PL205929B1 - Sposób odzyskiwania i oczyszczania poxywirusów z zainfekowanych komórek - Google Patents
Sposób odzyskiwania i oczyszczania poxywirusów z zainfekowanych komórekInfo
- Publication number
- PL205929B1 PL205929B1 PL369498A PL36949802A PL205929B1 PL 205929 B1 PL205929 B1 PL 205929B1 PL 369498 A PL369498 A PL 369498A PL 36949802 A PL36949802 A PL 36949802A PL 205929 B1 PL205929 B1 PL 205929B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- poxvirus
- virus
- cells
- infected cells
- mva
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 107
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000011084 recovery Methods 0.000 title abstract description 11
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims abstract description 48
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 38
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 claims description 8
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 claims description 7
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 6
- 241001112691 Goatpox virus Species 0.000 claims description 5
- 241000700665 Sheeppox virus Species 0.000 claims description 5
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 claims description 4
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 claims description 4
- 241000700568 Suipoxvirus Species 0.000 claims description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 4
- 241000700664 Capripoxvirus Species 0.000 claims description 3
- 238000003825 pressing Methods 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 60
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 100
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 18
- 206010072219 Mevalonic aciduria Diseases 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 8
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 7
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 4
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 4
- 241000700628 Chordopoxvirinae Species 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010022998 Irritability Diseases 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000004135 animal tissue culture Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- VMWJTBYKMYBHOC-QTNFYWBSSA-N (2s)-2-aminopentanedioic acid;potassium;hydrate Chemical compound O.[K].OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O VMWJTBYKMYBHOC-QTNFYWBSSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241001137864 Camelpox virus Species 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000700572 Entomopoxvirinae Species 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 208000005585 Poxviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 201000005332 contagious pustular dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 210000004895 subcellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24151—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy metody odzyskiwania pokswirusów (poxywirusów), w szczególności zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (MVA), z zainfekowanych komórek. Według niniejszego wynalazku zainfekowane pokswirusem komórki są poddawane homogenizacji wysokociśnieniowej, co ma na celu otrzymanie homogenatu zawierającego pokswirusy. Homogenat zawierający pokswirusy może być poddawany co najmniej jednemu etapowi oczyszczania celem otrzymania frakcji wzbogaconej w pokswirusy. Wynalazek dotyczy również frakcji zawierającej pokswirusy oraz homogenatu zawierającego pokswirusy uzyskanych metodą według niniejszego wynalazku.
Tło wynalazku
Poxviridae stanowią dużą grupę złożonych wirusów DNA, które replikują w cytoplazmie komórek kręgowców i bezkręgowców. Rodzina Poxviridae może być dzielona na podrodziny Chordopoxvirinae (pokswirusy atakujące komórki kręgowców) i Entomopoxvirinae (pokswirusy atakujące owady).
Do podrodziny Chordopoxvirinae należy kilka pokswirusów zwierzęcych (zaliczanych do różnych rodzajów) o dużym znaczeniu ekonomicznym, takich jak wirusy ospy wielbłądziej, wirusy ospy owczej, wirusy ospy koziej, wirusy ospy ptasiej, w szczególności pokswirus atakujący drób. Do ochrony żywego inwentarza przed ospą owczą i kozią są dostępne szczepionki z wirusów żywych atenuowanych i inaktywowanych. Do szczepienia drobiu uzyskano szczepionki rekombinowane z wykorzystaniem jako wektora wirusa ospy ptasiej.
Jako że wirus ospy ptasiej atakuje komórki ludzkie, przyjmuje się, że może być on również wykorzystywany jako wektor do ekspresji heterologicznych genów w organizmach ludzkich i do indukowania odpowiedniej odpowiedzi immunologicznej. US 5 736 368 i US 6 051 410 dotyczą wirusów ospy ptasiej zawierających w swoim genomie geny HIV. W przypadku ludzi wirus ospy właściwej, członek rodzaju Orthopoxivirus, był jak dotąd najważniejszym z pokswirusów. Wirus krowianki, również członek rodzaju Orthopoxivirus w rodzinie Poxviridae, używany był jako żywa szczepionka do wywoływania odpowiedzi immunologicznej przeciw ospie. Zakończone powodzeniem światowe szczepienia wirusem krowianki doprowadziły w efekcie końcowym do eliminacji wirusa ospy właściwej (The global eradication of smallpox. Finał report of the global commission for the certification of smallpox eradication; History of Public Health, No.4, Geneva: World Health Organization, 1980). Od czasu deklaracji WHO (Światowej Organizacji Zdrowia) na wiele lat zaprzestano szczepień za wyjątkiem ludzi narażonych na duże ryzyko zainfekowania wirusem (np. pracowników laboratoryjnych). Programy szczepień zaczynają cieszyć się z powrotem zainteresowaniem ze względu na zagrożenie, że wirus ospy właściwej zostanie wykorzystany jako broń biologiczna przez bioterrorystów. W ostatnich latach wirusy krowianki były również używane w projektowaniu wektorów wirusowych do ekspresji genów rekombinowanych i do potencjalnego zastosowania w formie żywych rekombinowanych szczepionek (Mackett, M., Smith, G. L. i Moss, B. [1982] P.N.A.S. USA 79, 7415-7419; Smith, G. L., Mackett, M. i Moss, B. [1984] Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383-407). Wymaga to wprowadzania przy pomocy technik rekombinacji DNA sekwencji DNA (genów) kodujących obce antygeny do genomu wirusów krowianki. Jeśli gen zostanie wstawiony do DNA wirusa w miejscu, które nie jest istotne dla jego cyklu życiowego, nowopowstały wirus krowianki może być zakaźny, czyli zdolny do infekowania komórek obcych i tym samym do ekspresji wstawionej sekwencji DNA (EP Patent Applications Nr 83, 286 i nr 110, 385). Otrzymane w ten sposób rekombinowane wirusy krowianki mogą być wykorzystywane zarówno jako żywe szczepionki w profilaktyce chorób zakaźnych, jak i do otrzymywania białek heterologicznych w komórkach eukariotycznych.
Używanie wirusa krowianki jako wektora do otrzymywania rekombinowanych żywych szczepionek zostało podporządkowane względom bezpieczeństwa i odpowiednim przepisom. Większość opisanych w literaturze rekombinowanych wirusów krowianki jest oparta o szczep wirusa krowianki Western Reserve. Powszechnie wiadomo, że jest to szczep o wysokiej neurowirulencji i dlatego trudno go stosować w przypadku ludzi i zwierząt (Morita et al., Vaccine 5, 65-70 [1987]). Zmodyfikowany wirus krowianki Ankara (MVA, ang. Modified Vaccinia virus Ankara) uznawany jest natomiast za wyjątkowo bezpieczny. MVA został uzyskany w wyniku wielokrotnego długotrwałego pasażowania szczepu Ankara wirusa krowianki (CVA) na fibroblastach zarodków kurzych (patrz praca przeglądowa Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. i Stickl, H. [1975] Infection 3, 6-14; Patent Szwajcarski nr 568 392). Przykładowymi szczepami wirusa MVA zdeponowanymi z uwzględnieniem wymogów Traktatu Budapeszteńskiego są szczepy MVA 572, MVA 575 i MVA-BN zdeponowane w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Tkankowych (ECACC, ang. European Collection of Animal Cell Cultures), Salisbury (Wielka
PL 205 929 B1
Brytania) z numerami akcesyjnymi, odpowiednio: ECACC V94012707, ECACC V00120707 i ECACC V00083008. MVA wyróżnia się dzięki swojej wysokiej atenuacji, czyli zmniejszonej wirulencji lub zakaźności z jednoczesnym zachowaniem wysokiej immunogenności. Wirus MVA był badany pod kątem zmian w genomie w stosunku do szczepu CVA typu dzikiego.
Zidentyfikowano sześć głównych delecji w genomowym DNA (delecje I, II, III, IV, V i VI), dających łącznie 31 000 par zasad (Meyer, H., Sutter, G. i Mayr A. [1991] J. Gen. Virol. 72, 1031-1038). Otrzymany wirus MVA stal się mocno specyficzny w kierunku komórek ptasich jako komórek gospodarza. Co więcej, MVA charakteryzuje się wyjątkową atenuacją. W trakcie testów z użyciem licznych modeli zwierzęcych MVA okazał się być niezjadliwy nawet w przypadku zwierząt poddanych immunosupresji. Co ważniejsze, doskonałe własności szczepu MVA zostały w szerokim zakresie potwierdzone testami klinicznymi (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). W ramach wspomnianych testów u ponad 120 000 ludzi, w tym pacjentów z grupy wysokiego ryzyka, nie stwierdzono efektów ubocznych zwią zanych z zastosowaniem szczepionki zawierającej MVA. Rekombinowane MVA przeznaczone do stosowania jak szczepionki zostały już skonstruowane i poddane próbom klinicznym. WO 98/13500 dotyczy rekombinowanych MVA zawierających i zdolnych do ekspresji jednej lub więcej sekwencji DNA kodujących antygeny wirusa dengi. Obce sekwencje były wstawiane do wirusowego DNA w miejscu naturalnie występującej w genomie MVA delecji. Aby sprostać wymogom prawnym należy przed przystąpieniem do stosowania pokswirusów lub rekombinowanego pokswirusa jako szczepionki do pewnego stopnia oczyścić wirusa. Tradycyjnym sposobem oczyszczania pokswirusów, a w szczególności MVA jest następująca procedura: w pierwszym kroku hoduje się komórki podatne na infekcję odpowiednim pokswirusem. W przypadku MVA komórkami podatnymi są między innymi fibroblasty zarodków kurzych. Podatne komórki są infekowane pokswirusem i hodowane przez okres czasu wystarczający na namnożenie się wirusa. Następnie komórki są zamrażane i rozmrażane w celu ich oddzielenia od powierzchni naczynia i częściowej dezintegracji.
Mieszanina całych i uszkodzonych komórek jest odwirowywana. Następnie przy pomocy ultradźwięków uzyskuje się homogenat. Wirusy są oczyszczane z homogenatu przez wirowanie na poduszce sacharozowej (Joklik W. K. „The purification of four strains of poxvirus” Virology 1962; 18: 9-18). Kluczowym etapem całego procesu jest homogenizacja przy pomocy ultradźwięków (Hedstom, K. G. i Lindenberg, U., Z. Immun. Forsch. 1969 137: 421-430; Stickl, H., Korb, W. I. Hochstein-Mintzel, V., Zbl. Bakt, I. Abt. Orig. (1970), 215,38-50). W procesach przemysłowych korzystnym jest, aby wszystkie etapy były łatwe do kontrolowania i powtarzalne. Dlatego wadą stosowania ultradźwięków do homogenizacji zawiesiny komórek i wirusów jest to, że jest to etap trudny do powtórzenia w sposób identyczny, regulacji i adaptacji ze skali laboratoryjnej do przemysłowej.
Przedmiot wynalazku
Stąd też celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie metody odzyskiwania pokswirusów, w szczególnoś ci wirusów krowianki, takich jak szczep MVA, z komórek zainfekowanych wirusem, w której homogenizacja zainfekowanych komórek jest powtarzalna, ł atwa do kontrolowania i pozwala na łatwą adaptację ze skali laboratoryjnej do przemysłowej. Przedmiotem wynalazku jest sposób odzyskiwania pokswirusów z zainfekowanych komórek, charakteryzujący się tym, że obejmuje etap poddawania zainfekowanych komórek wysokociśnieniowej homogenizacji, w celu otrzymania homogenatu zawierającego pokswirusy.
Korzystnie, pokswirus jest wybrany z grupy obejmującej rodzaje Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Suipoxvirus i Capripoxvirus. Równie korzystnie, pokswirus jest wybrany z grupy składającej się z wirusa krowianki, wirusa ospy koziej, wirusa ospy owczej, pokswirusa atakującego kanarki i pokswirusa atakującego drób, przy czym korzystnie irus krowianki jest szczepem Elstree lub zmodyfikowanym szczepem wirusa krowianki Ankara (MVA), w szczególności MVA-BN o numerze akcesyjnym ECACC V00083008. Równie korzystnie, pokswirus jest rekombinowanym pokswirusem. Równie korzystnie, homogenizację wysokociśnieniową prowadzi się przez umieszczanie zainfekowanych komórek w komorze wysokociśnieniowej, zwiększanie ciśnienia w komorze i wyciskanie zainfekowanych komórek przez dyszę wylotową, przy czym korzystnie ciśnienie w komorze jest zwiększane do wartości leżącej w zakresie od 200 do 1000 barów, natomiast średnica dyszy wylotowej ma wielkość z zakresu od 0,10 do 0,6 mm. Równie korzystnie, homogenat zawierający pokswirusy jest poddawany etapowi oczyszczania w celu otrzymania frakcji wzbogaconej w pokswirusy, przy czym korzystnie etap oczyszczania jest etapem ultrafiltracji, zwłaszcza filtracją krzyżową, przy czym korzystnie podczas etapu filtracji krzyżowej używana jest membrana o wielkości porów większej niż 500 kDa, ale mniejszej lub równej
PL 205 929 B1
0.1 μm. Korzystnie, po etapie ultrafiltracji stosowany jest przynajmniej jeden etap chromatografii kolumnowej. Równie korzystnie, otrzymany homogenat zawierający pokswirusy lub frakcja wzbogacona w pokswirusy są liofilizowane.
Przedmiotem wynalazku jest także frakcja wzbogacona w pokswirusy lub homogenat zawierający pokswirusy otrzymane sposobem według wynalazku zdefiniowanym powyżej. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie frakcji wzbogaconej w pokswirusy lub homogenatu zawierającego pokswirusy według wynalazku, jak zdefiniowano powyżej, do otrzymywania szczepionki.
Szczegółowy opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy metody odzyskiwania pokswirusów, w szczególności wirusów krowianki, takich jak szczep Elstree czy zmodyfikowany wirus krowianki Ankara (MVA), z zainfekowanych komórek. Metoda według niniejszego wynalazku stosowana do odzyskiwania pokswirusów z zainfekowanych komórek, obejmuje etap poddawania zainfekowanych komórek homogenizacji wysokociśnieniowej mający na celu otrzymanie homogenatu zawierającego pokswirusy. Możliwość uzyskania nieuszkodzonych i zakaźnych pokswirusów metodą według niniejszego wynalazku była niespodziewanym odkryciem. Homogenizacja wysokociśnieniowa jest powszechnie stosowana do dezintegracji struktur komórkowych i subkomórkowych w celu izolacji białek lub lipidów z komórek eukariotycznych i prokariotycznych. US 3 983 008 dotyczy metody pozyskiwania użytecznych składników z komórek bakteryjnych z zastosowaniem homogenizacji wysokociśnieniowych. Otrzymywanymi związkami były białka drożdżowe, enzymy bakteryjne i lipidy drożdżowe. DE 19918619 dotyczy zastosowania homogenizacji do izolacji HbsAg z komórek drożdży. US 4 225 521 dotyczy procesu otrzymywania izomerazy glukozowej z komórek drobnoustrojów poprzez jej uwalnianie pod wpływem wysokiego ciśnienia. Homogenizacja wysokociśnieniowa była również używana do izolacji cząstek wirusopodobnych (VLP, ang. virus like particles) z rekombinowanych Saccharomyces cerevisiae (Milburn i Dunnill (1994) Biotechnology and Bioengineering 44, 736-744) oraz do otrzymywania i oczyszczania wektorów adenowirusowych (US 6 194 191). Cząstki VLP i Adenowirusy są nieopłaszczonymi oraz raczej małymi i prostymi wirusami, które przypominają białkowe struktury komórkowe. Dlatego nie jest zaskakujące, że homogenizacja wysokociśnieniowa, o której wiadomo, że jest skuteczna w przypadku izolacji białek z komórek, może być również używana do izolacji Adenowirusów i cząstek VLP z komórek eukariotycznych. Wewnątrzkomórkowe dojrzałe wiriony pokswirusa (IMV, ang. intracelhdar mature virions, patrz poniżej, patrz Fields et al., Fields Virology 1996, Lippincott-Raven publishers, Philadelphia, USA, ISBN 0-7817-0253-4, rozdział 83, strony 2654-5), przeciwnie, mają bardzo skomplikowaną morfologię, na którą składają się między innymi błony lipidowe. Morfologia i fizyczne własności pokswirusów IMV są w niektórych aspektach bardziej podobne do morfologii i fizycznych własności komórek, niż nieopłaszczonych wirusów. Stąd też spodziewano się, że warunki używane do dezintegracji komórek podczas homogenizacji wysokociśnieniowej, będą również prowadziły do uszkodzenia pokswirusów. Dlatego zadziwiającym było odkrycie, że homogenizacja wysokociśnieniowa uszkadza komórki, ale pozostawia nieuszkodzoną wystarczającą do dalszego oczyszczania ilość pokswirusów. Innymi słowy, nie zakładano, że homogenizacja wysokociśnieniowa mogłaby być stosowana jako metoda odzyskiwania pokswirusów z zainfekowanych komórek. Istotnie, według znanej procedury odzyskiwania pokswirusów z zainfekowanych komórek, do homogenizacji używano ultradźwięków, co jest dość delikatną formą homogenizacji.
W przeciwieństwie do metod odzyskiwania wirusów, wykorzystujących ultradźwięki, metoda według niniejszego wynalazku pozwala na powtarzalną homogenizację zainfekowanych komórek; jest łatwa do kontrolowania i umożliwia łatwą adaptację procesu ze skali laboratoryjnej na przemysłową.
W kontekście niniejszego wynalazku określenie „pokswirus” odnosi się do jakiegokolwiek wirusa należącego do rodziny Poxviridae. Metoda według niniejszego wynalazku jest w formie preferowanej używana w przypadku pokswirusów z podrodziny Chordopoxvirinae, w formie bardziej preferowanej w przypadku rodzajów Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Capńpoxvirus i Suipoxvirus. W formie najbardziej preferowanej wynalazek dotyczy metody odzyskiwania i oczyszczania pokswirusów wybranych z grupy składającej się z: wirusa krowianki, wirusa ospy koziej, wirusa ospy owczej, pokswirusa atakującego kanarki i pokswirusa atakującego drób. Szczególnie preferowany jest wirus krowianki.
Przykładowymi szczepami wirusa krowianki, w przypadku których może być stosowana metoda według niniejszego wynalazku, są szczepy: Elstree, Wyeth, Copenhagen, Tempie of Heaven, NYCBH, Western Reserve. Wynalazek nie ogranicza się do tych szczegółowo wymienionych szczepów wirusa krowianki, ale może być stosowany w przypadku jakiegokolwiek szczepu wirusa krowianki.
PL 205 929 B1
Przykładowym preferowanym szczepem wirusa krowianki jest zmodyfikowany szczep wirusa krowianki Ankara (MVA). Typowym szczepem MVA jest MVA 575, który został zdeponowany w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Tkankowych (ECACC) z numerem akcesyjnym ECACC V00120707. Najbardziej preferowanym jest MVA-BN będący pochodną powyższego. MVA-BN został opisany w WO 02/42480 (PCT/EP01/13628). Wzmiankowane zgłoszenie międzynarodowe dotyczy testów biologicznych pozwalających na określenie, czy szczep MVA jest szczepem MVA-BN lub jego pochodną i metod pozwalających uzyskać MVA-BN lub jego pochodną. Treść tego zgłoszenia jest włączona do niniejszego w postaci odnośnika. MVA-BN został zdeponowany w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Tkankowych z numerem akcesyjnym ECACC V00083008. Odzyskiwane wirusy mogą być wirusami natywnymi, atenuowanymi lub rekombinowanymi.
Określenie „wirus rekombinowany” odnosi się do jakiegokolwiek wirusa, w którym do genomu wirusowego został wstawiony gen heterologiczny, który nie jest naturalnie częścią genomu wirusowego. Gen heterologiczny może być genem terapeutycznym, genem kodującym antygen lub peptyd zawierający przynajmniej jeden epitop wywołujący odpowiedź immunologiczną, antysensowną kasetą ekspresyjną lub genem rybozymu. Metody otrzymywania wirusów rekombinowanych są znane specjalistom w tej dziedzinie. Gen heterologiczny jest w sposób preferowany wstawiany w rejonie nieistotnym dla genomu wirusa. W innej preferowanej formie zastosowania wynalazku, heterologiczna sekwencja kwasu nukleinowego jest wstawiana do genomu MVA w naturalnie występującym miejscu delecji (opisane w PCT/EP/96/02926).
„Wirus atenuowany” jest wirusem, który podczas infekcji organizmu gospodarza powoduje niższą śmiertelność i/lub wykazuje się niższą chorobotwórczością w porównaniu do nie atenuowanego wirusa macierzystego. Przykładowymi atenuowanymi szczepami wirusa krowianki są szczepy MVA, w szczególnoś ci MVA-575 i MVA-BN.
Pokswirusy, takie jak wirus krowianki, znane są z tego, że występują w dwóch różnych formach: pokswirusów związanych z błonami komórkowymi w cytoplazmie zainfekowanych komórek (wewnątrzkomórkowych dojrzałych wirionów (IMV)) i wirusów, które wydostały się na zewnątrz komórki (zewnątrzkomórkowych wirionów opłaszczonych (EEV, ang. extracellular enveloped virions)) (Vanderplasschen A, Hollinshead M, Smith GL „Intracellular and extracellular vaccinia virions enter cells by different mechanisms” J. Gen. Virol. (1998), 79, 877-887). Obie formy, IMV i EEV, są zakaźne, ale różnią się morfologicznie, ponieważ forma EEV zawiera dodatkową otoczkę lipoproteinową. W normalnych warunkach cząstki IMV są bardziej powszechne niż EEV, ale metodą według niniejszego wynalazku można uzyskać oba typy cząstek.
Materiałem wyjściowym do etapu homogenizacji według niniejszego wynalazku są komórki zainfekowane odpowiednim pokswirusem. Określenie „komórki zainfekowane”, używane do zdefiniowania materiału wyjściowego do homogenizacji według niniejszego wynalazku, odnosi się do nieuszkodzonych komórek zainfekowanych odpowiednim wirusem, części i fragmentów zainfekowanych komórek, z którymi związany jest odpowiedni pokswirus lub mieszaniny nieuszkodzonych i poddanych lizie/uszkodzonych komórek. Przykładowymi częściami lub fragmentami zainfekowanych komórek są błony komórkowe poddanych lizie/uszkodzonych komórek, z którymi związany jest odpowiedni pokswirus. Materiał wyjściowy może również zawierać wolne cząstki wirusa, niezwiązane z błoną komórkową i nie znajdujące się wewnątrz komórek.
W celu uzyskania zainfekowanych komórek, które są materiał em wyjściowym do zastosowania metody według niniejszego wynalazku, komórki eukariotyczne są infekowane odpowiednim pokswirusem. Komórki eukariotyczne są komórkami, które są podatne na infekcję odpowiednim pokswirusem i pozwalają na jego replikację i namnażanie. Takie komórki są znane specjalistom w tej dziedzinie dla wszystkich pokswirusów. W przypadku MVA i szczepu Elstree wirusa krowianki przykładowymi komórkami tego typu są fibroblasty zarodków kurzych (CEF, ang. chicken embryo fibroblasts) (Drexler I., Heller K., Wahren B., Erfle V. i Sutter G. „Highly attenuated modified vaccinia Ankara replicates in baby hamster kidney cells, a potential host for virus propagation, but not in various human transformed and primary cells” J. Gen. Virol. (1998), 79, 347-352). Komórki CEF mogą być hodowane w warunkach znanych specjaliście w tej dziedzinie. W sposób preferowany komórki CEF są hodowane w poż ywce nie zawierającej surowicy w naczyniach nieruchomych lub kolbach obracanych. Okres inkubacji wynosi w formie preferowanej od 48 do 96 godzin w 37°C ± 2°C. Pokswirusy są używane do infekcji w formie preferowanej z zastosowaniem współczynnika zakażania (MOI, ang. multiplicity of infection) 0,05 do 1 TCID50 i okresu inkubacji wynoszącego w formie preferowanej od 48 do 72 godzin w 37°C ± 2°C. Przebieg infekcji może być kontrolowany przez obserwację efektów cytopatycznych
PL 205 929 B1 (CPE, ang. cytopathic effects), w typowej formie mających postać znacznego zaokrąglenia zainfekowanych komórek.
Niniejszy wynalazek umożliwia odzyskiwanie pokswirusów, takich jak Elstree łub MVA z zainfekowanych komórek. Pojęcie „odzyskiwanie” oznacza, że metoda według niniejszego wynalazku pozwala na dezintegrację komórek zainfekowanych pokswirusem i/lub oddzielanie pokswirusów od błon komórkowych, z którymi są one zwykle związane, w takim stopniu, aby możliwe było dalsze oczyszczanie pokswirusów. Dlatego produktem odzyskiwania pokswirusów z zainfekowanych komórek (określanym w niniejszym zgłoszeniu jako „homogenat zawierający pokswirusy”) jest homogenna mieszanina wolnych pokswirusów i szczątków komórek zawierająca jedynie niewielką ilość całych, nieuszkodzonych komórek i wirusów związanych z błonami komórkowymi. Jeżeli komórki zainfekowane są komórkami, które mogą być hodowane w zawiesinie, to komórki zainfekowane mogą być łatwo odzyskiwane z zawiesiny przy pomocy wirowania. Jeżeli komórki zainfekowane są mniej lub bardziej nieuszkodzonymi komórkami adherentnymi, to powinny być zbierane, np. usunięte z naczynia hodowlanego, przed poddaniem ich działaniu homogenizacji wysokociśnieniowej. Metody usuwania komórek z naczynia są znane specjaliś cie w tej dziedzinie. Wykorzystywanymi technikami są metody mechaniczne (np. używanie gumowego narzędzia do zdrapywania komórek), fizyczne (np. zamrażanie naczyń hodowlanych do temperatury poniżej -15°C i rozmrażanie do temperatury +15°C) lub biochemicznych (poddawanie hodowli działaniu enzymów, np. trypsyny, w celu oddzielenia komórek od naczyń hodowlanych). W przypadku stosowania enzymów czas inkubacji powinien być kontrolowany, ponieważ stosowane enzymy mogą podczas inkubacji uszkodzić wirusy.
W ramach metody wedł ug niniejszego wynalazku, komórki zainfekowane, a precyzyjniej odzyskane komórki zainfekowane są następnie poddawane homogenizacji wysokociśnieniowej. W niniejszej specyfikacji zamiast określenia „homogenizacja wysokociśnieniowa” będzie niekiedy użyty skrót „HPH”. Homogenizacja wysokociśnieniowa wywołuje podwójny efekt. Z jednej strony powoduje dezintegrację nieuszkodzonych komórek i w ten sposób cząstki IMV są uwalniane i stają się dostępne do dalszego oczyszczania. Z drugiej strony powoduje odłączanie pokswirusów od błon komórkowych lub przynajmniej ograniczenie rozmiarów agregatów wirusów z błoną komórkową, co również ułatwia dalsze oczyszczanie pokswirusów.
Ogólna zasada działania homogenizacji wysokociśnieniowej nie jest obca specjalistom w tej dziedzinie (White MD, Marcus D., „Disintegration of microorganisms, Adv. Biotechnol. Processes 1988, 8: 51-96). Systemy HPH są oparte o zastosowanie wysokiego ciśnienia do przeciśnięcia próbki przez małą sztywną dyszę wylotową z wysoką szybkością w kontrolowanych i powtarzalnych warunkach. W niniejszym opisie określenia zawór, dysza oraz otwór wylotowy będą używane zamiennie. Sercem każdego urządzenia do dezintegracji komórek jest głowica dezintegrująca. Głowica dezintegrująca składa się zazwyczaj z:
(I) komory/cylindra wysokociśnieniowego, (II) wysokociśnieniowego tłoka, który wsuwa się do komory/cylindra i w ten sposób zwiększa ciśnienie w komorze/cylindrze i (III) zaworu/dyszy wylotowej, przez który wyciskana jest zawartość komory.
Wyciśnięta zawartość komory jest kierowana na powierzchnię docelową, jak na przykład element metalowy, która posiada zazwyczaj system wymiany ciepła umożliwiający chłodzenie. W celu gromadzenia zdezintegrowanej zawartości komory system wyposażony jest w elementy służące do zbierania zdezintegrowanej próbki (nazywane „komorą zbierającą”). Typowym zestawem do homogenizacji wysokociśnieniowej jest Basic Z+ firmy Constant Cell Disruption Systems (Low March, Daventry, Northants, NN114SD, Wielka Brytania).
W preferowanej formie dezintegracja komórek metodą homogenizacji wysokociś nieniowej odbywa się w trzech etapach.
(I) Próbka jest wprowadzana do komory/cylindra wysokociśnieniowego. Następnie ciśnienie w komorze/cylindrze jest zwię kszane. W tym celu opuszczany jest tł ok wysokociś nieniowy.
(II) Tłok przeciska próbkę z dużą szybkością przez dyszę wylotową. Gwałtowne przeniesienie próbki z warunków wysokiego ciśnienia do warunków niskiego ciśnienia powoduje dezintegrację komórek.
(III) Próbka uderza w element docelowy i jest rozprowadzana promieniście po chłodzonej powierzchni wymieniającej ciepło. Następnie produkt wpada do komory zbierającej. Hydraulika jest wraca do stanu początkowego i rozpoczyna się kolejny cykl. Pod koniec procesu wyciśnięty homogenat jest gromadzony w odpowiednim naczyniu w zależności od objętości.
PL 205 929 B1
Do odzyskiwania pokswirusów według niniejszego wynalazku dysza wylotowa powinna mieć średnicę o wielkości z zakresu od 0,10 do 0,6 mm, od 0,15 do 0,6 mm, od 0,15 do 0,50 mm, w formie preferowanej od 0,15 do 0,40 mm, od 0,20 do 0,50 mm, w formie bardziej preferowanej od 0,20 do 0,40 mm, w formie najbardziej preferowanej od 0,25 mm do 0,35 mm. Przykładowe najbardziej preferowane wielkości średnic to 0,25 mm i 0,35 mm. Ciśnienie w komorze/cylindrze ciśnieniowym jest ustalane na wysokości z zakresu od 200 do 1000 barów, w formie preferowanej od 400 do 1000 barów, od 200 do 800 barów, w formie bardziej preferowanej od 400 do 800 barów, od 600 do 1000 barów, w formie jeszcze bardziej preferowanej od 600 do 900, w formie najbardziej preferowanej od 700 do 900 barów. Najbardziej preferowanym ciśnieniem jest 800 barów. Temperatura wypływającego homogenatu w formie preferowanej nie powinna przekraczać +25°C, co więcej powinna w formie preferowanej wynosić poniżej 15°C, w formie najbardziej preferowanej poniżej 10°C.
Metoda według niniejszego wynalazku może być adaptowana do większych objętości w sposób niemal liniowy oraz może być stosowana partiami lub w sposób ciągły. W przypadku procesu prowadzonego partiami każda partia komórek do homogenizacji może być poddawana etapowi wysokociśnieniowej homogenizacji jednorazowo lub wielokrotnie. W formie preferowanej każda partia komórek jest poddawana etapowi homogenizacji jeden do trzech razy, w formie najbardziej preferowanej tylko raz. Pozytywny wynik procesu homogenizacji może być weryfikowany w sposób preferowany przez oznaczanie miana wirusa (równego liczbie zakaźnych cząstek wirusa, mierzonej w postaci dawki zakaźnej dla hodowli tkankowej (TCID50, ang. tissue culture infectious dose) lub jednostek formowania łysinek (pfu, ang. plague forming units) w materiale wyjściowym zdefiniowanym powyżej i materiale otrzymanym w wyniku etapu homogenizacji. Innymi słowy, miano wirusa jest oznaczane przed i po wysokociśnieniowej homogenizacji. Materiał wyjściowy zawiera mniej lub więcej nieuszkodzonych komórek i raczej wysoki procent dużych agregatów zawierających cząstki pokswirusa związane z błonami komórkowymi. Jeżeli taki materiał zostanie użyty do oznaczania miana wirusa, uzyskane miano jest niższe niż rzeczywista liczba cząstek zakaźnych. Wynika to z faktu, że systemy używane do oznaczania miana wirusa są zwykle systemami związanymi z hodowlami komórkowymi (takimi jak system opisany w przykładzie 2), w przypadku których określa się liczbę zainfekowanych komórek lub powstałych łysinek. W przypadku takiego systemu nie można rozróżnić wyniku pozytywnego, który jest wynikiem zakażenia komórki tylko jednym wirusem od zakażenia komórek, np. dużymi agregatami wirusów związanych z błonami komórkowymi. W wyniku homogenizacji wysokociśnieniowej pokswirusy odłączają się od błon komórkowych i/lub wielkość agregatów wirus-błona komórkowa jest znacznie zredukowana, co prowadzi do większej liczby mniejszych agregatów. Jeżeli taki materiał zostanie użyty do oznaczania miana uzyskane wyniki są wyższe nawet w przypadku, gdy rzeczywista liczba zakaźnych cząstek wirusa się nie zmieniła. Stąd też pozytywny wynik homogenizacji jest odzwierciedlany w formie preferowanej przez mniejszy lub równy współczynnik TCID50/ml („TCID” jest skrótem od „dawki zakaźnej dla hodowli tkankowej”) homogenatu w porównaniu do materiału wyjściowego. W części zawierającej przykłady zobrazowano szczegółowo, w jaki w sposób moż na oznaczyć wartość TCID50/ml. Alternatywnie, wydajność i pozytywny wynik procesu homogenizacji wysokociśnieniowej mogą być określane przy pomocy mikroskopii elektronowej.
Celem dalszego oczyszczenia, uzyskany homogenat jest poddawany przynajmniej jednemu etapowi oczyszczania do uzyskania frakcji wzbogaconej w pokswirusy. Tego typu etapy mogą być w szczególności zastosowane w stosunku do homogenatu zawierającego wirusa krowianki, jeśli ma to na celu oczyszczenie wzmiankowanego wirusa krowianki.
Etap oczyszczania może obejmować między innymi:
- wirowanie partiami (np. na poduszce sacharozowej) lub ultrawirowanie przepływowe (gradienty sacharozy) (Hilfenhaus, J. Kohler, R. i Gruschkau, H., J. Biol. Stand. (1976) 4, 285-293; Madalinski, W., Bankovski, A. i Korbecki, M., Acta Virol. (1977) 21, 104-108),
- ultrafiltrację (np. filtrację krzyżową (ang. cross-flow filtration) przy użyciu membran o wielkości porów większej niż 500 kDa, ale mniejszej lub równej 0,1 μm),
- chromatografię kolumnową (np. jonowymienną oddziaływań hydrofobowych, wykluczenia (ang. size-exclusion) lub kombinację powyższych) (Hedstrom, K. G. i Lindberg, U., Z. Immun, Forsch.
1969 137: 421-430; Stickl, H., Korb, W. I. Hochstein-Mintzel, V., Zbl. Bakt, I. Abt. Orig. (1970), 215,
38-50) lub
- kombinację wszystkich wymienionych powyżej (Masuda, N., Ellen, R. P. i Grove, D. A., J. Bacteriol. (1981), 147(3), 1095-1104).
PL 205 929 B1
Wszystkie inne metody oczyszczania znane specjaliście w tej dziedzinie są również w zakresie niniejszego wynalazku.
W formie preferowanej etap oczyszczania jest etapem ultrafiltracji. W formie najbardziej preferowanej ultrafiltracja jest filtracją krzyżową. Zasada filtracji krzyżowej jest znana specjaliście w tej dziedzinie, patrz np. Richards, G. P. i Goldmintz, D., J. Virol. Methods (1982), 4 (3), strony 147-153. „Evaluation of a cross-flow filtration technique for extraction of polioviruses from inoculated oyster tissue homogenates”.
Mimo że jeden etap oczyszczania mógłby być wystarczający do spełnienia wymogów prawnych dotyczących produktów biofarmaceutycznych, dwa lub więcej z wyżej wymienionych etapów oczyszczania mogą być zestawione w celu otrzymania jeszcze bardziej oczyszczonego produktu.
W najbardziej preferowanej formie niniejszego wynalazku pierwszym etapem oczyszczania jest filtracja krzyżowa, po której następuje przynajmniej jeden etap chromatografii kolumnowej. W najbardziej preferowanej formie etap chromatografii kolumnowej jest etapem chromatografii jonowymiennej lub oddziaływań hydrofobowych. W formie fakultatywnej, otrzymana frakcja wzbogacona w wirusy jest liofilizowana. Sposoby liofilizacji są znane specjaliście w tej dziedzinie (Day J. i McLellan M., Methods in Molecular Biology (1995), 38, Humana Press, „Cryopresevation and freeze-drying protocols”).
W dalszej kolejnoś ci wynalazek dotyczy frakcji wzbogaconej w pokswirusy i/lub homogenatu zawierającego pokswirusy otrzymanych metodą odzyskiwania pokswirusów według niniejszego wynalazku, a ściślej metodą obejmującą etap poddawania zainfekowanych komórek homogenizacji wysokociśnieniowej. Wynalazek dotyczy w szczególności frakcji wzbogaconej w pokswirusy uzyskanej metodą odzyskiwania/oczyszczania według niniejszego wynalazku, a ściślej metodą, w której homogenat zawierający pokswirusy uzyskany w wyniku HPH jest poddawany przynajmniej jednemu etapowi oczyszczania. Pokswirus może być jakimkolwiek pokswirusem jak zdefiniowano powyżej. Pokswirus według niniejszego wynalazku może być w szczególności wirusem krowianki, takim jak jakikolwiek szczep nadający się do użycia w charakterze szczepionki, w szczególności szczep Elstree lub zmodyfikowany wirus krowianki Ankara, w formie najbardziej preferowanej MVA-BN.
Homogenat zawierający pokswirusy i/lub frakcja wzbogacona w pokswirusy uzyskane metodą według niniejszego wynalazku, obejmującą etap HPH, charakteryzują się bardzo wysokim stosunkiem wolnej formy IMV pokswirusa do formy EEV pokswirusa. Określenie „wolna forma IMV” jest używane dla wirusów IMV, które zostały odłączone od błon komórkowych po, przed łub w czasie dezintegracji zainfekowanych komórek i dlatego mogą być użyte do dalszych etapów oczyszczania. We wszystkich procesach przemysłowych używanych do otrzymywania pokswirusów materiał wyjściowy zawiera zarówno zainfekowane komórki, jaki i supernatant z hodowli. Dlatego materiał wyjściowy zawiera pokswirusy IMV znajdujące się wewnątrz zainfekowanych komórek, jak i pokswirusy EEV znajdujące się głównie w supernatancie. Znane metody do dezintegracji komórek i następującej potem homogenizacji (np. z użyciem ultradźwięków) nie uszkadzają komórek i/lub nie odłączają pokswirusów IMV od szczątków komórek w sposób tak wydajny jak homogenizacja wysokociśnieniowa. Innymi słowy, większość wirusów IMV pozostaje w formie związanej z błonami komórkowymi lub szczątkami komórek. Dlatego stosunek wolnych IMV do EEV jest niższy niż w przypadku zastosowania metody według niniejszego wynalazku. W przypadku zastosowania ultradźwięków stosunek ten nie zmienia się znacząco podczas dalszych etapów oczyszczania, ponieważ szczątki komórkowe, z którymi IMV pozostają cały czas związane, są zazwyczaj usuwane. W odróżnieniu od znanych metod odzyskiwania pokswirusów, wynikiem metody odzyskiwania według niniejszego wynalazku jest bardzo wydajna dezintegracja zainfekowanych komórek oraz bardzo wydajne odłączenie IMV od błon komórkowych. W ten sposób całkowita ilość wolnych IMV dostępnych do dalszego oczyszczania jest wyższa niż w przypadku wcześ niej znanych metod i w konsekwencji stosunek wolnych pokswirusów IMV do EEV jest również wyższy.
Homogenat zawierający pokswirusy i/lub frakcja wzbogacona w pokswirusy uzyskane metodą według niniejszego wynalazku mogą być stosowane w charakterze szczepionek. Jeżeli homogenat zawierający pokswirusy i/lub frakcja wzbogacona w pokswirusy zawierają niezmodyfikowane pokswirusy lub atenuowane pokswirusy, takie jak szczepy wirusa krowianki Elstree lub MVA, to mogą być używane do szczepień przeciw infekcjom pokswirusami. Np. homogenat zawierający wirusy i/lub frakcja wzbogacona w wirusy, które zawierają wirusy krowianki, takie jak szczep Elstree lub MVA, w szczególności MVA-BN, mogą być stosowane do szczepień przeciw infekcjom wirusem ospy właściwej. Jeżeli homogenat zawierający pokswirusy i/lub frakcja wzbogacona w pokswirusy zawierają pokswirus, który posiada i umożliwia ekspresję jednego lub więcej genów heterologicznych, to homoPL 205 929 B1 genat zawierający pokswirusy i/lub frakcja wzbogacona w pokswirusy mogą być dalej użyte do szczepienia zwierząt, włączając ludzi, przeciw białku kodowanemu przez gen(y) heterologiczny(e).
W celu przygotowania szczepionki homogenat zawierający pokswirusy i/lub frakcja wzbogacona w pokswirusy uzyskane metodą według niniejszego wynalazku są przekształcane do formy akceptowalnej fizjologicznie. Może to być wykonane na bazie doświadczeń w otrzymywaniu szczepionek pokswirusowych używanych do szczepień przeciw wirusowi ospy właściwej (jak opisano, Stickl et al., [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). Przykładowo, homogenat zawierający pokswirusy i/lub frakcja wzbogacona w pokswirusy, których miano wynosi 5 x 108 TCID50/ml, są przechowywane w -80°C w roztworze około 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH 7,4. Do przygotowania zastrzyków szczepionki, np. 103-108 TCID50 wirusa jest liofilizowane w ampułce, w formie preferowanej w ampułce szklanej, w roztworze soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) w obecności 2% peptonu i 1% ludzkiej albuminy. W formie alternatywnej, zastrzyki szczepionki mogą być otrzymywane w wyniku stopniowej liofilizacji wzmiankowanego roztworu zawierającego wirusy. Roztwór ten może również zawierać substancje dodatkowe, takie jak mannitol, dekstran, cukier, glicyna, laktoza lub poliwinylopirolidon lub inne dodatki, takie jak antyoksydanty lub gaz obojętny, stabilizatory, czy też białka rekombinowane (np. ludzką albuminę osoczową) właściwe do podawania in vivo. Typowy roztwór zawierający wirusy odpowiedni do liofilizacji zawiera 10 mM bufor Tris, 140 mM NaCl, 18,9 g/l dekstranu (MW 36000-40000), 45 g/l sacharozy, 0.108 g/l jednowodnej jednopotasowej soli kwasu L-glutaminowego pH 7,4. Następnie ampułka szklana jest szczelnie zamykana i może być przechowywana w temperaturze od 4°C do pokojowej przez kilka miesięcy. Jednak w przypadku, gdy nie ma takiej potrzeby, ampułka jest przechowywana w formie preferowanej w temperaturze poniżej -20°C.
W celu szczepienia liofilizowany lub sublimacyjnie suszony produkt może być rozpuszczony w 0,1 do 0,5 ml roztworu wodnego, w formie preferowanej soli fizjologicznej lub buforu Tris i podawany ogólnoustrojowo lub lokalnie, ściślej pozajelitowo, domięśniowo lub w jakikolwiek inny sposób znany wprawnemu lekarzowi. Forma podawania, dawka i ilość dawek może być w znany sposób optymalizowana przez specjalistów w tej dziedzinie. W formie najbardziej preferowanej wektory pokswirusowe są podawane podskórnie lub domięśniowo.
W dalszej kolejności wynalazek dotyczy sposobu szczepienia zwierząt, w tym ludzi obejmujący szczepienie zwierzęcia, w tym człowieka, u którego występuje taka potrzeba, homogenatem zawierającym pokswirusy i/lub frakcją wzbogaconą w pokswirusy uzyskanymi metodą według niniejszego wynalazku.
Streszczenie wynalazku
Wynalazek obejmuje między innymi poniższe, pojedynczo lub w zestawieniu:
Metodę odzyskiwania pokswirusów z zainfekowanych komórek obejmującą etap poddawania zainfekowanych komórek homogenizacji wysokociśnieniowej, w celu otrzymania homogenatu zawierającego pokswirusy.
Powyższą metodę charakteryzującą się tym, że pokswirus jest wybrany z grupy obejmującej rodzaje Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Suipoxvirus i Capripoxvirus.
Powyższą metodę charakteryzującą się tym, że pokswirus jest wybrany z grupy składającej się z wirusa krowianki, wirusa ospy koziej, wirusa ospy owczej, pokswirusa atakującego kanarki i pokswirusa atakującego drób.
Powyższą metodę charakteryzującą się tym, że wirus krowianki jest zmodyfikowanym szczepem wirusa krowianki Ankara (MVA), w szczególności MVA-BN o numerze akcesyjnym ECACC V00083008.
Powyższą metodę charakteryzującą się tym, że pokswirus jest rekombinowanym pokswirusem.
Powyższą metodę charakteryzującą się tym, że homogenizacja wysokociśnieniowa jest prowadzona przez umieszczanie zainfekowanych komórek w komorze wysokociśnieniowej, zwiększanie ciśnienia w komorze i wyciskanie zainfekowanych komórek przez dyszę wylotową.
Powyższą metodę charakteryzującą się tym, że ciśnienie w komorze jest zwiększane do wysokości z zakresu od 200 do 1000 barów.
Powyższą metodę charakteryzującą się tym, że średnica dyszy wylotowej ma wielkość z zakresu od 0,10 do 0,6 mm.
Powyższą metodę charakteryzującą się tym, że homogenat zawierający pokswirusy jest poddawany przynajmniej jednemu etapowi oczyszczania, w celu otrzymania frakcji wzbogaconej w pokswirusy.
Powyższą metodę charakteryzującą się tym, że przynajmniej jeden z etapów oczyszczania jest etapem ultrafiltracji.
PL 205 929 B1
Powyższą metodę charakteryzującą się tym, że ultrafiltracja jest filtracją krzyżową.
Powyższą metodę charakteryzującą się tym, że podczas etapu filtracji krzyżowej używana jest membrana o wielkości porów większej niż 500 kDa, ale mniejszej lub równej 0,1 μm.
Powyższą metodę charakteryzującą się tym, że po etapie ultrafiltracji stosowany jest przynajmniej jeden etap chromatografii kolumnowej.
Powyższą metodę charakteryzującą się tym, że otrzymany homogenat zawierający pokswirusy lub frakcja wzbogacona w pokswirusy są liofilizowane. Homogenat zawierający pokswirusy lub frakcja wzbogacona w pokswirusy uzyskane metodą zdefiniowaną powyżej.
Zdefiniowane powyżej, homogenat zawierający pokswirusy lub frakcja wzbogacona w pokswirusy jako szczepionka.
Zastosowanie zdefiniowanego powyżej homogenatu zawierającego pokswirusy lub frakcji wzbogaconej w pokswirusy do otrzymywania szczepionki.
Metoda szczepienia zwierzęcia, w tym człowieka, u którego występuje taka potrzeba, charakteryzująca się podawaniem homogenatu zawierającego pokswirusy lub frakcji wzbogaconej w pokswirusy lub szczepionki, jak zdefiniowano powyżej, do ciała zwierzęcia.
Opis figur
Figura 1: Komórki CEF zainfekowane MVA-BN były poddawane cyklom zamrażania i rozmrażania w celu otrzymania zawiesiny wirusów i komórek. Miano wirusa w zawiesinie było oznaczane jak opisano w przykładzie 2 bez dalszego oczyszczania zawiesiny wirusów i komórek („wartość - 0”). Zawiesina wirusów i komórek była poddawana znanej wcześniej metodzie homogenizacji z zastosowaniem ultradźwięków („Sonifikator”) lub metodzie homogenizacji według niniejszego wynalazku („HPH”) jak opisano w przykładzie 1. Podczas etapu HPH użyto ciśnienia 800 barów, a dysza wylotowa miała średnicę 0,25 mm. Pod koniec etapu homogenizacji miano wirusa było oznaczane ponownie.
Przykłady
Następujące przykłady szerzej zilustrują niniejszy wynalazek. Dla specjalisty w tej dziedzinie zrozumiałym będzie, że podane przykłady nie mogą być w żaden sposób interpretowane tak, aby ograniczało to niniejszy wynalazek do zastosowania technologii użytej w tych przykładach.
P r z y k ł a d 1. Homogenizacja zawiesiny pokswirusów i komórek przy użyciu homogenizatora wysokociśnieniowego
Fibroblasty zarodków kurzych (CEF) hodowane w kolbach obracanych były infekowane przy pomocy MVA-BN (ECACC V00083008). Zainfekowane komórki były poddawane zamrażaniu i rozmrażaniu w celu uzyskania zawiesiny wirusów i komórek.
Do homogenizatora Basic Z+ firmy Constant Celi Disruption Systems (Low March, Daventry, Northants, NN114SD, Wielka Brytania) wlewano podczas każdego cyklu 50 ml nieoczyszczonej zawiesiny wirusów i komórek. W celu znalezienia optymalnych warunków homogenizacji testowano średnice otworu wylotowego w zakresie od 0,18 do 0.40 mm i wysokości ciśnienia w zakresie od 200 do 1000 barów. Nie oczyszczona zawiesina była poddawana homogenizacji wysokociśnieniowej jeden, dwa lub trzy razy. Homogenizator był używany według instrukcji producenta. Wynik optymalizacji metody był weryfikowany przez monitorowanie miana wirusa jak opisano w przykładzie 2.
W ramach testów wstępnych stwierdzono, że średnice otworu wylotowego większe niż 0,4 mm nie mają pozytywnego wpływu na wynik homogenizacji. W przypadku wielkości otworu wylotowego 0,18 mm, 0,25 mm i 0,35 mm najlepsze wyniki uzyskiwano przy poddawaniu zawiesiny wirusów i komórek jednorazowo działaniu ciśnienia 800 barów. W tych warunkach nie stwierdzono większych różnic miana wirusów.
Metoda według niniejszego wynalazku została porównana do znanej wcześniej metody bezpośredniego przepływowego poddawania działaniu ultradźwięków. Podsumowanie wyników przedstawia figura 1. W porównaniu do poddawania działaniu ultradźwięków, metodą według niniejszego wynalazku uzyskano wyższe miano wirusa i lepszą homogenność zawiesiny, która jest dzięki temu łatwiejsza do dalszego przetwarzania.
P r z y k ł a d 2. Miareczkowanie Zmodyfikowanego Wirusa Krowianki Ankara (MVA)
Miareczkowanie zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (MVA) jest prowadzone przy pomocy testu opartego o TCID50 z zastosowaniem rozcieńczeń 10-krotnych na płytkach 96-dołkowych. Pod koniec testu zainfekowane komórki są barwione przy pomocy przeciwciał przeciw wirusowi krowianki i odpowiedniego roztworu barwiącego. 2-3 dniowe pierwotne komórki CEF (fibroblastów zarodków kurzych) są rozcieńczane do 30 stężenia 1 x 105 komórek/ml w 7% RPMI. Przygotowywane są 10-krome rozcieńczenia z 8 powtórzeniami na rozcieńczenie. Po rozcieńczeniu, komórki są wysiewaPL 205 929 B1 ne na płytki 96-dolkowe, po 100 μl na studzienkę. Następnie komórki są inkubowane przez noc w 37°C i 5% CO2. Rozcieńczenia roztworów zawierających wirusy są wykonywane w systemie 10-krotnym (odpowiednio od 10-1 do 10-12) przy użyciu RPMI bez cielęcej surowicy płodowej. Następnie, 100 μl każdej próbki wirusa jest dodawane do dołków zawierających komórki. Płytki 96-dołkowe są inkubowane w 37°C i 5% CO2 przez 5 dni, aby umożliwić infekcję i replikację wirusów.
dni po infekcji komórki są barwione przy pomocy przeciwciał specyficznych wobec wirusa krowianki. Do detekcji specyficznych przeciwciał używana jest peroksydaza chrzanowa (HRP, ang. horseradish peroxidase) związana z przeciwciałem wtórnym. Przeciwciała specyficzne wobec MVA są poliklonalnymi króliczymi przeciwciałami IgG, specyficznymi wobec wirusa krowianki (Quartett, Berlin, Niemcy # 9503-2057). Wtórnymi przeciwciałami są związane z HRP kozie antykrólicze przeciwciała IgG (Promega, Mannheim, Niemcy, # W4011). Reakcja barwna jest prowadzona według znanych technik. Każdy dołek zawierający komórki dające w wyniku reakcji barwnej odczyn pozytywny jest oznaczany jako pozytywny podczas obliczania TCID50.
Miano jest uzyskiwane z wzoru Spearmana [1] i Kaerbera [2]. Ponieważ wszystkie parametry testu są stałe, używany jest poniższy, uproszczony wzór:
Miano wirusa [TCID50 / ml] = 10 [a + 1,5 + — +Xb + — ]
8 8 a = współczynnik rozcieńczenia ostatniej kolumny, w której wszystkie osiem dołków daje wynik pozytywny xa = liczba pozytywnych dołków w kolumnie a + 1 Xb = liczba pozytywnych dołków w kolumnie a + 2 xc = liczba pozytywnych dołków w kolumnie a + 3
Claims (16)
1. Sposób odzyskiwania pokswirusów z zainfekowanych komórek, znamienny tym, że obejmuje etap poddawania zainfekowanych komórek wysokociśnieniowej homogenizacji, w celu otrzymania homogenatu zawierającego pokswirusy.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pokswirus jest wybrany z grupy obejmującej rodzaje Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Suipoxvirus i Capripoxvirus.
3. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 2, znamienny tym, że pokswirus jest wybrany z grupy składającej się z wirusa krowianki, wirusa ospy koziej, wirusa ospy owczej, pokswirusa atakującego kanarki i pokswirusa atakującego drób.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wirus krowianki jest szczepem Elstree lub zmodyfikowanym szczepem wirusa krowianki Ankara (MVA), w szczególności MVA-BN o numerze akcesyjnym ECACC V00083008.
5. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, że pokswirus jest rekombinowanym pokswirusem.
6. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 5, znamienny tym, że homogenizację wysokociśnieniową prowadzi się przez umieszczanie zainfekowanych komórek w komorze wysokociśnieniowej, zwiększanie ciśnienia w komorze i wyciskanie zainfekowanych komórek przez dyszę wylotową.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że ciśnienie w komorze jest zwiększane do wartości leżącej w zakresie od 200 do 1000 barów.
8. Sposób według jednego z zastrz. od 6 do 7, znamienny tym, że średnica dyszy wylotowej ma wielkość z zakresu od 0,10 do 0,60 mm.
9. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 8, znamienny tym, że homogenat zawierający pokswirusy jest poddawany etapowi oczyszczania w celu otrzymania frakcji wzbogaconej w pokswirusy.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że etap oczyszczania jest etapem ultrafiltracji.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że ultrafiltracja jest filtracją krzyżową.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że podczas etapu filtracji krzyżowej używana jest membrana o wielkości porów większej niż 500 kDa, ale niniejszej lub równej 0,1 μm.
13. Sposób według jednego z zastrz. od 10 do 12, znamienny tym, że po etapie ultrafiltracji stosowany jest przynajmniej jeden etap chromatografii kolumnowej.
14. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 13, znamienny tym, że otrzymany homogenat zawierający pokswirusy lub frakcja wzbogacona w pokswirusy są liofilizowane.
PL 205 929 B1
15. Frakcja wzbogacona w pokswirusy lub homogenat zawierający pokswirusy otrzymane sposobem według jednego z zastrz. od 1 do 14.
16. Zastosowanie frakcji wzbogaconej w pokswirusy lub homogenatu zawierającego pokswirusy określonych w zastrz. 15 do otrzymywania szczepionki.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA200101928 | 2001-12-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL369498A1 PL369498A1 (pl) | 2005-04-18 |
| PL205929B1 true PL205929B1 (pl) | 2010-06-30 |
Family
ID=8160920
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL369498A PL205929B1 (pl) | 2001-12-20 | 2002-12-13 | Sposób odzyskiwania i oczyszczania poxywirusów z zainfekowanych komórek |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7056723B2 (pl) |
| EP (1) | EP1407006B9 (pl) |
| JP (2) | JP5322252B2 (pl) |
| KR (1) | KR100947976B1 (pl) |
| CN (1) | CN1289663C (pl) |
| AT (1) | ATE302268T1 (pl) |
| AU (1) | AU2002352247B2 (pl) |
| BR (1) | BRPI0215003B1 (pl) |
| CA (1) | CA2467099C (pl) |
| DE (1) | DE60205631T2 (pl) |
| DK (1) | DK1407006T3 (pl) |
| EA (1) | EA006485B1 (pl) |
| ES (1) | ES2247404T3 (pl) |
| HU (1) | HU227507B1 (pl) |
| IL (2) | IL161526A0 (pl) |
| MX (1) | MXPA04006001A (pl) |
| NO (1) | NO335975B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ533586A (pl) |
| PL (1) | PL205929B1 (pl) |
| SI (1) | SI1407006T1 (pl) |
| UA (1) | UA77735C2 (pl) |
| WO (1) | WO2003054175A1 (pl) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7445924B2 (en) | 2000-11-23 | 2008-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| WO2002042480A2 (en) | 2000-11-23 | 2002-05-30 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia ankara virus variant |
| SI1434858T2 (sl) * | 2002-09-05 | 2019-05-31 | Bavarian Nordic A/S | Postopek za pomnoževanje poksvirusa v razmerah brez seruma |
| US7951576B2 (en) * | 2004-11-05 | 2011-05-31 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods for preparing cells and viruses |
| US7625570B1 (en) * | 2005-03-10 | 2009-12-01 | The Regents Of The University Of California | Methods for purifying adeno-associated virus |
| AU2008250596C1 (en) * | 2007-05-14 | 2010-11-25 | Bavarian Nordic A/S | Purification of Vaccinia virus- and recombinant Vaccinia virus-based vaccines |
| US8003363B2 (en) | 2007-05-14 | 2011-08-23 | Bavarian Nordic A/S | Purification of vaccinia virus- and recombinant vaccinia virus-based vaccines |
| BRPI0908474A2 (pt) * | 2008-02-12 | 2016-07-26 | Sanofi Pasteur Ltd | métodos de uso de cromatografia de troca de íon e de filtração de gel para purificação de vírus causador da catapora |
| SG176554A1 (en) * | 2009-05-12 | 2012-01-30 | Transgene Sa | Method for orthopoxvirus production and purification |
| FR2953686B1 (fr) * | 2009-12-14 | 2012-11-02 | Agronomique Inst Nat Rech | Procede pour reduire la teneur bacterienne d'un milieu alimentaire et/ou biologique d'interet, contenant des gouttelettes lipidiques |
| US10087423B2 (en) | 2010-07-20 | 2018-10-02 | Bavarian Nordic A/S | Method for harvesting expression products |
| CN102353792A (zh) * | 2011-07-07 | 2012-02-15 | 贵州大学 | 一种基于gpv p32蛋白的间接elisa试剂盒及制备方法 |
| FR3042121A1 (fr) | 2015-10-08 | 2017-04-14 | Jean-Marc Limacher | Composition anti-tumorale |
| KR20200003921A (ko) | 2017-05-15 | 2020-01-10 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 안정한 바이러스-함유 조성물 |
| WO2018211419A1 (en) | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stable virus-containing composition |
| EP3847246A1 (en) | 2018-09-06 | 2021-07-14 | Bavarian Nordic A/S | Storage improved poxvirus compositions |
| EP4117722A1 (en) | 2020-03-12 | 2023-01-18 | Bavarian Nordic A/S | Compositions improving poxvirus stability |
| EP4547273A1 (en) | 2022-06-29 | 2025-05-07 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified sarna (vrp) and vaccinia virus ankara (mva) prime-boost regimen |
| CN119604618A (zh) | 2022-06-29 | 2025-03-11 | 巴法里安诺迪克有限公司 | 爱泼斯坦-巴尔病毒疫苗 |
| CN115197966A (zh) * | 2022-08-15 | 2022-10-18 | 深圳源兴基因技术有限公司 | 一种利用生物反应器大规模生产重组痘苗病毒载体的方法 |
| FR3160186A1 (fr) | 2024-03-13 | 2025-09-19 | Odimma Therapeutics | Vecteur non-viral pour transcription augmentee |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB877898A (en) | 1956-12-06 | 1961-09-20 | Apv Co Ltd | A new or improved method of liberating enzymes |
| JPS5328989B2 (pl) | 1974-05-27 | 1978-08-17 | ||
| CH621573A5 (en) | 1976-08-05 | 1981-02-13 | Vnii Biosinteza Belkovykh Vesc | Process for the continuous disintegration of microorganism cells and system for carrying out this process |
| JPS54154594A (en) | 1978-05-25 | 1979-12-05 | Sumitomo Chem Co Ltd | Extraction of glucose isomerase |
| WO1991001367A1 (en) | 1989-07-20 | 1991-02-07 | Bioeng, Inc. | Supercritical fluid disruption of and extraction from microbial cells |
| UA68327C2 (en) * | 1995-07-04 | 2004-08-16 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwe | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
| TW426733B (en) | 1995-10-06 | 2001-03-21 | Merck & Co Inc | Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device |
| WO1998013500A2 (en) * | 1996-09-24 | 1998-04-02 | Bavarian Nordic Research Institute A/S | Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
| US5721120A (en) | 1996-10-02 | 1998-02-24 | Merck & Co., Inc. | Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device |
| NZ299720A (en) * | 1996-11-08 | 1999-07-29 | Howick Engineering Ltd | Epicyclic input/output annuli of same pcd, with planetary input/output gear sets, and with only one set having aligned teeth |
| BR9713368A (pt) * | 1996-11-20 | 2001-09-18 | Introgen Therapeutics Inc | Processo melhorado para a produção e a purificação de vetores adenovirais |
| US6000551A (en) | 1996-12-20 | 1999-12-14 | Eastman Chemical Company | Method for rupturing microalgae cells |
| FR2787465A1 (fr) * | 1998-12-21 | 2000-06-23 | Transgene Sa | Procede d'inactivation des virus enveloppes dans une preparation virale de virus non enveloppes |
| WO2000050573A1 (fr) * | 1999-02-22 | 2000-08-31 | Transgene S.A. | Procede d'obtention d'une preparation virale purifiee |
| DE19918619A1 (de) | 1999-04-23 | 2000-10-26 | Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh | Verfahren zum Gewinnen von rekombinantem HBsAg |
| US6951752B2 (en) * | 2001-12-10 | 2005-10-04 | Bexter Healthcare S.A. | Method for large scale production of virus antigen |
-
2002
- 2002-12-13 ES ES02787945T patent/ES2247404T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-13 EP EP02787945A patent/EP1407006B9/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-13 MX MXPA04006001A patent/MXPA04006001A/es active IP Right Grant
- 2002-12-13 CA CA2467099A patent/CA2467099C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-13 AT AT02787945T patent/ATE302268T1/de active
- 2002-12-13 EA EA200400833A patent/EA006485B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-12-13 US US10/495,151 patent/US7056723B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-13 CN CNB028255267A patent/CN1289663C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-13 UA UA20040705906A patent/UA77735C2/uk unknown
- 2002-12-13 DK DK02787945T patent/DK1407006T3/da active
- 2002-12-13 KR KR1020047009777A patent/KR100947976B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-13 SI SI200230220T patent/SI1407006T1/sl unknown
- 2002-12-13 IL IL16152602A patent/IL161526A0/xx unknown
- 2002-12-13 PL PL369498A patent/PL205929B1/pl unknown
- 2002-12-13 JP JP2003554879A patent/JP5322252B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-13 BR BRPI0215003A patent/BRPI0215003B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-12-13 NZ NZ533586A patent/NZ533586A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-12-13 WO PCT/EP2002/014179 patent/WO2003054175A1/en not_active Ceased
- 2002-12-13 AU AU2002352247A patent/AU2002352247B2/en not_active Ceased
- 2002-12-13 HU HU0402337A patent/HU227507B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-12-13 DE DE60205631T patent/DE60205631T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-04-20 IL IL161526A patent/IL161526A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-07-19 NO NO20043181A patent/NO335975B1/no not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-11-19 JP JP2009263687A patent/JP2010046093A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL205929B1 (pl) | Sposób odzyskiwania i oczyszczania poxywirusów z zainfekowanych komórek | |
| JP4439263B2 (ja) | ポックスウイルス含有調合物およびその調製方法 | |
| CN1653183B (zh) | 表达插入痘病毒基因组中的同源基因的重组痘病毒 | |
| CA2751301C (en) | Optimized early-late promoter combined with repeated vaccination favors cytotoxic t cell response against antigens in replication deficient recombinant virus vaccines | |
| CA2887623C (en) | Pr13.5 promoter for robust t-cell and antibody responses | |
| CA2459754C (en) | Vaccinia virus mva-e3l-knock-out-mutants and use thereof | |
| US9163237B2 (en) | Replication deficient recombinant viruses expressing antigens regulated by transcriptional control elements comprising multiple elements | |
| EP3585882A1 (en) | Novel vaccinia virus vectors related to mva with extensive genomic symmetries | |
| HK1161677B (en) | Optimized early-late promoter combined with repeated vaccination favors cytotoxic t cell response against antigens in replication deficient recombinant virus vaccines | |
| MXPA06005559A (es) | Promotores para la expresion en vaccinia virus ankara modificado | |
| HK1170772A (en) | Recombinant poxvirus expressing homologous genes inserted into the poxviral genome |