PL206302B1

PL206302B1 - Związek GLP-1

Info

Publication number: PL206302B1
Application number: PL360406A
Authority: PL
Inventors: Wolfgang Glaesner; Rohn Lee Millican
Original assignee: Elli Lilly And Companyelli Lilly And Company
Priority date: 2000-06-16
Filing date: 2001-06-01
Publication date: 2010-07-30
Also published as: JP2004501162A; HUP0301212A2; EA200300026A1; CN100469791C; ATE346093T1; HUP0301212A3; PT1695983E; US7498308B2; US7084243B2; NZ522330A; WO2001098331A3; PL360406A1; DE60124710T2; EP1695983A2; PE20011363A1; BR0111562A; ATE424413T1; CZ20024088A3; MY137350A; KR100847615B1

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy związku glukagonopodobnego peptydu 1 (GLP-1).

Glukagonopodobny peptyd 1 (GLP-1), będący peptydem o 37 aminokwasach, jest wydzielany przez komórki L jelita w odpowiedzi na spożycie pokarmu. Stwierdzono, że stymuluje on wydzielanie insuliny (działanie insulinotropowe), dzięki czemu powoduje pobieranie glukozy przez komórki i obniżenie poziomu glukozy w surowicy [patrz, na przykład:S. Mojsov, Int. J. Peptide Protein Research, 40, 333 - 343 (1992)]. Jednakże, GLP-1(1-37) przejawia niewielką tylko aktywność, więc uwagę skupiono na jego skróconych analogach, określanych jako związki GLP, o wiele bardziej aktywnych biologicznie niż sam GLP-1. Do przykładowych tego rodzaju związków należą GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)NH2, Gly⁸-GLP-1(7-37)OH i Ser³⁴-GLP-1(7-37)OH. Ze względu na zdolności do stymulowania wydzielania insuliny uważa się, że związki GLP mogą być z powodzeniem stosowane jako środki do leczenia cukrzycy, otyłości i stanów pokrewnych.

Związki GLP-1 mogą istnieć co najmniej w dwóch różnych postaciach. Pierwsza postać jest fizjologicznie aktywna i łatwo się rozpuszcza w roztworze wodnym o fizjologicznej wartości pH (7,4). W przeciwieństwie do tego, postać druga nie wykazuje żadnej aktywności insulinotropowej, a nawet jeśli, to tylko w niewielkim stopniu, i w zasadzie jest nierozpuszczalna w wodzie przy pH 7,4. Niestety, do utworzenia postaci nieaktywnej dochodzi łatwo wtedy, gdy wodne roztwory GLP-1 poddawane są mieszaniu, są eksponowane na powierzchnie hydrofobowe lub mają duże powierzchnie rozdziału faz powietrze/woda. Ta skłonność do przemiany w postać nierozpuszczalną w znacznej mierze komplikuje proces wytwarzania aktywnych związków GLP-1 na skalę komercyjną. Operacje mieszania lub ciągły przepływ przez pompy są powszechnie stosowanymi operacjami w procesach wytwarzania na dużą skalę, a operacje te powodują mieszanie, powstawanie powierzchni międzyfazowych powietrze/woda i/lub zaistnienie kontaktu z powierzchniami hydrofobowymi i wszystko to prowadzi do powstawania postaci nierozpuszczalnej. Przemiana w postać nieaktywną może nastąpić także w trakcie przechowywania, albo już po podaniu podmiotowi, co w dalszym ciągu komplikuje stosowanie tych związków jako leków. Toteż, istnieje wielkie zapotrzebowanie na biologicznie aktywne analogi GLP-1, trudniej przekształcające się w postać nierozpuszczalną, niż ma to miejsce w przypadku dotychczas dostępnych związków GLP-1.

Obecnie stwierdzono, że szereg analogów GLP-1 z modyfikacjami w jednej, lub większej ilości następujących pozycji:11, 12, 16, 22, 23, 24, 26, 27, 30, 33, 34, 35, 36 lub 37, przejawia znacząco mniejszą skłonność do agregacji w porównaniu z GLP-1(7-37)OH.

Wiele z tych analogów utrzymuje zdolność aktywacji receptora GLP-1, porównywalną, a w niektórych przypadkach nawet większą, do zdolności znanych związków GLP-1, takich jak GLP-1(7-37)OH i Val⁸-GLP-1(7-37)OH. I tak, na przykład, czas agregacji Val⁸-Glu²²-Glp(7-37)OH jest ponad 20 razy dłuższy od czasu agregacji GLP-1(7-37)OH, a jego zdolność aktywacji receptora GLP-1 jest o okoł o 25% wię ksza od zdolnoś ci GLP-1(7-37)OH. W oparciu o te odkrycia, ujawniono tu nowe związki GLP-1 i ich zastosowanie w sposobach leczenia.

Przedmiotem wynalazku jest związek GLP-1 obejmujący sekwencję aminokwasową o wzorze III (SEQ ID NO:3):

His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R

Wzór III (SEQ ID NO:3) w którym:

Xaa8 oznacza: Gly albo Val;

Xaa22 oznacza: Glu;

Xaa23 oznacza: His, Asp, Lys, Glu albo Gln;

Xaa27 oznacza: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg albo Lys

Xaa30 oznacza: Ala, Glu, Asp, Ser albo His;

R oznacza: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, -NH2, Gly, Gly-Pro, Gly-Pro-NH2, albo jest usunięty.

Korzystnie związek GLP-1 wybrany jest spośród:

Val⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:5),

Gly⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:9),

Val⁸-Glu²²-GLP-1(7-36) NH2 (SEQ ID NO:32),

Gly⁸-Glu²²-GLP-1(7-36)NH2 (SEQ ID NO:37),

PL 206 302 B1

Val⁸-Glu²²-Lys²³-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:48),

Val⁸-Glu²²-Glu²³-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:49) albo

Val⁸-Glu²²-Ala²⁷-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:50).

Korzystniej ma on sekwencję oznaczoną SEQ ID NO:5.

Jeszcze korzystniej tworzy on kompleks z dwuwartościowym kationem metalu.

Najkorzystniej tworzy on kompleks z dwuwartościowym kationem cynku.

Zgodnie z wynalazkiem opisano polipeptyd o sekwencji aminokwasowej o wzorze I (SEQ ID N0:1):

His-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Ala-Xaa₂₆-Xaa₂₇-Phe-Ile-Ala-Xaa₃₁-Leu-Xaa₃₃ - Xaa₃₄ -Xaa₃₅-Xaa₃₆-R wzór I (SEQ ID NO:1) w którym:

Xaa8 oznacza: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser lub Thr;

Xaa11 oznacza: Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys lub His;

Xaa12 oznacza: His, Trp, Phe lub Tyr;

Xaa16 oznacza: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu lub Ala;

Xaa22 oznacza: Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg, Cys lub kwas cysteinowy;

Xaa23 oznacza: His, Asp, Lys, Glu lub Gln;

Xaa24 oznacza: Glu, His, Ala lub Lys;

Xaa26 oznacza: Asp, Lys, Glu lub His;

Xaa27 oznacza: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg lub Lys;

Xaa30 oznacza: Ala, Glu, Asp, Ser lub His;

Xaa33 oznacza: Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly lub Glu;

Xaa34 oznacza: Glu, Lys lub Asp;

Xaa35 oznacza: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His lub Glu;

Xaa36 oznacza: Arg, Glu lub His;

R oznacza: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, -NH2, Gly, Gly-Pro lub Gly-Pro-NH2, albo go nie ma, przy czym taki polipeptyd nie ma sekwencji GLP-1(7-37)OH lub GLP-1(7-36)-NH2, i przy czym taki polipeptyd nie stanowi

Gly⁸-GLP-1(7-37)OH,

Leu⁸-GLP-1(7-37)OH,

Gly⁸-GLP-1(7-36)NH2,

Leu⁸-GLP-1(7-36)NH2,

Val⁸-GLP-1(7-37)OH,

Ile⁸-GLP-1(7-37)OH,

Thr⁸-GLP-1(7-37)OH,

Ser⁸-GLP-1(7-37)OH, Ser⁸-GLP-1(7-36)NH2,

Ala¹¹-GLP-1(7-37)OH, Ala¹¹-GLP-1(7-36)NH2

Val⁸-GLP-1(7-36)NH2, Ile⁸-GLP-1(7-37)NH2, Thr⁸-GLP-1(7-36)NH2,

Glu²⁷-GLP-1(7-37)OH, Glu²⁷-GLP-(7-36)NH

Ala³³-GLP-1(7-37)OH lub Ala³³-GLP-1(7-36)NH2.

Zgodnie z wynalazkiem opisano także polipeptyd o sekwencji aminokwasowej o wzorze II (SEQ ID NO:2): His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-AlaXaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val -Lys-Xaa35-Arg-R wzór II (SEQ ID NO:2) w którym:

Xaa8 oznacza: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser lub Thr;

Xaa12 oznacza: His, Trp, Phe lub Tyr;

Xaa16 oznacza: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu lub Ala

Xaa22 oznacza: Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg, Cys lub kwas cysteinowy;

Xaa23 oznacza: His, Asp, Lys, Glu lub Gln;

Xaa26 oznacza: Asp, Lys, Glu lub His;

Xaa30 oznacza: Ala, Glu, Asp, Ser lub His;

Xaa35 oznacza: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His lub Glu;

Gly⁸-GLP-1(7-37)OH, Leu⁸-GLP-1(7-37)OH, Ser⁸-GLP-1(7-37)OH, Ala¹⁶-GLP-1(7-37)OH lub

Val⁸-GLP-1(7-37)OH,

Ile⁸-GLP-1(7-37)OH,

Thr⁸-GLP-1(7-37)OH,

Val⁸-GLP-1(7-36)NH2,

Ile⁸-GLP-1(7-36)NH2,

Thr⁸-GLP-1(7-36)NH2,

Gly⁸-GLP-1(7-36)NH2,

Leu⁸-GLP-1(7-37)NH2,

Ser⁸-GLP-1(7-36)NH2,

Ala¹⁶-GLP-1(7-36)NH2 .

Polipeptyd według wynalazku ma sekwencję aminokwasową o wzorze III (SEQ ID NO:3): His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R

PL 206 302 B1 wzór III (SEQ ID NO:3) w którym:

Xaa8 oznacza: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser lub Thr;

Xaa22 oznacza: Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg, Cys lub kwas cysteinowy;

Xaa23 oznacza: His, Asp, Lys, Glu lub Gln;

Xaa27 oznacza: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg lub Lys Xaa30 oznacza: Ala, Glu, Asp, Ser lub His;

R oznacza: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, -NH2, Gly, Gly-Pro lub Gly-Pro-NH2, albo go nie ma. Taki polipeptyd nie ma sekwencji GLP-1(7-37)OH lub GLP-1(7-36)NH2, i nie stanowi

Gly⁸-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-GLP-1(7-36)NH2, Leu⁸-GLP-1(7-37)OH, Leu⁸-GLP-1(7-36)NH2, Ser⁸-GLP-1(7-37)OH, Ser⁸-GLP-1(7-36)NH2, Ala¹⁶-GLP-1(7-36)OH, Ala¹⁶-GLP-1(7-36)NH2

Val⁸-GLP-1(7-36)NH2,

Ile⁸-GLP-1(7-36)NH2,

Thr⁸-GLP-1(7-36)NH2,

Glu²⁷-GLP-1(7-36)NH2.

Val⁸-GLP-1(7-37)OH,

Ile⁸-GLP-1(7-37)OH,

Thr⁸-GLP-1(7-37)OH,

Glu²⁷-GLP-1(7-37) OH,

Zgodnie z wynalazkiem opisano także polipeptydy o sekwencji aminokwasowej o wzorze IV (SEQ ID NO:4):

Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R

Wzór IV (SEQ ID NO:4 ) w którym:

Xaa₇ oznacza L-histydynę, D-histydynę, desaminohistydynę, 2-aminohistydynę, β-hydroksyhistydynę, homohistydynę, α-fluorometylohistydynę i α-metylohistydynę;

Xaa8 oznacza glicynę, alaninę, walinę, leucynę, izoleucynę, serynę lub treoninę.

Zalecany tu Xaa8 oznacza glicynę, walinę, leucynę, izoleucynę, serynę lub treoninę; Xaa22 oznacza kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, glutaminę, asparaginę, lizynę, argininę, cysteinę lub kwas cysteinowy, oraz R oznacza NH2 lub Gly(OH).

Zgodnie z wynalazkiem opisano także związek glukagonopodobnego peptydu 1 (GLP-1) zawierający w pozycji 8 aminokwas inny niż alanina i w pozycji 22 aminokwas inny niż glicyna.

Zgodnie z wynalazkiem opisano również sposób stymulowania receptora GLP-1 u podmiotu potrzebującego stymulacji receptora GLP-1. Sposób taki obejmuje etap podawania podmiotowi w ilości skutecznej związków GLP-1 tu opisanych, albo polipeptydu o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4.

Zgodnie z wynalazkiem opisano też związki GLP-1, w tym związki o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 lub SEQ ID NO:4, do stymulowania receptora GLP-1 u podmiotu potrzebującego takiej stymulacji receptora GLP-1.

Związki GLP-1 według niniejszego wynalazku zachowują zdolność GLP-1 do aktywacji receptora i, oprócz tego, przejawiają zmniejszoną skłonność do agregowania w porównaniu z innymi związkami GLP-1. W wyniku tego, roztwory omawianych związków można poddawać mieszaniu, z minimalnym tylko przekształceniem się ich w nierozpuszczalne postacie nieaktywne. Ta korzystna cecha w dużym stopniu upraszcza proces wytwarzania. Poza tym, oczekuje się, że po podaniu podmiotowi nie nastąpi żadna agregacja in vivo, a jeśli nawet, to tylko w nieznacznym stopniu. Oznacza to zwiększenie aktywności omawianych związków i zminimalizowanie zdolności do wywoływania przez nie reakcji niepożądanych. W dodatku, omawiane związki GLP-1 są oporne na degradację przez diaminopeptydazę IV i wiążą cynk, na podstawie czego sądzi się, że zapewniają wydłużony czas działania in vivo.

Fig. 1 przedstawia sekwencje aminokwasowe

Val⁸-Glu²² -GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO :5); Val⁸-Asp²² -GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO :6); Val⁸-Arg²² -GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO :7); oraz Val⁸-Lys²² -GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO :8).

Fig. 2 przedstawia sekwencje aminokwasowe

Gly⁸-Glu²² -GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO :9); Gly⁸-Asp²² -GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO :10); Gly⁸-Arg²² -GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO :11); oraz Gly⁸-Lys²² -GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO :12).

Fig. 3 przedstawia sekwencje aminokwasowe:

Val⁸-Glu³⁰-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:13);

PL 206 302 B1

Gly⁸-Glu³⁰-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:14);

Val⁸-His³⁷-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:15); oraz

Gly⁸-His³⁷-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:16).

Fig. 4 przedstawia sekwencje aminokwasowe:

Val⁸-Glu²²-Ala²⁷-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:17);

Val⁸-Lys²²-Glu²³-GLP-1(7-37)OH (SEQ IDNO:18);

Związek GLP-1 jest to polipeptyd obejmujący od około 25 do około 39 aminokwasów, tak naturalnych, jak i nie występujących w przyrodzie i wykazujący w wystarczającym stopniu homologię z GLP-1(7-37), tak że wykazuje aktywność insulinotropową. Do przykładowych aminokwasów nie występujących w przyrodzie należą α-metyloaminokwasy (na przykład α-metyloalanina), D-aminokwasy, aminokwasy histydynopodobne (na przykład 2-aminohistydyna, β-hydroksyhistydyna, homohistydyna, α-fluorometylohistydyna i α-metylohistydyna), aminokwasy zawierające dodatkową grupę metylenową w łańcuchu bocznym („homo aminokwasy) oraz aminokwasy, w przypadku których funkcyjna grupa kwasu karboksylowego w łańcuchu bocznym jest zastąpiona ugrupowaniem kwasu sulfonowego (na przykład kwasu cysteinowego). Jednakże, związki GLP-1 według niniejszego wynalazku zawierają jedynie aminokwasy występujące w przyrodzie, jeżeli tego inaczej nie wyszczególniono w niniejszym opisie.

Termin „związek GLP-1 typowo obejmuje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej GLP-1(7-37)OH, analog GLP-1(7-37)OH, fragment GLP-1(7-37)OH lub fragment analogu GLP-1(7-37)OH.

GLP-1(7-37)OH ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO:19:

⁷His-Ala-Glu-¹⁰Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-¹⁵Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-²⁰Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-²⁵Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-³⁰Ala-Trp-Leu-Val-Lys-³⁵Gly-Arg-³⁷Gly (SEQ ID NO:19)

Zgodnie ze zwyczajem przyjętym w tej dziedzinie techniki, N-końcowi GLP-1(7-37)OH nadano numer reszty 7, a C-końcowi numer 37. Inne aminokwasy w polipeptydzie numerowane są kolejno, jak to pokazano w SEQ ID NO:19. I tak, na przykład, pozycję 12 zajmuje fenyloalanina, a pozycję 22 glicyna. Jeżeli tego inaczej nie wyszczególniono, C-koniec występuje w tradycyjnej formie karboksylowej.

„Fragment GLP-1 jest polipeptydem skróconym, uzyskanym po odcięciu jednego, lub więcej niż jednego aminokwasu od N-końca i/lub C-końca GLP-1(7-37)OH lub analogu GLP-1(7-37)OH. Nazewnictwo stosowane do opisu GLP-1(7-37)OH przenosi się na fragmenty GLP-1. I tak, na przykład, GLP-1(9-36)OH oznacza fragment GLP-1 otrzymany po odcięciu dwu aminokwasów od N-końca i jednego aminokwasu od C-końca. Aminokwasy obecne we fragmencie oznacza się takim samym numerem jak odpowiednie aminokwasy w GLP-1(7-37)OH. I tak, na przykład, N-końcowy kwas glutaminowy w GLP-1(9-36) znajduje się pozycji 9, pozycja 12 jest zajęta przez fenyloalaninę, a pozycja 22 przez glicynę, tak jak w GLP-1(7-37)OH.

Termin „związek GLP-1 obejmuje także polipeptydy z jednym, lub więcej niż jednym, aminokwasem dodanym do N-końca lub C-końca GLP-1(7-37)OH, albo do ich fragmentów. Związki GLP-1 tego typu zawierają do około 39 aminokwasów. Aminokwasy w „przedłużonym związku GLP-1 oznaczone są tymi samymi numerami jak odpowiednie aminokwasy w GLP-1(7-37)OH. I tak, na przykład, N-końcowy aminokwas związku GLP-1 otrzymanego przez dodanie dwu aminokwasów do N-końca GLP-1(7-37)OH, znajduje się w pozycji 5, a C-końcowy aminokwas związku GLP-1 otrzymanego przez dodanie jednego aminokwasu do C-końca GLP-1(7-37)OH, znajduje się w pozycji 38. I tak, w obu tych „przedłużonych związkach GLP-1 pozycja 12 zajęta jest przez fenyloalaninę, a pozycja 22 zajęta jest przez glicynę, tak jak w GLP-1(7-37). Dogodnie, aminokwasy 1-6 przedłużonego związku GLP-1 są takie same, lub stanowią konserwatywne podstawienie aminokwasu w odpowiedniej pozycji GLP-1(1-37)OH. Dogodnie, aminokwasy 38 - 45 przedłużonego związku GLP-1 są takie same, lub stanowią konserwatywne podstawienie aminokwasu w odpowiedniej pozycji glukagonu lub eksendyny-4.

Analog „GLP-1 jest homologiczny z GLP-1(7-37)OH lub fragmentem GLP-1(7-37)OH w stopniu wystarczającym do tego, aby wykazywać aktywność insulinotropową. Dogodnie, analog GLP-1 ma sekwencję aminokwasową GLP-1(7-37)OH, lub jego fragmentu, tak zmodyfikowaną, że jeden, dwa, trzy, cztery lub pięć aminokwasów różni się od aminokwasów w odpowiedniej pozycji GLP-1(7-37)OH lub fragmentu GLP-1(7-37)OH. W nazewnictwie stosowanym w niniejszym opisie do określania związków GLP-1, podstawiający aminokwas i jego pozycja wskazane są przed strukturą macierzystą. I tak, na przykład, Glu²²-GLP-1(7-37)OH oznacza związek GLP-1, w którym glicyna normalnie znajdująca się w pozycji 22 GLP-1(7-37)OH została zastąpiona kwasem glutaminowym; Val⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH oznacza związek GLP-1, w którym alanina normalnie znajdująca się w pozycji 8 i glicyna normalnie znajdująca się w pozycji 22 GLP-1(7-37)OH zostały zastąpione, odpowiednio, waliną i kwasem glutaminowym.

PL 206 302 B1

Na ogół, N-koniec związku GLP-1 jest niepodstawiony, ale może być alkilowany lub acylowany (zwłaszcza grupą C1-C20). C-koniec może być niepodstawiony, tak jak w przypadku GLP-1(7-37)OH, ale może być amidowany przez -NH2, -NHR lub NRR', albo estryfikowany przez -OR''. R i R' oznaczają, niezależnie, grupy alkilowe lub acylowe (zwłaszcza C1-C20). R'' oznacza grupę alkilową (C1-C20). GLP-1(7-36)NH2 stanowi przykładowy „amidowany związek GLP). Zalecane związki GLP-1 mają C-koniec nie podstawiony lub podstawiony przez -NH2.

Związki GLP-1 według niniejszego wynalazku obejmują swym zakresem analogi GLP-1 lub fragmenty analogów GLP-1, których szkielet zawiera w pozycji 8 aminokwas inny niż alanina („analogi w pozycji 8). Szkielet może także zawierać w pozycji 7 L-histydynę, D-histydynę lub zmodyfikowane formy histydyny, takie jak desaminohistydyna, 2-aminohistydyna, β-hydroksyhistydyna, homohistydyna, α-fluorometylohistydyna lub α-metylohistydyna). Dogodnie takie analogi w pozycji 8 mogą zawierać jedną, lub większą ilość zmian w pozycjach 11, 12, 16, 22, 23, 24, 26, 27, 30, 33, 34, 35, 36 i 37, w porównaniu z odpowiednim aminokwasem natywnego GLP-1(7-37)OH. Dogodniej, takie analogi w pozycji 8 mogą zawierać jedną, lub większą ilość dodatkowych zmian w pozycjach 12, 16, 22, 23, 30, 35 i 37 w porównaniu z odpowiednim aminokwasem natywnego GLP-1(7-37)OH. Jeszcze dogodniej takie analogi w pozycji 8 mogą zawierać jedną, lub więcej dodatkowych zmian w pozycjach 22, 23, 27, 30 i 37 w porównaniu z odpowiednim aminokwasem natywnego GLP-1(7-37)OH.

Dogodnie analogi te mogą zawierać 6, lub mniejszą ilość zmian w porównaniu z odpowiednimi aminokwasami w natywnym GLP-1(7-37)OH. Dogodniej analogi mogą zawierać 5, lub mniejszą ilość zmian w porównaniu z odpowiednimi aminokwasami w natywnym GLP-1(7-37)OH, albo 4, lub mniejszą ilość zmian w porównaniu z odpowiednimi aminokwasami w natywnym GLP-1(7-37)OH. Jeszcze dogodniej analogi te mogą zawierać 3, lub mniejszą ilość zmian w porównaniu z odpowiednimi aminokwasami w natywnym GLP-1(7-37)OH, w szczególności analogi te zawierają 2, lub mniejszą ilość zmian w porównaniu z odpowiednimi aminokwasami w natywnym GLP-1(7-37)OH.

Stwierdzono, że podstawienia takie zmniejszają skłonność związków GLP-1 do agregowania i tworzenia postaci nierozpuszczalnych. Na ogół, przy dokonywaniu ich oceny (na przykład w teście agregacji, opisanym w przykładzie 3, poniżej) związki GLP-1 według niniejszego wynalazku agregują co najmniej 5 razy wolniej od GLP-1(7-37)OH, w szczególności co najmniej 20 razy wolnej, zwłaszcza co najmniej 40 razy wolniej, także w szczególności około 50 razy wolniej, zwłaszcza około 60 razy wolniej i także w szczególności co najmniej 65 razy wolniej. Dogodnie związki GLP-1 opisane w niniejszym opisie stanowią analogi GLP-1(7-36)NH2 lub GLP-1(7-37)OH.

W opisanym tu związku GLP-1 aminokwas obecny w pozycji 22 może mieć łańcuch boczny o co najmniej dwóch atomach węgla i polarnych lub naładowanych grupach funkcyjnych. Dotyczy to także kwasu asparaginowego, zawierającego węgiel metylenowy i karboksylowy. Dogodniej, łańcuch boczny aminokwasu znajdującego się w pozycji 22 może mieć grupę alkilową o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, o 2 - 6 atomach węgla i naładowanej grupie funkcyjnej, taką jak, na przykład, ugrupowanie kwasu karboksylowego, aminy, guanidyny lub kwasu sulfonowego. I tak, do przykładowych aminokwasów zajmujących pozycję 22 należą, oprócz kwasu glutaminowego, kwas asparaginowy, arginina i lizyna. W przypadku, gdy pozycję 22 zajmuje kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, arginina lub lizyna, wtedy w pozycji 8 dogodnie znajduje się glicyna, walina, leucyna, izoleucyna, seryna, treonina lub metionina, a zwłaszcza walina lub glicyna. Przykładowym aminokwasem z ugrupowaniem kwasu sulfonowego w łańcuchu bocznym jest kwas cysteinowy [(-NH-CH(CH2SO3)-CO, w skrócie „Cya]. W przypadku, gdy pozycję 22 zajmuje kwas sulfonowy, taki jak kwas cysteinowy, wtedy w pozycji 8 dogodnie znajduje się glicyna, walina, leucyna, izoleucyna, seryna, treonina lub metionina, a zwłaszcza walina lub glicyna.

W opisanym tu związku aminokwasem w pozycji 8 jest glicyna albo walina, lub ewentualnie może nim być leucyna, izoleucyna, seryna, treonina lub metionina, a korzystniej walina lub glicyna, a w pozycji 30 kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, seryna lub histydyna, a zwłaszcza kwas glutaminowy.

W innym opisanym tu związku aminokwasem w pozycji 8 jest glicyna albo walina, lub ewentualnie może nim być leucyna, izoleucyna, seryna, treonina lub metionina, a korzystniej walina lub glicyna, a w pozycji 37 histydyna, lizyna, arginina, treonina, seryna, kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina, a zwłaszcza histydyna.

W innym opisanym tu związku aminokwasem w pozycji 8 jest glicyna labo walina, lub ewentualnie może nim być leucyna, izoleucyna, seryna, treonina lub metionina, a korzystniej walina lub glicyna, a w pozycji 22 kwas glutaminowy, lizyna, kwas asparaginowy lub arginina, a zwłaszcza kwas glutamiPL 206 302 B1 nowy lub lizyna, a w pozycji 23 lizyna, arginina, kwas glutaminowy, kwas asparaginowy i histydyna, a zwł aszcza lizyna lub kwas glutaminowy.

W innym opisanym tu zwią zku aminokwasem w pozycji 8 jest glicyna albo walina, lub ewentualnie może nim być leucyna, izoleucyna, seryna, treonina lub metionina, a zwłaszcza walina lub glicyna, w pozycji 22 kwas glutaminowy, lizyna, kwas asparaginowy lub arginina, a zwłaszcza kwas glutaminowy lub lizyna, a w pozycji 27 alanina, lizyna, arginina, tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina lub histydyna, a zwłaszcza alanina.

Inne opisane tu związki GLP-1 zawierają aminokwas w pozycji 8, i jeden, dwa lub trzy aminokwasy wybrane z grupy obejmującej pozycję 11, pozycję 12, pozycję 16, pozycję 22, pozycję 23, pozycję 24, pozycję 26, pozycję 27, pozycję 30, pozycję 33, pozycję 34, pozycję 35, pozycję 36 i pozycję 37, które różnią się od aminokwasu w odpowiedniej pozycji natywnego GLP-1(7-37)OH.

Inne opisane tu związki GLP-1 zawierają, oprócz aminokwasu w pozycji 8, jeden lub dwa aminokwasy wybrane z grupy obejmującej pozycję 11, pozycję 12, pozycję 16, pozycję 22, pozycję 23, pozycję 24, pozycję 26, pozycję 27, pozycję 30, pozycję 33, pozycję 34, pozycję 35, pozycję 36 i pozycję 37, które różnią się od aminokwasu w odpowiedniej pozycji natywnego GLP-1(7-3 7)OH.

Jak to powyżej opisano, związki GLP-1 tu opisane mogą zawierać, oprócz aminokwasów obecnych w pozycjach 8, 11, 12, 16, 22, 23, 24, 26, 27, 30, 33, 34, 35, 36 i 37, także aminokwasy różniące się od aminokwasów znajdujących się w odpowiednich pozycjach GLP-1(7-37) lub fragmentu GLP-1(7-37). Aminokwasy inne niż aminokwasy znajdujące się w pozycjach 8, 11, 12, 16, 22, 23, 24, 26, 27, 30, 33, 34, 35, 36 i 37 w związku GLP, różniące się od aminokwasu w odpowiednich pozycjach GLP-1(7-37)OH, dogodnie stanowią podstawienia konserwatywne, a zwłaszcza podstawienia wysoce konserwatywne.

Związki GLP-1 tu opisane mogą zawierać 0, 1, 2 lub 3 aminokwasy, oprócz aminokwasów w pozycjach 8 i 22, które róż nią się od aminokwasu w odpowiedniej pozycji GLP-1(7-37)OH lub fragmentu GLP-1(7-37)OH. Zgodnie z jednym z przykładowych tego rodzaju wykonań, jeden, lub większa ilość aminokwasów w pozycjach 7, 21 i 27 związku GLP-1 różni się od odpowiedniego aminokwasu w GLP-1(7-37)OH lub fragmentu GLP-1(7-37)OH, poza aminokwasami w pozycjach 8 i 22.

Dogodnie jedynie pozycje 7, 8 i 22 różnią się od aminokwasu w odpowiedniej pozycji GLP-1(7-37)OH (lub jego fragmentu). Oczekuje się, że inne ulepszone związki GLP-1 o zredukowanych właściwościach dotyczących agregowania można otrzymać ze znanych biologicznie aktywnych związków GLP-1, przez zastąpienie glicyny w pozycji 22 i, dogodnie, alaniny w pozycji 8 tych związków, odpowiednim aminokwasem, jak to opisano w niniejszym opisie. Znane, biologicznie aktywne związki GLP-1 ujawnione są w następujących publikacjach: patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5977071 (Hoffmann i in.); patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5545618 (Buckley i in.); J. Biol. Chem, 269, 6275 (1994).

Termin „podstawienie konserwatywne oznacza zastąpienie aminokwasu innym aminokwasem o takim samym ładunku elektrycznym netto i o takich samych, w przybliżeniu, rozmiarach i kształcie. Aminokwasy z alifatycznymi lub podstawionymi alifatycznymi aminokwasowymi łańcuchami bocznymi mają w przybliżeniu taką samą wielkość wtedy, gdy całkowita liczba atomów węgla i heteroatomów w ich łańcuchach bocznych różni się o nie więcej niż 4. Mają one w przybliż eniu taki sam kształt wtedy, gdy liczba rozgałęzień w ich łańcuchach bocznych różni się o nie więcej niż 1. Sądzi się, że aminokwasy z grupami fenylowymi lub podstawionymi grupami fenylowymi w ich łańcuchach bocznych mają mniej więcej taką samą wielkość i kształt. Poniżej wyszczególniono pięć grup aminokwasów. Rezultatem zastąpienia aminokwasu w związku GLP-1 innym aminokwasem z tej samej grupy jest podstawienie konserwatywne.

Grupa I: glicyna, alanina, walina, leucyna, izoleucyna, seryna, treonina, cysteina, i aminokwasy nie występujące w przyrodzie z C1 - C4-alifatycznymi lub podstawionymi grupą hydroksylową C1 - C4-alifatycznymi łańcuchami bocznymi (prostymi lub jednokrotnie rozgałęzionymi).

Grupa II: kwas glutaminowy, kwas asparaginowy i aminokwasy nie występujące w przyrodzie z podstawionymi ugrupowaniem kwasu karboksylowego C1 - C4-alifatycznymi łańcuchami bocznymi (prostymi lub rozgałęzionymi w jednym miejscu).

Grupa III: lizyna, ornityna, arginina i aminokwasy nie występujące w przyrodzie z podstawionymi grupą aminową lub grupą guanidynową C1 - C4-alifatycznymi łańcuchami bocznymi (prostymi lub rozgałęzionymi w jednym miejscu).

Grupa IV: glutamina, asparagina i aminokwasy nie występujące w przyrodzie z podstawionymi grupą amidową C1 - C4-alifatycznymi łańcuchami bocznymi (prostymi lub rozgałęzionymi w jednym miejscu).

PL 206 302 B1

Grupa V: fenyloalanina, fenyloglicyna, tyrozyna i tryptofan.

Jeżeli tego inaczej nie wyszczególniono w niniejszym opisie, podstawień konserwatywnych korzystnie dokonuje się z udziałem aminokwasów naturalnych.

Termin „podstawienie wysoce konserwatywne oznacza zastąpienie aminokwasu innym aminokwasem z taką samą grupą funkcyjną w łańcuchu bocznym i o prawie tej samej wielkości i kształcie. Aminokwasy z alifatycznymi lub podstawionymi alifatycznymi aminokwasowymi łańcuchami bocznymi mają prawie taką samą wielkość wtedy, gdy całkowita liczba atomów węgla i heteroatomów w ich łańcuchach bocznych różni się o nie więcej niż dwa. Mają one prawie taki sam kształt wtedy, gdy mają one taką samą ilość rozgałęzień w swych łańcuchach bocznych. Do przykładowych wysoce konserwatywnych podstawień należą: walina zamiast leucyny, treonina zamiast seryny, kwas asparaginowy zamiast kwasu glutaminowego i fenyloglicyna zamiast fenyloalaniny. Do przykładowych podstawień, które nie są wysoce konserwatywne należą: alanina zamiast waliny, alanina zamiast seryny i kwas asparaginowy zamiast seryny.

Przykładowym związkiem GLP-1 tu opisanym jest polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:1. Zalecanym przykładowym związkiem GLP-1 jest GLP-1(7-37)OH, w którym Xaa8 oznacza Gly lub Val, Xaa22 oznacza Glu lub Lys i Xaa23 oznacza Glu lub Lys. Innym przykładowym związkiem GLP-1 jest GLP-1(7-37)OH, z tym, że Xaa8 oznacza Gly lub Val i Xaa30 oznacza Glu. Dodatkowo, przykładowym związkiem GLP-1 jest GLP-1(7-37)OH, w którym Xaa8 oznacza Gly lub Val i Xaa37 oznacza His.

Innym przykładowym związkiem GLP-1 tu opisanym jest polipeptyd o sekwencji aminokwasowej

SEQ ID NO:4. W zalecanym przykładowym związku o SEQ ID NO:4 Xaa7 oznacza L-histydynę,

D-histydynę, deazminohistydynę, 2-aminohistydynę, β-hydroksyhistydynę, homohistydynę, α-fluorometylohistydynę i α-metylohistydynę, Xaa₈ oznacza glicynę, alaninę, walinę, leucynę, izoleucynę, serynę lub treoninę, a zwłaszcza glicynę, walinę, leucynę, izoleucynę, serynę lub treoninę, R oznacza -NH2 lub Gly (OH), oraz Xaa22 oznacza lizynę, kwas glutaminowy, kwas asparaginowy lub argininę. W bardziej zalecanym przykładowym związku, Xaa7 oznacza L-histydynę, Xaa8 oznacza glicynę lub walinę, Xaa22 oznacza lizynę, kwas glutaminowy, kwas asparaginowy lub argininę i R oznacza Gly (OH). Alternatywnie, w SEQ ID NO:4 Xaa7, Xaa8 i R mają wyżej podane znaczenie, a Xaa22 oznacza aminokwas z łańcuchem bocznym zawierającym ugrupowanie kwasu sulfonowego, na przykład kwasu cysteinowego.

W innych przykładowych związkach GLP-1 tu opisanych aminokwas znajdujący się w pozycji 8 jest inny niż D-aminokwas i nie ma łańcucha bocznego glicyny, seryny, treoniny, cysteiny lub betaalaniny wtedy, gdy aminokwas obecny w pozycji 22 ma C1 - C2-alkilowy łańcuch boczny, hydroksylowany C1 - C2-alkilowy łańcuch boczny lub tiolowany C1 - C2-alkilowy łańcuch boczny (jak, na przykład, cysteina). W zalecanych przykładowych związkach GLP-1 tu opisanych aminokwas w pozycji 8 jest inny niż D-aminokwas i nie ma łańcucha bocznego glicyny, seryny, treoniny, cysteiny lub betaalaniny, wtedy gdy aminokwas w pozycji 22 ma C1 - C4-alkilowy łańcuch boczny, hydroksylowany C1 - C4-alkilowy łańcuch boczny lub tiolowany C1 - C4-alkilowy łańcuch boczny.

W innych przykładowych związkach GLP-1 tu opisanych aminokwasem w pozycji 8 jest glicyna, walina, lub ewentualnie leucyna, izoleucyna, metionina, seryna, treonina, cysteina, kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, lizyna, arginina, asparagina, glutamina, fenyloalanina, tyrozyna, histydyna lub tryptofan, a aminokwasem w pozycji 22 jest kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, lizyna, arginina, asparagina, glutamina lub histydyna.

Do konkretnych przykładowych związków GLP-1 tu opisanych należą:

Glu²²-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:20),

Asp²²-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:21),

Arg²²-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:22),

Lys²²-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:23),

Cya²²-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:24),

Val⁸-Asp²²-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:6),

Val⁸-Arg²²-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:7),

Val⁸-Lys²²-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:8),

Val⁸-Cya²²-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:25),

Gly⁸-Asp²²-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:10),

Gly⁸-Arg²²-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:11),

Gly⁸-Lys²²-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:12),

PL 206 302 B1

Gly⁸-Cya²²-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:26),

Glu²²-GLP-1(7-36 )NH2 (SEQ ID NO:27),

Asp²²-GLP-1(7-36)NH2 (SEQ ID NO:28),

Arg²²-GLP-1(7-36)NH2 (SEQ ID NO:29),

Lys²²-GLP-1(7-36)NH2 (SEQ ID NO:30),

Cya²²-GLP-1(7-36)NH2 (SEQ ID NO:31),

Val⁸-Asp²²-GLP-1(7-36)NH2 (SEQ ID NO:33),

Val⁸-Arg²²-GLP-1(7-36)NH2 (SEQ ID NO:34),

Val⁸-Lys²²-GLP-1(7-36)NH2 (SEQ ID NO:35),

Val⁸-Cya²²-GLP-1(7-36)NH2 (SEQ ID NO:36),

Gly⁸-Asp²²-GLP-1(7-36)NH2 (SEQ ID NO:38),

Gly⁸-Arg²²-GLP-1(7-36) NH2 (SEQ ID NO:39),

Gly⁸-Lys²²-GLP-1(7-36) NH2 (SEQ ID NO:40), oraz Gly⁸-Cya²²-GLP-1(7-36)NH2 (SEQ ID NO:41),

Val⁸-Lys²³-GLP-1(7-3(7)OH (SEQ ID NO:42),

Val⁸-Ala²⁷-GLP-1(7-3(7)OH (SEQ ID NO:43),

Val⁸-Glu³⁰-GLP-1(7-3(7)OH (SEQ ID NO:44),

Gly⁸-Glu³⁰-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:45),

Val⁸-His³⁵-GLP-1(7-3(7)OH (SEQ ID NO:46),

Val⁸-His³⁷)-GLP-1(7-3(7)OH (SEQ ID NO:47),

Val⁸-Gly³⁴-Lys³⁵-GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:51),

Val⁸-His³⁷)-GLP-1(7-3(7)OH (SEQ ID NO:52),

Gly⁸-His³⁷)-GLP-1(7-3(7)OH (SEQ ID NO:53).

Stosowany w niniejszym opisie termin „związek GLP-1 obejmuje swym zakresem także farmaceutycznie dopuszczalne sole związków opisywanych w niniejszym opisie. Związek GLP-1 tu opisywany może zawierać grupę funkcyjną wystarczająco silnie kwasową, grupę funkcyjną wystarczająco silnie zasadową oraz obie te grupy funkcyjne, w wyniku czego może odpowiednio do tego reagować z szeregiem zasad nieorganicznych, a także kwasów nieorganicznych i organicznych, z utworzeniem soli. Kwasami zwykle stosowanymi do tworzenia kwaśnych soli addycyjnych są kwasy nieorganiczne, takie jak kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas jodowodorowy, kwas siarkowy, kwas fosforowy itp., a także kwasy organiczne, takie jak kwas p-toluenosulfonowy, kwas metanosulfonowy, kwas szczawiowy, kwas p-bromofenylosulfonowy, kwas węglowy, kwas bursztynowy, kwas cytrynowy, kwas benzoesowy, kwas octowy itp. Do przykładowych soli tego rodzaju należy siarczan, pirosiarczan, wodorosiarczan, siarczyn, wodorosiarczyn, fosforan, monowodorofosforan, diwodorofosforan, metafosforan, pirofosforan, chlorek, bromek, jodek, octan, propionian, dekanian, oktanian, akrylan, mrówczan, izomaślan, heksanian, heptanian, propiolan, szczawian, malonian, bursztynian, suberynian, sebacynian, fumaran, maleinian, butyno-1,4-dian, heksyno-1,6-dian, benzoesan, chlorobenzoesan, metylobenzoesan, dinitrobenzoesan, hydroksybenzoesan, metoksybenzoesan, ftalan, sulfonian, ksylenosulfonian, fenylooctan, fenylopropionian, fenylomaślan, cytrynian, mleczan, gamma-hydroksymaślan, glikolan, winian, metanosulfonian, propanosulfonian, naftaleno-1-sulfonian, naftaleno-2-sulfonian, migdalan itp.

Do zasadowych soli addycyjnych należą sole wywodzące się z zasad nieorganicznych, takich jak wodorotlenki, węglany i wodorowęglany amonu, metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych itp. Tak więc, do zasad użytecznych pod względem tworzenia soli tu opisanych należy wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek amonu, węglan potasu itp.

Związki GLP-1 mogą być stosowane do leczenia podmiotów cierpiących na bardzo wiele chorób i stanów chorobowych. Uważa się, że związki GLP-1, włącznie ze związkami według wynalazku, wywierają swe działanie biologiczne poprzez działanie na receptor określany jako „receptor GLP-1 [patrz: patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5670360 (Thorrens)]. Toteż, podmioty cierpiące na choroby i/lub stany chorobowe z korzystną reakcją na stymulację receptora GLP-1 lub na podawanie związków GLP-1 mogą być leczeni związkami GLP-1 według niniejszego wynalazku. Podmioty takie określane są jako „potrzebujący leczenia związkami GLP-1 lub „potrzebujący stymulacji receptora GLP-1. Określenia te obejmują także podmioty chore na cukrzycę insulinonie zależną, cukrzycę insulinozależną, udar [patrz: dokument patentowy WO 00/16797 (Efendic)], zawał mięśnia sercowego [patrz: dokument patentowy WO 98/08531 (Efendic)], otyłość [patrz: dokument patentowy WO 98/19698 (Efendic)], zmiany kataboliczne po zabiegu chirurgicznym [patrz: patent Stanów Zjed10

PL 206 302 B1 noczonych Ameryki nr 6006753 (Efendic)], dyspepsję funkcjonalną i zespół jelita drażliwego [patrz: dokument patentowy WO 99/64060 (Efendic)]. Objęte tym określeniem są także podmioty wymagające zapobiegawczego leczenia przy użyciu związku GLP-1, na przykład podmioty z ryzykiem rozwinięcia się cukrzycy insulinonie zależnej (patrz: dokument patentowy WO 00/07617). Podmioty z upośledzoną tolerancją na glukozę lub z nieprawidłową glikemią na czczo, podmioty o masie ciała o 25% większej od normalnej masy ciała w odniesieniu do wysokości i budowy ciała danego podmiotu, dalej podmioty po częściowym wycięciu trzustki, mający jedno lub oboje rodziców z cukrzycą insulinoniezależną, kobiety, które przeszły cukrzycę ciążową i podmioty, które miały ostre lub przewlekłe zapalenie trzustki, wszyscy oni objęci są ryzykiem rozwinięcia się u nich cukrzycy insulinoniezależnej.

Stosowany w niniejszym opisie termin „skuteczna ilość związku GLP-1 jest to ta jego ilość, która po podaniu podmiotowi potrzebującego stymulacji receptora GLP-1 skutkuje pożądanym efektem terapeutycznym i/lub profilaktycznym bez powodowania niepożądanych działań ubocznych. Termin „pożądany efekt terapeutyczny obejmuje swym zakresem jedno, lub większą ilość zdarzeń następujących: 1) złagodzenie objawu(objawów) związanych z daną chorobą lub stanem chorobowym; 2) opóźnienie wystąpienia objawów związanych z daną chorobą lub stanem chorobowym; 3) zwiększenie długości życia w porównaniu z długością życia przy braku leczenia; oraz 4) lepsza jakość życia w porównaniu z jakością życia przy braku leczenia. I tak, na przykład, „skuteczną ilością związku GLP-1 w leczeniu cukrzycy jest ta jego ilość, która zapewni lepszą regulację stężenia glukozy we krwi, niż ma to miejsce przy braku leczenia, co z kolei skutkuje opóźnieniem wystąpienia powikłań na tle cukrzycy, takich jak retinopatia, neuropatia lub choroba nerek. „Skuteczna ilość związku GLP-1 w profilaktyce cukrzycy, jest to ta jego ilość, która zapewni opóźnienie, w porównaniu z brakiem leczenia, wystąpienia podwyższonego poziomu glukozy we krwi wymagającego leczenia przy użyciu leków antyhipoglikemicznych, takich jak sulfonylomoczniki, tiazolidynodiony, insulina i/lub biguanidyny.

Podawana podmiotowi „ilość skuteczna związku GLP-1 zależeć będzie także od rodzaju i ciężkości choroby i od charakterystycznych cech podmiotowych, takich jak ogólny stan zdrowia, wiek, płeć, masa ciała i tolerancja na leki. Specjalista w tej dziedzinie może ustalić właściwe dawkowania w zależności od tych i innych czynników. Typowo, terapeutycznie skuteczna ilość związku GLP-1 podawanego osobie dorosłej może mieścić się w zakresie od około 0,01 mg/dzień do około 1000 mg/dzień. Zalecane dawkowanie mieści się w zakresie od około 0,1 mg/dzień do około 100 mg/dzień, zwłaszcza w zakresie od około 1,0 mg/dzień do około 10 mg/dzień.

Związki GLP-1 według niniejszego wynalazku można, na przykład podawać doustnie, donosowo, w postaci inhalacji lub pozajelitowo. Podawanie pozajelitowe może obejmować, na przykład, podawanie układowe, takie jak wstrzyknięcia domięśniowe, dożylne, podskórne lub dootrzewnowe. Związki GLP-1 można podawać podmiotowi łącznie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub zaróbką, jako część kompozycji farmaceutycznej do leczenia powyżej omówionych chorób. Kompozycja farmaceutyczna może stanowić roztwór albo, w przypadku podawania drogą pozajelitową, zawiesinę związku GLP-1 lub zawiesinę związku GLP-1 skompleksowanego z dwuwartościowym kationem metalu, jak to poniżej opisano. Stosowne nośniki farmaceutyczne mogą zawierać składniki obojętne, nieoddziaływujące z peptydem lub pochodną peptydu. Posługiwać się tu można typowymi farmaceutycznymi metodami formułowania leków, takimi jak metody opisane w Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Do odpowiednich nośników farmaceutycznych należą, na przykład, woda jałowa, fizjologiczny roztwór chlorku sodu, bakteriostatyczny roztwór chlorku sodu (zawierający około 0,9% mg/ml alkoholu benzylowego), roztwór chlorku sodu buforowany fosforanem, roztwór Hanka, mleczan Ringera itp. Do niektórych przykładowych odpowiednich zaróbek należy laktoza, glukoza, sacharoza, trehaloza, sorbitol i mannitol.

Stosowane w niniejszym opisie określenie „podmiot odnosi się do ssaka, zwłaszcza człowieka, a także zwierząt domowych (na przykład takich jak psy, koty itp.), zwierząt gospodarskich (takich jak krowy, owce, świnie, konie itp.) oraz zwierząt laboratoryjnych (takich jak szczury, myszy, świnki morskie itp.).

Korzystnie związki GLP-1 według niniejszego wynalazku można skompleksować z odpowiednim dwuwartościowym kationem metalu. Kompleksy utworzone przez związki GLP-1 z dwuwartościowymi kationami metali są, na ogół, nierozpuszczalne w roztworach wodnych o fizjologicznej, w przybliżeniu, wartości pH. Toteż, kompleksy te można podawać drogą podskórną w postaci zawiesin i wykazują one zmniejszoną szybkość uwalniania in vivo, wydłużając tym samym czas działania związku. Do przykładowych odpowiednich dwuwartościowych kationów metali należą: Zn⁺⁺, Mn⁺⁺, Fe⁺⁺, Ca⁺⁺, Co⁺⁺, Cd⁺⁺, Ni⁺⁺ itp. Korzystne są kationy Zn⁺⁺.

PL 206 302 B1

W celu otrzymania kompleksów związków GLP-1 według niniejszego wynalazku z dwuwartościowymi kationami metali, GLP-1 rozpuszcza się w stosownym buforze, w obecności soli metalu. Mieszaninę pozostawia się w temperaturze otoczenia dla umożliwienia zajścia reakcji i wytrącenia się powstałego kompleksu. Odpowiednimi buforami są te bufory, które utrzymują wartość pH mieszaniny mieszczącą się w zakresie od około 3,0 do około 9,0, i które nie zakłócają reakcję kompleksowania. Do przykładowych buforów należą bufory fosforanowe, bufory octanowe, bufory cytrynianowe i bufory Goode'a, a więc bufory takie jak, na przykład, HEPES, Tris i octan Tris. Odpowiednimi solami metali są te sole, w przypadku których metal jest dostępny dla reakcji kompleksowania. Do przykładowych stosownych soli cynku należy chlorek cynku, octan cynku, tlenek cynku i siarczan cynku. Dogodnie, sól metalu dającą kationy dwuwartościowe, taką jak chlorek cynku, wprowadza się w nadmiarze z otrzymaniem stosunku molowego wynoszącego do około 50 cząsteczek dwuwartościowego kationu metalu na każdą cząsteczkę związku GLP-1.

Termin „aktywność insulinotropowa odnosi się do stymulowania wydzielania insuliny w odpowiedzi na podwyższony poziom glukozy, powodującego przez to pobieranie glukozy przez komórki i obniżenie poziomu glukozy w surowicy. Aktywność insulinotropową można ocenić sposobami znanymi w tej dziedzinie wiedzy, włącznie z wykonaniem eksperymentów in vivo i in vitro, pozwalających na zmierzenie aktywności wiązania receptora GLP-1 albo aktywacji receptora, na przykład testów wykorzystujących komórki wysepek trzustkowych lub komórki insulinomy, jak to opisano, odpowiednio, w dokumencie patentowym EP 619322 (Gelfand i in.) oraz w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5120712.

Związki GLP-1 według niniejszego wynalazku można wytwarzać z zastosowaniem typowych metod syntezy peptydu na fazie stałej. Syntezatory peptydów są dostępne w handlu, na przykład z firmy Applied Biosystems w Foster City CA. Odczynniki do syntezy peptydów na fazie stałej są dostępne w handlu, na przykład z firmy Midwest Biotach (Fishers, IN). Syntezatorów peptydów na fazie stałej można używać, zgodnie z instrukcjami wytwórcy, do blokowania grup zakłócających, zabezpieczania aminokwasów przewidzianych do reagowania, sprzęgania, odłączania i „cappingu aminokwasów nieprzereagowanych.

Typowo, sprzęga się aminokwas zabezpieczony grupą α-N-karbamoilową i N-końcowy aminokwas na powstającym łańcuchu peptydu, na żywicy, w temperaturze pokojowej, w środowisku obojętnego rozpuszczalnika, takiego jak dimetyloformamid, Nmetylopirolidon lub chlorek metylenu, w obecności odczynników sprzęgających, takich jak dicykloheksylokarbodiimid i 1-hydroksybenzotriazol, oraz zasady, takiej jak diizopropyloetyloamina. Z powstałej tak peptydożywicy usuwa się α-N-karbamoilową grupę zabezpieczającą, stosując odczynnik taki jak kwas trifluorooctowy lub piperydyna i reakcję sprzęgania powtarza się z dodaniem do łańcucha peptydu następnego pożądanego, N-zabezpieczonego aminokwasu. Stosowne grupy zabezpieczające grupę aminową są dobrze znane w tej dziedzinie techniki i są opisane, na przykład, w: Green i Wuts, „Protecting Groups in Organie Synthesis, John Wiley and Sons (1991). Zawarte tam wskazówki są w całości włączone do niniejszego opisu jako odnośnik. Przykładowymi grupami są tu: grupa tert-butyloksykarbonylowa (tBoc) i grupa fluorenylometoksykarbonylowa (Fmoc).

Peptydy syntetyzuje się także z wykorzystaniem protokołów typowej zautomatyzowanej syntezy na fazie stałej przy użyciu tert-butoksykarbonylo- lub fluorenylometoksykarbonylo-a-aminokwasów z odpowiednim zabezpieczeniem łańcucha bocznego. Po doprowadzeniu syntezy do końca, peptydy odszczepia się od nośnika fazy stałej z jednoczesnym odblokowaniem łańcucha bocznego, stosując typowe metody postępowania z udziałem fluorowodoru. Otrzymane surowe peptydy poddaje się dalszemu oczyszczaniu metodą chromatografii z odwróconą fazą na kolumnach Vydac C18 przy użyciu gradientów acetonitrylu w 0,1% kwasie trifluorooctowym (TFA). W celu usunięcia acetonitrylu, peptydy poddaje się liofilizacji z roztworu zawierającego 0,1% TFA, acetonitryl i wodę. Czystość sprawdza się analityczną metodą chromatografii z odwróconą fazą. Tożsamość peptydów można sprawdzić metodą spektrometrii mas. Peptydy można rozpuszczać w buforach wodnych przy obojętnym pH.

Wynalazek objaśniają następujące przykłady, których nie należy interpretować jako ograniczających zakres wynalazku w jakikolwiek sposób.

PL 206 302 B1

P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie związków GLP-1 według niniejszego wynalazku z zastosowaniem chemii t-Boc na fazie stałej

Około 0,5 - 0,6 g (0,38 - 0,45 mmola) żywicy Boc-Gly-PAM umieszczono w typowym 60 ml reaktorze i rozpoczęto podwójne sprzęganie w syntezatorze peptydów Applied Biosystems ABI430A. Do syntezy użyto następujących aminokwasów z zabezpieczonymi łańcuchami bocznymi (2 mmolowe ładunki Boc-aminokwasów) otrzymanych z firmy Midwest Biotach (Fishers, IN):

Arg-tosyl (TOS), ester Asp^-cykloheksylowy (CHXL), ester Glu^-cykloheksylowy (CHXL), Hisbenzyloksymetyl (BOM), Lys-2-chlorobenzyloksykarbonyl (2Cl-2), Met-sulfotlenek(O), eter Ser-O-benzylowy (OBz1), eter Thr-O-benzylowy(OBz1), Trp-formyl (CHO) i Tyr-2-bromobenzyloksykarbonyl(2Br-Z) oraz żywica Boc-Gly-PAM. Kwas trifluorooctowy(TFA), diizopropyloetyloaminę (DIEA), 0,5 M hydroksybenzotriazol (HOBt) w DMF i 0,5 M dicykloheksylokarbodiimid (DCC) w dichlorometanie dostarczyła firma PE-Applied Biosystems (Foster City, CA). Dimetyloformamid (DMF-Burdick and Jackson) i dichlorometan (DCM-Mallinkrodt) dostarczyła firma Mays Chemical Co.(Indianapolis, IN).

Typowe podwójne sprzęgania prowadzono z zastosowaniem albo bezwodnika symetrycznego lub estrów HOBt, oba utworzone przy użyciu DCC. Drugą serię podwójnych sprzęgań (bez odblokowania przy użyciu TFA) przeprowadzono z udziałem Trp31, Thr13 i Thr11. Po zajściu syntezy do końca, usunięto N-końcową grupę Boc i peptydylożywicę potraktowano 20% roztworem piperydyny w DMF w celu odformylowania bocznego łańcucha Trp. Po przemyciu przy użyciu DCM, żywice przeniesiono do teflonowego reaktora i wysuszono pod próżnią.

W przypadku analogów zawierających Met, przeprowadzono redukcje na żywicy przy użyciu układu TFA/10% dimetylosulfotlenek (DMS)/2% stężony HCl. Odszczepienia dokonano przez podłączenie reaktora do aparatu HF (z kwasem fluorowodorowym) (Penninsula Laboratories). Dodano 1 ml m-krezolu/gram żywicy i 10 ml HF(dostarczonego przez firmę AGA, Indianapolis, IN) skondensowano do uprzednio schłodzonego reaktora. W przypadku obecności metioniny dodano 1 ml DMS/g żywicy. Utworzone tak mieszaniny reakcyjne mieszano przez 1 godzinę w łaźni lodowej, po czym HF usunięto pod próżnią. Pozostałości rozpuszczono w eterze etylowym i substancje stałe odsączono i przemyto eterem. Każdy peptyd wyekstrahowano do uwodnionego kwasu octowego i albo zliofilizowano, albo załadowano bezpośrednio na kolumnę do chromatografii z odwróconą fazą.

Oczyszczanie przeprowadzano na kolumnie 2,2 x 25 cm VYDAC C18 w buforze A (0,1 % kwas trifluorooctowy w wodzie, B: 0,1 TFA w acetonitrylu). Do HPLC stosowano gradient 20% do 90% B (Waters), przez 120 minut, przy 10 ml/min, z monitorowaniem UV przy 280 nm (4,0 A) i odbieraniem frakcji jednominutowych. Właściwe frakcje połączono ze sobą, zamrożono i zliofilizowano. Suche produkty poddano analizie metodą HPLC (0,46 x 15 cm, METASIL AQ C18) i spektrometrii mas MALDI.

P r z y k ł a d 2. Wytwarzanie związków GLP-1 według niniejszego wynalazku z zastosowaniem chemii F-Moc na fazie stałej

Około 114 mg (50 mmoli) żywicy FMOC-Gly-Wang (dostarczonej z firmy NovaBiochem, LaJolla, CA) umieszczono w zaprogramowanych dołkach 96-studzienkowego bloku reakcyjnego i przeprowadzono podwójne sprzęgania w syntezatorze peptydów Advanced ChemTech 396. Analogi z C-końcowym amidem otrzymano przy użyciu (75 mg (50 μmoli) żywicy Rink Amide AM (NovaBiochem; LaJolla, CA).

Następujące Fmoc-aminokwasy dostarczyły firmy Advanced ChemTech (Louisville, KY), NovaBiochem (La Jolla, CA) i Midwest Biotach (Fishers, IN):

Arg-2,2,4,6,7-pentametylodihydrobenzofurano-5-sulfonyl (Pbf), Asn-trityl (Trt), ester Asp-e-tertbutylowy (tBu), ester Glu-e-tert-butylowy (tBu), Gln-trityl (Trt), His-trityl (Trt), Lys-tert-butyloksykarbonyl (Boc), eter Ser-tert-butylowy (OtBu), eter Thr-tert-butylowy(OtBu), Trp-tert-butyloksykarbonyl(Boc), eter Tyr-tert-butylowy (OtBu).

Rozpuszczalniki: dimetyloformamid (DMF - Burdick and Jackson), N-metylopirolidon (NMP - Burdick and Jackson) i dichlorometan (DCM - Mallinkrodt) dostarczyła firma Mays Chemical Co. (Indianapolis).

Hydroksybenzotriazol (HOBt), diizopropylokarbodiimid (DIC), diizopropyloetyloaminę (DIEA) i piperydynę (Pip) dostarczyła firma Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI).

Wszystkie aminokwasy rozpuszczano w 0,45 M HOBt w NMP i po 20-minutowym odblokowywaniu przy użyciu 20% Pip/DMF przeprowadzano 50 minutowe sprzęgania z aktywacją (DIC/HOBt). Każdą żywicę po odblokowaniu i po sprzęganiu przemywano DMF.

Po ostatnim sprzęganiu i odblokowaniu, peptydylożywice przemywano DCM i wysuszono pod próżnią w bloku reakcyjnym.

PL 206 302 B1

W stosownym zestawie blokowym do przeprowadzania reakcji/rozszczepiania, do każdego dołka wprowadzono 2 ml odczynnika K i poddawaną rozszczepianiu mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny [odczynnik K = 0,75 g fenolu, 0,5 ml tioanizolu, 0,25 ml etanoditiolu, 0,5 ml wody na 10 ml kwasu trifluorooctowego (TFA); wszystkie składniki dostarczyła firma Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI]. Przesącza TFA wprowadzono do 40 ml eteru etylowego i wytrącone osady wirowano przez 2 minuty przy 2000 obr/min. Następnie, supernatanty zdekantowano, osady zawieszono w 40 ml eteru, powtórnie wirowano i po dekantacji wysuszono w atmosferze azotu, a następnie pod próżnią.

W 1 ml porcjach układu 0,1% TFA/acetonitryl (ACN) rozpuszczono 0,3 - 0,6 mg porcje każdego z otrzymanych jak wyżej produktów i 20 μl próbki poddano analizie metodą HPLC [0,46 x 15 cm METASIL AQ C18, 1 ml/min, 45°C, 214 nM (0,2 A), A = 0,1% TFA, B = 0,1% TFA/50% ACN. Gradient = 50% B do 90% B przez 30 minut].

Operacje oczyszczania prowadzono na 2,2 x 25 cm kolumnie VYDAC C18 w buforze A (0,1% kwasu trifluorooctowego w wodzie, B : 0,1% TFA w acetonitrylu). Po HPLC stosowano gradient 20% do 90% B (Waters) przez 120 minut przy 10 ml/min, z monitorowaniem UV przy 280 nm (4,0 A) i odbieraniem frakcji jednominutowych. Stosowne frakcje połączono ze sobą, zamrożono i zliofilizowano. Suche produkty poddano analizie metodą HPLC (0,46 x 15 cm, METASIL AQ C18) i spektrometrii mas MALDI.

P r z y k ł a d 3. Test agregacji GLP

Peptydy GLP według niniejszego wynalazku poddano analizie pod względem ich zdolności do agregowania w roztworze. Mówiąc ogólnie, peptydy w roztworze mieszano w temperaturze podwyższonej, w odpowiednim buforze, z rejestrowaniem zmętnienia przy 350 nm w funkcji czasu. Zmierzono czas rozpoczęcia agregacji w celu skwantyfikowania zdolności danej cząsteczki GLP do agregowania w tych wymuszonych warunkach.

Protokół:

Najpierw, Związek GLP-1 rozpuszczano w warunkach alkalicznych (pH 10,5) przez 30 minut w celu przeprowadzenia do roztworu jakiegokolwiek zagregowanego materiału. Następnie, pH otrzymanego tak roztworu doprowadzono do wartości 7,4 i przesączono. Mówiąc dokładniej, 4 mg zliofilizowanego związku GLP-1 rozpuszczono w 3 ml układu 10 mM fosforan/10 mM cytrynian, po czym pH doprowadzono do wartości mieszczącej się w zakresie od 10,0 do 10,5 i utrzymywano na tym poziomie przez 30 minut. Następnie, roztwór doprowadzono przy użyciu HCl do pH (7,4 i przesączono przez stosowny filtr, taki jak, na przykład, Millex GV syringe filter (Millipore Corporation, Bedford, MA). Następnie, roztwór rozcieńczono z otrzymaniem końcowej próbki zawierającej 0,3 mg/ml białka w układzie 10 mM cytrynian, 10 mM fosforan, 150 mM NaCl i roztwór doprowadzono do pH 7,4 -7,5. Próbkę inkubowano w temperaturze 37°C w kwarcowej kuwecie. Co 5 minut mierzono zmętnienie roztworu przy 350 nm przy użyciu spektrofotometru AVIV Model 14DS. UV-VIS (Lakewood, NJ). Na 30 sekund przed pomiarem i podczas jego trwania roztwór mieszano przy użyciu mieszadła magnetycznego z firmy Starna Cells, Inc. (Atascadero, CA). Wzrost wartości OD przy 350 nm wskazuje na agregowanie peptydu GLP-1. Czas do agregacji jest w przybliżeniu określany przez punkt przecięcia linii z dopasowań liniowych do fazy przedwzrostowej i fazy wzrostu, zgodnie z metodą Drake'a [T. Arvinte, A. Cudd i A.F. Drake, J. Bio. Chem., 268, 6415 -6422 (1993)].

Między dwoma eksperymentami kuwetę czyszczono przy użyciu roztworu mydła kaustycznego(na przykład, Contrad-70).

Wyniki otrzymane dla szeregu związków GLP-1 według niniejszego wynalazku przedstawiono w poniższej tabeli 1 jako czas (h) potrzebny do zagregowania danego związku. Jak widać z danych zamieszczonych w tej tabeli, związki według niniejszego wynalazku wykazują czas agregacji znacznie dłuższy od czasu wykazywanego przez związki GLP-1 znane z dotychczasowego stanu techniki.

P r z y k ł a d 4. Aktywacja receptora GLP-1 z udziałem związków GLP-1 według niniejszego wynalazku

Zdolność związków GLP-1 według niniejszego wynalazku do aktywowania receptora GLP-1 oceniano w testach in vitro, takich, jak testy opisane, odpowiednio, w dokumencie patentowym EP 619322 (Gelfand i in.) oraz w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5120712. Aktywność wspomnianych związków w stosunku do aktywności GLP-1(7-37)OH przedstawiono w poniższej tabeli 1. Jak widać z danych zamieszczonych w tej tabeli, aktywność związków GLP-1 według niniejszego wynalazku jest, na ogół, równie dobra jak aktywność GLP-1(7-37)OH, albo nawet jeszcze lepsza.

PL 206 302 B1

T a b e l a 1

Związek GLP-1	Czas agregacji (h)	Aktywacja receptora GLP-1
GLP-1(7-37)OH	1	1.0
Val⁸-GLP-1(7-37)OH	0.9 ± 0.2 (n=6)	0.47
Gly⁸-His^11-GLP-1(7-37)OH	9*	0.282
Val⁸-Ala¹¹-GLP-1(7-37)OH	10	0.021
Val⁸-Lys¹³-GLP-1(7-37)OH	13	0.001
Val⁸-Tyr¹²-GLP-1(7-37)OH	6	0.81
Val⁸-Glu¹⁶-GLP-1(7-37)OH	12	0.047
Val⁸-Ala¹⁶-GLP-1(7-37)OH	16	0.112
Val⁸-Tyr¹²-GLP-1(7-37)OH	5	1.175
Val⁸-Lys²⁰-GLP-1(7-37)OH	5	0.33
Gln²²-GLP-1(7-37)OH	7	0.42
Val⁸-Ala²²-GLP-1(7-37)OH	19	0.56
Val⁸-Ser²²-GLP-1(7-37)OH	22	0.50
Val⁸-Asp²²-GLP-1(7-37)OH	>90	0.40
Val⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH	72	1.29
Val⁸-Lys²²-GLP-1(7-37)OH	100, 54	0.58
Val⁸-Pro²²-GLP-1(7-37)OH	>75	0.01
Val⁸-His²²-GLP-1(7-37)OH	>75	0.14
Val⁸-Lys²²-GLP-1(7-36)NH2	24	0.53
Val⁸-Glu²²-GLP-1(7-36)NH2	>65	1.0
Gly⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH	19	1.07
Val⁸-Glu²³-GLP-1(7-36)OH	65	0.2B
Val⁸-Lys²³-GLP-1(7-37)OH	>45	0.18
Val⁸-His²⁴-GLP-1(7-37)OH	3	0.007
Val⁸-Lys²⁴-GLP-1(7-37)OH	22	0.02
Ala⁸-His²⁶-GLP-1(7-37)OH	>24	0.8
Ala⁸-Glu²⁶-GLP-1(7-37)OH	>24	0.7
Val⁸-His²⁷-GLP-1(7-37)OH	10	0.37)
Val⁸-Ala²⁷-GLP-1(7-37)OH	2	0.47
Gly⁹-Glu³⁰-GLP-1(7-37)OH	>40	0.29
Val⁸-Glu³⁰-GLP-1(7-37)OH	30	0.29
Val⁸-Asp³⁰-GLP-1(7-37)OH	>45	0.15
Val⁸-Ser³⁰-GLP-1(7-37)OH	8	0.19
Val⁸-His³⁰-GLP-1(7-37)OH	13	0.19
Val⁸-Glu³³-GLP-1(7-37)OH	>70	0.039
Val⁸-Ala³³-GLP-1(7-37)OH	20	0.1
Val⁸-Gly³³-GLP-1(7-37)OH	9	0.01
Val⁸-Glu³⁴-GLP-1(7-37)OH	>40*	0.17
Val⁸-Pro³⁵-GLP-1(7-37)OH	14	0.094
Val⁸-His³⁵-GLP-1(7-37)OH	>45, 30	0.41
Val⁸-Glu³⁵-GLP-1(7-37)OH	63	0.15
Val⁸-Glu³⁶-GLP-1(7-37)OH	>45	0.11
Val⁸-His³⁶-GLP-1(7-37)OH	8	0.22
Val⁸-His³⁷-GLP-1(7-37)OH	>40	0.33
Val⁸-Leu¹⁶-Glu²⁶-GLP-1(7-37)OH	>20	0.23
Val⁸-Lys²²-Glu³⁰-GLP-1(7-37)OH	4	0.37)
Val⁸-Lys²²-Glu²³-GLP-1(7-37)OH	>30	0.35
Val⁸-Glu²²-Gln²³-GLP-1(7-37)OH	>20	0.47
Val⁸-Glu²²-Ala²¹-GLP-1(7-37)OH	>45	1.02
Val⁸-Glu²²-Lys²³-GLP-1(7-37)OH	>65	1.43
Val⁸-Lys³³-Val³⁴-GLP-1(7-37)OH	22	0.08
Val⁸-Lys³³-Asn³⁴-GLP-1(7-37)OH	>48	0.09
Val⁸-Gly³⁴-Lys³⁵-GLP-1(7-37)OH	27	0.34
Val⁸-Gly³⁶-Pro³⁷)-GLP-1(7-37)NH	2 2	0.53

PL 206 302 B1 * Czas agregacji oznaczono w temperaturze 30°C.

P r z y k ł a d 5. Wytrącanie związków GLP-1 cynkiem

Poszczególne związki GLP-1 wytworzono jak opisano w przykładach 1 lub 2. W 3 ml 0, 1 M buforu HEPES pH 10,5 rozpuszczono 3 mg cząsteczek poszczególnych zliofilizowanych GLP. Następnie, pH powstałego roztworu doprowadzono do wartości mieszczącej się w zakresie od 10,0 do 10,5 przy użyciu 0,2 N NaOH. Otrzymany roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie jego pH doprowadzono do wartości 7,4 przy uż yciu 0,2 N HCl. Roztwór przesączono przez odpowiedni filtr strzykawkowy, na przykład przez filtr Millex GV syringe filter (Millipore Corporation, Bedford, MA) i stężenie związku GLP-1 oznaczono przez zmierzenie absorpcji przy 280 nm przy użyciu spektrofotometru, na przykład Beckman DU640. Następnie, stężenie białka doprowadzono do

200 μΜ w HEPES pH 7,4.

Następnie, 100 μΐ przesączonych roztworów GLP-1, na płytce ELISA (na przykład Falcon Microtest™ 96), rozcieńczono 100 μl 0,1 M HEPES pH 7,4, zawierającego różne stężenia chlorku cynku, w wyniku czego otrzymano 200 μl roztworu zawierającego różne stężenia chlorku cynku i 100 μM związków GLP-1. Roztwory te przetrzymano w temperaturze otoczenia (22°C) przez 18 godzin, po czym wirowano, na przykład w wirówce Jouan CR412 z adapterami mikropłytkowymi. Po odwirowaniu, 150 μl supernatantu przeniesiono na płytkę do mikromiareczkowania ELISA nadającą się do odczytywania w świetle UV (na przykład płytkę Costar UV) i oznaczono OD przy 280 nm przy użyciu czytnika do mikropłytek (na przykład Molecular Devices SPECTRAmax PLUS, SOFTmax PRO). Otrzymane wyniki eksperymentu przedstawiono w poniższej tabeli 2. Wartości A2so stanowią wynik dwu niezależnych oznaczeń.

T a b e l a 2

Stosunek molowy Zn/GLP-1	GLP-1 (7-37)OH A280	Gly⁸- GLP-1(7-37)OH A280	Val⁸- GLP-1(7-37)OH A280	Gln²²- GLP-1(7-37)OH A280	Val⁸-Glu²² GLP-1(7-37)OH A280	Val⁸-Ala²² GLP-1(7-37)OH A280
0	0.337	0.32	0.3	0.290	0.295	0.289
0.3	0.318	0.166	0.27	0.390	0.291	0.202
0.5	0.329	0.151	0.26	0.123	0.292	0.107
0.7	0.253	0.156	0.124	0.076	0.293	0.104
1	0.148	0.119	0.06	0.074	0.26	0.110
2	0.092	0.089	0.025	0.095	0.078	0.110.
3	0.081	0.085	0.021	0.095	0.052	0.104
5	0.074	0.078	0.019	0.097	0.035	0.119

T a b e l a 2 c.d.

Stosunek molowy Zn/GLP-1	Val⁸-Ser²²- GLP-1(7-37)OH A280	Val⁸- Phe²²-GLP-1(7-37)OH A280	Val⁸- Pro²²-GLP-1(7-37)OH A280	Val⁸-Lys²² GLP-1(7-37)OH A280	Val⁸-Asp²² GLP-1(7-37)OH A280
0	0.2855	0.31	0.2595	0.299	0.288
0.3	0.2805	0.1485	0.2455	0.0825	0.2785
0.5	0.2665	0.1165	0.2325	0.0905	0.2845
0.7	0.1825	0.1015	0.219	0.1195	0.287
1	0.149	0.1265	0.1905	0.1225	0.291
2	0.0935	0.092	0.1695	0.1675	0.184
3	0.101	0.061	0.1615	0.1475	0.1485
5	0.0615	0.00795	0.171	0.142	0.1675

PL 206 302 B1

Wyniki te pokazują, że do skompleksowania i wytrącenia w znacznej ilości różnych związków GLP-1 z tych rozcieńczonych roztworów potrzebna jest jedynie niewielka ilość cynku.

Równoważne sposoby wykonania wynalazku

Aczkolwiek wynalazek niniejszy został szczegółowo przedstawiony i opisany w odniesieniu do korzystnych sposobów jego wykonania, to dla specjalistów w tej dziedzinie techniki będzie zrozumiałe, że można do niego wprowadzić rozmaite zmiany co do formy i szczegółów, bez odchodzenia od istoty i zakresu wynalazku, jak zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach. Specjaliści w tej dziedzinie techniki rozpoznają, lub będą zdolni, na podstawie jedynie rutynowego eksperymentowania, do upewnienia się, że będą możliwe liczne sposoby wykonania wynalazku równoważne sposobom szczegółowo opisanym w niniejszym opisie.

PL 206 302 B1

Wykaz sekwencji

<110>	Eli Lilly and Company
<120>	ANALOGI GLUKAGONOPODOBNEGO PEPTYDU-1
<130)	Χ-13989
<160>	53
<170>	Patentln version 3.0
<210>	1
<211>	31
<212>	PRT
<213>	Sztuczna

<220>

<223>

konstrukcja syntetyczna

<220>

<221>	WARIANT
<222>	(2) .. (2)
<223>	Xaa w pozycji 2 oznacza Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser lub

Thr;

<220>
<221>	WARIANT
<222>	(5) .. (5)
<223>	Xaa w pozycji 5 oznacza Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys lub His;

<220>

<221>

WARIANT

PL 206 302 B1

<222> <223>	(6) . . (6)	oznacza His,	Trp,	Phe lub Tyr;
Xaa w pozycji	6 <
<220>
<221>	WARIANT
<222>	(10)..(10)
<223>	Xaa w pozycji	10	oznacza Leu,	Ser,	Thr, Trp, His, Phe,
	Asp, Val, Glu	lub Ala;
<220>
<221>	WARIANT
<222>	(16)..(16)
<223>	Xaa w pozycji	16	oznacza Gly,	Asp,	Glu, Gin, Asn, Lys,
	Arg lub Cys;
<220>
<221>	WARIANT
<222>	(17) . . (17)
<223>	Xaa w pozycji	17	oznacza His,	Asp,	Lys, Glu lub Gin;
<220>
<221>	WARIANT
<222>	(18)..(18)
<223>	Xaa w pozycji	18	oznacza Glu,	His,	Ala lub Lys;
<220>
<221>	WARIANT
<222>	(20) .. (20)
<223>	Xaa w pozycji	20	oznacza Asp,	Lys,	Glu lub His;

PL 206 302 B1 <220>

<221> WARIANT <222> (21) . . (21) <223> Xaa w pozycji 21 oznacza Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg lub Lys;

<220>

<221> WARIANT <222> (25) .. (25) <223> Xaa w pozycji 25 oznacza Ala, Glu, Asp, Ser lub His;

<220>

<221> WARIANT <222> (27).. (27) <223> Xaa w pozycji 27 oznacza Asp, Arg, Val, Lys, Ala,' Gly lub Glu;

<220>

<221> WARIANT <222> (28)..(28) <223> Xaa w pozycji 28 oznacza Glu, Lys lub Asp;

<220>

<221> WARIANT <222> (29)..(29) <223> Xaa w pozycji 29 oznacza Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His lub Glu;

<220>

<221> WARIANT

PL 206 302 B1

<222> <223>	(30)..(30)	Arg,	Glu	lub	His;
Xaa	w pozycji	30 oznacza
<220>
<221>	WARIANT
<222>	(31)	..(31)
<223>	Xaa	w pozycji	31 oznacza	Lys,	Arg,	Thr	, Ser, Glu, Asp,
	Trp,	Tyr, Phe,	His, -NH₂,	Gly,	Gly-	-Pro	lub Gly-Pro-

NH₂, albo go nie ma.

<400> 1

His Xaa Glu Gly Xaa Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Phe Ile Ala Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <220>

<221> WARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa w pozycji 2 oznacza Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser lub

Thr;

PL 206 302 B1 <220>

<221> WARIANT <222> (6)..(6) <223> Xaa w pozycji β oznacza His, Trp, Phe lub Tyr;

<220>

<221> WARIANT <222> (10)..(10)

<223>	Xaa w pozycji Val, Glu lub j	10 ?\la;	oznacza	Leu,	Ser,	Thr,	Trp, His, Phe, Asp
<220>
<221>	WARIANT
<222>	(16)..(16)
<223>	Xaa w pozycji	16	oznacza	Gly,	Asp,	Glu,	Gin, Asn, Lys, Arg
	lub Cys;
<220>
<221>	WARIANT
<222>	(17) .. (17)
<223>	Xaa w pozycji	17	oznacza	His,	Asp,	Lys,	Glu lub Gin;
<220>
<221>	WARIANT
<222>	(20) .. (20)
<223>	Xaa w pozycji	20	oznacza	Asp,	Lys,	Glu	lub His;

<220>

<221> WARIANT <222> (24) .. (24)

PL 206 302 B1

<223>	Xaa w pozycji	24	oznacza Ala, Glu, Asp,	Ser lub His;
<220>
<221>	WARIANT
<222>	(29)..(29)
<223>	Xaa w pozycji	29	oznacza Thr, Ser, Lys,	Arg, Trp, Tyr, Phe

Asp, Gly, Pro, His lub Glu;

<220>

<221> WARIANT <222> (31)..(31) <223> Xaa w pozycji 31 oznacza Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, -NH₂, Gly, Gly-Pro lub Gly-Pro-NH_:, albo go nie ma.

<400> 2 .

His Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa ¹⁵ 10 15

Xaa Ala Ala Xaa elu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Lys Xaa Arg Xaa ²⁰ 25 jo <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna

PL 206 302 B1 <220>

<221> WARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa w pozycji 2 oznacza Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser lub Thr;

<220>

<221> WARIANT <222> (16)..(16)

<223>	Xaa w pozycji lub Cys;	16 oznacza	Gly,	Asp, Glu, Gin, Asn, Lys,	Arg,
<220>
<221>	WARIANT
<222>	(17)..(17)
<223>	Xaa w pozycji	17 oznacza	His,	Asp, Lys, Glu lub Gin;
<220>
<221>	WARIANT
<222>	(21) . . (21)
<223>	Xaa w pozycji lub Lys;	21 oznacza	Ala,	Glu, His, Phe, Tyr, Trp,	Arg
<220>
<221>	WARIANT
<222>	(24) . . (24)
<223>	Xaa w pozycji	24 oznacza	Ala,	Glu, Asp, Ser lub His;

<220>

PL 206 302 B1

<221>	WARIANT
<222>	(31) .. (31)
<223>	Xaa w pozycji 31 oznacza Lys, Arg, Thr, Ser, Glu,	Asp,	Trp
	Tyr, Phe, His, -NH₂, Gly, Gly-Pro lub Gly-Pro-NH₂,	albo	go
	nie ma.

<400> 1

His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa 20 25 30 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <220>

<221> WARIANT <222> (1). (1) <223> Xaa w pozycji 1 oznacza L-histydynę, D-histydynę, dezaminohistydynę, 2-aminohistydynę, betahydroksyhistydynę, homohistydynę, alfafluororaetylohistydynę lub alfametylohlstydynę;

<220>

<221> WARIANT <222> (2) .. (2)

PL 206 302 B1

<223> Thr;	Xaa w pozycji	2	oznacza	Gly, Ala,	Val, Leu, Ile,	Ser	lub
<220>
<221>	WARIANT
<222>	(16)..(16)
<223>	Xaa w pozycji	16	oznacza	Asp, Glu	, Gin, Asp, Lys,	Arg	lub
	Cys ;
<220>
<221>	WARIANT
<222>	(31) .. (31)
<223>	Xaa w pozycji	31	oznacza	-NH₂ lub	Gly.

<4Q0> 4

Xaa Zaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Aap Val Ser Ser Tyr Leu Glu Zaa

5 10 15

Glu Ala Ala Lya Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lya Gly Ara Zaa

25 30 <210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223) konstrukcja syntetyczna

PL 206 302 B1 <400> 5

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

5 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

25 30 <210> 6 <211> 31 <222> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <40Q> 6

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp 15 lo 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lya Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<230> konstrukcja syntetyczna

PL 206 302 B1 <400> 7

Hia Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Len Glu Arg ¹ 5 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

25 30 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<^30> konstrukcja syntetyczna <400> 8

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys 15 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

25 30 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220 <223> konstrukcja syntetyczna <400> 5 w

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu ^L 5 io ₁₅

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

25 30

PL 206 302 B1

PL 206 302 B1 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 12

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys 15 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 13

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

5 10 ₁₅ ^J

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

25 30 <210> 14 <211> 31

PL 206 302 B1

<210>	16
<211>	31
<212>	PRT
<213>	Sztuczna

PL 206 302 B1 <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <40θ> 16

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly ¹⁵ 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His 20 - 25 30 <210> 17 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 17

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu ¹ 5 10 15

Gin Ala Ala Lys Ala Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Aro His

25 30 <210> 18 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

PL 206 302 B1 <223> konstrukcja syntetyczna <400» 18

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys ¹⁵ 10 15

Glu Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Ara Hia 20 . 25 30

<210>	19
<211>	31
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens

<400> 19

His Ala Cłu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly ^{1 5} 10 15

Gin Ala Ale Lys Glu Phe Ile Ale Trp Leu Val Lys Gly Aro Gly

25 lo <210> 20 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna

PL 206 302 B1 <40Q> 20

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu ¹⁵ 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 21 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 21

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp ¹ 5 10 is

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu val Lys Gly Arg Gly

25 30 <210> 22 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna

PL 206 302 B1 <400> 22

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Arg

S 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

25 30 <210> 23 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 23

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lya

5 10 1S

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

25 30 <210> 24 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <220>

<221> WARIANT

PL 206 302 B1 <222> (16). .(16) <223> Xaa w pozycji 16 oznacza kwas cysteinowy.

<400> 24

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa 15 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 25 <211> 31 <212> PRT .

<213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <220>

<221> WARIANT <222> (16). .(16) <223> Xaa w pozycji 16 oznacza kwas cysteinowy.

<400> 25

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa 15 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly <210>

<210>

<211>

<212>

PRT

PL 206 302 B1 <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <220>

<221> WARIANT <222> (16). .(16) <223> Xaa w pozycji 16 oznacza kwas cysternowy.

<400> 26

Ή** The Thr S<r Asp Val Sar Sar Tyr Leu Glu Xaa

1Q ₁₅

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 27 <211> 30 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 27

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu ¹⁵ 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30

PL 206 302 B1 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 28

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp 15 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 3Q <210> 29 <211> 30 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 29

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Arg 15 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 ’ 25 30 <210> 30 <211> 30

PL 206 302 B1 <2i2> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna ^400> 30

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys 15 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <220>

<221> WARIANT <222> (16). .(16) <223> Xaa w pozycji 16 oznacza kwas cysternowy.

PL 206 302 B1 <400> 31

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa 1 S 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 32 <211> 30 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <4D0> 32

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr.Leu Glu Glu 15 10 15

Gin Ala Ala Lya Glu Phe Ile Ale Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 33 <211> 30 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna

PL 206 302 B1 <400> 33

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp 15 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 34 <211> 30 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 34

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Arg 15 10 15 w

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 35 <211> 30 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna

PL 206 302 B1 <400> 35

His 1	Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Sar Ser tyr Leu Glu Lys
5	10	15
Gin	Ala Ala Lya Glu Phe Ile Ala	Trp Leu Val Lys	Gly Arg
	20	25	30

<210>	36
<211>	30
<212>	PRT
<213>	Sztuczna
<220>
<223>	konstrukcja syntetyczna
<220>
<221>	WARIANT
<222>	(16). .(16)
<223>	Xaa w pozycji 16 oznacza kwas	cysteinowy.
<400> 3«
KiB 1	Val Glu Gly Thr phe Thr Ser Asp S	Val Ser Ser 10	Tyr Leu Glu Zaa 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 37 <211> 30 <212> PRT

PL 206 302 B1 <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 37

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu ¹ ' ⁵ 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 38 <211> 30 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 38

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp ¹ 5 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Γτρ Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30

<210>	39
<211>	30
<212>	PRT
<213>	Sztuczna

PL 206 302 B1 <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <40Q> 19

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Arg 1 5 . 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 40 <211> 30 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <40O> 40

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Sar Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys 15 10 15

GIC Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 41 <211> 30 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna

PL 206 302 B1 <220>

<221> WARIANT <222> (16). .(16) <223> Xaa w pozycji 16 oznacza kwas cysternowy

<400> 41

His

Gly Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

Ser

Asp

Val

Ser

Tyr

Leu

Glu Xaa

1

5

10

15

Gin

Ala Ala

Lys

Glu

Phe

Ile

Ala

Trp

Leu

Val

Lys

Gly

Arg

20

25

30

<210> 42 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 42

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

5 10 15

Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

25 30 <210> 43 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna

PL 206 302 B1 <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 43

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser 1 5

Gin Ala Ala Lys Ala Pfaa Ile Ala 20

Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 10 15

Tip Leu Val Lys Gly Arg Gly 25 30 <210> 44 <211> 31 <212> PRT <2±3> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 44

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu 1 5 i 10

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lya Gly Arg 20 25 30

Glu Gly 15

Gly

<210>	45
<211>	31
<212>	PRT
<213>	Sztuczna

<220>

PL 206 302 B1

<220>

<223> konstrukcja syntetyczna

PL 206 302 B1 <400> 47

Kia Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Lwu Val Lya Gly Arg Hie 20 25 30 <210> 48 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 48

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 15 10 15

Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 49 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna

PL 206 302 B1 <400> 49

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 15 10 15

Glu Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lya Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 50 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 50

His V*1 Glu 1

Gin Ala Ala

Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 5 10 15

Lys Ala Phe Ile Ala Trp Leu Val Lye Gly Arg Gly 20 25 30

<210>	51
<211>	31
<212>	PRT
<213>	Sztuczna

<220>

<223> konstrukcja syntetyczna

PL 206 302 B1 <400> 51

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser'Tyr Leu Glu Gly 15 io i®

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Vał Gly Lys Arg Gly ²⁰ 25 30 <210> 52 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 52

His val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly ¹ 5 10 ₁₅

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His

25 30 <210> 53 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> konstrukcja syntetyczna

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Związek GLP-1 obejmujący sekwencję aminokwasową o wzorze III (SEQ ID NO:3): His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-LysXaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R

Wzór III (SEQ ID NO:3) w którym:

Xaa8 oznacza: Gly albo Val;

Xaa22 oznacza: Glu;

Xaa23 oznacza: His, Asp, Lys, Glu albo Gln;

Xaa27 oznacza: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg albo Lys Xaa30 oznacza: Ala, Glu, Asp, Ser albo His;

R oznacza: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, -NH2, Gly, Gly-Pro, Gly-Pro-NH2, albo jest usunięty.
2. Związek GLP-1 według zastrz. 1, znamienny tym, że wybrany jest spośród:

Val⁸-Glu²²- GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:5),

Gly⁸-Glu²² GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:9),

Val⁸-Glu²²- GLP-1(7-36)NH2 (SEQ ID NO:32),

Gly⁸-Glu²²- GLP-1(7-36) NH2 (SEQ ID NO:37),

Val⁸-Glu²²- Lys²³- GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:48),

Val⁸-Glu²²- Glu²³- GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:49) albo Val⁸-Glu²²- Ala²⁷- GLP-1(7-37)OH (SEQ ID NO:50).
3. Związek GLP-1 według zastrz. 2, znamienny tym, że ma sekwencję oznaczoną SEQ ID NO:5.
4. Związek GLP-1 według zastrz. 3, znamienny tym, że tworzy kompleks z dwuwartościowym kationem metalu.
5. Związek GLP-1 według zastrz. 4, znamienny tym, że tworzy kompleks z dwuwartościowym kationem cynku.