como se indica más arriba para el
procedimiento descrito en el documento WO 98/08526 o en los Ejemplos
1 y 2.
La Tabla III indica los parámetros de los
ensayos y los resultados de los mismos a temperatura ambiente y con
refrigeración a 0ºC.
Los resultados de los ensayos permiten apreciar
claramente que:
- a)
- el lavado básico, es decir la separación de cresol, no se ve afectado al disminuir la temperatura a 0ºC. La separación de cresol se produce en forma cuantitativa. Esto está indicado en la Tabla III.
- b)
- la pérdida de hormonas durante el lavado intermedio se reduce en aproximadamente 50% por la disminución de temperatura. Esto está indicado en la Tabla II.
La aplicación de solución de hidróxido sódico
refrigerada a aproximadamente 0ºC durante el lavado básico ofrece,
de esta forma, una posibilidad sencilla de disminuir también la
pérdida de hormonas en el lavado intermedio, trabajando
aproximadamente a 0ºC, sin afectar a la separación de cresol.
La disminución de temperatura durante el lavado
intermedio a aproximadamente 0ºC permite una minimización, es decir,
la disminución de las pérdidas inevitables de hormonas por el lavado
intermedio adicional, en hasta aproximadamente 50%.
La refrigeración de la columna durante el lavado
intermedio puede lograrse en forma sencilla si el lavado básico que
se lleva a cabo antes del lavado intermedio también se realiza a
aproximadamente 0ºC. La separación de cresol que tiene lugar durante
el lavado básico no resulta afectada negativamente por la
disminución de temperatura.
\vskip1.000000\baselineskip
En los procedimientos de los Ejemplos 1 a 3
precedentes se analizó la manera en que disminuye el contenido en
hormonas libres al utilizar el procedimiento según la invención. Los
resultados se resumen en la siguiente Tabla IV a (ensayos
comparativos sin lavado intermedio) y IV b (ensayos según la
invención con lavado intermedio).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
IV
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (7)
1. Procedimiento para la obtención de una mezcla
natural de estrógenos conjugados, empobrecida en componentes
fenólicos de la orina, a partir de la orina de yeguas preñadas, en
el cual
a) un líquido urinario, constituido
eventualmente por un líquido urinario exento de sustancias
mucilaginosas y sólidos, un concentrado de este líquido urinario, o
un retentato de orina concentrado por filtración de este líquido
urinario por membrana, se pone en contacto con una cantidad de
resina adsorbente polímera suficiente para la adsorción de la
mezcla de estrógenos conjugados contenida en el líquido urinario, y
se separa del líquido urinario remanente la resina adsorbente
polímera cargada con la mezcla de estrógenos conjugados,
b) la resina adsorbente polímera cargada
con la mezcla de estrógenos conjugados se lava con agua de lavado
ajustada a un intervalo de pH de al menos 12,0, y
c) la resina adsorbente lavada se pone
en contacto con una cantidad de líquido eluyente suficiente para la
desorción de la mezcla de estrógenos conjugados adsorbida, estando
constituido el líquido eluyente por un disolvente orgánico miscible
con agua, seleccionado del grupo que comprende éteres, alcanoles
inferiores y cetonas alifáticas inferiores miscibles con agua, o una
mezcla del disolvente orgánico miscible con agua, con agua
eventualmente alcalinizada, separándose de la resina adsorbente un
eluato que contiene la mezcla natural de estrógenos conjugados, que
eventualmente se concentra,
caracterizado porque entre las etapas de
procedimiento b) y c) se lleva a cabo un lavado intermedio, durante
el cual la resina adsorbente polímera cargada con la mezcla de
estrógenos conjugados se lava con agua.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el lavado intermedio se lleva a cabo a
temperaturas menores que la temperatura ambiente, en especial a
temperaturas entre 0ºC y 10ºC, preferentemente a temperaturas
mayores próximas a 0ºC.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el agua de
lavado utilizada para el lavado intermedio está
pre-refrigerada a temperaturas menores que la
temperatura ambiente, en especial a temperaturas entre 0ºC y 10ºC,
preferentemente a temperaturas mayores próximas a 0ºC.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el agua de lavado alcalinizada utilizada
en la etapa de procedimiento b) se enfría a temperaturas menores que
la temperatura ambiente, en especial a temperaturas entre 0ºC y
10ºC, preferentemente a temperaturas mayores próximas a 0ºC.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el lavado
intermedio y la etapa de procedimiento b) precedente se llevan a
cabo a temperaturas menores que la temperatura ambiente, en especial
a temperaturas entre 0ºC y 10ºC, preferentemente a temperaturas
mayores próximas a 0ºC.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los
dispositivos utilizados, incluidos los reactores para la recepción
de la resina adsorbente polímera y/o los reactores que ya la
contienen, y/o la PMU utilizada, se usan de forma preenfriada a
temperaturas menores que la temperatura ambiente, en especial a
temperaturas entre 0ºC y 10ºC, preferentemente a temperaturas
mayores próximas a 0ºC.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque como
resinas adsorbentes polímeras se utilizan resinas adsorbentes
semipolares, preferentemente resinas adsorbentes semipolares no
iónicas.
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