PL206458B1 - Zastosowanie siarczanowanych glikozoaminoglikanów w położnictwie - Google Patents

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 370428 (22) Data zgłoszenia: 02.01.2003 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

02.01.2003, PCT/SE03/000004 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

10.07.2003, WO03/055499 (11) 206458 (13) B1 (51) Int.Cl.

A61K 31/726 (2006.01) A61K 31/727 (2006.01) A61K 31/737 (2006.01) A61P 15/04 (2006.01) (54) Zastosowanie siarczanowanych glikozoaminoglikanów w położnictwie (73) Uprawniony z patentu:

(30) Pierwszeństwo:

02.01.2002, SE, 0200005-7 (43) Zgłoszenie ogłoszono:

30.05.2005 BUP 11/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

31.08.2010 WUP 08/10

DILAFOR AB, Sztokholm, SE (72) Twórca(y) wynalazku:

(74)

GUNVOR EKMAN-ORDEBERG, Danderyd, SE

ANDERS MALMSTROM, Lund, SE

Pełnomocnik:

rzecz. pat. Sulima Zofia

SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA

BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH spółka jawna

PL 206 458 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie siarczanowanych glikozoaminoglikanów do wytwarzania preparatu farmaceutycznego do profilaktyki i leczenia powolnego postępu terminowego porodu.

Częstym problemem klinicznym w położnictwie jest przedłużający się poród lub różne zaburzenia porodu. W Szwecji udokumentowano, że powolny postęp lub zatrzymanie porodu występuje w przypadku 40 - 60% wszystkich porodów. W krajach rozwijają cych się ś mier ć matki spowodowana zahamowaniem porodu z poważnym krwawieniem po porodzie jest najczęstszym powodem zgonu matek. Powolny postęp porodu jest najczęstszym wskazaniem do wykonania cięcia cesarskiego ze wskazań nagłych, co z kolei często prowadzi do żądania wykonania planowego cięcia cesarskiego w następnej ciąży. Inne powikłania przedłużającego się porodu powodują zwiększoną częstość występowania zamartwicy płodu, prowadzącej do odległych powikłań.

Macica jest zbudowana z dwóch części, trzonu i szyjki spełniających różne funkcje podczas ciąży i porodu. Trzon macicy zbudowany jest głównie z pęczków mięśni gładkich, mięśniówki, osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej, ECM, a szyjka macicy składa się głównie z ECM. Głównym składnikiem ECM jest kolagen, aczkolwiek w mniejszej ilości występują tam również proteoglikany. Proteoglikany składają się z rdzenia białkowego, do którego dołączonych jest od jednego do stu łańcuchów polisacharydowych, glikozoaminoglikanów.

Koordynacja pomiędzy skurczami i rozluźnieniem macicy, lub innymi słowy dojrzewaniem i rozwieraniem szyjki macicy jest niezbędna dla prawidłowego porodu. Niezgodność pomiędzy tymi procesami prowadzi do nieprawidłowych porodów.

W czasie ciąży i porodu zarówno szyjka, jak i trzon macicy ulegają przebudowie. Znaczna przebudowa trzonu macicy prowadzi do około siedmiokrotnego wzrostu jego objętości. Niedostateczna przebudowa macicy jest związana z zaburzeniami kurczliwości. Prawidłowe rozwarcie ujścia szyjki macicy od 1 cm do 10 cm w czasie porodu implikuje całkowitą przebudowę tkanki łącznej szyjki macicy, będącą efektem spadku stężenia kolagenu i proteoglikanów, co prowadzi do powstania miękkiej i sprężystej szyjki macicy. Zaburzenia dojrzewania szyjki mogą, jeżeli proces ten zacznie się zbyt wcześnie, doprowadzić do przedwczesnego porodu. Przedwczesny poród musi być skoordynowany z przedwczesnym dojrzewaniem szyjki macicy, aby doprowadzić do przedwczesnego urodzenia dziecka. Z drugiej strony niedostateczne dojrzewanie szyjki macicy prowadzi do przeterminowanej ciąży, w której występuje często przedłużony poród i rozwiązanie zabiegowe. Zatem dojrzewanie szyjki macicy i skurcze mięśniówki macicy to dwa odrębne procesy, które muszą być skoordynowane, aby doprowadzić do prawidłowego porodu.

Fizjologia zarówno prawidłowego, jak i przedłużonego porodu jest wciąż niejasna. Wydaje się, że kontrola hormonalna obejmuje hamujące działanie progesteronu i pobudzenie przez wzrastające poziomy estrogenu. Sugerowano, że w zapoczątkowaniu porodu biorą udział hormon uwalniający kortykotropinę, prostaglandyny i zmiana stosunku estrogeny/progesteron. Wprowadzony w 1950 roku dożylny wlew oksytocyny jest wciąż podstawowym leczeniem przedłużającego się porodu i ostatnio opublikowane badania i prace przeglądowe dotyczące wolnego postępu porodu głównie przedstawiają różne schematy leczenia przez podawanie oksytocyny. W wielu przypadkach leczenie to jest nieskuteczne i prowadzi do wzrastającej liczby rozwiązań operacyjnych. Pomimo ogromnego obecnego na całym świecie problemu związanego z wolnym postępem porodu czyniono nieliczne wysiłki w celu opracowania nowych leków do nasilenia czynności porodowej.

Wywołanie porodu u kobiet z niedojrzałą szyjką macicy przez około dwadzieścia lat wykonywano przez miejscowe podawanie prostaglandyny E2. W 15 - 20% tych przypadków nie udało się wywołać dojrzewania szyjki macicy i porodu. Najbardziej znaczącym niepowodzeniem jest zahamowanie porodu.

Opisano skurcz macicy spowodowany heparyną jako działanie uboczne dożylnego podawania dużej dawki heparyny do leczenia zakrzepicy żylnej u 32 letniej wieloródki w trzydziestym drugim tygodniu ciąży (K. Shaker i in., British Medical Journal, 16 listopada 1974 r.). Heparyna jest glikozoaminoglikanem izolowanym dla celów handlowych z tkanek zwierzęcych i stosowanym w klinice jako lek przeciwzakrzepowy.

Osmers, Rϋdiger i in., Obstet. Gynecol. tom 81, nr 1, 1993, str. 88-92, badali zawartość i model dystrybucji glikozoaminoglikanów w ludzkiej szyjce macicy podczas ciąży i porodu. Stwierdzili oni, że całkowita ich ilość wzrosła podczas ciąży i osiągnęła najwyższą wartość w momencie rozpoczęcia porodu. Przykładowo, wystąpił gwałtowny wzrost poziomu kwasu hialuronowego w momencie rozpoPL 206 458 B1 częcia porodu, a podczas porodu wystąpił wzrost poziomu siarczanów heparanu i obniżenie poziomu siarczanów dermatanu. Wywnioskowano, że dojrzewanie szyjki macicy jest przede wszystkim procesem metabolicznym kontrolowanym przez syntezę glikozoaminoglikanów. Uważa się, że utrata siarczanów dermatanu jest związana z destabilizacją włókien kolagenowych.

W EP 0509120 B1 ujawniono zastosowanie glikozoaminoglikanów, GAG, do wytwarzania ś rodka farmaceutycznego do stosowania miejscowego do profilaktyki i leczenia chorób obszaru szyjkowo-pochwowego. Jako przykłady tych chorób wymieniono stany dystrofii i atrofii wywołane brakiem hormonów estrogenowych, zapalenie skóry pochwy, nieswoiste zapalenie pochwy, itp. Uważa się, że GAG biorą udział w ochronie i przywracaniu naturalnego ekosystemu pochwy.

Opisano, że glikozoaminoglikany należą do wysoce heterogennej klasy makrocząsteczek mających bardzo długie cząsteczki zawierające powtarzające się jednostki disacharydowe tworzące liniowe makrocząsteczki. Ogólnie każda z powtarzających się jednostek zawiera resztę aminocukrową, to znaczy glukozoaminy lub galaktozoaminy, oraz resztę kwasu uronowego, zawierającą kwas glukuronowy lub iduronowy. Grupy hydroksylowe w położeniach C2, C3, C4 i C6 i grupa aminowa w położeniu C2 mogą być podstawione grupami siarczanowymi. GAG reprezentowane są przez następujące związki: heparynę, siarczan heparanu, siarczan dermatanu, kwas hialuronowy, siarczan chondroityny, siarczan keratanu.

EP 0867452 A1 dotyczy środka przyspieszającego dojrzewanie szyjki macicy, który jako składnik czynny zawiera kwas hialuronowy lub jego pochodną.

Dobrze wiadomo, że glikozoaminoglikany wywierają szereg działań na funkcjonowanie komórki.

Ostatnio stwierdzono, że ekspresja proteoglikanów siarczanu heparanu zmienia się w czasie przebudowy macicy w czasie ciąży i porodu. Uważa się zatem, że odgrywają one kluczową rolę w porodzie. Stwierdzono takż e, ż e podawanie siarczanowanych glikozoaminoglikanów do skrawków ludzkiej macicy nasila ich czynność skurczową.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że określone siarczanowane glikozoaminoglikany o działaniu przeciwkrzepliwym 100 jednostek BP/mg lub słabszym są użyteczne do profilaktycznego przygotowania lub leczenia szyjki macicy i mięśniówki macicy w celu doprowadzenia do skutecznego porodu u kobiet. Prawidłowy poród obejmuje zmiękczenie szyjki macicy i regularne skurcze mięśniówki.

Wynalazek dotyczy zastosowania siarczanowanych glikozoaminoglikanów wybranych z grupy obejmującej siarczany heparanu, depolimeryzowane siarczany heparanu, siarczany dermatanu, depolimeryzowane siarczany dermatanu, heparyny o niskiej masie cząsteczkowej i depolimeryzowane heparyny, o działaniu przeciwkrzepliwym 100 jednostek BP/mg lub słabszym do wytwarzania preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia powolnego postępu terminowego porodu.

Korzystne jest zastosowanie glikozoaminoglikanu o działaniu przeciwkrzepliwym 30 jednostek BP/mg lub słabszym.

Korzystne jest zastosowanie heparyn o niskiej masie cząsteczkowej lub depolimeryzowanych heparyn, o średniej masie cząsteczkowej poniżej 10000.

Korzystnie stosuje się heparyny o niskiej masie cząsteczkowej lub depolimeryzowane heparyny o ś redniej masie cząsteczkowej poniż ej 6000.

Korzystnie stosuje się glikozoaminoglikan w połączeniu z oksytocyną.

Korzystne jest zastosowanie glikozoaminoglikanów do wytwarzania preparatu farmaceutycznego do podawania miejscowego.

Ponadto korzystne jest zastosowanie glikozoaminoglikanów do wytwarzania preparatu farmaceutycznego do podawania pozajelitowego.

Działanie przeciwkrzepliwe oceniano przez pomiar wydłużenia czasu krzepnięcia na mg siarczanowanego glikozoaminoglikanu i jest ono wyrażane w jednostkach BP na mg (według British Pharmakopeia 1968, str. 1345). Heparyna wykazuje działanie przeciwkrzepliwe 157 jednostek BP/mg.

Siarczanowane glikozoaminoglikany, to znaczy głównie heparyna, siarczan heparanu, siarczan dermatanu i siarczan chondroityny, są zbudowane z położonych na przemian reszt heksozoaminy i kwasu uronowego. Kwas hialuronowy nie zawiera grup siarczanowych. Obecność kwasu D-glukuronowego (GlcA) i jego C-5 epimeru, kwasu L-iduronowego (IdoA) oraz specyficznych siarczanowanych reszt heksozoaminowych i uronozylowych nadaje polimerowi bardzo dużą zmienność strukturalną. Struktura ta może zawierać od żadnego lub bardzo niewielu do niemalże 100% disacharydów zawierających kwas iduronowy. Budowa disacharydów zawierających GlcA- i IdoA-N-heksozoaminę może być różna, od długich bloków do położonych na przemian disacharydów. Duży stopień siarczanowania i duża zawartość siarczanu kwasu iduronowego wiąże się na ogół z dużą aktywnością biolo4

PL 206 458 B1 giczną związku. Istnieją różne dobrze określone polisacharydy siarczanu dermatanu (DS), siarczanu chondroityny (CS), siarczanu heparanu (HS) i depolimeryzowanej heparyny.

Siarczan heparanu, zawierający glukozoaminę i kwas uronowy jako powtarzające się disacharydy, oraz składający się z N-acetylowanych i N-siarczanowanych disacharydów, które są ułożone głównie w sposób posegregowany, jest powszechnie obecny na powierzchni komórek i w macierzy zewnątrzkomórkowej. Ogólnie jest on mniej siarczanowany i ma mniejszą zawartość iduronianu, niż heparyna oraz ma bardziej różnorodną budowę. Uważa się, że oddziaływania między siarczanem heparanu a białkami odgrywają rolę w wielu procesach fizjologicznych, takich jak adhezja komórek, regulacja enzymów, działanie cytokin, wchodzenie wirusa do komórek i właściwości przeciwkrzepliwe. Siarczany heparanu mają działanie przeciwkrzepliwe zależne od obecności swoiście przeciwkrzepliwego pentasacharydu, jednakże znacznie słabsze niż heparyna. Siarczan heparanu jest liniowym polisacharydem, który można wytworzyć z wieprzowej jelitowej błony śluzowej lub płuc wołu, z ubocznych frakcji heparyny z użyciem frakcji chlorku cetylopirydyniowego i sekwencyjnej ekstrakcji soli, jak opisali Fransson i in., Structural studies on heparan sulphates, Eur. J. Biochem. 106, 59-69 (1980).

Siarczan dermatanu jest siarczanowanym liniowym polisacharydem, zawierającym położone na przemian reszty kwasu uronowego i N-acetylowanej galaktozoaminy. Kwasy uronowe oznaczają D-GlcA lub L-IdoA, a disacharyd może być siarczanowany w położeniu 4 i 6 oraz 2 odpowiednio w galaktozoaminie i Ido-A. DS moż na otrzymać ze ś wińskiej skóry i jelitowej bł ony ś luzowej. Siarczan dermatanu wywiera działania biologiczne, takie jak budowa macierzy zewnątrzkomórkowej, oddziaływanie z cytokinami, działania przeciwkrzepliwe i rekrutacja neutrofilów.

Heparyny o niskiej masie cząsteczkowej lub depolimeryzowane heparyny są liniowymi oligosacharydami o Mr 2 - 10 kDa, głównie składającymi się z położonych na przemian reszt N-siarczanowanej glukozoaminy i IdoA i często zawierającymi przeciwkrzepliwy pentasacharyd. Można je wytworzyć z heparyn przez swoiste chemiczne rozszczepienie. Ich główna kliniczna funkcja polega na hamowaniu czynnika Xa, co prowadzi do działania przeciwzakrzepowego. Sugeruje się, że mają właściwości przeciwprzerzutowe. Fragmin® (Pharmacia, Szwecja) jest przykładem heparyny o niskiej masie cząsteczkowej, otrzymanej w procesie kontrolowanej depolimeryzacji heparyny i mającej działanie przeciwzakrzepowe dzięki hamowaniu czynnika Xa. Fragmenty heparyny wykazujące selektywne działanie przeciwkrzepliwe oraz sposoby ich wytwarzania opisane są w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4303651. Normalnie działanie przeciwkrzepliwe nie jest pożądane dla preparatu do zastosowania w czasie porodu.

Zgodnie z wynalazkiem stosuje się depolimeryzowane heparyny o względnej masie cząsteczkowej poniżej 10000 Da, korzystnie nie większej niż 6000 Da.

Bardzo ważne jest, aby działanie przeciwkrzepliwe nie było zbyt silne i zgodnie z korzystną postacią wynalazek dotyczy zastosowania siarczanowanego glikozoaminoglikanu o działaniu przeciwkrzepliwym 30 jednostek BP/mg lub słabszym.

Badania przeprowadzone in vitro sugerują, że w małym stopniu siarczanowane struktury nie wykazujące działania przeciwkrzepliwego lub wykazujące niewielkie działanie przeciwkrzepliwe są korzystnymi związkami. Zatem produkty uboczne otrzymane podczas wytwarzania heparyny są dobrymi kandydatami do wyboru wyjściowego materiału. Związki o żądanych właściwościach można otrzymać z ubocznych frakcji heparanu i heparyny przez konkretne utlenienie nadjodanem w celu usunięcia właściwości wiązania antytrombiny III.

Selektywne N-odsiarczanowanie, a następnie ponowne N-acetylowanie lub selektywne O-odsiarczanowanie także prowadzi do otrzymania związków o słabym działaniu przeciwkrzepliwym.

Selektywne N-deacetylowanie, a następnie konkretne N- i/lub O-siarczanowanie także prowadzi do otrzymania związków o żądanym działaniu.

W szczególnej postaci wynalazku stosuje się glikozoaminoglikan o stosunku siarczan/heksozoamina poniżej 1,0 i działaniu przeciwkrzepliwym lub czasie krzepnięcia mniejszym niż 10 jednostek BP/mg.

Jeżeli w momencie rozpoczęcia porodu ilość endogennej oksytocyny osiągnęła optymalny poziom, zastosowanie siarczanowanych glikozoaminoglikanów zgodnie z wynalazkiem wywoła początek porodu. W przypadku niedostatecznego poziomu endogennej oksytocyny siarczanowane glikozoaminoglikany można stosować w połączeniu z dożylną oksytocyną dla pobudzenia mięśniówki macicy.

W szczególnej postaci wynalazku siarczanowane glikozoaminoglikany stosuje się do wytwarzania preparatu farmaceutycznego, który można podawać miejscowo, to znaczy doszyjkowo, dopochwowo, doodbytniczo lub naskórnie albo układowo, to znaczy pozajelitowo, tak jak przez wstrzyknięcie podskórne lub dożylne. Środek farmaceutyczny można także podawać doustnie.

PL 206 458 B1

Do podawania pozajelitowego związki czynne można stosować w postaci roztworu lub zawiesiny, które także zawierają jeden lub większą liczbę substancji pomocniczych, takich jak jałowe rozcieńczalniki, takie jak woda do wstrzykiwań, roztwór soli, nielotne oleje roślinne, glikol polietylenowy, glicerol, glikol propylenowy lub inne syntetyczne rozpuszczalniki, środki przeciwbakteryjne, przeciwutleniacze, środki chelatujące, bufory i środki do dostosowania toniczności. Preparaty pozajelitowe można dostarczać w ampułkach, jednorazowych strzykawkach lub jako wlewy.

Preparat do podawania miejscowego zawiera czynne siarczanowane glikozoaminoglikany w połączeniu ze znanym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Nośnik lub zaróbkę może stanowić substancja stała, półstała lub ciekła, która może służyć jako podłoże dla substancji czynnej. Przykładowymi preparatami do podawania miejscowego są maść, krem, żel, spray donosowy lub dopochwowy, płyn, roztwór lub zawiesina.

Aby doprowadzić do skutecznego porodu, siarczanowane glikozoaminoglikany można podawać w pojedynczej dawce raz na 24 godziny przez okres 1 - 30, korzystnie 1 - 10 dni. Dawkę należ y oszacować jako najniższą dawkę wywołującą czynność skurczową mięśniówki macicy. Szacowana pojedyncza dawka wynosi 25 - 100 mg/dzień, ale może wynosić do 1 g lub więcej. Dawka zależy od postaci podawania.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie siarczanów heparanu

W 1 litrze 5% octanu wapnia - 0,5 M kwasu octowego rozpuszczono 10 g produktu ubocznego heparyny, TB 001-91 SVCM 950130 (Kabi-Pharmacia, Szwecja). Roztwór przesączono. Przesączony roztwór następnie doprowadzono do stężenia etanolu 18%. Po odwirowaniu supernatant doprowadzono do stężenia etanolu 36%. Osad uzyskano przez odwirowanie. Następujące siarczany heparanu wytworzono zgodnie z Fransson i in., Structural studies on heparan sulphates, Eur. J. Biochem. 106, 59-69 (1980) .

Wytwarzanie HS6

Osad otrzymany z roztworu o stężeniu 18 - 36% etanolu rozpuszczono w 1,2 M NaCl. Dodano 18 g chlorku cetylopirydyniowego, CPC i pozostawiono roztwór na 24 godziny w celu wytrącenia osadu. Osad uzyskano przez odsączenie i ponownie rozpuszczono w 2 M NaCl. Przesączu użyto do wytwarzania HS5. Do ponownie rozpuszczonego osadu dodano 3 objętości etanolu. Otrzymany roztwór pozostawiono na 16 godzin dla wytrącenia osadu, a następnie uzyskano go przez odwirowanie. Ostatecznie rozpuszczono go ponownie w wodzie i wytrącono ponownie z użyciem 3 objętości etanolu 0,4 % octanu sodu. Osad uzyskano przez odwirowanie i wysuszono. Otrzymano 4,34 g.

Wytwarzanie HS5

Przesącz z wytwarzania HS6 następnie rozcieńczono za pomocą 0,1% CPC do końcowego stężenia 1,0 M NaCl. Następnie postępowano tak jak w przypadku HS6. Przesączu użyto do wytwarzania HS4. Otrzymano 0,82 g.

Wytwarzanie HS4

Przesącz z wytwarzania HS5 następnie rozcieńczono za pomocą 0,1% CPC do końcowego stężenia 0,8 M NaCl. Następnie postępowano tak jak w przypadku HS6. Przesączu użyto do wytwarzania HS3. Otrzymano 0,51 g.

Wytwarzanie HS3

Przesącz z wytwarzania HS4 następnie rozcieńczono za pomocą 0,1% CPC do końcowego stężenia 0,6 M NaCl. Następnie postępowano tak jak w przypadku HS6. Przesączu użyto do wytwarzania HS2. Otrzymano 0,17 g.

Wytwarzanie HS2

Przesącz z wytwarzania HS3 następnie rozcieńczono za pomocą 0,1% CPC do końcowego stężenia 0,4 M NaCl. Następnie postępowano tak jak w przypadku HS6. Otrzymano 0,09 g.

Różne siarczany heparanu analizowano pod kątem zawartości kwasu glukuronowego, kwasu iduronowego i całkowitej zawartości grup siarczanowych. Liczbę grup siarczanowych przypadających na grupę aminową heksozoaminy określono w molach na mol oraz oznaczono procentową zawartość reszt kwasu iduronowego. Wyniki podano w poniższej tabeli 1. Oceniano także działanie przeciwkrzepliwe, mierząc czas krzepnięcia na 1 mg siarczanu heparyny i w poniższej tabeli 1 wyrażono go w jednostkach BP na mg.

PL 206 458 B1

T a b e l a 1. Analiza siarczanów heparanu

Preparat	Siarczan/hekso- zoamina (mol/mol)	N- -siarczan/hekso- zoamina (mol/mol)	IdoA/całkowity kwas uronowy (%)	IdoA- -SO4/całkowity kwas uronowy (%)	Działanie przeciwkrzepliwe (jednostki BP/mg)
HS2	0,56	0,26	30	10	-
HS3	1,00	0,40	35	20	8
HS4	1,15	0,47	40	25	30
HS5	1,23	0,62	50	45	88
HS6	1,63	0,73	65	60	140

Działanie przeciwkrzepliwe wszystkich powyższych preparatów siarczanu heparanu można znieść przez selektywne utlenianie nadjodanem, patrz Fransson LA i Lewis W, Relationship between anticoagulant activity of heparin and susceptibility to periodate oxidation, FEBS Lett. 1979, 97: 119-23.

P r z y k ł a d 2. Wytwarzanie siarczanu dermatanu

Jeden kg wysuszonej świńskiej skóry przeprowadzono w zawiesinę w 5 litrach 0,5 M NaCl, 0,01 M EDTA i 0,01 M chlorowodorku cysteiny, pH 6,5. Dodano 500 mg krystalicznej papainy i trawienie przebiegało przez 50 godzin. Produkt trawienia przesączono, a następnie wytrącono z użyciem 75 ml 10% roztworu CPC. Otrzymany kompleks pirydyniowy odsączono i ponownie rozpuszczono w 2 M NaCl zawierającym 15% etanolu. Roztwór ten rozcieńczono 3 objętościami 0,5% CPC. Osad zebrano i rozpuszczono w 200 ml 1 M NaCl i 40 ml etanolu. Osad ponownie rozpuszczono w 100 ml wody, a następnie wytrącono z uż yciem 3 obję tości etanolu - 0,4% octanu sodu. Otrzymany osad zebrano i wysuszono. Otrzymano 2,39 g substancji. Patrz Fransson i in., Structure of pig skin dermatan sulfate.

1. Distribution of D-glucuronic acid residues. (1971) Eur. J. Biochem. 18, 422-430.

Wytwarzanie DS o różnej zawartości kwasu L-iduronowego

W 220 ml 5% octanu wapnia - 0,5 M kwasu octowego rozpuszczono 2,2 g substancji otrzymanej powyżej. Roztwór ten zmieszano z etanolem i zebrano osady wytrącone z roztworu o stężeniu odpowiednio 0 - 18% etanolu (DS-18), 18 - 36% etanolu (DS-36) i 36-50% etanolu (DS-50). Osady ponownie rozpuszczono w wodzie i ponownie wytrącono z użyciem 3 objętości etanolu - 0,4% octanu sodu. Po wysuszeniu otrzymano 0,9 g DS-18; 1,02 g DS-36; 0,28 g DS-50.

Różne siarczany dermatanu analizowano pod kątem zawartości grup siarczanowych, kwasu glukuronowego, kwasu iduronowego i heksozoaminy, a wyniki podano w poniższej tabeli 2.

T a b e l a 2. Analiza siarczanów dermatanu

Preparat	Siarczan/heksozoaminy (mol/mol)	IdoA/całkowity kwas uronowy (%)	IdoA-SO4/całkowity kwas uronowy (%)
DS-18	1,16	90	20
DS-36	1,12	75	15
DS-50	1,06	50	10

Galaktozoamina zawarta w preparatach DS stanowi 99% wszystkich heksozoamin, a glukozoamina zawarta w preparatach HS i heparyny stanowi >97% wszystkich heksozoamin.

Testy doświadczalne

Test 1. Oznaczenie kurczliwości

W nastę pują cym teście badano siarczany heparanu HS2 i HS6, otrzymane z ubocznej frakcji heparyny TB 001-91 SVCM 950130 (Kabi-Pharmacia, Szwecja). HS6 różni się od HS2 tym, że jest znacznie bardziej siarczanowany i zawiera więcej reszt kwasu L-iduronowego (patrz powyższa tabela 1).

Próbki macicy uzyskano od kobiet poddawanych planowemu cięciu cesarskiemu w 38 - 39 tygodniu ciąży. Próbki miały rozmiary 20 x 10 x 10 mm i były pobierane z górnej części cięcia cieśniowego. Bioptat umieszczano natychmiast w lodowatym buforze Krebsa-Ringera. Bioptaty cięto na podłużne paski o długości 10 - 15 mm i szerokości około 5 mm. Pasek zawieszano pionowo w łaźni do narządów w temperaturze 37°C, zawierającej 2 ml roztworu Krebsa-Ringera. Przez roztwór przepuszczono pęcherzykami mieszaninę 95% O2 i 5% CO2 w celu utrzymania odczynu kąpieli o pH 7,35 7,45. Doświadczenia przeprowadzono po doprowadzeniu skrawków do stanu stabilnego skurczu,

PL 206 458 B1 zazwyczaj po 1 - 2 godzinach od ich zawieszenia. Skurcze rejestrowano izometrycznie z użyciem poligrafu Grassa, model 7 (Grass Instr. Co., Quincy, MA, USA). Wszystkie próbki eksponowano na 100 mM KCl w czasie doświadczenia dla uzyskania standaryzowanej maksymalnej odpowiedzi. Następnie do kąpieli zawierającej pasek macicy dodano różne dawki siarczanu heparanu. Po 20 minutach dodano 1 U oksytocyny. Dodanie jedynie 1 U oksytocyny stosowano jako kontrolę.

Procedurę tę powtarzano z użyciem 6 μg siarczanu heparanu. Po 20 minutach dodano 1 jednostkę oksytocyny. Skurcze rejestrowano i oceniano przez całkowanie powierzchni pod krzywą. Dodano dwa siarczany heparanu, HS2 i HS6, o różnej budowie oraz jako kontrolę stosowano 1 jednostkę oksytocyny. Patrz poniższa tabela 3.

T a b e l a 3. Względna kurczliwość paska mięśnia macicy po stymulacji siarczanem heparanu i oksytocyną, % niestymulowanej kontroli

	Niestymulowana kontrola	Kontrola z oksytocyną, 1U	HS	HS i oksytocyna
HS2	100	226	289	936
HS6	100	226	183	584

Połączenie oksytocyny i HS6 doprowadziło do 2,5-krotnego wzrostu siły skurczu, a połączenie z HS2 doprowadziło do 4,1-krotnego wzrostu siły skurczu.

Wskazuje to, że siarczan heparanu zwiększa siłę skurczu ludzkich skrawków mięśnia macicy w warunkach in vitro. Działanie to jest zależne od budowy siarczanu heparanu i struktura o niewielkim stopniu siarczanowania wydaje się bardziej skuteczna.

Gdy powtórzono ten test z siarczanem dermatanu, DS-18, patrz tabela 2, zarejestrowano kurczliwość, ale wyniki dotychczas nie zostały ocenione.

Test 2. Wpływ na poziom Ca²⁺ w fibroblastach szyjki macicy

Hodowle fibroblastów uzyskano od nie-ciężarnych pacjentek i pacjentek w ciąży o czasie i od kobiet po porodzie pochwowym (pacjentek po urodzeniu dziecka). Komórki hodowano w hodowli w postaci pojedynczej warstwy w minimalnym niezbędnym podłożu z 10% donorowej surowicy cielęcej. W doświadczeniach komórki te umieszczono na szkiełkach przykrywkowych w stanie półkonfluentnym i nasycano Fluo-4 w roztworze soli buforowanym fosforanem, zawierającej 10 mM HEPES przez 30 min. Początkowo roztwór soli buforowany fosforanami, zawierającą 10 mM HEPES (bufor HEPES) pompowano do komory obserwacyjnej przez 30 sekund, następnie KCl w tym samym buforze pompowano przez 60 sekund, a potem bufor HEPES przez 30 sekund. Następnie dodano 10 ng PDGF/ml w buforze HEPES. Fluorescencję monitorowano w sposób ciągły przez 3 minuty. W innych doświadczeniach PDGF zastąpiono 100 μg HS6. Nie obserwowano zmiany fluorescencji w hodowlach od nie ciężarnych pacjentek i pacjentek w ciąży o czasie. W hodowlach uzyskanych od pacjentek bezpośrednio po porodzie, wszystkie związki - KCl, PDGF i HS6 - wywoływały przejściowy 4 - 8-krotny wzrost fluorescencji, co wskazuje na przejściowy wzrost wewnątrzkomórkowego Ca²⁺. Świadczy to o tym, że komórki w hodowlach od pacjentek po porodzie są pobudzane przez HS6. Zakłada się, że działanie to jest ważne w czasie porodu dla ostatecznego przygotowania szyjki macicy do porodu.

Test 3. Test kliniczny z solą sodową dalteparyny (Fragmin®)

Oceniono dane kliniczne dotyczące wyników porodów u pierworódek. 14 pierworódek otrzymywało podskórnie Fragmin® (Pharmacia, Szwecja) w czasie ciąży w związku ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Podawana profilaktycznie dawka wynosiła 5000 IE na dobę u wszystkich poza 4 kobietami, które otrzymywały 2500 IE na dobę. Osiem z tych kobiet leczono przez ponad 12 tygodni (12 - 28 tygodni), a 6 z nich przez 1 - 6 tygodni. Jako odpowiednie pacjentki kontrolne badano kolejne 13 pierworódek nie otrzymujących Fragminu®, które rodziły w tej samej klinice bezpośrednio po kobietach objętych badaniem. Punkty końcowe obejmowały czas porodu (w godzinach) i liczbę cięć cesarskich i wskazania do ich wykonania.

Nie obserwowano żadnej korelacji między czasem trwania leczenia i czasem trwania porodu. Czas porodu wynosił 5,8 ± 2,6 godzin w grupie pacjentek i 14,0 ± 6,3 godzin w grupie kontrolnej (p < 0,001). Ponadto wolny postęp porodu zgłaszano u 6 z 13 kobiet w grupie kontrolnej w porównaniu z 1 z 14 kobiet w grupie leczonej.

Liczba cięć cesarskich wynosiła 3 w każdej grupie, ale wskazania w grupie badanej obejmowały stan przedrzucawkowy, niedostateczne leczenie przeciwbólowe i podejrzenie zamartwicy płodu.

PL 206 458 B1

W grupie kontrolnej głównym wskazaniem we wszystkich 3 przypadkach był o zahamowanie porodu, u dwóch kobiet w połączeniu z podejrzeniem zamartwicy pł odu.

Czas porodu badano także u 21 wieloródek, które otrzymywały Fragmin® jak wyżej, w porównaniu z 9 kontrolami. Czas porodu w grupie otrzymującej Fragmin® wynosił 3,5 ± 2,9 godzin (0,5 - 8) w porównaniu z 5,9 ± 2,1 godzinami (3 - 12) w grupie kontrolnej (p < 0,05). Czas porodu był zatem znacznie krótszy w grupie leczonej.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie siarczanowanych glikozoaminoglikanów wybranych z grupy obejmującej siarczany heparanu, depolimeryzowane siarczany heparanu, siarczany dermatanu, depolimeryzowane siarczany dermatanu, heparyny o niskiej masie cząsteczkowej i depolimeryzowane heparyny, o działaniu przeciwkrzepliwym 100 jednostek BP/mg lub słabszym do wytwarzania preparatu farmaceutycznego do profilaktyki lub leczenia powolnego postępu terminowego porodu.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1 glikozoaminoglikanu o działaniu przeciwkrzepliwym 30 jednostek BP/mg lub słabszym.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2 heparyn o niskiej masie cząsteczkowej lub depolimeryzowanych heparyn, o średniej masie cząsteczkowej poniżej 10000.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2 heparyn o niskiej masie cząsteczkowej lub depolimeryzowanych heparyn o średniej masie cząsteczkowej poniżej 6000.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1-4 glikozoaminoglikanu w połączeniu z oksytocyną.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 1-5 glikozoaminoglikanów do wytwarzania preparatu farmaceutycznego do podawania miejscowego.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 1-5 glikozoaminoglikanów do wytwarzania preparatu farmaceutycznego do podawania pozajelitowego.

   Departament Wydawnictw UP RP