PL206701B1 - Immunoglobulinowe białko fuzyjne, kodujący je kwas nukleinowy, replikujący wektor ekspresji zawierający taki kwas nukleinowy, eukariotyczna komórka gospodarza zawierająca taki wektor ekspresji oraz sposób zwiększania ekspresji takiego białka fuzyjnego - Google Patents

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 366981 (22) Data zgłoszenia: 07.03.2002 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

07.03.2002, PCT/US02/007011 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

19.09.2002,WO02/072605 (11) 206701 (13) B1 (51) Int.Cl.

C07K 16/46 (2006.01) C07K 16/30 (2006.01) C12N 15/09 (2006.01)

Immunoglobulinowe białko fuzyjne, kodujący je kwas nukleinowy, replikujący wektor ekspresji zawierający taki kwas nukleinowy, eukariotyczna komórka gospodarza zawierająca taki wektor ekspresji oraz sposób zwiększania ekspresji takiego białka fuzyjnego

	(73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo:	MERCK PATENT GMBH, Darmstadt, DE
07.03.2001, US, 60/274,096	(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 07.02.2005 BUP 03/05	STEPHEN D. GILLIES, Carlisle, US JEFFREY WAY, Cambridge, US KIN-MING LO, Lexington, US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.09.2010 WUP 09/10	(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Łukaszyk Szymon Kancelaria Patentowa Łukaszyk

PL 206 701 B1

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy ogólnie sposobów i kompozycji dotyczących przeciwciał z jednostkami pochodzącymi z dwóch lub większej liczby izotypów oraz pochodzących od nich białek fuzyjnych, w tym białek zawierających jednostkę przeciwciała ze zmienioną funkcją efektorową, zwiększoną ekspresją białka i/lub obniżonym stopniem oligomeryzacji. Wynalazek dotyczy szczególnie przeciwciał i białek fuzyjnych, w których region zawiasowy pochodzi od jednego izotypu, a domena CH2 pochodzi od innego izotypu.

Zgłoszenie korzysta z pierwszeństwa ze zgłoszenia U.S. 60/274,096 z dnia 7 marca 2001, które włączone jest do niniejszego opisu poprzez odesłanie.

Wydajność ekspresji białek z komórek opracowanych genetycznie jest ważnym problemem komercyjnym. W celu zapewnienia właściwego formowania i glikozylacji, niektóre komercyjnie ważne białka są wytwarzane korzystnie z komórek eukariotycznych, takich jak komórki ssaków, roślin czy drożdży. Ze względu na wysokie koszty utrzymania ogromnych kultur komórek eukariotycznych, białka wytwarzane w taki sposób są drogie w produkcji, dlatego też istnieje praktyczna potrzeba maksymalizacji poziomu ekspresji białek z komórek eukariotycznych.

Pokrewnym problemem jest to, iż białka terapeutyczne wytwarzane z komórek eukariotycznych muszą ulegać ekspresji we właściwym stanie konformacyjnym. Generalnie mechanizmy transkrypcji i translacji zapewniają, że genetycznie opracowana komórka będzie wytwarzała białko, którego sekwencja jest określona przez kwas nukleinowy kodujący to białko. Po transkrypcji i translacji białko może jednak kształtować się niewłaściwie i może ulegać rozkładowi. Alternatywnie, białko może być wytwarzane w postaci agregatów w taki sposób, że jego aktywność jest ograniczona. Nawet jeśli białko w formie agregatu jest aktywne, może nie być ono farmakologicznie tolerowane z powodu zwiększonej immunogeniczności w porównaniu do białka nie tworzącego agregatów. Dlatego też preparat farmakologicznie tolerowanych białek powinien być ogólnie pozbawiony agregatów białek.

Ilość białka, które ulega ekspresji z genetycznie opracowanej komórki eukariotycznej, jest funkcją poziomu transkrypcji kodującego genu, wydajności procesu splatania (ang. splicing) mRNA i wydajności transportu z jądra oraz wydajności translacji. Rola, jaką odgrywają te procesy w ekspresji białka jest wystarczająco dobrze poznana, tak że każdy ekspert w dziedzinie inżynierii genetycznej i ekspresji biał ek moż e ogólnie wbudować wł a ś ciwą sekwencję kwasu nukleinowego w model konstrukcji ekspresyjnej o wydajnej transkrypcji, splicingu, eksportu mRNA oraz translacji.

Jednakże ilość właściwie ukształtowanego, nietworzącego agregatów białka, które jest wytwarzane z komórek eukariotycznych, jest także funkcją sekwencji aminokwasów białka, jak również sekwencji kwasu nukleinowego, która określa transkrypcje, splicing, eksport mRNA, translację i modyfikację po-translacyjną. Na przykład uważa się, że znacząca frakcja białek syntetyzowanych w komórce jest degradowana. Cechy białka, które określają, czy białko powinno, czy nie powinno być degradowane są współcześnie przedmiotem intensywnych badań, ale obecnie nie można przewidzieć wydajności kształtowania się białka, degradacji, czy tworzenia agregatów poprzez proste badanie sekwencji białka. Niektóre naturalnie występujące białka kształtują się wydajnie, są oporne na proteolizę oraz nie tworzą agregatów. Inne białka z kolei nie kształtują się wydajnie, są gwałtownie degradowane i tworzą agregaty.

Przeciwciała i sztuczne białka zawierające fragment przeciwciała, białka fuzyjnego zakończonego przeciwciałem lub białka fuzyjne Ig są użyteczne do różnych celów związanych z selektywnymi właściwościami zmiennych domen przeciwciała jak i zdolności stałych regionów do wiązania różnych innych białek. Preparaty przeciwciał i białek fuzyjnych przeciwciał są szczególnie korzystne kiedy są one właściwie ukształtowane i nie tworzą agregatów. Dlatego istnieje zapotrzebowanie na praktyczne sposoby i kompozycje wytwarzania preparatów przeciwciał i białek fuzyjnych przeciwciał o obniżonym stopniu tworzenia agregatów.

Przeciwciała i białka fuzyjne przeciwciał są również korzystne ponieważ ich zdolność do wiązania z innymi białkami umożliwia im, na przykład, wywoływanie specyficznych funkcji efektorowych. W niektórych) przypadkach specyficzne efektorowe funkcje s ą pożądane, ale czę sto korzystna jest utrata funkcji efektorowych. Składnik białka fuzyjnego będący przeciwciałem może być zmieniony, aby zredukować bądź wykluczyć funkcje efektorowe poprzez wykorzystanie zmodyfikowanego przeciwciała. Preparaty przeciwciała i białka fuzyjnego przeciwciała są także korzystne, gdy są one zmodyfikowane w sposób zmieniający ich funkcyjność. Istnieje zatem zapotrzebowanie na praktyczne sposoby

PL 206 701 B1 i kompozycje wytwarzania zmodyfikowanych przeciwciał i białek fuzyjnych przeciwciał o zmienionych funkcjach efektorowych.

Leki białkowe mogą być degradowane przez proteazy w taki sposób, że ich dostępność i właściwości farmakokinetyczne są poniżej poziomu optymalnego. Istnieje więc zapotrzebowanie na leki białkowe, które posiadają praktyczne właściwości pewnych białek, a przy tym większą oporność na proteazę.

Wynalazek dotyczy korzystnych sposobów i kompozycji do wytwarzania całych przeciwciał, immunocytokin, immunofuzyn, immunoligandów oraz innych białek fuzyjnych przeciwciała i Fc, które polepszają ekspresję, właściwą oligomeryzację, oczyszczanie oraz oporność na proteazę pożądanego białka fuzyjnego opcjonalnie ze zmodyfikowanymi, połączonymi lub obniżonymi funkcjami efektorowymi Fc. W szczególności wynalazek dostarcza jednostek przeciwciał z hybrydą izotypów, opcjonalnie z zastosowaniem składników zmutowanej Ig do użycia w całym przeciwciele i w białkach fuzyjnych zawierających jednostkę przeciwciała.

Istotą wynalazku jest immunoglobulinowe białko fuzyjne będące hybrydą izotypów składające się z jednostki immunoglobuliny połączonej z jednostką nie będącą immunoglobuliną, które charakteryzuje się tym, że jednostka immunoglobuliny zawiera pierwszą domenę z pierwszego izotypu przeciwciała i drugą domenę z drugiego izotypu przeciwciała, przy czym pierwsza domena z pierwszego izotypu przeciwciała jest regionem zawiasowym lgG1, zaś druga domena z drugiego izotypu przeciwciała jest domeną lgG2 CH2 i CH3 lub domeną lgG4.

W korzystnej realizacji wynalazku cysteina leżąca najbliż ej koń ca N regionu zawiasowego lgG1 jest zmutowana.

Miejsce połączenia pomiędzy jednostką Ig i jednostką niebędącą Ig w białku fuzyjnym według wynalazku jest korzystnie zmutowane natomiast jednostka niebędąca immunoglobuliną jest korzystnie połączona do końca C jednostki immunoglobuliny. Dodatkowo miejsce połączenia pomiędzy jednostką Ig i jednostką niebędącą Ig jest zmutowane poprzez korzystną zmianę lizyny na końcu C jednostki immunoglobuliny na alaninę lub leucynę.

W korzystnym przykładzie realizacji wynalazku jednostka immunoglobuliny zawiera domenę CH1, przy czym szczególnie korzystnie jest, gdy jednostka immunoglobuliny zawiera region zawiasowy lgG1, domenę CH1, CH2 i CH3 lgG2 i miejsce wiążące antygen.

Korzystną strukturą białka według wynalazku jest struktura X - Fc, Fc - X lub X - Fc - Y, gdzie Fc oznacza jednostkę immunoglobuliny, a X, Y oznacza jednostkę niebędącą immunoglobuliną.

Jednostka niebędąca immunoglobuliną jest w korzystnym przykładzie białka fuzyjnego cytokiną lub cząsteczką erytropoetyny, przy czym szczególnie korzystne jest, gdy cytokina jest przyłączona do końca C jednostki immunoglobuliny zawierającej regiony V, które rozpoznają antygen EPCAM (przeciwciało KS) oraz region CH1 - CH2 - CH3 lgG2 i region zawiasowy lgG1 zmutowany z cysteiny na serynę w miejscu najbliższym końcowi N, przy czym miejsce połączenia pomiędzy jednostką immunoglobuliny, a jednostką niebędącą immunoglobuliną jest zmutowane poprzez zmianę lizyny C końca jednostki immunoglobuliny na alaninę.

Istotą wynalazku jest także kwas nukleinowy kodujący immunoglobulinowe białko fuzyjne według wynalazku, replikujący wektor ekspresji zawierający taki kwas nukleinowy oraz eukariotyczna komórka gospodarza zawierająca wektor ekspresji według wynalazku.

Istotą wynalazku jest wreszcie sposób zwiększania ekspresji immunoglobulinowego białka fuzyjnego specyficznego izotypu Ig typu dzikiego mającego niepoprawną strukturę z powodu niewłaściwie utworzonego wiązania disulfidowego w czasie homomodernizacji ciężkiego łańcucha przeprowadzany w warunkach in vitro. Sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje zastąpienie regionu zawiasowego immunoglobulinowego białka fuzyjnego regionem zawiasowym z innego izotypu Ig mającego zredukowaną liczbę reszt cysteinowych, prowadzące do utworzenia białka fuzyjnego będącego hybrydą izotypów zdefiniowanego w dowolnym z zastrz. 1-10.

Hybryda izotypów IgG/lgG

Immunoglobulinowe białka fuzyjne mają korzystnie obniżoną funkcję efektorową i ulepszone formowanie. Takie białka fuzyjne są szczególnie korzystne, gdy jednostka Ig służy do zwiększenia ekspresji i polepszenia okresu półtrwania w surowicy, ale wówczas, kiedy nie są potrzebne immunologiczne funkcje jednostki Ig.

W takich realizacjach białko fuzyjne korzystnie zawiera domeny CH1, CH2 i/lub CH3 z lgG2 lub lgG4 połączone zawiasowym regionem z IgG1 lub zawiasowym regionem z lgG4, drugi region zawiasowy

PL 206 701 B1 korzystnie zawiera mutację, która polepsza właściwe powstawanie wiązań disulfidowych pomiędzy jednostkami pochodzącymi od ciężkich łańcuchów (Angal S, et al. Mol Immunol 1993 Jan;30(1): 105-8). Białka fuzyjne według tej realizacji ułatwiają ekspresję na wysokim poziomie i polepszają właściwe formowania całego przeciwciała i białek fuzyjnych Ig zawierających regiony Fc.

W bardziej korzystnej realizacji, białka fuzyjne także zawierają jedną lub większą liczbę mutacji w jednostce Ig. Na przykł ad jednostka Ig jest zmutowana w celu dalszej redukcji jakiejkolwiek pozostałej funkcji efektorowej, która nie jest pożądana. Na przykład zmutowane jest wiążące miejsce C1q w domenie CH2 w lgG2. Przykł adowo zwykł a lgG4 nie wiąże dopeł niacza, poniewa ż zawiera serynę zamiast odpowiadającej proliny w pozycji 331 w IgG1 (nomenklatura Eu) (Tao, MA et al. (1993) J.Exp.Med. 178:661-667; Brekke, OH et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:2542-2547); podobna mutacja w lgG2 redukuje wią zanie C1q. Inne reszty, które jak wiadomo biorą udział w wią zaniu C1q mogą być zmodyfikowane w taki sposób jak reszty w pozycjach 318, 320, 322 i 297 (Duncan AR (1988) Naturę: 322: 738-740), co skutkuje zmniejszeniem się wiązania C1q.

Immunoglobulinowe białka fuzyjne według wynalazku mogą także zawierać mutację w regionie zawiasowym. Na przykład, gdy występuje także lekki łańcuch przeciwciała, korzystna jest forma regionu zawiasowego IgG1 z resztą cysteiny w zwykłej ilości w jej zwykłych pozycjach. Jednakże w przypadkach, gdy lekki łańcuch przeciwciała nie występuje jako osobny łańcuch peptydowy, korzystny jest obszar zawiasowy IgG1, w którym pierwsza cysteina jest zmutowana na inną resztę. Na przykład korzystne jest wykorzystanie takiego zmutowanego regionu w białkach typu Fc-X, typu X-Fc i w przeciwciałach złożonych z pojedynczych łańcuchów, w których region zmienny lekkiego łańcucha jest przyłączony do ciężkiego łańcucha za pomocą łącznika polipetydowego. W tym kontekście pierwsza cysteina w regionie zawiasowym IgG1 jest korzystnie zmutowana na serynę.

W drugiej klasie realizacji wykorzystują cych zmutowany region zawiasowy, stosowana jest zmutowana forma regionu zawiasowego lgG4, która umożliwia wydajne tworzenie wiązania disulfidowego między dwoma ciężkimi łańcuchami.

W trzeciej klasie realizacji wykorzystują cych zmutowany region zawiasowy wykorzystana została, w przeciwciele będącym hybrydą izotypów lub w białku fuzyjnym Ig, zmutowana forma regionu zawiasowego lgG2, w której każda z dwóch pierwszych cystein jest zmutowana na inny aminokwas. Korzystne jest także stosowanie takiego zmutowanego regionu zawiasowego w przeciwciele lub białku fuzyjnym Ig, który całkowicie pochodzi z lgG2. Na przykład, zmodyfikowany region zawiasowy lgG2 o sekwencji ERKSSVECPPCP (SEQ ID NO: 1) zastosowany jest w kontekście przeciwciała lub białka fuzyjnego Ig. Kolejny korzystny typ regionu zawiasowego jest hybrydą pomiędzy obszarem zawiasowym lgG2, a obszarem zawiasowym lgG4, z taką sekwencją jak ESKYG-VECPPCP (SEQ ID NO: 2), w której pięć aminokwasów przed myślnikiem pochodzi z lgG4, a pozostałe aminokwasy z lgG2. Realizacje te są szczególnie korzystne w kontekście przeciwciał i białek fuzyjnych ulegających ekspresji i wydzielanych przez komórki eukariotyczne ponieważ rzeczone realizacje obszarów zawiasowych zapoczątkowują właściwe formowanie tych białek. Realizacje te mogą zostać zastosowane jako alternatywa do regionu zawiasowego IgG1. Kluczową cechą realizacji regionów zawiasowych przeciwciała jest to, iż posiadają one tylko dwie reszty cysteiny.

Jeszcze jedna klasa realizacji obejmuje mutacje w jednostce Ig białek fuzyjnych składających się z hybrydy izotypów Ig, w miejscu połączenia pomiędzy jednostką Ig a jednostką innego pochodzenia. W jednej realizacji, zmiany w sekwencji aminokwasów w białku fuzyjnym występują korzystnie w połączeniu jednostki Ig i jednostki innego pochodzenia i korzystnie leżą w obrę bie 10 aminokwasów w miejscu połączenia. Bardziej korzystnie, zmiany aminokwasów pociągają za sobą zmianę C-terminalnej lizyny w jednostce przeciwciała na hydrofobowy aminokwas taki jak alanina czy leucyna.

Alternatywna realizacja jest praktyczna w okolicznościach, w których pożądane jest skrócenie okresu półtrwania białka fuzyjnego. IgG3 ma względnie krótki okres półtrwania w porównaniu do innych izotypów IgG ze względu na modyfikację w wiążącym miejscu FcRn/FcRp zlokalizowanego w domenie CH3(H435 do R) (patrz Ward, ES. i Gheti, V (1995) Therapeutic Immunology 2:77-94). Białko fuzyjne z CH2 i CH3 domenami IgG3 może być zastosowane, gdy pożądany jest krótki okres narażenia. Według tej realizacji, praktyczne jest zastosowanie CH3 domeny IgG3 w połączeniu z regionem zawiasowym IgG1; tego rodzaju białko fuzyjne IgG1 (region zawiasowy)-lgG3(CH3) posiada lepszą ekspresję i właściwości formowania w porównaniu z białkiem fuzyjnym zawierającym obszar zawiasowy IgG3 i CH3 domenę IgG3.

W bardziej korzystnej realizacji białka fuzyjnego lg zaprojektowanej tak, aby posiadało krótki czas półtrwania w surowicy, ograniczono funkcje efektorowe oraz wydajne formowanie, zastosowano

PL 206 701 B1 hybrydę regionów Ig, w której region zawiasowy pochodzi z IgG1, CH2 domena pochodzi z lgG2 i CH3 domena pochodzi z IgG3.

Hybryda izotypów IgG/lgA

Wynalazek dotyczy również białka fuzyjnego będącego hybrydą izotypów Ig o ulepszonej oporności na proteazę i ulepszonym okresie półtrwania w surowicy. Realizacja ta jest szczególnie korzystna w sytuacjach, gdy białko fuzyjne Ig jest narażone na środowisko bogate w proteazy, takie jak jelito lub inna tkanka śluzowa, na przykład podczas doustnego podawania leku zawierającego białko fuzyjne Ig. Według tej realizacji dostarczane jest białko fuzyjne Ig zawierające fragmenty stałych regionów IgG i IgA. W korzystnej realizacji zastosowano region zawiasowy z lgA1 oraz domeny CH2 i CH3 z IgG. W konkretnej korzystnej realizacji, segmenty aminokwasów kodujące miejsca glikozylacji przez atomy O w Fc regionie IgA są wszczepione w Fc region IgG.

Hybryda izotypów IgG/IgM

Kolejna realizacja wynalazku dostarcza przeciwciał hybrydy izotypów i białek fuzyjnych Ig z cechami oligomeryzacji IgA lub IgM, ale z funkcjami efektorowymi charakterystycznymi dla IgG. Na przykład, opracowano białko zawierające region zawiasowy i domenę CH2 z IgG1 lub lgG3 połączone z domeną CH3 i CH4 z IgM. W bardziej korzystnej realizacji, opracowano przeciwciało zawierające zmienne regiony ciężkiego i lekkiego łańcucha i także zawierające region zawiasowy oraz CH2 z IgG połączone z domeną CH3 i CH4 z IgM. W alternatywnej, bardziej korzystnej realizacji, opracowano białko fuzyjne typu X-Fc, w którym X jest korzystnie ligandem dla receptora powierzchniowego komórki, a jednostka Fc zawiera domenę CH3 i CH4 z IgM. Cząsteczka taka łączy funkcję efektorową ADCC IgG z wysoką wartościowością IgM.

W korzystnej realizacji hybrydy izotypów z zastosowaniem domeny CH4 z IgM lub IgA, C-terminalna cysteina w domenie CH4 jest zmutowana, aby zablokować disulfidowe wiązanie z łańcuchem J. Redukuje to wydzielanie białka fuzyjnego Ig do jelita.

Korzystne jednostki niebędące jednostkami Ig

Korzystnym typem jednostek nie będących jednostkami Ig w białkach fuzyjnych według wynalazku jest białko lub jednostka, która jest normalnie pozabłonowa, kiedy nie jest częścią białka fuzyjnego Ig. Na przykład hormon, cytokina, chemokina, wydzielany enzym lub pozabłonowa część transmembranowego receptora.

W korzystnej realizacji składnik niebędący immunoglobuliną jest takim białkiem jak białko przeciwko otyłości. Na przykład składnikiem niebędącym immunoglobuliną jest leptyna, CNTF, CLC/CLF-1 lub fragment Acrp30.

W jeszcze kolejnej korzystnej realizacji składnikiem niebędącym immunoglobuliną jest białko takie jak erytropoetyna czy EPO.

W alternatywnej realizacji, składnikiem białka fuzyjnego, który nie jest immunoglobuliną, jest hormon. Na przykład składnikiem niebędącym immunoglobuliną jest insulina, hormon wzrostu albo peptyd 1 glukagonopodobny (GLP-1).

W kolejnej realizacji składnik białka fuzyjnego, który nie jest immunoglobuliną, jest cytokiną. Termin „cytokina” oznacza według wynalazku naturalnie występujące lub rekombinowane białka, ich analogi oraz ich fragmenty, które wywołują specyficzną odpowiedź w komórce, która posiada receptor dla tej cytokiny. Korzystnie cytokinami są białka, które mogą być wytwarzane i wydzielane przez komórkę. Korzystnie cytokiny obejmują interleukiny takie jak interleukinę-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 i IL-18, czynniki krwiotwórcze takie jak czynnik stymulujący wzrost koloni granulocytów i makrofagów (GM-CSF), G-CSF i erytropoetynę, czynniki śmierci nowotworu (TNF - tumor necrosis factor), takie jak TNFa, limfokiny, takie jak limfotoksyna, regulatory procesów metabolicznych takie jak leptyna, interferony, takie jak interferon α, interferon β i interferon γ i chemokiny. Korzystnie białko fuzyjne Ig-cytokina według wynalazku wykazuje biologiczną aktywność cytokiny.

W alternatywnej korzystnej realizacji, składnikiem białka fuzyjnego niebędącym immunoglobuliną, jest białko wiążące ligand o aktywności biologicznej. Takie białka wiążące ligand mogą, na przykład, (1) blokować oddziaływanie receptor - ligand na powierzchni komórki; lub (2) znosić aktywność biologiczną cząsteczki (na przykład cytokiny) w płynnej fazie krwi, tym samym zapobiegając osiągnięciu przez nią celu znajdującego się na błonie. Korzystne białka wiążące ligandy obejmują CD4, CTLA-4, receptory TNF, receptory interleukiny takie jak receptor dla IL-1 albo receptor dla IL-4. Korzystnie białko fuzyjne typu przeciwciało-receptor według wynalazku wykazuje biologiczną aktywność białka wiążącego ligand. Jedna wysoce korzystna realizacja obejmuje pozabłonowy fragment domeny receptora

PL 206 701 B1

TNF stosowany w leku białkowym Enbrel, w postaci TNFR-obszar zawiasowy-CH2-CH3 lub region zawiasowy-CH2-CH3-TNFR, w których domeny CH2 i CH3 pochodzą z lgG2 lub lgG4 i każdy z dwóch zawiasowych regionów w dimerycznym Fc posiada trzy lub mniejszą liczbę cystein, a bardziej korzystnie dwie lub mniejszą liczbę cystein.

Kolejny rodzaj korzystnego białka wiążącego ligand ma zdolność wiązania z małymi cząsteczkami bardziej niż z białkami. Na przykład, korzystnie łączy się awidynę z jednostką będącą hybrydą izotypów Ig, taką jak przeciwciało. Połączenie awidyny z hybrydą izotypów przeciwciała jest następnie podawane ssakowi takiemu jak mysz lub człowiek i ulega koncentracji w tkance docelowej w organizmie, jak zostało to określone przez specyficzność regionu V przeciwciała. Po tym jak białko fuzyjne przeciwciało-awidyna zostanie dostatecznie usunięte z organizmu, podaje się połączenie biotyny i cząsteczki terapeutycznej. Połączenie biotyny ulega koncentracji w docelowej tkance za pomocą wiązania z awidyną, co skutkuje zmniejszeniem efektów ubocznych, które mogłyby powstać w wyniku koncentracji cząsteczki terapeutycznej w innej niż docelowa tkance. Strategia ta może być stosowana z innymi parami ligand/biał ko wiążące ligand.

Kolejnym rodzajem korzystnej jednostki, która nie jest immunoglobuliną, jest enzym. Na przykład, enzym z określoną specyficznością może być połączony z jednostką będącą hybrydą izotypów Ig, taką jak przeciwciało. Połączenie hybrydy izotypów przeciwciała i enzymu jest następnie podawane ssakowi takiemu jak mysz lub człowiek i ulega koncentracji w tkance docelowej, jak zostało to określone przez specyficzność regionu V przeciwciała. W jednym korzystnym sposobie leczenia według wynalazku, po tym jak białko fuzyjne przeciwciało-enzym zostanie dostatecznie usunięte z organizmu, podaje się prolek, który może być transformowany przez enzym do jego aktywnej formy. Aktywowany lek ulega koncentracji w tkance docelowej, co skutkuje zmniejszeniem efektów ubocznych, które mogłyby powstać w wyniku koncentracji aktywnej cząsteczki leku w innej niż docelowa tkance. W wysoce korzystnej odmianie tej realizacji, aktywowany lek jest lekiem przeciwrakowym, takim jak czynnik cytotoksyczny. W alternatywnej wysoce korzystnej realizacji, sam enzym ma aktywność terapeutyczną. Na przykład RNAza, taka jak Onconaza jest sparowana z białkiem fuzyjnym hybrydy izotypów przeciwciał i ukierunkowana na guz przez region V przeciwciał a.

Kwasy nukleinowe

Wynalazek dotyczy także nowych sekwencji kwasu nukleinowego, które umożliwiają ekspresję i wydzielanie białek fuzyjnych Ig i całych przeciwciał z hybrydą izotypów. Rozważane są również sposoby konstruowania takich kwasów nukleinowych.

Szczególnie korzystną cechą sekwencji genowych kodujących białka przeciwciała jest to, iż region zmienny, CH1, region zawiasowy, regiony CH2, CH3, oraz CH4 są kodowane przez osobne egzony. Cecha ta umożliwia opracowanie białek fuzyjnych hybrydy izotypów Ig poprzez „przetasowanie egzonów” (ang. „exon shuffling”) (Zuckier et al, Cancer Research [1998] 58:3905-8; Poon et al, J.BIol.Chem. [1995] 270:8571-7; Jefferis R, et al, Mol. Immunol. [1990] 27:1237-40; Chappel MS, Proc.Natl.Acad.Sci. USA. [1991] 88:9036-40; Senior BW, et al, Infect. Immun. [2000] 68:463-9).

W przypadku białek fuzyjnych Fc, cząsteczki kwasu nukleinowego mogą kodować białko w różnych konfiguracjach. W korzystnym zestawie realizacji, cząsteczka kwasu nukleinowego koduje, seryjnie w kierunku od 5' do 3', (i) sekwencję sygnałową, region Fc immunoglobuliny i sekwencje białka docelowego lub (ii) sekwencję sygnałową, docelowe białko i region Fc immunoglobuliny, albo (iii) sekwencję sygnałową, pierwsze białko docelowe, region Fc immunoglobuliny oraz drugie białko docelowe. Otrzymana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje zatem strukturę typu Fc-X, X-Fc lub X-Fc-Y, gdzie X i Y jest białkiem lub białkami docelowymi. Na przykład, X i Y mogą same być białkami docelowymi. Łączniki są opcjonalnie zakodowane między tymi jednostkami.

Podobnie, według wynalazku, kwasy nukleinowe kodujące całe białko fuzyjne przeciwciała Ig są przypisane do kodowania sekwencji sygnałowej w końcu N każdej jednostki ciężkiego łańcucha i każdej jednostki lekkiego łańcucha.

Kwas nukleinowy według wynalazku może być wbudowany jako funkcjonalna całość do replikującego wektora ekspresji, który może być wprowadzony do eukariotycznej komórki gospodarza odpowiedniego do produkcji białka fuzyjnego. Otrzymane białka fuzyjne Ig są wytwarzane z wydajnością i wydzielane z eukariotycznych komórek gospodarza. Wydzielane białka fuzyjne Ig mogą być zbierane z nośnika kultury bez przeprowadzania lizy eukariotycznych komórek gospodarza. Produkt białkowy może być badany w kierunku aktywności i/lub oczyszczany z zastosowaniem powszechnych odczynników koniecznych dla tego etapu, i/lub odczepiany od drugiego składnika połączenia, wszystkie procesy wykorzystują konwencjonalne techniki. Alternatywnie kwas nukleinowy według wynalazku, może

PL 206 701 B1 być wprowadzony do komórki bakteryjnej, a otrzymane białko fuzyjne Ig oczyszczane według standardowych technik.

Wynalazek może także służyć do ulepszania poziomu przeciwciał i białek fuzyjnych Ig wytwarzanych w komórkach, które może znaleźć zastosowanie w przypadku wytwarzania produktów w komórkach eukariotycznych, korzystnie komórkach ssaków. Na przykł ad wytwarzanie wyjś ciowego przeciwciała lub białka fuzyjnego Ig może być udoskonalone poprzez wymianę sekwencji kwasu nukleinowego kodującą domeny jednostki Ig na odpowiednie sekwencje kodujące domeny z izotypów innego przeciwciała, lub na sekwencje zmutowane, porównując poziom ekspresji poprzez analizowanie wytwarzania zmienionych białek, jak tutaj opisano oraz wybierając daną konstrukcję ekspresji, która daje najwyższe poziomy. Proces ten może być stosowany powtórnie. Jest on szczególnie korzystny przy wymianie regionów zawiasowych.

Leczenie

Wynalazek dotyczy także sposobów leczenia z zastosowaniem zmodyfikowanych przeciwciał i białek fuzyjnych Ig. Szczególnie odpowiednie według wynalazku są sposoby, które są zarówno wydajne i niedrogie tak samo jak białka, które są mniej immunogenne.

Powyższe i inne cele, cechy i zalety wynalazku staną się bardziej widoczne w nawiązaniu do następującego szczegółowego opisu, rysunku i zastrzeżeń.

Na rysunku fig 1 A-D przedstawiono schematyczne ilustracje hybrydy izotypów IgG stosowanych do sporządzania białek fuzyjnych według wynalazku; gruba linia przedstawia wiązania disulfidowe łączące reszty cysteiny; domeny przeciwciała są zaznaczone na rysunku fig. 1; domeny IgG1 są przedstawione jako czarne, domeny lgG2 są przedstawione jako białe, a domeny zmiennego i lekkiego łańcucha są przedstawione jako paskowane;

fig. 1A przedstawia izotyp IgG1; fig. 1B przedstawia izotyp lgG2;

fig. 1C przedstawia hybrydę lgG2 i obszaru zawiasowego IgG1 posiadającego mutacje w pozycji pierwszej cysteiny;

fig. 1D przedstawia y1(CH1-H) y2(CH2-CH3) hybrydę IgG;

rysunek fig. 2A-C przedstawia schematyczne ilustracje białka fuzyjnego Ig zawierającego regiony Fc, które zawierają hybrydę izotypów; „X” i „Y” mogą być dowolną jednostką niebędącą Ig;

fig. 2A przedstawia białko fuzyjne Ig w konfiguracji Fc-X, zawierające region zawiasowy z jednego izotypu przeciwciała i jednostkę Fc składającą się z domeny CH2 i CH3 z drugiego izotypu; w końcu C jednostki Fc znajduje się jednostka białka „X”;

fig. 2B przedstawia białko fuzyjne Ig w konfiguracji X-Fc, zawierające region zawiasowy z jednego izotypu przeciwciała i jednostkę Fc składającą się z domeny CH2 i CH3 z drugiego izotypu; w końcu N jednostki Fc znajduje się jednostka białka „X”;

fig. 2C przedstawia białko fuzyjne Ig w konfiguracji X-Fc-Y zawierające region zawiasowy z jednego izotypu przeciwciała i jednostkę Fc składającą się z domeny CH2 i CH3 z drugiego izotypu; w końcu N jednostki Fc znajduje się jednostka „X”, która może być dowolnym białkiem oraz w końcu C jednostki Fc znajduje się jednostka białka „Y”;

rysunek fig. 3A-D przedstawia schematyczne ilustracje białek fuzyjnych Ig, które zawierają zmienne regiony i które zawierają hybrydę izotypów; „X” i „Y” mogą być dowolną jednostką niebędącą Ig;

fig. 3A przedstawia białko fuzyjne Ig składające się z regionu zawiasowego pochodzącego od jednego izotypu przeciwciała (czarny), regionów CH1, CH2 i CHS pochodzących z innego izotypu; białko „X” niebędące Ig jest przyłączone na końcu C ciężkiego łańcucha;

fig. 3B przedstawia białko fuzyjne Ig składające się z regionu zawiasowego pochodzącego od jednego izotypu przeciwciała (czarny), regionów CH1, CH2 i CH3 pochodzących z innego izotypu; białko „X” niebędące Ig jest przyłączone na końcu C ciężkiego łańcucha; strzałki wskazują podzbiór możliwych miejsc mutacji w jednostce przeciwciała, jak zostało opisane;

fig. 3C przedstawia białko fuzyjne Ig składające się z regionu zawiasowego i region CH1 pochodzący od jednego typu przeciwciała (czarny), regionów CH2 i CH3 pochodzących z innego izotypu; białko „X” nie będące Ig jest przyłączone na końcu C ciężkiego łańcucha, rozgałęziona struktura wychodząca z regionu zawiasowego przedstawia jednostkę glikozylacji;

fig. 3D przedstawia białko fuzyjne Ig składające się z regionu zawiasowego pochodzącego od jednego izotypu przeciwciała (czarny), regionów CH1, CH2 i CH3 pochodzących z innego izotypu; białko „X” niebędące Ig jest przyłączone na końcu C ciężkiego łańcucha, drugie białko „Y” niebędące Ig jest przyłączone na końcu N lekkiego łańcucha;

PL 206 701 B1 fig. 3E przedstawia białko fuzyjne Ig składające się z regionu zawiasowego pochodzącego od jednego izotypu przeciwciała (czarny), regionów CH1, CH2 i CH3 pochodzących z innego izotypu; białko „X” niebędące Ig jest przyłączone na końcu C ciężkiego łańcucha, drugie białko „Y” niebędące Ig jest przyłączone na końcu N ciężkiego łańcucha;

rysunek fig. 4 jest schematyczną ilustracją białka fuzyjnego Ig, które składa się ze zmiennych regionów obejmujących wiele izotypów i które ma zwiększoną wartościowość w porównaniu do IgG; czarne owale przedstawiają domeny CH3 i CH4 z IgM; białe owale przedstawiają domeny CH1, zawiasową i CH2 z IgG; paskowane owale przedstawiają zmienne domeny i lekki łańcuch stałej domeny; grube linie przedstawiają wiązania disulfidowe normalnie występujące w IgG1; cienkie linie oznaczone literą 's' przedstawiają wiązania disulfidowe normalnie występujące w IgM.

Definicje

Termin „izotyp” według wynalazku oznacza klasę ciężkich łańcuchów stałego regionu (C) immunoglobuliny, która określa funkcjonalną aktywność przeciwciała. Istnieje pięć głównych klas obejmujących IgA, IgG, IgM, IgD i IgE.

Przez IgA rozumie się klasę immunoglobulin określoną przez ciężki łańcuch α.

Przez IgD rozumie się klasę immunoglobulin określoną przez ciężki łańcuch δ.

Przez IgE rozumie się klasę immunoglobulin określoną przez ciężki łańcuch ε.

Przez IgM rozumie się klasę immunoglobulin określoną przez ciężki łańcuch μ.

Przez IgG rozumie się klasę immunoglobulin określoną przez ciężki łańcuch γ.

Terminy „gamma1” lub „γ1” odnoszą się do ciężkiego łańcucha lub jego fragmentu pochodzącego z IgG1. Podobnie, „gamma2” lub „γ2” pochodzą z lgG2, i tak dalej.

Termin „allotyp”, według wynalazku oznacza polimorfizm alleli tego samego genu ciężkiego łańcucha immunoglobuliny. Wyznaczniki te występują u niektórych, ale nie wszystkich członków gatunków.

Termin „idiotyp”, według wynalazku oznacza wyznaczniki antygeniczności znajdujące się w zmiennych (V) regionach przeciwciał i odpowiadające szczególnie zmienionym genom VH i VL.

Termin „FcRn”, znany także jako FcRp oznacza według wynalazku noworodkowy jelitowy receptor transportujący, zawierający beta-2-mikroglobulinę, który reguluje usuwanie IgG i jest ważny ze względu na czas półtrwania przeciwciał w krążeniu in vivo.

Termin „FcyR”, według wynalazku oznacza receptory na powierzchni komórki, w tym FcyRI, RM, RIII, które wiążą się z fragmentem Fc cząsteczek IgG i wywołują komórkowe funkcje efektorowe. FcyR ulegają ekspresji na fagocytach, limfocytach B, komórkach NK i komórkach dendrycznych.

Terminy „IgG1” lub „lgG2” lub inne cząsteczki Ig według wynalazku, oznaczają całe przeciwciało w tym ciężki i lekki łańcuch lub ich fragmenty.

Termin „biwalentny monomer”, według wynalazku oznacza przeciwciało, połączenie Fc lub połączenie przeciwciała, które ulega normalnie dimeryzacji poprzez tworzenie wiązań disulfidowych, które występują w normalnym przeciwciele. Tworzenie się takich wiązań disulfidowych wynika powszechnie ze zdolności do migracji białka zawierającego Fc w denaturującym, nieredukującym żelu SDS w postaci osobnego pasma z pozorną masą cząsteczkową około dwukrotnie większą niż pozorna masa cząsteczkowa obserwowana w warunkach redukujących. Obecność biwalentnego monomeru wynika również z występowania piku w chromatografii sączenia molekularnego, który odpowiada właściwej masie cząsteczkowej. Inne sposoby określania rozmiaru białka mogą także być zastosowane do określenia występowania biwalentnych monomerów.

Termin „białko fuzyjne Ig”, według wynalazku oznacza białko fuzyjne, które zawiera część lub całe przeciwciało połączone z drugą jednostką, która korzystnie jest częścią lub całym białkiem nie będącym ani przeciwciałem, ani immunoglobuliną. Immunocytokiny, białka Fc-X, białka X-Fc i białka X-Fc-Y są przykładami białek fuzyjnych. Podobnie, białka fuzyjne, w których jednostka nie będąca Ig jest umiejscowiona pomiędzy dwiema jednostkami Ig lub domenami, tworząc rodzaj białka fuzyjnego Ig.

Termin „formowanie”, według wynalazku oznacza właściwe ukształtowanie białka i oligomeryzację do właściwego stanu polimerycznego. Formowanie może być obserwowane na wiele sposobów, znanych ze stanu techniki. W praktyce, właściwe formowanie białka, ze względu na wiązania disulfidowe, może być konwencjonalnie monitorowane poprzez porównanie migracji na nieredukującym i redukującym SDS żelu: jeśli dana forma białka tworzy wielokrotne pasma na nieredukującym żelu, ale tworzy pojedyncze pasmo na redukującym SDS żelu, można wywnioskować, że tylko jedno z pasm na nieredukującym SDS żelu jest właściwie uformowaną formą. Alternatywnie, chromatografia sączenia molekularnego może zostać zastosowana do rozróżnienia pojedynczych jednostek białek od

PL 206 701 B1 oligomerów wysokiego rzędu i agregatów, które mogą tworzyć się z niewłaściwego wiązania disulfidowego lub oddziaływań niekowalencyjnych.

Termin „domena” jednostki przeciwciała, według wynalazku oznacza strukturalną domenę, która odpowiada segmentowi aminokwasów kodowanemu przez pojedynczy egzon w genach przeciwciał u ludzi. Na przykład, stałymi domenami IgG są domeny CH1, region zawiasowy, CH2 i CH3. W niektórych przypadkach, domeny: zawiasowa i CH2 są kodowane przez ten sam egzon. W takich przypadkach, połączenie pomiędzy domenami zawiasową a CH2 jest określone przez zestawienie z innymi połączeniami rejon zawiasowy/CH2 (patrz Paul, op cit., strony 46-49).

Terminy „domena”, „białko”, „region” albo „cząsteczka”, według wynalazku oznaczają całą domenę, białko, region albo cząsteczkę, lub ich fragment, mutację lub ich sztucznie opracowaną formę, bądź formę zasadniczo pochodzącą od nich. Fragment, mutacja lub forma sztucznie otrzymana korzystnie mają właściwości funkcyjne, charakterystyczne dla całej domeny, białka, regionu albo cząsteczki.

Termin „zasadniczo pochodzące”, według wynalazku oznacza mające przynajmniej 95% swoich aminokwasów pochodzących od poszczególnej sekwencji naturalnie występującego białka lub domeny. Na przykład sekwencja, która zasadniczo pochodzi od CH2 domeny ludzkiej lgG2 jest przynajmniej w 95% identyczna z domeną CH2 ludzkiej lgG2 pod względem ustawienia aminokwasów.

Termin „zmodyfikowany region zawiasowy IgG1”, według wynalazku oznacza region zawiasowy z IgG1, w którym cysteina, korzystnie pierwsza cysteina jest zmutowana do innego aminokwasu. Cysteina ta normalnie tworzy wiązania disulfidowe z łańcuchem lekkim przeciwciała. Zmodyfikowany region zawiasowy IgG1 jest szczególnie praktyczny w białkach, w których albo brakuje łańcucha lekkiego, albo posiadają inną cysteinę, która może wiązać się z lekkim łańcuchem.

Termin „cząsteczka erytropoetyny” według wynalazku oznacza cząsteczkę, która ma zasadniczo taką samą strukturę i podobną sekwencję aminokwasów jak erytropoetyna występująca u kręgowców, opcjonalnie zawierającą mutację. Przykład 18 opisuje zastosowanie ludzkiej erytropoetyny bez mutacji i odmiany ludzkiej erytropoetyny z czterema mutacjami.

Wynalazek dotyczy sposobów i kompozycji do ulepszenia produkcji in vivo i in vitro białek fuzyjnych immunoglobulin. W szczególności wynalazek dotyczy praktycznych sposobów polepszenia ekspresji, agregacji i/lub właściwości kształtowania białek fuzyjnych immunoglobulin. Wynalazek jest w części oparty na nieoczekiwanej obserwacji, ż e białko fuzyjne immunoglobulin ulega ekspresji na wyższym poziomie, z mniejszymi problemami przy agregacji i/lub kształtowaniu, gdy zastosowano hybrydę immunoglobulin jako składnika połączenia zamiast immunoglobuliny typu dzikiego. Ulepszone właściwości wytwarzania białek fuzyjnych skojarzonych z hybrydami immunoglobulin nie są wymagane, gdyż immunoglobuliny typu dzikiego, takie jak IgG1 i lgG2 są uważane za dobrze ukształtowane białka, które ulegają wydajnej ekspresji zarówno in vivo jak i in vitro.

Odpowiednio, jeden aspekt wynalazku obejmuje sposoby i kompozycje korzystne do ekspresji białek fuzyjnych immunoglobulin, do których zalicza się jednostkę hybrydy immunoglobuliny (lub hybrydy Ig). Korzystne hybrydy immunoglobulin obejmują region zawiasowy IgG1 z CH2 i CH3 domenami lgG2. Inne korzystne hybrydy obejmują domeny IgG1 z lgG4.

Struktura przeciwciała

Przeciwciała są cząsteczkami o kształcie litery Y i składają się z dwóch ciężkich (heavy-H) i dwóch lekkich (light-L) łańcuchów. Każdy ciężki łańcuch jest połączony z lekkim łańcuchem wiązaniem disulfidowym i opiera się na kowalencyjnych i niekowalencyjnych oddziaływaniach właściwie zorientowanych łańcuchów względem siebie. Domena zmienna na końcu aminowym obu tych łańcuchów zawiera miejsce wiążące antygen i, łącznie z domenami CH1, określa koniec Fab cząsteczki.

Cztery łańcuchy wykorzystują hydrofobowe wiązanie pomiędzy ciężkimi łańcuchami i jedno lub większą liczbę wewnątrz łańcuchowych wiązań disulfidowych w celu stabilizacji kompleksu. Stąd cała immunoglobuliną jest biwalentna z dwoma identycznymi miejscami wiążącymi antygen. Pewne immunoglobuliny normalnie ulegają dodatkowej polimeryzacji, tak jak IgM i IgA.

Każdy łańcuch polipeptydowy posiada od dwóch do pięciu domen; lekkie łańcuchy zawierają dwie domeny, podczas gdy ciężkie łańcuchy zawierają cztery lub pięć. Pojedyncza domena na końcu aminowym każdego łańcucha jest różnie zakończona z powodu szerokiego zróżnicowania sekwencji, podczas gdy kilka domen na końcu C jest określanych jako stałe regiony. Regiony ciężkiego łańcucha są numerowane jako cm, region zawiasowy, CH2, CH3, CH4 i są odpowiedzialne za wiele ważnych funkcji przeciwciała w tym za wiązanie receptora Fc (FcR) i wiązania dopełniacza.

PL 206 701 B1

Istnieje pięć głównych izotypów klas regionów ciężkiego łańcucha klasyfikowanych jako IgA, IgG, IgD, IgE, IgM, każdy o charakterystycznej funkcji efektorowej (IgG jest osobno podzielona na cztery γ podklasy izotypów: γ1, γ2, γ3, γ4). Stałe regiony lekkiego łańcucha posiadają jedynie jedną domenę C, która może należeć do jednej z dwóch klas, Ck i Ολ, i która nie posiada żadnych atrybutów funkcjonalności (patrz W.E. Paul, red., 199S, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, N.Y.).

Wszystkie immunoglobuliny posiadają region zawiasowy zlokalizowany przy domenie CH1 w kierunku końca ich ciężkich łańcuchów, oddzielający regiony cząsteczki Fab i Fc. W większości przypadków, region zawiasowy umożliwia ogromy stopień elastyczności pomiędzy komponentami cząsteczki wiążącej antygen (koniec Fab) a komponentami oddziaływania z efektorem (Fc), łącząc w ten sposób dwa funkcjonalne elementy przeciwciała. W izotypach IgG wewnątrz cząsteczkowe wiązania disulfidowe tworzą się typowo w obrębie regionu zawiasowego, tworząc końcową tetrameryczną cząsteczkę.

Z wyjątkiem IgM, region zawiasowy jest zdominowany przez prolinę, serynę i treoninę, aminokwasy, które dążą do zapobieżenia tworzeniu drugorzędowej struktury i które jak się uważa, nadają regionowi zawiasowemu elastyczność. Izotop IgG1, często stosowany w białkach fuzyjnych, posiada dwa disulfidowe wiązania w regionie zawiasowym, które łączą ze sobą dwa łańcuchy ciężkie. W przeciwieństwie, izotyp lgG2 posiada cztery wiązania disulfidowe (rysunek fig. 1). Według wynalazku, rzeczone wiązania disulfidowe dążą do zapoczątkowania niewłaściwego uformowania przeciwciała i białek fuzyjnych Ig, jak wykazano w nieoczekiwanych odkryciach w przykładach.

Korzystne konfiguracje białek fuzyjnych Ig

Immunocytokiny są tylko jednym z przykładów terapii z zastosowaniem białek fuzyjnych ukierunkowanych na nowotwór, dla których sposoby i kompozycje według wynalazku znajdują zastosowanie. Inne cząsteczki toksyczne dla nowotworu mogą także być ukierunkowane na nowotwory przez złączenie ze specyficznymi dla nowotworu przeciwciałami według wynalazku. Dodatkowo, inne typy komórek chorobowych, takie jak komórki zainfekowane wirusem, mogą być atakowane przez białka fuzyjne przeciwciała według wynalazku.

Sposoby i kompozycje według wynalazku są także korzystne w kombinacji z zastosowaniem technologii Fc-X i X-Fc. Według wynalazku, zastosowanie hybrydy izotypów przeciwciała w białku fuzyjnym polepsza wytwarzanie i zbieranie docelowego białka lub polipeptydu, który jest połączony z fragmentem Fc immunoglobuliny. Dla białek fuzyjnych typu Fc-X, pojedynczy peptyd, poprzedzony przez fragment Fc według genu immunoglobuliny, jest częścią połączenia z docelowym białkiem poprzez koniec N. Białko fuzyjne ulega następnie ekspresji w komórce gospodarza, na przykład komórce ssaka, takiej, w której immunoglobuliną ulega ekspresji naturalnie. Fragment sygnałowy peptyd-Fc na końcu N składnika połączenia kieruje białko docelowe przez ścieżkę wydzielania, w taki sposób, że białko fuzyjne jest z łatwością wydzielane. Dodatkowo, zastosowanie fragmentu Fc, który normalnie jest zglikolizowany i o wysokim ładunku w obojętnym pH, umożliwia rozpuszczenie bardziej hydrofobowych białek. Ukierunkowanie białek fuzyjnych typu Fc-X na drodze wydzielania ułatwia także rozwiązanie problemów związanych z toksycznością białka wewnątrz komórki i umożliwia izolację stabilnych linii komórkowych. Wytwarzane białko fuzyjne jest łatwo poddawane analizie i oczyszczane, jako że jest bez problemu zbierane z pożywki w jego natywnej konformacji z zachowaniem zarówno biologicznej jak i enzymatycznej aktywności.

Wydajność tej technologii została przedstawiona przy użyciu Fc-leptyny i Fc-erytropoetyny. Niektóre z tych zalet są także przypisane białkom X-Fc.

Według wynalazku przykłady korzystnych połączeń jednostek przeciwciała obejmują białka typów Fc-X, X-Fc i X-Fc-Y. Białka takie zawierają region Fc z białkiem nie będącym przeciwciałem lub fragmentem białka przyłączonym na końcu N, końcu C lub na obu tych końcach. Jednym korzystnym efektem połączenia jest to, że okres półtrwania w surowicy składnika połączenia może być znacząco zwiększony. Drugim korzystnym efektem jest to, że 'X' może efektywnie ulegać dimeryzacji poprzez przyłączenie do Fc. Na przykład, Enbrel jest białkiem fuzyjnym składającym się z fragmentu receptora TNF i regionu Fc IgG1.

W niektórych realizacjach wynalazku, szczególnie korzystne jest opracowanie białka fuzyjnego z hybrydą izotypów o orientacji X-Fc. W tej konstrukcji białko docelowe znajduje się na końcu N białka fuzyjnego, a fragment Fc występuje za nim. Dla niektórych białek takie podejście może być praktyczne, na przykład z powierzchniową glikoproteiną komórek limfocytarnych (LHR) (patrz opis patentowy

US 5,428,130).

PL 206 701 B1

Według wynalazku, użyteczność białek fuzyjnych opartych na rekombinowanym przeciwciele, nawet lepsza niż zastosowanie osobno białka czy cytokiny, może być ograniczona przez ich gwałtowną eliminację in vivo z krążenia, gdyż białka fuzyjne przeciwciała mają znacząco niższy czas półtrwania in vivo w krążeniu niż wolne przeciwciało. Ten spadek okresu półtrwania w krążeniu jest prawdopodobnie wynikiem zwiększonego usuwania przez receptor Fc (FcR). Zostało udowodnione, że wyłączenie izotypu jest jednym mechanizmem, za pomocą którego cechy takie jak okres półtrwania mogą zostać zmienione. Ulepszenia w okresie półtrwania dwóch immunocytokin zostały przedstawione (Cancer Research 59(9):2159-66, 1999) poprzez zamianę izotypu regionu C ludzkiego łańcucha ciężkiego z IgGYl lub IgGY3 na lgGY4 - izotyp o obniżonym wiązaniu FcR. Oparte na lgG4 immunocytokiny i białka fuzyjne mają dziesięciokrotnie obniżone wiązanie FcR i zredukowane funkcje efektorowe receptora Fc takiego jak ADCC, ale w dalszym ciągu wykazują podobną lub lepszą efektywność w modelach mysich nowotworów niż te białka fuzyjne, które są oparte na oryginalnej IgGYl. Jednakże wynalazek dotyczy białek opartych na hybrydzie przeciwciał, która łączy funkcjonalne i strukturalne właściwości różnych typów przeciwciał w jednej cząsteczce.

Odpowiednio, dla pewnych zastosowań, izotyp lgG2 nadaje lepsze właściwości białkom fuzyjnym przeciwciała, gdyż izotyp lgG2 posiada znacznie obniżone wiązanie receptora Fc (Hulett et al., [1994] Adv. Immunol. 57:1127). Dla białek fuzyjnych całego przeciwciała jest czasem korzystnie zastosować izotyp γ2 w białkach fuzyjnych zawierających tylko region Fc. Uzasadnienie to jest identyczne w przypadku całego przeciwciała: często jest pożądane uniknięcie wiązania receptorów Fc, które jest osiągnięte przez regiony Fc pochodzące od innych izotypów.

Jednakże zastosowanie izotypu lgG2 w białku fuzyjnym ogólnie wywołuje pewien poziom niewłaściwego uformowania, jak zostało to opisane. Sposoby i kompozycje według wynalazku dostarczają białek fuzyjnych przeciwciała, które posiadają zmniejszone funkcje efektorowe izotypu lgG2, ale które nie posiadają właściwości tworzenia agregatów charakterystycznych dla tego izotypu.

Według wynalazku, nowe hybrydy izotypów przeciwciał i białek fuzyjnych wykazują lepszą ekspresję i polepszone formowanie niż te w przypadku białka fuzyjnego opartego na lgG2. Dodatkowo, hybryda izotypów przeciwciał i białek fuzyjnych może posiadać zwiększoną wydajność w terapeutykach, w przypadku których funkcje efektorowe Fc nie są pożądane.

Rodzaje regionów zawiasowych

Hybryda izotypów przeciwciała według wynalazku obejmuje także przeciwciała, w których region zawiasowy jest zmutowanym regionem zawiasowym, korzystnie regionem zawiasowym o zmniejszonej liczbie reszt cysteiny, na przykład zmodyfikowany region zawiasowy IgG1, w którym pierwsza cysteina jest zmutowana na serynę. Pierwsza cysteina w regionie zawiasowym IgG1 normalnie wiąże się z lekkim łańcuchem. W białku typu Fc-X lub X-Fc lub w każdym innym białku fuzyjnym przeciwciała z brakującym łańcuchem lekkim, cysteina ta nie spełnia swej naturalnej funkcji i dlatego może zostać zmutowana. Jednakże, według wynalazku, hybryda izotypów przeciwciała z regionem zawiasowym IgGI o brakującej pierwszej cysteinie i z CH1 domeną lgG2 może łączyć się z lekkim łańcuchem, gdyż lekki łańcuch normalnie tworzy wiązanie disulfidowe z cysteina w obrębie CH1 domeny lgG2.

Uważa się, że cztery cysteiny w regionie zawiasowym lgG2 tworzą między sobą wiązania disulfidowe.

Według wynalazku, cysteiny w regionie zawiasowym przeciwciała lub białka fuzyjnego Ig, które biorą udział w homodimeryzacji ciężkich łańcuchów (ciężki łańcuch - ciężki łańcuch), mogą wywierać znaczący wpływ na ekspresję i uformowanie białek fuzyjnych przeciwciała lub Ig. W szczególności, większa liczba cystein może prowadzić do niewłaściwego formowania białka fuzyjnego przeciwciała lub Ig, z powodu niewłaściwego tworzenia się wiązania disulfidowego. Wynalazek ujawnia zatem mutację jednej lub większej liczby cystein zaangażowanych w homodimeryzację ciężkich łańcuchów, która może spowodować polepszenie ekspresji lub uformowanie białka fuzyjnego przeciwciała albo Ig. W korzystnej realizacji, cysteina biorąca udział w homodimeryzacji ciężkich łańcuchów, może zostać zmutowana, korzystnie na serynę, alaninę, treoninę, prolinę, kwas glutaminowy, lizynę, histydynę, argininę, asparaginę, kwas asparaginowy, glicynę, metioninę, walinę, izoleucynę, leucynę, tyrozynę, fenyloalaninę, tryptofan lub selenocysteinę.

W szczególności korzystne jest zastosowanie regionu zawiasowego IgG1, który jest zmutowany w pierwszej, leżącej najbliżej końca N cysteinie. Przewagą tego regionu zawiasowego jest to, że jako jedyny posiada dwie cysteiny. Pierwsza cysteina w regionie zawiasowym IIgG1 normalnie tworzy wiązanie disulfidowe z cysteina w lekkim łańcuchu. Jednakże, w białkach fuzyjnych Ig o brakującym

PL 206 701 B1 łańcuchu lekkim, takich jak białka typu Fc-X, X-Fc i X-Fc-Y, cysteina leżąca najbliżej końca N w regionie zawiasowym IgG1 nie służy do tego celu i dlatego może zostać zmutowana (Lo et al. Protein Engineering 11:405-500 [1998]). Jak opisano w przykładach region zawiasowy IgG1 posiadający dwie cysteiny może także zostać użyty w całym przeciwciele lub białku fuzyjnym całego przeciwciała, w którym domena CH1 pochodzi z lgG2, gdyż CH1 domena lgG2 posiada cysteinę, która może tworzyć wiązanie disulfidowe z lekkim łańcuchem.

Receptory Fc

Cząsteczki IgG oddziałują z wieloma klasami receptorów błonowych, w tym z trzema klasami receptorów Fcy (FcyR) specyficznych dla klasy przeciwciał IgG, mianowicie FcyRI, FcyRII i FcyRIII. Receptory te są odpowiedzialne za wychwyt kompleksów antygen-przeciwciało. Miejsce wiążące receptor Fc na Fc znajduje się na domenie CH2 w pobliżu regionu zawiasowego i uważa się, że wiązanie się regionów V z antygenem wspomaga przesunięcie regionu stałego łańcucha lekkiego ze sterycznie zablokowanego regionu zawiasowego. W ten sposób przeciwciała wiązane przez antygen są korzystnie wiązane przez receptor Fc.

Czwarty receptor, alternatywnie zwany „receptorem ochrony” (FcRp) lub „receptorem noworodkowym” (FcRn) jest odpowiedzialny za odzyskiwanie przeciwciał z endosomu po endocytozie kompleksu przeciwciało-antygen i ich rozdzieleniu w endosomie. Wiążące miejsce dla FcRp znajduje się na połączeniu pomiędzy domenami CH2 a CH3 w trójwymiarowej strukturze przeciwciała. Okres półtrwania przeciwciał IgG w surowicy zależy od produktywnych oddziaływań z funkcjonalnym FcRp. Inne typy przeciwciał, takie jak IgM, IgD, IgE oraz IgA nie wiążą się z FcRp.

Kolejnym wiążącym się składnikiem z pewnymi przeciwciałami jest C1q, który pośredniczy w wiązaniu dopełniacza.

Oddziaływania z receptorami Fc i FcRp także wywierają wpływ na aktywność biologiczną i metabolizm białek fuzyjnych zawierających jednostkę Fc.

Na przykład, białka fuzyjne o słabym wiązaniu z FcR mają dłuższy okres półtrwania w surowicy niż odpowiadające im białka fuzyjne o dobrym wiązaniu z FcR. Białka fuzyjne o słabym wiązaniu z FcRp mają krótszy okres półtrwania w surowicy niż odpowiadające im białka fuzyjne o dobrym wiązaniu z FcRp.

Na przykład, białko fuzyjne Ig zawierające domeny CH2 i CH3 lgG2 posiada dłuższy okres półtrwania w surowicy niż białko fuzyjne zawierające IgG1 Podobnie, białko fuzyjne zawierające region Fc pochodzący od lgG3 posiada krótszy okres półtrwania w surowicy niż odpowiadające mu białko fuzyjne zawierające IgG1 albo lgG2. Białka fuzyjne zwierające domeny CH2 i CH3 pochodzące z IgM, IgD, IgE i IgA posiadają nawet krótszy czas półtrwania w surowicy niż odpowiadające im białka fuzyjne pochodzące od IgG.

W celu zilustrowania zastosowań według wynalazku, korzystne jest pogrupowanie przeciwciał i białek fuzyjnych Ig na dwie ogólne klasy: białka, w których immunologiczne funkcje efektorowe są pożądane oraz białka, w których jednostka Ig służy jako immunologicznie obojętny nośnik i pozbawiona jest funkcji efektorowych. Odnośnie poprzedniej kategorii białek korzystnie jest opracować białka z hybrydą izotypów, w której stworzono szczególne zestawienie funkcji efektorowych. Odnośnie drugiej kategorii korzystne jest opracowanie białek z hybrydą izotypów wykorzystującą regiony pewnych izotypów o nieznacznych funkcjach efektorowych i regiony z innych izotypów, które polepszają uformowanie białka jak tutaj opisano.

Formowanie przeciwciał i białek fuzyjnych Ig

Wynalazek ujawnia, że region zawiasowy przeciwciała lub białka fuzyjnego Ig odgrywa kluczową rolę we właściwym formowaniu i braku agregacji białka fuzyjnego, takiego jak białko fuzyjne wydzielane przez komórkę ssaka. Na przykład, bez wnikania w teorię, uważa się, że uformowanie przeciwciała i białka fuzyjnego Ig obejmuje etapy, w których dwa ciężkie łańcuchy najpierw asocjują niekowalencyjnie przez hydrofobowe połączenie w domenie CH3. Po tej asocjacji regiony zawiasowe dopasowywują się tworząc wewnątrz-łańcuchowe wiązanie disulfidowe. Region zawiasowy znajduje się około 50 Angstremów od hydrofobowego połączenia w domenie CH3.

Projektując konstrukcję białka fuzyjnego przeciwciała lub Ig, praktycznym jest zróżnicowanie regionu zawiasowego. Na przykład, korzystne jest zastąpienie DNA kodującego region zawiasowy w danej konstrukcji ekspresyjnej przez DNA kodujący inny region zawiasowy, taki jak region zawiasowy z IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA, IgD, IgE albo IgY.

Według wynalazku, na przykład białka fuzyjne przeciwciał i Ig zawierające regiony zawiasowe o większej liczbie cystein nie formują się tak wydajnie jak odpowiadające im białka o mniejszej liczbie

PL 206 701 B1 cystein. Bez wnikania w teorię, regiony zawiasowe o większej liczbie cystein wykazują większe prawdopodobieństwo złego dopasowania cystein i niewłaściwego kształtowania się wiązania disulfidowego. W wyniku tego uważa się, że białka fuzyjne przeciwciał i Ig z regionami zawiasowymi zawierającymi większą liczbę cystein znacznie łatwiej ulegają procesowi agregacji i występują w wielu odmianach o innych właściwościach elektroforetycznych w porównaniu do odpowiadających im białek fuzyjnych przeciwciał i Ig z regionami zawiasowymi zawierającymi mniejszą liczbę cystein. Ilustracja tego zjawiska znajduje się w przykładach.

Na przykład, białka fuzyjne przeciwciał i Ig zawierające region zawiasowy z czterema cysteinami są mniej wydajnie formowane niż białka fuzyjne przeciwciał i Ig z trzema lub dwiema cysteinami. Na przykład, białka zawierające region zawiasowy pochodzący z lgG2 są mniej efektywnie formowane niż odpowiednie białka zawierające region zawiasowy pochodzący z I IgG1 W konkretnym przykładzie, białka zawierające region zawiasowy pochodzący z lgG3 są słabo formowane; region zawiasowy lgG3 zawiera 11 cystein.

Wykorzystanie wynalazku jest w szczególny sposób zilustrowane w przypadku, w którym jest pożądane minimalne wiązanie z Fc receptorem I. Na przykład, w kontekście białek fuzyjnych, korzystne jest stosowanie regionów CH2 i CH3 z lgG2 ponieważ wiązanie z FcR jest zasadniczo obniżone, dlatego też obniżony jest ADCC i polepszony jest okres półtrwania w surowicy. Jednakże, zastosowanie regionu zawiasowego lgG2 powoduje, że otrzymane połączenie przeciwciała albo Ig jest słabo formowane. Szczególnie korzystne jest zastosowanie CH2 i CH3 regionów lgG2 w połączeniu z regionem zawiasowym IgG1, jak zilustrowano poniżej w różnych przykładach.

Równoległe odkrycie, przedstawione w kilku przykładach, dotyczy wyboru szczególnego regionu zawiasowego lub innej domeny, który może mieć wpływ na poziom wytwarzania połączenia przeciwciała lub Ig. Jest to odkrycie o wielkim znaczeniu ekonomicznym, gdyż leki białkowe takie jak całe przeciwciała często muszą być dawkowane w dużych ilościach, takich jak kilkaset miligramów na pacjenta na dobę. Uważa się ogólnie, że wybór regionu zawiasowego o minimalnej liczbie cystein, takiej jak trzy lub dwie, polepsza wydajność otrzymanego białka fuzyjnego przeciwciała albo Ig z eukariotycznego systemu ekspresji. Obniżenie licznych cystein może być osiągnięte poprzez mutację lub substytucję regionu zawiasowego jednego izotypu na region innego, lub obydwoma sposobami.

Zwiększenie oporności na proteazę

Region zawiasowy jest szczególnie wrażliwy na proteazy. W klasycznych eksperymentach, przeciwciała były rozdzielane na regiony Fab i regiony Fc przez rozczepienie protezą w regionie zawiasowym.

Korzystne jest opracowanie białek fuzyjnych przeciwciał i Ig z regionem zawiasowym z IgA i innymi składnikami z innych izotypów przeciwciała. Na przykład, jeśli białko fuzyjne przeciwciała albo Ig ma być podawane doustnie lub przez inną powierzchnię śluzową taką jak nosowa, płucna, pochwowa czy śluzówkę odbytu, praktyczne jest posiadanie białka szczególnie odpornego na protezę, aby chronić białko fuzyjne przeciwciała albo Ig przed występującymi tam proteazami. Na przykład, korzystnym jest stworzenie białka fuzyjnego przeciwciała albo Ig, które zawiera region zawiasowy IgA oraz domeny CH2 i CH3 z IgG, w taki sposób, że hybryda izotypów białek będzie posiadała cechy oporności na proteazę i zwiększony okres półtrwania w surowicy po tym jak białko dostanie się do krążenia. Region zawiasowy z lgA1 jest korzystnym regionem zawiasowym, ponieważ miejsca glikozylacji w regionie zawiasowym nadają oporność na szerokie spektrum proteaz. W przeciwieństwie, region zawiasowy z lgA2 jest krótszy i jest oporny na bakteryjne proteazy, które specyficznie rozczepiają region zawiasowy lgA1.

Inne ciężkie łańcuchy izotypów także posiadają miejsca glikozylacji, które wpływają na oporność na proteazy. Na przykład, IgA, IgD, IgE i IgM zawierają miejsca glikozylacji w stałej domenie, co przyczynia się do oporności na proteazę. Na przykład, CH1 domena IgE zawiera trzy miejsca glikozylacji poprzez atom N. Praktyczne jest połączenie CH1 domeny IgE z, na przykład, regionem zawiasowym z IgA i z domenami CH2 i CH3 z IgG.

Korzystne jest również wbudowanie miejsc glikozylacji z jednego izotypu w region CH2 lub CH3 innego izotypu. W takich przypadkach ogólnie nie wystarczy stworzyć białka fuzyjne przeciwciał lub Ig, w których całe domeny, określone jako regiony kodowane są przez pojedyncze egzony, praktyczne jest zatem stworzenie hybrydy domen. Na przykład, korzystnie jest połączyć właściwości wiązania FcRp przypisane izotypom IgG z właściwościami oporności na proteazę przypisanymi innym izotypom. Aby osiągnąć taką kombinację właściwości, konieczne jest stworzenie pojedynczych domen

PL 206 701 B1 z sekwencjami aminokwasów z dwóch różnych izotypów. Otrzymana hybryda domen jest następnie stosowana do stworzenia połączeń I z jednostkami niebędącymi Ig.

Na przykład, korzystne jest zastąpienie odcinka aminokwasów z CH2 domeny IgE, który obejmuje sekwencję VNLTW (SEQ ID NO: 3) na odpowiadające im aminokwasy w CH2 domenie IgG. Na przykład, w IgG1 tymi aminokwasami są VKFNW (SEQ ID NO: 4), a w lgG3 tymi aminokwasami są VQFKW (SEQ ID NO: 5). Według wynalazku, odpowiadające aminokwasy w innych domenach CH2 mogą być określone za pomocą komputerowego lub strukturalnego dopasowania domen CH2 z innych izotypów lub z opublikowanej literatury (Paul, WE Fundamental Immunology, Czwarte Wydanie, rozdział 3, strony 46-47).

Podobnie, korzystne jest także wbudowanie innych miejsc glikozylacji do IgG. Na przykład, segmenty sekwencji, które obejmują sekwencje NTSGF (SEQ ID NO: 6) albo LNASR (SEQ ID NO: 7) z IgD, stosowane są do zastąpienia odpowiadających im sekwencji regionu Fc pochodzącego z IgG w białku fuzyjnym przeciwciała lub Ig. Według wynalazku, innymi praktycznymi miejscami glikozylacji w obrębie stałych regionów przeciwciała ujawnione są w Paul (Fundamental immunology, Czwarte Wydanie, rozdział 3) i znajdujących się tam odnośnikach.

W niektórych realizacjach wynalazku, wbudowanie miejsc glikozylacji niepochodzących z IgG osłabia oddziaływanie z FcRp. W takich przypadkach, istnieje wybór pomiędzy ulepszeniem oporności na proteazę a zwiększeniem czasu półtrwania w surowicy, natomiast przydatność takiej hybrydy izotypów białka musi być oceniona w kontekście danego zastosowania.

Według wynalazku, oporność na proteazę danego białka fuzyjnego hybrydy izotypów przeciwciała albo Ig jest badana według standardowych procedur. Proteazy mogą zostać nabyte od komercyjnych dostawców i są inkubowane w obecności danego białka fuzyjnego hybrydy izotypów przeciwciała albo Ig według zaleceń wytwórcy. Proteoliza jest mierzona, na przykład, z zastosowaniem SDS elektroforezy żelowej i analizy ilościowej wyjściowego materiału oraz produktów rozczepienia.

Według wynalazku, zdolność białka fuzyjnego hybrydy izotypów przeciwciała albo Ig do oddziaływania z FcRp może być także mierzona według standardowych procedur. Na przykład, właściwości farmakokinetyczne białka fuzyjnego przeciwciała lub Ig są mierzone u ssaków takich jak mysz, szczur, królik, pies, naczelny niebędący człowiekiem, lub człowiek. Farmakokinetyczne właściwości białka fuzyjnego przeciwciała lub Ig są praktycznie określane przez wiązanie z FcRp, i w zasadzie, celem włączenia właściwości wiązania FcRp do białka fuzyjnego przeciwciała albo Ig jest polepszenie właściwości farmakokinetycznych przeciwciała. Korzystne jest także zbadanie struktury trójwymiarowej kompleksu FcRp-Fc, aby określić, czy dane białko fuzyjne hybrydy izotypów przeciwciała albo Ig może oddziaływać z FcRp (Martin, W.L., et al.: Crystal Structure at 2.8A of an FcRn/Heterodimeric Fc Complex: Mechanism of pH-Dependent Binding. Mol.Cell 7 pp. 867 [2001]; struktura ID IMA na stronie internetowej http://www.rcsb.org/pdb/).

Według wynalazku, szczególnie korzystne jest opracowanie białek typu Fc-X, w których region Fc zawiera region zawiasowy z IgA1, region CH2 i CH3 zawierający te elementy lgG2, które pośredniczą w wiązaniu z FcRp, oraz te elementy CH2, które mają obniżone funkcje efektorowe w porównaniu do innych IgG.

Zwiększanie wartościowości białka fuzyjnego przeciwciała lub Ig

Według wynalazku, korzystne jest czasami stworzenie białka fuzyjnego hybrydy izotypów przeciwciała albo Ig, które posiada wysoką wartościowość, ale także posiada funkcje efektorowe lub inne właściwości charakterystyczne dla przeciwciał o niskiej wartościowości. IgA i IgM posiadają wysoką wartościowość ze względu na oligomeryzację przez wewnątrz łańcuchowe wiązania disulfidowe w regionie CH3. IgA i IgM posiadają także wiązania disulfidowe z cysteiny w pobliżu końca C CH4 z łańcuchem J. IgA jest dimerem, a IgM jest pentamerem lub heksamerem, tak że IgA posiada 4 miejsca wiążące antygen, a IgM posiada 10 albo 12 miejsc wiążących antygen.

IgM i IgA nie pośredniczą jednakże w ADCC. Aby opracować poliwalentne połączenie przeciwciała albo Ig, które pośredniczy w ADCC, korzystne jest opracowanie białka, które posiada domenę CH2 z IgG i domeny CH3 i CH4 z IgM albo IgA. Ogólnie, korzystne jest stosowanie CH3 i CH4 domeny z IgM, gdyż otrzymana hybryda izotypów białka posiada wyższą wartościowość niż odpowiednia hybryda izotypów białka posiadająca IgA.

Wynalazek ilustruje użyteczność białek fuzyjnych hybrydy izotypów o zwiększonej wartościowości. Wiele komórek nowotworowych charakteryzuje się nadmierną ekspresją receptorów EGF na powierzchni tych komórek. Receptor EGF ulega także ekspresji na powierzchni wielu normalnych komórek, tak więc różnica w ekspresji receptora EGF między zwykłymi komórkami a komórkami nowotworowymi

PL 206 701 B1 jest tylko ilościowa. Według jednej realizacji wynalazku, praktyczna hybryda izotypów białek IgG-IgM zawiera region V, który słabo oddziałuje z ludzkim receptorem EGF. Powinowactwo regionu V jest wybrane w ten sposób, aby białko fuzyjne nie oddziaływało wydajnie z EGF-R na zwykłych komórkach, ale oddziaływało z nadmiernie ulegającym ekspresji receptorem EGF na komórkach nowotworowych w wyniku efektu zachłanności (ang. avidity effect). Zastosowanie domeny CH2 z IgG, na przykład domeny CH2 z IgG1, pośredniczy w ADCC przeciwko komórkom nowotworowym.

Aby zwiększyć specyficzne niszczenie komórek nowotworowych, korzystne jest także połączenie białka hybrydy izotypów IgG-IgM anty-EGF-R z białkiem o aktywności przeciwnowotworowej, takim jak cytokina. Na przykład może zostać zastosowana IL-2. Alternatywnie, korzystne jest także przyłączenie radioaktywnego atomu do białka hybrydy izotypów, w taki sposób, że stężenie białka hybrydy izotypów w obszarze guza wywoła korzystne napromieniowanie guza. Na przykład ltr-90 (Yttrium-90) może być przyłączony do białka hybrydy izotypów IgG-IgM. Połączenie ADCC i działania IL-2 lub ADCC oraz napromieniowania jest szczególnie korzystne w niszczeniu komórek nowotworowych.

W białku fuzyjnym IgG-IgM, takim jak białko przeciwnowotworowe opisane powyżej, ogólnie korzystne jest stosowanie regionu zawiasowego z IgG, korzystnie IgG1. Region zawiasowy z lgG3, w wielu aplikacjach, jest najmniej korzystnym regionem zawiasowym IgG ponieważ region ten ma tendencję do wywoływania zmiennego formowania; ponadto, region zawiasowy lgG3 łatwo ulega proteolizie (Baici A, et al. Scand J Immunol. [1980] 12:41-50).

Poprzednie przykłady ilustrują ogólną zasadę według wynalazku: że antygen, który ulega znacznie większej ekspresji na typie komórki docelowej niż na zwykłych komórkach może być bardziej wydajnie utrafiony przez białko fuzyjne przeciwciała lub Ig o wysokiej wartościowości, ale względnie niskim powinowactwie pojedynczego wiązania.

Na przykład, w chorobach autoimmunologicznych, pewne komórki odpornościowe, jak limfocyty T powodują ekspresję białek powierzchniowych takich jak receptory cytokiny. Korzystne jest atakowanie takich komórek odpornościowych białkiem fuzyjnym Ig albo przeciwciała o wysokiej wartościowości IgG1, lgG2 albo lgG4-lgM, skierowanym przeciwko przeładowanej powierzchni komórki. W ten sposób zminimalizowane jest namierzenie komórek, w których występuje białko powierzchniowe, ale nie jest przeładowane. Na przykład podczas ataku choroby autoimmunologicznej, korzystnie jest leczyć pacjenta białkiem fuzyjnym IgG-IgM, w którym regiony V są skierowane przeciwko, na przykład receptorowi IL-2, receptorowi IL-12, lub każdemu innemu przeładowanemu receptorowi. Region zawiasowy i domena CH2 korzystnie pochodzą z IgG1, lgG2 albo lgG4, a regiony CH3 i CH4 korzystnie pochodzą z IgM. Regiony V korzystnie słabo wiążą się z receptorem IL-2 albo IL-12 w przypadku leczenia chorób autoimmunogennych. Terapia ta wykazuje efekt zniszczenia podgrupy limfocytów T, ale nie całego zestawu limfocytów T.

Tworzenie plazmidów ekspresji, za pomocą których ekspresji ulegała białka fuzyjne przeciwciał i Ig z hybrydą izotypów

Wynalazek dotyczy także kwasów nukleinowych, które kodują przeciwciała i białka fuzyjne według wynalazku. Wynalazek jest najlepiej realizowany, kiedy kodujące kwasy nukleinowe kodują także kasetę sekrecyjną tak, że kiedy ulegają transkrypcji i translacji, dają w efekcie peptyd sygnałowy. Peptyd sygnałowy jest przeważnie odczepiany od dojrzałego produktu. Wydzielane białko fuzyjne może być zbierane z pożywki bez konieczności lizy komórek gospodarza i może być badane pod względem aktywności oraz oczyszczane z zastosowaniem niezbędnych, powszechnie dostępnych odczynników. W niektórych przypadkach, występowanie pewnych składników połączenia, takich jak cytokina CNTF, pozwala na wydzielenie białka fuzyjnego Ig bez kasety sekrecji.

Przeciętny znawca danej dziedziny może przeprowadzić takie konstrukcje rekombinowanego DNA wykorzystując DNA z intronami ponieważ naturalnie występujące introny rozdzielają DNA kodujący region zawiasowy od DNA kodującego domeny CH1 i CH2. Można stosować miejsca restrykcyjne w intronach. Alternatywnie, ponieważ regiony zawiasowe są z reguły długości tylko około od 15 do 70 aminokwasów, możliwe jest stworzenie syntetycznych DNA kodujących cały region zawiasowy, na przykład z zastosowaniem syntezy oligonukleotydów, PCR lub ich połączenia. Syntetyczny fragment kodujący region zawiasowy może być następnie umiejscowiony w plazmidzie ekspresji kodującym białko fuzyjne Ig z zastosowaniem standardowych technik rekombinacji DNA.

Wynalazek zilustrowano poniżej przez następujące przykłady nieograniczające zakresu jego ochrony.

PL 206 701 B1

P r z y k ł a d 1:

Tworzenie plazmidu ekspresji białka fuzyjnego Fc-X z regionem zawiasowym i regionem CH2 z różnych izotypów przeciwciała

Tworzenie plazmidu, którego ekspresja prowadzi do HuFcY1-Leptyny zostało opisane w publikacji PCT WO 00/040615 A2.

Plazmid, którego ekspresja prowadzi do połączenia Fc pochodzącego od lgG2 ze składnikiem połączenia przez koniec C został stworzony następująco.

W pierwszej kolejności, została otrzymana sekwencja genomowa ludzkiego γ2 Fc. Genomowy DNA kodujący ludzki Fcy2 otrzymany został z zastosowaniem metody PCR przeprowadzonej na komórkowym DNA izolowanym z ludzkich komórek PBMC. Przedni primer miał sekwencję 5' CCTTA AGC GAG CGC AAA TGT TGT GTC GAG (SEQ ID NO: 8), gdzie miejsce restrykcyjne AfIII C TTA AG było wprowadzone powyżej regionu kodującego region zawiasowy γ2: GAG CGC AAA TGT TGT GTC GAG (SEQ ID NO: 9). Tylny primer posiadał sekwencję 5' CCTcGaG TCA TTT ACC CGG GGA CAG GGA G (SEQ ID NO: 10), gdzie miejsce restrykcyjne Xhol: CTCGAG było wprowadzone bezpośrednio za kodonem zatrzymującym translację (antykodon TCA). Ponadto, tylny primer także wprowadzał Smal CC CGGG za pomocą cichej mutacji (substytucja A na G, podkreślona). Fragment 910 bp PCR był sklonowany do TOPO TA Cloning Vector (Invitrogen, Carlsbad, CA) w celu weryfikacji sekwencji.

W drugiej kolejności, ludzki γ2 Fc był wstawiany do wektora ekspresji. Naturalne miejsce restrykcyjne Smal w sekwencji DNA CTG CCC CCA TCC CGG GAG GAG ATG ACC AAG (SEQ ID NO: 11) kodującej górny region CH3 było usunięte przez cichą mutację wprowadzoną za pomocą techniki nakładającej się PCR (Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res. 19: 2471-6, 1991). Przedni primer posiadał sekwencję 5' CTG CCC CCA TCA CGG GAG GAG ATG ACC AAG (SEQ ID NO: 12), gdzie podkreślono substytucję C na A; a tylny primer posiadał sekwencję 5' GGT CAT CTC CTC CCG TGATGG GGG CAG gGt GTA C (SEQ ID NO: 13), gdzie podkreślono substytucję G na T. Po weryfikacji sekwencji, otrzymany fragment restykcyjny Aflll-Xhol kodujący Fc z γ2 zawierał unikalne miejsce Smal powyżej kodonu zatrzymującego translację oraz miejsce Xhol poniżej zatrzymującego kodonu. Fragment AfIII-Smal kodujący Fcy2 był następnie zastosowany do zastąpienia odpowiadającego fragmentu restrykcyjnego kodującego Fcy1 w pdCs-huFcyl-Leptynę (publikacja PCT WO 00/040615 A2) w celu otrzymania pdCs-huFcY2-Leptyny.

W trzeciej kolejności, DNA kodujący region zawiasowy Fc γ2 był zastąpiony przez zmieniony region zawiasowy z γ1. Region zawiasowy γ2 zawiera cztery cysteinowe wiązania disulfidowe. Poniżej pokazano fragment AfIII-Stul zawierający egzon zawiasowy γ2. Miejsce AfIII (C TTA AG) jest poprzedzone sekwencją DNA kodującą peptyd sygnałowy. Kwas glutaminowy (E) jest pierwszą resztą aminokwasu regionu zawiasowego γ2. Małe litery reprezentują sekwencję intronów występującą po egzonie zawiasowym γ2. Miejsce restrykcyjne Stul (aggccf) jest C-metylowane w większości szczepów E.coli przez metylazę DCM z powodu C-metylacji w sekwencji ccagg i odwróconym ogniwie cctgg; w przypadku, gdy miejsce to jest zmetylowane nie może być cięte przez Stul.

ERKCCVEC PPC P (SEQ ID

NO: 14)

C TTA AGC GAG CGC AAA TGT TGT GTC GAG TGC CCA CCG TGC CCA G gtaagccagcccaggccf (SEQ ID NO: 15)

Fragment AfIII-Stul zawierający egzon zawiasowy γ2 w pdCs-huFcY2-Leptynie był zastąpiony przez odpowiadający fragment AfIII-Stul zawierający egzon zawiasowy γ1 z pdCs-huFcY1-Leptyny, który jest pokazany poniżej:

EP KSSD KT Η T C PP C P (SEQ ID NO: 16)

C TTA AGC GAG CCC AAA TCT TCT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA G

Gtaagccagcccaggcct (SEQ ID NO: 17)

PL 206 701 B1

Sekwencja regionu zawiasowego γ1 w pdOs-huFcYl zawiera mutację Cys na Ser (podkreślone), co eliminuje resztę Cys, która tworzy wiązanie disulfidowe z lekkim łańcuchem w IgG1 (Lo et al., (1998) Protein Engineering 11:495-500). Ponieważ miejsca Stul w obu egzonach γ1 i γ2 są C-metylowane, a restrykcyjna endonukleaza Stul jest wrażliwa na metylację, oba plazmidy są izolowane z DCM negatywnych szczepów bakteryjnych przed trawieniem enzymem Stul. Otrzymana pdCs-huFcY2-Leptyna z regionem zawiasowym z pdCs-huFcYl została oznaczona jako pdCs-huFcY2h-Leptyna (γ2^γ2 ze zmienionym regionem zawiasowym).

P r z y k ł a d 2:

Charakterystyka stanu oligomeryzacji immunopołączeń huFcY2-leptyny i huFcY2h-leptyn y

Oceniono ekspresję białka z komórek NS/0 z zastosowaniem wektora ekspresji pdCs-huFc-huLeptyny z izotypami γ1, γ2 i Y2h. Oceniono fizyczny stan różnych form huFc-huLeptyny, w których jednostka huFc pochodzi od izotypów γ1, γ2 i γ3.

Konstrukcje DNA wytworzone jak opisano powyżej i w Lo et al. były transfekowane do komórek NS/0 i według standardowych procedur wytworzona była stabilna linia komórkowa, w której przebiegała ekspresja.

W tym i następnych przykładach, stabilne transfekowane komórki były wytworzone w następujący sposób: plazmidowe DNA były wprowadzane do mysich komórek szpiczaka NS/0 za pomocą elektroporacji. Komórki NS/0 rosły na pożywce Dulbecco w modyfikacji Eagle uzupełnionej 10% płodowej surowicy byka, 2mM glutaminą i penicyliną/streptomycyną. Około 5x10⁶ komórek było płukanych jednokrotnie z zastosowaniem PBS i ponownie zawieszanych w 0,5 ml PBS. Dziesięć μg liniowego plazmidu DNA było następnie inkubowanych z komórkami w kuwecie Gene Pulser Cuvette (przerwa między elektrodami 0,4 cm, BioRad) w lodzie przez 10 minut. Przeprowadzono elektroporację z użyciem Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) o parametrach 0,25 V i 500 gF. Komórki pozostawiano na 10 minut w lodzie, po czym były ponownie zawieszone w pożywce i przeniesione na dwie 96-dołkowe płytki. Stabilnie transfekowane klony były selekcjonowane poprzez wzrost w obecności 100 nM metotreksatu (MTX), który był wprowadzony dwa dni po transfekcji. Komórki były odżywiane co 3 dni dwa do trzech razy, a klony oporne na metotreksat pojawiły się po 2 do 3 tygodniach. Supernatant z klonów był poddany analizie z zastosowaniem anty-Fc ELISA, aby zidentyfikować klony wysoce produkcyjne. Wysoce produkcyjne klony były izolowane i namnażone w pożywce zawierającej 100 nM MTX.

Stężenie HuFc-huLeptyn w supernatancie było określane z zastosowaniem anty-huFc ELISA używając przeciwciała anty-huFc (peroksydaza chrzanowa połączona z kozimi anty-hulgG, FcyI lub Fcy2, z Jackson ImmunoResearch). Względnie niskie poziomy ekspresji stwierdzono w supernatantach z konstrukcji γ2 podczas, gdy konstrukcje γ1 i γ2h dawały wysokie poziomy ekspresji zarówno w przypadku przejściowej jak i stabilnej transfekcji. W przypadku przejściowych transfekcji z tymi samymi wektorami ekspresji kodującymi huFcγ2-huLeptynę i huFcγ2h-huLeptynę, huFcγ2h-huLeptyna była wytwarzana poziomie 8-krotnie wyższym.

W celu oczyszczenia, białka fuzyjne w supernatancie z kultury tkankowej były wiązane przez Protein A Sepharose przed elucją z zastosowaniem buforu fosforanu sodu (100 mM NaH2PO4, o pH 3, i 150 mM NaCI). Eluat był następnie zobojętniany stosując 0,1 objętości 2 M chlorowodorku Tris o pH 8, a składniki rozdzielane w SDS elektroforezie na żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE) i HPLC chromatografii sączenia molekularnego (ang. size exclusion chromatography - SEC).

Białka fuzyjne były badane z zastosowaniem SDS-PAGE w warunkach nieredukujących. Pasma białek, wizualizowane przez barwienie Coomassiego, pokazują, że HuFcγ1-huLeptyna ma pozorną masę cząsteczkową 96 kD, co wskazuje, że jest to biwalentny monomer. Analiza z zastosowaniem SDS-PAGE pokazuje, że wiele z białek fuzyjnych huFcγ2-huLeptyny występowało w formie o wyższej masie cząsteczkowej, migrując jako drabina pasm z pozornymi masami molekularnymi o wiele wyższymi niż masa Fc-Leptyny. W przeciwieństwie, huFcγ2h-huLeptyna była zasadniczo pojedynczym pasmem, migrującym jako cząstka o masie 96 kD.

Analiza z zastosowaniem chromatografii sączenia molekularnego (SEC) konstrukcji huFcγ2h skorelowana z wynikami SDS-PAGE pokazuje, że zarówno huFcγ2h-leptyna jak i huFcγ1-leptyna są w 83% monomerami, podczas gdy białko fuzyjne huFcγ2-huLeptyny jest w około 55% monomerem.

Badania z unieruchomionymi komórkami J774, które są bogate w receptory klasy FcyR, pokazują, że tylko białko fuzyjne huFcγ1-huLeptyny wykazuje wiązanie z Fc. Ponadto, zastosowano komórki BAF-3 transfekowane, do ekspresji receptora leptyny w taki sposób, aby ich różnicowanie mogło być stymulowane przez leptynę (Gainsford, T., et al. PNAS [1996] 93:14564-14568). Badania

PL 206 701 B1 z komórkami BAF3/receptor leptyny wskazują, że huFcY1-huLeptyna, huFcY2-huLeptyna i huFcY2h-huLeptyna miały taką samą bioaktywność jak leptyna.

Zidentyfikowano także stabilne klony komórek ssaków wydzielające huFcY2-huLeptynę i huFcY2h-huLeptynę. Transfekcje komórek przeprowadzone były w zasadniczo takich samych warunkach i taka sama liczba stabilnie transfekowanych komórek była klonowana i testowana pod kątem wytwarzania huFcY2-huLeptyny i huFcY2h-huLeptyny. Najlepiej wytwarzający huFcY2h-huLeptynę klon produkował około 5-krotnie więcej huFc-huLeptyny niż klon najlepiej wytwarzający huFcY2-huLeptynę.

P r z y k ł a d 3:

Tworzenie plazmidu ekspresji białka fuzyjnego X-Fc z regionem zawiasowym i regionem CH2 z różnych izotypów przeciwciała

Syntetyczna sekwencja DNA (SEQ ID NO: 18) kodująca reszty aminokwasów od 7 do 37 peptydu 1 glukagonopodobnego (GLP-1) (SEQ ID NO: 19) jest ujawniona poniżej.

HAEGT FTSDVSSYLEG

C TTA AGC CAT GCT GAA GGG ACC TTT ACT AGT GAT GTA AGT TCT TAT TTG GAA GGG

QAAKEFIAWLVKGRG

CAA GCT GCC AAG GAA TTC ATT GCT TGG CTG GTG AAA GGC CGA GGA GGA TCC TTA AGD

DNA kodujący peptyd GLP-1 był poprzedzony przez C TTA AGC, w którym zastosowano miejsce restrykcyjne AfIII aby połączyć ten fragment DNA z fragmentem DNA kodującym sekwencję sygnałową (Lo et al. Protein Engineering). Na końcu 3' po DNA kodującym GLP-1 znajdowało się miejsce restrykcyjne BamHI (GGA TCC, które koduje reszty aminokwasów G i S) oraz miejsce restrykcyjne AfIII, które było zastosowane do połączenia z restrykcyjnym fragmentem Aflll-Xhol kodującym Fcy2 (lub FcY2h) z kodonem zatrzymania translacji (patrz Przykład 1).

P r z y k ł a d 4:

Charakterystyka stanu oligomeryzacji immunopołączeń GLP1-huFcy2 i GLP1-huFcY2h

Otrzymane wektory z przykładu 3, pdCs GLP-1 huFcyl, pdCs GLP-1 huFcY2 i pdCs GLP-1 huFcy2h, były stosowane do przejściowej i stabilnej transfekcji komórek ssaków w celu ekspresji GLP-1 (7-37) huFcy1, GLP-1 (7-37) huFcY2 i GLP-1 (7-37) huFcY2h.

Ocena stanu agregacji i całkowitej ekspresji białka dla każdego białka fuzyjnego GLP-1 huFc była przeprowadzona z zastosowaniem SDS-PAGE i HPLC-SEC po oczyszczeniu na Protein A Septiarose, stosując ogólne sposoby opisane w przykładzie 2. Pasma białka były wizualizowane z zastosowaniem barwienia Coomasiego. GLP-1 huFcY2 i GLP-1 huFcY2h miały pozorną masę cząsteczkową w przybliżeniu 60 kDa wyznaczoną z zastosowaniem SDS-PAGE. Stężenie odmian GLP-1 huFc w supernatancie było określone z zastosowaniem anty-huFc ELISA. W przypadku transfekcji przejściowych) z tymi samymi wektorami ekspresji kodującymi GLP-1 huFcY2 i GLP-1 huFcy2h stwierdzono, że GLP-1 huFcy2h był wytwarzany na poziomie około 1.5-raza wyższym.

Analiza wszystkich lizatów komórkowych z zastosowaniem SDS-PAGE pokazała, że około połowa cząsteczek białek fuzyjnych GLP-1 huFcY2 ma nieprawidłowe wiązania disulfidowe, co zostało przedstawione jako obecność kilku form o wysokiej masie cząsteczkowej migrujących o pozornej masie cząsteczkowej odpowiadającej 100 do 200 kDa. W przeciwieństwie, właściwie wszystkie zidentyfikowane białka fuzyjne GLP-1 huFcY2h migrowały jako cząsteczki o pozornej masie cząsteczkowej około 60 kDa. Jeśli próbki były redukowane przed SDS-PAGE, wówczas białka GLP-1 huFcy2 i GLP-1 huFcY2h przemieszczały się jak cząsteczki o właściwie takiej samej pozornej masie cząsteczkowej około 34 kDa.

Analiza porównawcza z zastosowaniem HPLC-SEC białek fuzyjnych γ1, γ2 i Y2h pokazała, że zmodyfikowane białko fuzyjne Y2h jest znacząco bardziej monomeryczne niż inne białka fuzyjne. Zmodyfikowane białko fuzyjne GLP-1-huFcY2h, przedstawione jako pojedynczy pik, było w 84% biwalentnym monomerem, podczas gdy białka fuzyjne zarówno GLP-1-huFcY1, jak i GLP-1-huFcY2 posiadały wiele pików odpowiadających w przybliżeniu odpowiednio 42 i 33% formie biwalentnego monomeru.

Dlatego też białko fuzyjne GLP-1-Fc posiadające region zawiasowy z IgG1 oraz domeny CH2 i CH3 z lgG2 wykazuje zadziwiająco lepsze właściwości formowania niż białka fuzyjne GLP-1-Fc, w których cały region Fc pochodzi albo z IgG1 albo z lgG2.

PL 206 701 B1

P r z y k ł a d 5:

Tworzenie całego przeciwciała specyficznego dla chorych komórek, które zawiera CH1, CH2 i CH3 domeny z lgG2 oraz region zawiasowy z IgG1

Genomowy DNA kodujący stałe regiony immunoglobuliny γ2 (CH1, region zawiasowy, CH2, CH3) został otrzymany techniką PCR z zastosowaniem komórkowego DNA izolowanego z ludzkich PBMC. Przedni primer posiada sekwencję 5' CA AGCTTTCTGGGGCGAGC (SEQ ID NO: 20), gdzie miejsce restrykcyjne Hindlll A AGCTT zostało wprowadzone do sekwencji intronu w odległości około 220 bp powyżej egzonu CH1. Tylny primer posiada sekwencję 5' CCTCGAG TCA TTT ACC CGG GGA CAG GGA G (SEQ ID NO: 21), gdzie miejsce restrykcyjne Xhol CTCGAG zostało wprowadzone bezpośrednio po kodonie zatrzymania translacji (antykodon TCA), oraz Smal CC CGGG zostało stworzone przez cichą mutację, jak już opisano w przykładzie 1. Naturalne miejsce restrykcyjne Smal w sekwencji DNA kodującej górny region CH3 został także usunięty przez cichą mutację wprowadzoną z zastosowaniem techniki nakładającej się PCR, jak opisano w przykładzie 1. Znawca przedmiotu mógłby także rozpoznać to poprzez zafałszowanie restrykcyjnych fragmentów kodujących Fcy2 otrzymanych w przykładzie 1. Restrykcyjny fragment Hindlll-Xhol o długości —1810 par zasad (ang. base pair - bp) kodujący regiony CH1, zawiasowy, CH2 i CH3 i zawierający unikalne miejsce restrykcyjne, mogą być z łatwością stworzone. Po weryfikacji sekwencji, fragment Hindlll-Xhiol kodujący stałe regiony γ2 był zastosowany do zastąpienia fragmentu Hindlll-Xhol kodującego stały region y1-IL2 w pdHL7-huKSY1-IL2 w celu otrzymania przeciwciała pdHL7-huKSY2.

Wektor ekspresji dla przeciwciała huKSY2h został opracowany w następujący sposób. Plazmid pdCs-huFcY2h-Leptyny został zastosowany jako wzorzec PCR dla stworzenia fragmentu restrykcyjnego o długości ~130 bp Pstl-Pvull kodującego tylko zmodyfikowany region zawiasowy γ1 z seryną zamiast cysteiny. Przedni primer posiadał sekwencję 5' CTGCAGAGCCCAAATCTTC (SEQ ID NO: 22), który przywraca natywne miejsce restrykcyjne Pstl(CTGCAG) na początku egzonu zawiasowego γ1 (z mutacją C na S opisaną powyżej). Tylny primer miał sekwencję 5'CAGCTGGGGCCTGTCCCTG (SEQ ID NO: 23), która odpowiada miejscu Pvull (CAGCTG) w intronie pomiędzy egzonami zawiasowym a CH2. Po weryfikacji sekwencji ten restrykcyjny fragment Pstl-Pvull o długości —130 bp stosowany był do zastąpienia odpowiadającego mu fragmentu w przeciwciele pdHL7-huKSY2, co prowadziło do otrzymania przeciwciała pdHL7-huKSY2h.

P r z y k ł a d 6:

Charakterystyka stanu niezredukowanego przeciwciała-Y2 i odpowiadającego mu przeciwciała-Y2h skierowanego przeciwko chorym komórkom

Dla przejściowej transfekcji, wektory pdHL7 z przeciwciała KS z izotypami IgGY1, γ2 i Y2h były wprowadzone do komórek ssaków z zastosowaniem lipofekcji używając Lipofectamine Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) zgodnie z wytycznymi dostawcy. Stabilne transfekowane komórki zostały stworzone jak opisano w przykładzie 2.

Przeciwciała KS w kondycjonowanej pożywce (10% surowica) były wychwytywane na Protein A Sepharose (Repligen, Cambridge, MA), a następnie eluowane poprzez doprowadzenie do wrzenia w buforowanej próbce białka z lub bez 2-merkaptoetanolem przed scharakteryzowaniem z zastosowaniem SDS-PAGE. Wizualizacja za pomocą wybarwienia Coomassiego pokazała, że niezredukowane przeciwciało KS γ2 migruje jako kilka odmian o masie cząsteczkowej około 150 kDa. W przeciwieństwie, przeciwciało KS Y2h migruje jako główne pasmo o pozornej masie cząsteczkowej 150 kDa. Jeśli przeciwciało KS γ2 i przeciwciało KS Y2h zostały zredukowane z zastosowaniem merkaptoetanolu przed SDS-PAGE, obserwowany był identyczny wzór pasm odpowiadających ciężkim i lekkim łańcuchom zarówno dla przeciwciała KS γ2, jak i przeciwciała KS Y2h.

Bez wnikania w teorię, obserwacje te sugerują, że wyraźnie migrujące odmiany widoczne w przypadku KSy2 są spowodowane różnorodnością w kształtach wiązań disulfidowych.

Stabilne klony komórek ssaków, w których zachodzi ekspresja przeciwciała KSy2 i przeciwciała KSY2h zostały także zidentyfikowane. Transfekcje komórek były przeprowadzone w zasadniczo takich samych warunkach i podobna liczba stabilnie transfekowanych komórek była klonowana i testowana w kierunku wytwarzania huFc przeciwciała KSy2 i przeciwciała KSY2h. Cztery klony, w których najlepiej przebiegała ekspresja przeciwciała KSY2h wytwarzały około 114, 98, 85 i 49 mikrogramów przeciwciała na mililitr supernatantu kultury tkankowej, podczas gdy w tych samych warunkach cztery klony, w których najlepiej przebiegała ekspresja huFc przeciwciała KSy2 wytwarzały około 36, 34, 15 i 13 mikrogramów przeciwciała na mililitr supernatantu kultury tkankowej.

PL 206 701 B1

P r z y k ł a d 7:

Tworzenie białka fuzyjnego obejmującego całe przeciwciało, które zawiera lgG2 domeny CH1,

CH2 i CH3 oraz region zawiasowy z IgG1

W tym przykładzie badana była praktyczność białka fuzyjnego przeciwciała, w którym jednostka przeciwciała posiada hybrydę izotypów.

Wektor ekspresji dla huKSY2-IL2, pdHL7-huKSY2-IL2 został stworzony poprzez zastąpienie fragmentu restrykcyjnego Smal-Xhol w przeciwciele pdHL7-huKSY2, który zawierał sekwencję GGGTAAATGA (SEQ ID NO: 24), po której znajdował się lepki koniec Xhol, fragment restrykcyjny Smal-Xhol izolowany z pdHL7-huKS-IL2. Ten drugi fragment zawiera sekwencję GGGTAAA, po której bezpośrednio występuje sekwencja DNA kodująca dojrzałą IL2 obejmującą kodon zatrzymania translacji. Otrzymany wektor ekspresji pdHL7-huKSY2-IL2 był stosowany do transfekowania komórek w celu uzyskania ekspresji białka.

Podobnie wektor ekspresji dla huKSY2h-IL2, pdHL7-huKSY2h-IL2 został stworzony poprzez zastąpienie fragmentu restrykcyjnego Smal-Xhol w przeciwciele pdHL7-huKSY2h, który zawierał sekwencję GGGTAAATGA (SEQ ID NO: 24), po której znajdował się lepki koniec Xhol, fragment restrykcyjny Smal-Xhol izolowany z pdHL7-huKS-IL2 jak opisano w poprzednim akapicie. Otrzymany wektor ekspresji, pdHL7-huKSY2h-IL2, stosowany był do transfekowania komórek w celu uzyskania ekspresji białka.

P r z y k ł a d 8:

Charakterystyka niezredukowanego stanu białka fuzyjnego Y2-przeciwciało i odpowiadającego mu białka fuzyjnego Y2h-przeciwciało

Dla przejściowej transfekcji, plazmidy kodujące KSy2-IL2 i KSY2h-IL2 były wprowadzone do komórek ssaków z zastosowaniem lipofekcji używając Lipofectamine Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) według wytycznych dostawcy.

W celu otrzymania stabilnych transfekowanych klonów, plazmidowe DNA były wprowadzone do mysich komórek szpiczaka NS/0 za pomocą elektroporacji, jak opisano w przykładzie 2.

Białka fuzyjne KS-IL2 z izotypami γ2 i Y2h były analizowane z zastosowaniem SDS-PAGE jak opisano w przykładzie 6. Białka fuzyjne przeciwciała w kondycjonowanej pożywce (10% surowica) były wychwytywane na Protein A Sepharose (Repligen, Cambridge, MA), a następnie eluowane poprzez doprowadzenie do wrzenia w buforowanej próbce białka z lub bez 2-merkaptoetanolem przed scharakteryzowaniem z zastosowaniem SDS-PAGE. Wizualizacja za pomocą wybarwienia Coomassiego pokazała, że niezredukowane KSy2-IL2 migruje jako kilka odmian o masie cząsteczkowej około 180 kDa. W przeciwieństwie, KSY2h-IL2 migruje jako główne pasmo o pozornej masie cząsteczkowej około 180 kDa. Jeśli KSy2-IL2 i KSY2h-IL2 zostały zredukowane z zastosowaniem merkaptoetanolu przed SDS-PAGE, obserwowany był identyczny wzór pasm odpowiadający połączeniu: ciężki łańcuch - IL2 lub samym lekkim łańcuchom zarówno dla KSy2-IL2, jak i KSY2h-IL2.

Bez wnikania w teorię, obserwacje te sugerują, że wyraźnie migrujące odmiany badane w przypadku KSy2-IL2 są spowodowane różnorodnością w kształtach wiązań disulfidowych.

Zmodyfikowane Y2h-immunocytokiny są testowane na zwierzętach i mają zwiększony okres półtrwania i lepszą efektywność w modelach zwierzęcych nowotworów w porównaniu do oryginalnych immunocytokin opartych na IgGy1.

Stabilne klony komórek ssaków, w których zachodzi ekspresja KSy2-IL2 i KSY2h-IL2 zostały także zidentyfikowane. Transfekcje komórek były przeprowadzone w zasadniczo takich samych warunkach i podobna liczba stabilnie transfekowanych komórek była klonowana i testowana w kierunku wytwarzania KSy2-IL2 i KSY2h-IL2. Cztery klony, w których najlepiej przebiegała ekspresja KSY2h-IL2 wytwarzały około 52, 37, 31 i 30 mikrogramów białka fuzyjnego na mililitr supernatantu kultury tkankowej, podczas gdy w tych samych warunkach cztery klony, w których najlepiej przebiegała ekspresja KSy2-IL2 wytwarzały około 31,27, 27 i 17 mikrogramów białka fuzyjnego na mililitr supernatantu kultury tkankowej.

P r z y k ł a d 9:

Tworzenie plazmidów ekspresii białka fuzyjnego przeciwciała z hybrydą izotypów i drugorzędową mutacją mającą wpływ na aktywność białka fuzyjnego

HuKSY2-Ala-IL2 vs huKSY2h-Ala-IL2

Wektor ekspresji dla pdHL7-huKSY2-Ala-IL2 i pdHL7-huKSY2h-Ala-IL2 (opisany powyżej) został stworzony poprzez zastąpienie fragmentu restrykcyjnego Smal-Xhol odpowiednio w przeciwciele pdHL7-huKSY2 i przeciwciele pdHL7-huKSY2h, które zawierały sekwencję GGGTAAATGA (SEQ ID

PL 206 701 B1

NO: 24), po której znajdował się lepki koniec Xhol, fragment restrykcyjny Smal-Xhol izolowany z pdHL7-huKSY1-Ala-IL2. Ten drugi fragment zawiera sekwencję GGGTGCA, po której bezpośrednio występuje sekwencja DNA kodująca dojrzałą IL2 obejmująca kodon zatrzymania translacji. GCA koduje lizynę zamiast alaniny w łączniku białka fuzyjnego. Otrzymane wektory były stosowane do transfekowania komórek w celu wytwarzania huKSY2-Ala-IL2 i huKSY2h-Ala-IL2.

P r z y k ł a d 10:

Charakterystyka stanu niezredukowanego białka fuzyjnego Y2-przeciwciało i odpowiadającego mu białka fuzyjnego Y2h-przeciwciało posiadających drugorzędową mutację wywierającą wpływ na funkcję białka fuzyjnego

Dla przejściowej transfekcji, plazmidy kodujące KSY2-Ala-IL2 i KSy Y2h-Ala-IL2 były wprowadzone do komórek ssaków z zastosowaniem lipofekcji używając Lipofectamine Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) według wytycznych dostawcy.

Stabilne klony komórek ssaków, w których zachodzi ekspresja KSY2-Ala-IL2 i KSY2h-Ala-IL2 zostały także zidentyfikowane jak w przykładzie 2. Transfekcje komórek były przeprowadzone w zasadniczo takich samych warunkach i podobna liczba stabilnie transfekowanych komórek była klonowana i testowana w kierunku wytwarzania KSY2-Ala-IL2 i KSY2h-Ala-IL2. Trzy klony, w których najlepiej przebiegała ekspresja KSY2h-Ala-IL2 wytwarzały około 39, 38 i 29 mikrogramów białka fuzyjnego na mililitr supernatantu kultury tkankowej, podczas gdy w tych samych warunkach trzy klony, w których najlepiej przebiegała ekspresja KSY2-Ala-IL2 wytwarzały około 22, 17, 6 mikrogramów białka fuzyjnego na mililitr supernatantu kultury tkankowej. Białka fuzyjne KS-Ala-IL2 z izotypami γ2 i Y2h były analizowane z zastosowaniem SDS-PAGE jak opisano w przykładzie 6. Białka fuzyjne KS-Ala-IL2 w kondycjonowanej pożywce (10% surowica) były wychwytywane na Protein A Sepharose (Repligen, Cambridge, MA), a następnie eluowane poprzez doprowadzenie do wrzenia w buforowanej próbce białka z lub bez 2-merkaptoetanolem przed scharakteryzowaniem z zastosowaniem SDS-PAGE. Wizualizacją za pomocą wybarwienia Coomassiego pokazała, że niezredukowane KSY2-Ala-IL2 migruje jako kilka odmian. W przeciwieństwie, KSY2h-Ala-IL2 migruje jako główne pasmo. Jeśli KSY2-Ala-IL2 i KSY2h-Ala-IL2 zostały zredukowane z zastosowaniem merkaptoetanolu przed SDS-PAGE, obserwowany był identyczny wzór pasm odpowiadających połączeniu ciężki łańcuch - IL2 lub samym lekkim łańcuchom zarówno dla KSY2-Ala-IL2, jak i KSY2h-Ala-IL2.

Bez wnikania w teorię, obserwacje te sugerują, że wyraźnie migrujące odmiany widziane w przypadku KSY2-Ala-IL2 są spowodowane różnorodnością w kształtach wiązań disulfidowych.

P r z y k ł a d 11:

Ekspresja białka fuzyjnego przeciwciała ze stałym regionem pochodzącym od różnych izotypów

W niektórych przypadkach, pożądane jest stworzenie białka fuzyjnego Ig, w którym różne stałe regiony, oprócz regionu zawiasowego, pochodzą od ciężkich łańcuchów różnych izotypów. Aby zbadać właściwości tej klasy cząsteczek, przeprowadzono następujące eksperymenty.

Białko huKS(Y1:CH1-H)(Y2:CH2-CH3)-Ala-IL2, które jest białkiem fuzyjnym przeciwciała IL2 z łańcuchem ciężkim IgG zawierającym KS VH, regiony CH1 i zawiasowy region z IgG1 oraz regiony CH2-CH3 z lgG2 (z substytucją lizyny na alaninę w łączniku połączenia, jak opisano powyżej), po których występuje IL-2, ulegało następującej ekspresji. Wektor ekspresji pdHL7-huKSfy1:CH1-H)(Y2:CH2-CH3)-Ala-IL2 został stworzony przez zastąpienie restrykcyjnego fragmentu Hindlll-Afllll w pdHL7-KSY2-Ala-IL2 przez odpowiadający mu fragment restrykcyjny Hindlll-Afllll zawierający regiony CHI i region zawiasowy z pdHL7-KS-IL2. Rzeczony wektor ekspresji był transfekowany do hodowanych komórek ssaków jak opisano powyżej, aby otrzymać białko fuzyjne przeciwciała z hybrydą izotypów.

Hybryda HuKS(Y1:CH1-H)(Y2:CH2-CH3)(Ala)-IL2 i białka fuzyjne przeciwciało-cytokina HuKSY2(Ala)-IL2 były określane z zastosowaniem nieredukującej SDS-PAGE jak opisano w przykładzie 6. Białko fuzyjne hybrydy izotypów HuKs(Y1:CH1-H)(Y2:CH2-CH3)(Ala)-IL2 migruje jako główne pasmo o molekularnej masie około 180 kDa. W przeciwieństwie, białko fuzyjne przeciwciało-cytokina HuKSY2(Ala)-IL2 migruje jako wiele pasm w przedziale 180 kDa.

Jeśli hybryda HuKS(Y1:CH1-H)(Y2:CH2-CH3)(Ala)-IL2 i białka fuzyjne przeciwciało-cytokina HuKSY2(Ala)-IL2 są określane przez redukującą SDS-PAGE, to oba białka dają identyczne wzory pasm odpowiadające fuzyjnym polipeptydom lekkiego łańcucha i ciężkiego łańcucha-IL2.

Bez wnikania w teorię, wydaje się, że białko fuzyjne przeciwciało-cytokina HuKS(Y2)(Ala)-IL2 istnieje w przynajmniej dwóch innych izomerycznych konfiguracjach, w których różnica jest wynikiem różnicy w kształcie wiązań disulfidowych.

PL 206 701 B1

P r z y k ł a d 12:

Ekspresja białek fuzyjnych hybrydy izotypów ze specyficznością antygenu nie-białkowego i składnika połączenia o wielu podjednostkach

Przeciwciało 14.18 wiąże się z glikolipidowym antygenem GD2. lnterleukina-12 jest heterodimeryczną cytokiną, która zawiera podjednostki p35 i p40, połączone kowalentnie przez wiązanie disulfidowe.

Jak opisano powyżej, zastosowanie hybrydy izotypów, takiej jak hybryda lgG1/lgG2 prowadzi do polepszenia formowania w porównaniu do naturalnego izotypu, takiego jak lgG2. Polepszone formowanie może być potwierdzone poprzez zwiększone poziomy ekspresji.

W jednym przypadku, plazmidy ekspresji 14.18(y2)-Ala-IL12 i 14.18(y2h)-Ala-IL12 zostały równolegle stworzone i przejściowo transfekowane do komórek w identycznych warunkach jak opisano powyżej i w Gillies et al. (opis patentowy WO09929732). Zastosowano ludzką IL-12. Poziom białka w supernatancie kultury tkankowej transfekowanej plazmidem ekspresji 14.18(y2h)-Ala-IL12 był około 40% wyższy od kultur transfekowanych plazmidem ekspresji 14.18(y2)-IL12.

Plazmidy ekspresji 14.18(y2)-Ala-IL12 i 14.18(y2h)-Ala-IL12 były także stabilnie transfekowane do komórek jak opisano powyżej, a cztery klony z każdej transfekcji, które najlepiej ulegały ekspresji były badane dalej. W przypadku 14.18(y2h)-Ala-IL12 średnia z czterech klonów, które najlepiej ulegały ekspresji była około 45% wyższa niż w przypadku czterech klonów, które najlepiej ulegały ekspresji pochodzących z plazmidu ekspresji 14.18(y2)-Ala-IL12.

W drugim przypadku, plazmidy ekspresji 14.18(y2)-IL12 i 14.18(y2h)-IL12 zostały stworzone i równolegle przejściowo transfekowane do komórek w identycznych warunkach jak opisano powyżej. Zastosowano mysią IL-12. Poziom białka w supernatancie kultury tkankowej transfekowanej plazmidem 14.18(y2h)-IL12 był około 40% wyższy od kultur transfekowanych plazmidem ekspresji 14.18(y2)-IL12.

Plazmidy ekspresji 14.18(y2)-IL12 i 14.18(y2h)-IL12 z użyciem mysiej IL-12 były także stabilnie transfekowane do komórek jak opisano powyżej, a cztery klony z każdej transfekcji, które najlepiej ulegały ekspresji, były badane dalej. W przypadku 14.18(y2h)-IL12 średnia z czterech klonów, które najlepiej ulegały ekspresji była około 35% wyższa niż w przypadku czterech klonów, które najlepiej ulegały ekspresji pochodzących z plazmidu ekspresji 14.18(y2)-IL12.

Wyniki te wskazują, że zastosowanie hybrydy izotypów w białku fuzyjnym prowadzi do polepszenia ekspresji nawet stosując inne przeciwciała i inne jednostki niebędące Ig niż w poprzednich przykładach. W tym przykładzie, jak oczekiwano, zastosowanie IL-12 jako jednostki nie będącej Ig znacząco komplikuje formowanie białka fuzyjnego Ig, z tego powodu, że IL-12 jest heterodimerem. Tym nie mniej, zastosowanie hybrydy izotypów daje korzystny efekt.

P r z y k ł a d 13:

Ekspresja białek fuzyjnych hybrydy izotypów przeciwciała z zastosowaniem regionu zawiasowego z IgA

Aby stworzyć białko fuzyjne Ig o ulepszonej oporności na proteazę, wytworzono białko fuzyjne IgA/lgG.

Na przykład, białko fuzyjne typu Fc-X jest stworzone tak, że zawiera region zawiasowy z ludzkiej IgG1 oraz regiony CH2 i CH3 z lgG2.

Przykład stworzenia wektora ekspresji, aby otrzymać białko fuzyjne typu Fc-X zawierające region zawiasowy z ludzkiego IgG1 oraz regiony CH2 i CH3 z lgG2 jest następujący. Plazmid pdCs-huFcy2-Leptyna z przykładu 2 jest użyty jako wektor.

Fragment AfIII-Stul zawierający egzon zawiasowy y2 w pdCs-huFcy2-Leptynie jest zastąpiony przez odpowiadający mu fragment AfIII-Stul (SEQ ID NO: 25), zawierający egzon zawiasowy IgA, który jest przedstawiony poniżej:

(Aflll) PSTPPTPSPSTP

CTTAAG T CCC TCA ACT CCA CCT ACC CCA TCT CCC TCA ACT CCA

PT PS PSCCH (SEQ ID NO: 26) (Stul)

CCT ACC CCA TCT CCC TCA TGC TGC CAC Ggtaagccagcccaggcct

PL 206 701 B1

W szczególności, zsyntetyzowano następujące oligonukleotydy:

Górne pasmo:

5'TTAAGTCCCTCAACTCCACCTACCCCATCTCCCTCAACTCCACCTACCCCATCTC CCTCATGCTGCCACGGTAAGCCAGCCCAGG-3' (SEQ ID NO: 27)

Dolne pasmo:

5'CCTGGGCTGGCTTACCGTGGCAGCATGAGGGAGATGGGGTAGGTGGAGTTGA GGGAGATGGGGTAGGTGGAGTTGAGGGAC-3' (SEQ ID NO: 28)

Oligonukleotydy te są rozprężane i stosowane do zastąpienia odpowiadających im fragmentów w pdΟs-huFcγ2-Leptynie.

Ponieważ miejsca Stul w egzonie γ2 są C-metylowane oraz restrykcyjna endonukleaza Stul jest wrażliwa na metylację, plazmid jest izolowany z DCM negatywnego szczepu bakteryjnego przed trawieniem enzymem Stul. Otrzymana pdΟs-huFcγ2-Leptyna z regionem zawiasowym z IgA1 jest oznaczona jako pdCs-huFcal^-Leptyna.

Plazmid pdCs-huFca1/y2-Leptyna jest transfekowany do eukariotycznych komórek i białko typu Fc-X formy α1 (region zawiasowy)-γ2(ΟH2,ΟH3)-leptyna ulega ekspresji jako wydzielane białko. Na przykład, stosuje się komórki i sposoby z przykładu 2. Otrzymane białko «1--/2-leptyna jest oczyszczane, oznaczane i stwierdza się, czy posiada aktywność leptyny i czy jest względnie niewrażliwe na rozczepienie przez proteazę w regionie zawiasowym.

P r z y k ł a d 14:

Ekspresje białka fuzyjnego hybrydy izotypów przeciwciała z zastosowaniem IgG i poliwalentnej immunoglobuliny

Aby stworzyć białka fuzyjne przeciwciała z efektorowymi funkcjami IgG, takie jak IgG1 czy lgG3, oraz o zwiększonej wartościowości, została stworzona hybryda białka izotypu Ig wykorzystująca regiony CH1, zawiasowy i CH2 z IgG oraz regiony CH3 i CH4 z IgA lub IgM. Rysunek fig. 4 przedstawia strukturę przeciwciała fuzyjnego będącego hybrydą izotypów IgG-IgM. Korzystne jest połączenie jednostki niebędącej Ig z końcem C domeny CH4 IgA lub IgM.

Korzystne jest także odcięcie ciężkiego łańcucha IgA lub IgM przed cysteina leżącą najbliżej końca C lub zmutowanie tej cysteiny, szczególnie kiedy białko fuzyjne hybrydy izotypów IgG/lgA albo IgG/IgM ulega ekspresji przy braku łańcucha J. Normalną funkcją C-terminalnej cysteiny jest tworzenie wiązania disulfidowego z łańcuchem J. Pożądane jest często, aby ekspresja białka fuzyjnego hybrydy izotypów IgG/lgA albo IgG/IgM przebiegała przy braku jednoczesnej ekspresji łańcucha J, szczególnie kiedy łączy się jednostkę nie będącą Ig z końcem C ciężkiego łańcucha.

Na przykład, białko fuzyjne hybrydy izotypów IgG-IgM tworzone jest następująco. Plazmid pdHL7-huKSγ1-IL2 jest zdolny do ekspresji przeciwciała z regionami zmiennymi, które wiążą się do cząsteczki adhezji komórki epitelialnej (ang. Epithelial Cell Adhesion Molecule) i regionami stałymi ludzkiej IgG1 Plazmid ten zawiera unikalne miejsce Ngo M IV w intronie pomiędzy sekwencjami kodującymi domeny CH2 i CH3 IgGI, a także zawiera unikalne miejsce Xmal na połączeniu pomiędzy sekwencjami kodującymi jednostki CH3 IgG1 i IL-2. Fragment DNA kodujący sekwencje CH3 i CH4 ludzkiej IgM jest wytworzony przez amplifikację PCR z ludzkiego genomowego DNA stosując następujące primery:

5-GCA GCCGGC CCTGAGCCTTGGCTTCCCAGAGCG-3' (SEQ ID NO: 29); oraz

5-GCT CCCGGG TCĄGTAGCAGGTGCCAGCTGTGTCG-3' (SEQ ID NO: 30)

Alternatywnie stosuje się następujące primery; posiadają one taką cechę, iż cysteina znajdująca się najbliżej końca C w jednostce IgM jest zmutowana na serynę.

PL 206 701 B1

5-GCA GCCGGC CCTGAGCCTTGGCTTCCCAGAGCG-3' (SEQ ID NO: 31) oraz

5-GCT CCCGGG TęAGTAGCTGGTGCCAGCTGTGTCG-3' (SEQ ID NO: 32);

Otrzymany fragment DNA jest łączony z Ngo M IV i Xmal, a następnie jest bezpośrednio lub pośrednio łączony z pdHL7-huKSY1-IL2, która była pocięta przez Ngo M IV i Xmal. Na przykład, fragment PCR kodujący domeny CH3 i CH4 IgM jest w pierwszej kolejności subklonowany w wektorze takim, jak wektor klonujący TA (lnvitrogen, Carlsbad CA), sekwencja tego wkładu jest weryfikowana, a następnie wkład jest usuwany z zastosowaniem Ngo M IV i Xmal oraz przyłączany do pdHL7huKSY1-IL2. Sekwencja aminokwasów otrzymanego ciężkiego łańcucha hybrydy izotypów, przyłączonego do ludzkiej IL-2 jest przedstawiona jako SEQ ID 33. Fragment IgM białka fuzyjnego został podkreślony. Z powodu naturalnie występującego polimorfizmu ciężkich łańcuchów ludzkiej IgM, jest także możliwe wytworzenie pokrewnych sekwencji, które są funkcjonalnie podobne.

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSVNSGALTSGVHTFPAV

LQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC

PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH

NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKD

QDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSYKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTN1SES

HPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVY

ELPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQ

APGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCWAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSL

VMSDTAGTCY (SEQ ID NO: 33)

Możliwych jest wiele alternatywnych strategii konstrukcji DNA. Na przykład sekwencja DNA kodująca domeny CH3 i CH4 IgM może być wytworzona z zastosowaniem RT-PCR z linii komórkowej lub populacji komórek, w których zachodzi ekspresja IgM. Primer 3' PCR może być taki sam, jak ten przedstawiony powyżej, ale primer 5' zawiera sztuczne miejsce składania 5' pomiędzy miejscem Ngo MIV a początkiem sekwencji kodującej CH3 IgM.

Komórki eukariotyczne są następnie transfekowane z otrzymanym plazmidem, pdHL7-óuKSy1^-IL2, a otrzymane białko ulega ekspresji i wydzieleniu z komórki. Na przykład, stosuje się komórki i sposoby opisane we wcześniejszych przykładach. Oczyszczone białko jest poddawane badaniom, na przykład z zastosowaniem elektronowego mikroskopu lub chromatografii sączenia molekularnego oraz stwierdza się, czy mają polimeryczną strukturę. Oczyszczone białko jest dalej badane, na przykład za pomocą mapowania peptydowego, i okazuje się, że cysteina w sekwencji...ASICEDD....

(SEQ ID NO: 34) tworzy wewnątrz-łańcuchowe wiązanie disulfidowe z innymi podjednostkami hybrydy izotypu IgG/IgM. Przykłady takich połączeń są zilustrowane na rysunku fig. 4. Oprócz pentamerycznej struktury z rysunku fig. 4, końcowa forma białka hybrydy izotypu IgG/IgM może być heksamerem lub innym typem polimerycznej struktury.

Okazuje się, że otrzymane białko fuzyjne hybrydy izotypu IgG/IgM wiąże się z receptorami Fcy. Na przykład, białko fuzyjne wiąże się z komórkami J774 w sposób, który konkuruje z ludzką IgG.

P r z y k ł a d 15:

Ekspresja przeciwciała hybrydy izotypu z zastosowaniem składników IgG1 i lqG4

Celem doświadczeń w przykładach 15-17 było, częściowo, zaprezentowanie użyteczności przeciwciał hybrydy izotypu w polepszaniu formowania cząsteczek składających) się przede wszystkim z lgG4. W zasadzie, powszechnie korzystną formą cząsteczki IgG jest forma H2L2, z dwoma ciężkimi i dwoma lekkimi łańcuchami. Jednakże znacząca frakcja przeciwciał lgG4 jest syntetyzowana jako HL „cząsteczki połówkowe” z jednym ciężkim i jednym lekkim łańcuchem. Angal et al. (1993; Molec. Immunol. 30:105) opisuje substytucję seryny na prolinę, która obniża poziom „cząsteczek połówkowych” występujący w przypadku wydzielanych ludzkich lgG4.

PL 206 701 B1

Przykład ten porównuje właściwości formowania trzech przeciwciał zawierających te same regiony V: formę lgG4, formę z regionem zawiasowym z IgG1 oraz domenami CH1, CH2 i CH3 z lgG4 oraz formę lgG4 z mutacją w regionie zawiasowym (Angal et al. ibid.).

Stosując standardowe techniki konstruowania plazmidów, stworzono plazmid zakończony pdHL7-KS-Y4. Plazmid ten jest identyczny z plazmidem pdHL7-huKSY2 opisanym w przykładzie 5, z wyjątkiem tego, że koduje region stały ciężkiego łańcucha lgG4 zamiast regionu stałego ciężkiego łańcucha lgG2.

Aby stworzyć pdHL7-KS-Y4h, plazmid pdHL7-KS-Y2h był hodowany w szczepie dcm (-) E. coli, plazmid DNA izolowany, a fragment Pstl-Stul o długości 60 bp kodujący zmodyfikowany region zawiasowy IgG1 był izolowany i stosowany do zastąpienia odpowiadającego mu fragmentu w pdHL7-KS-Y4.

Dla porównania, forma lgG4 z mutacją w regionie zawiasowym (Angal et al., ibid) była stworzona następująco. Dupleks oligonukleotydów kodujący region zawiasowy γ4 z substytucją seryny na prolinę, i lepki koniec 5' Pstl oraz tępy koniec 3' Stul, był oznaczony następująco:

Pstl ES KYG PPCPPC P (SEQ ID NO: 35)

GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA CCT TGC CCA GGTAAG

ACGT CTC AGG TTT ATA CCA GGGGGT ACG GGT GGA ACG GGT CCATTC

Stul

CCAACCCAGG (dopełnienie z SEQ ID NO: 36)

GGTTGGGTCC (SEQ ID NO: 36)

Ten dupleks oligonukleotydów stosowany był, aby zastąpić odpowiadający mu fragment DNA w pdHL7-KS-Y4 w celu otrzymania pdHL7-KS-Y4(S na P).

Plazmidy pdHL7-KS-Y4, pdHL7-KS-Y4h i pdHL7-KS-Y4(S na P) były transfekowane do komórek ssaków według standardowych) procedur, na przykład jak opisano w Lo et al., (1998; Protein Engineering 11:495-500). Białka przeciwciała kodowane przez pdHL7-KS-Y4, pdHL7-KS-Y4h i pdHL7-KS-Y4 (S na P) były oczyszczane z supernatantu transfekowanych komórek i analizowane z zastosowaniem SDS żelowej elektroforezy, w której porównano zredukowane i niezredukowane próbki.

Poprzez badanie niezredukowanych cząsteczek odkryto, że populacja przeciwciała KS-y4 występuje w 50% jako HL „cząsteczka połówkowa” i w 50% jako cząsteczka H2L2. W przeciwieństwie, populacja przeciwciała KS-Y4h i populacja przeciwciała KS-y4(S na P) występuje prawie w całości jako cząsteczka H2L2. Stosunek cząsteczek połówkowych HL był prawie taki sam w populacji przeciwciała KS-Y4h i populacji przeciwciała KS-y4(S na P). Podczas badania zredukowanych cząsteczek, wzór ciężkich i l ekkich łańcuchów obserwowany w przypadku KS-y4, KS-Y4h i KS-y4(S na P) był nie do rozróżnienia.

P r z y k ł a d 16:

Ekspresja białek fuzyjnych hybrydy izotypu przeciwciała z zastosowaniem składników IgG1 i lqG4

Plazmid pdHL7-KS-Y4-IL2 został opisany w Gillies et al. (Cancer Research [1999] 59:2159). Plazmid ten koduje białko fuzyjne przeciwciała z regionami V, które rozpoznaje antygen EpCAM i zawiera ciężki łańcuch z lgG4 z przyłączoną interleukiną-2 na końcu C.

Plazmidy pdHL7-KS-Y4h-IL2 i pdHL7-KS-Y4(S na P)-IL2 zostały stworzone z zastosowaniem procedur rekombinacji DNA analogicznych do tych stosowanych w przykładzie 15. Plazmidy pdHL7-KS-y4-IL2, pdHL7-KS-Y4h-IL2 i pdHL7-KS-Y4(S na P)-IL2 były transfekowane do komórek ssaków według standardowych) procedur, a odpowiadające im białka ulegały ekspresji i były oczyszczane według standardowych procedur, na przykład, jak opisano w Lo et al. (ref.). Białka fuzyjne kodowane przez pdHL7-KS-Y4-IL-2, pdHL7-KS-Y4h-IL-2 i pdHL7-KS-Y4(S na P)-IL-2 były oczyszczane z supernatantu transfekowanych komórek i analizowane z zastosowaniem SDS żelowej elektroforezy, w której porównano zredukowane i niezredukowane próbki.

Poprzez badanie niezredukowanych cząsteczek odkryto, że populacja białka fuzyjnego KS-y4-IL-2 występuje w 50% jako HL „cząsteczka połówkowa” i w 50% jako cząsteczka H2L2. W przeciwieństwie,

PL 206 701 B1 populacja białka fuzyjnego KS-y4h-IL-2 i populacja białka fuzyjnego KS-y4(S na P)-IL-2 występuje prawie w całości jako cząsteczka H2L2. Stosunek cząsteczek połówkowych HL był prawie taki sam w populacji białka fuzyjnego KS-y4h-IL-2 i populacji białka fuzyjnego KS-y4(S na P)-IL-2. Podczas badania zredukowanych cząsteczek, wzór ciężkich i lekkich łańcuchów obserwowany w przypadku KS-y4-IL-2, KS-y4h-IL-2 i KS-y4(S na P)-IL-2 był nie do rozróżnienia.

P r z y k ł a d 17:

Ekspresja białek fuzyjnych hybrydy izotypów Fc z zastosowaniem składników IgG1 i lqG4

Aby stworzyć zestaw plazmidów do ekspresji białek fuzyjnych zawierających region zawiasowy, domenę CH2 i CH3 oraz jednostkę niebędącą Ig, w których jednostki Ig pochodzą od lgG4 i IgG1, powzięto następujące kroki.

W pierwszej kolejności, stosując procedury analogiczne do tych opisanych w przykładzie 1, stworzono wektor ekspresji kodujący region Fc z lgG4 poprzez zastąpienie sekwencji DNA pdCs-huFcy1 pochodzącej od IgG1 (Lo et al. [1998] Protein Engineering 11:495-500) sekwencjami kodującymi odpowiadającą mu część lgG4. Szczególnie, następujący oligonukleotyd

ESKYGPP CP SC (SEQ ID NO: 37)

C TTA AGC GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA TCA TGC (SEQ ID NO: 38), który koduje miejsce AfIII na końcu 5', był stosowany jako primer 5' do amplifikacji segmentu DNA kodującego regiony zawiasowe, CH2 i CH3 lgG4. Primer 3' zawierał miejsce Xhol na jego końcu 5', analogicznie do primera stosowanego w przykładzie 1 do amplifikacji regionu Fc lgG2. Otrzymany fragment AfIII był wstawiany do Xhol+Aflll-cut pdCs-huFcy1, aby stworzyć pdCs-huFcy4.

Aby ułatwić wstawienie kwasów nukleinowych! kodujących jednostki nie będące Ig na końcu C Fcy4, stworzone zostało miejsce Smal poprzez wprowadzenie poniższych zmian od Leu do Pro w pobliżu końca C regionu kodującego Fcy4 w pdCs-huFcy4, w następujący sposób:

S L G K STOP S P G K STOP (SEQ ID NO: 39) (SEQ ID NO: 40)

TCT CTG GGT AAA TGA zostało zmienione na TCC CCG GGT AAA TGA (SEQ ID NO: 41) (SEQ ID NO: 42)

W celu wprowadzenia miejsca Smal do pdCs-huFcy4 zastosowano standardowe techniki ukierunkowanej mutagenezy.

Aby stworzyć plazmid zakończony pdCs-huFcy4h, kodujący zmodyfikowany region zawiasowy IgG1, po którym występują domeny CH2 i CH3 z lgG4, zastąpiono fragment Stul-Xhol z pdCs-huFcy2h (Przykład 1), który koduje domeny CH2 i CH3 z lgG2, odpowiadającym fragmentem z pdCs-huFcy4. W konstrukcji tej, każdy rodzimy plazmid pochodził ze szczepu dcm (-) E.coli. Plazmid pdCs-huFcy4 był całkowicie poddany trawieniu przez Xhol i częściowemu trawieniu przez Stul, ze względu na istnienie dodatkowego miejsca Stul w DNA kodującym y4, aby otrzymać fragmenty o długości około 300, 500 i 800 par zasad. Fragment o długości około 800 par zasad stosowany był w celu zastąpienia odpowiadającego mu fragmentu w pdCs-huFcy2h.

cDNA IFNβ sklonowany był z zastosowaniem PCR stosując sensowny primer CCCGGGT ATG AGC TAC AAC TTG CTT GGA TTC (SEQ ID NO: 43), gdzie ATG jest N-terminalną resztą dojrzałego białka, a CCCGGG jest wstawionym miejscem restrykcyjnym Smal oraz stosując tylny primer CTCGAG TCA GTT TCG GAG GTA ACC TGT AAG (SEQ ID NO: 44), gdzie TCA jest antykodonem dla kodonu kończącego translację, a CTCGAG jest wstawionym miejscem restrykcyjnym Xhol. Matrycowym DNA był pLG117R (Taniguchi et al., [1980] Proc.Nat. Acad.Sci. USA 77: 5230-5233) nabyty od American Type Culture Collection (ATCC numer 31903). Po weryfikacji sekwencji, sklonowany fragment Smal-Xhol był dołączany do miejsc Smal i Xhol w wektorze ekspresji pdCs-huFcy4, aby otrzymać pdCs-huFcy4-IFNe. Podobnymi sposobami opracowano także analogiczny plazmid ekspresji pdCs-huFcy4h-IFNe.

W celu stworzenia plazmidu ekspresji pdCs-huFcy4(S na P)-IFNe zsyntetyzowano następujący dupleks oligonukleotydów kodujący region zawiasowy y4 z substytucją seryny na prolinę, oraz 5' lepki koniec AfIII i 3' tępy koniec Stul:

PL 206 701 B1

AfIII ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 45)

TTA AGC GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA CCT TGC CCA GGT

G CTC AGG TTT ATA CCA GGG GGT ACG GGT GGA ACG GGT CCA

Stul

AAGCCAACCCAGG (SEQ ID NO: 46)

TTC GGTTGGTCC (dopełnienie z SEQ ID NO: 46)

Powyższy DNA zastosowany był do zastąpienia odpowiadającego mu fragmentu DNA w pdCs-Fc-Y4-IFNe, aby otrzymać pdCs-Fc-Y4(S na P)-IFNe.

Każdy plazmid pdCs-huFcY4-IFNe, pdCs-huFcY4h-IFNe, i pdCs-huFcY4(S na P)-IFNe był transfekowany do komórek ssaków. Białka ulegające ekspresji zawierające Fc były oczyszczane i badane przez redukującą i nieredukującą SDS elektroforezę żelową. Odkryto, że znacząca część białka huFcY4-IFNe wydzielanego z komórek ssaków jest raczej monomerycznymi cząsteczkami połówkowymi niż dimerami jak zwykłe przeciwciała. Jednakże ulegające ekspresji białka fuzyjne huFcY4h-IFNe i huFcY4(S na P)-IFNe były prawie całkowicie właściwie uformowanymi dimerami. Dla obu białek fuzyjnych: huFcY4h-IFNe jak i huFcY4(S na P)-IFNe, stosunek monomeru był niemal identyczny.

Podsumowując, wyniki z przykładów 15, 16 i 17 wskazują, że przeciwciała hybrydy izotypu i białka fuzyjne Ig składające się zasadniczo z lgG4, ale posiadające zmodyfikowany region zawiasowy z I IgG1 posiadają lepsze właściwości formowania w porównaniu do odpowiadających) białek pochodzących całkowicie z lgG4. Ponadto, wyniki z przykładów 15-17, w połączeniu z innymi przykładami, przedstawiają, że ulepszone formowanie białek hybrydy izotypów może się wyrażać na różne sposoby. Na przykład, w niektórych przypadkach, przeciwciało hybrydy izotypu lub białko fuzyjne wykazują obniżone właściwości tworzenia agregatów, w porównaniu do odpowiadających im przeciwciał lub białek fuzyjnych Ig pojedynczego izotypu; a w innych przypadkach przeciwciało hybrydy izotypów lub białko fuzyjne wykazują polepszoną właściwą oligomeryzację, w porównaniu do odpowiadających im pojedynczych przeciwciał lub białek fuzyjnych Ig.

P r z y k ł a d 18:

Ekspresja białek fuzyjnych hybrydy izotypu Fc z zastosowaniem składników pochodzących z IgG1 i lgG4

Aby stworzyć białko fuzyjne Fc-erytropeotyna, które w minimalnym stopniu tworzy agregaty podczas wydzielania z komórek ssaków, stworzono następujący plazmid ekspresji z zastosowaniem standardowych technik molekularnej biologii. Zastosowano fragment DNA Xmal-Xhol zawierający sekwencję kodującą formę ludzkiej erytropoetyny z mutacjami skutkującymi substytucjami aminokwasów: His32Gly, Cys33Pro, Trp88Cys i Pro90Ala, jak ujawniono w opisie patentowym WO 01/36489. Odpowiadająca sekwencja białka jest pokazana w SEQ ID NO: 47:

APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEGPSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVG

QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPCEGLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRAL

GAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR

Powyższy fragment DNA Xmal-Xhol był wstawiony do plazmidu wektorowego, który kodował region zawiasowy z IgG1 oraz regiony CH2 i CH3 z lgG2, który był zasadniczo taki sam jak stworzony wektor w przykładzie 1, z wyjątkiem tego, że występowały dwa zestawy mutacji, które skutkowały w substytucjach aminokwasów w końcu C regionu CH3, w taki sposób, że sekwencja na połączeniu końca C CH3 i koniec N Epo jest następująca:

...TQKSATATPGA-APPRLI.... (SEQ ID NO: 48)

PL 206 701 B1

Pierwszy zestaw mutacji, które zmieniały sekwencję KSLSLSPG (SEQ ID NO: 49) CH3 regionu lgG2 na KSATATPG (SEQ ID NO: 45), jest ujawniona w opisie patentowym U.S. 60/280,625. Efektem substytucji Leu-Ser-Leu-Ser (pozycje od 3 do 6 w SEQ ID NO: 49) przez Ala-Thr-Ala-Thr (pozycje od 3 do 6 w SEQ ID NO: 50) jest usunięcie potencjalnych nieswoistych epitopów limfocytu T, które mogą powstać ponieważ połączenie między ludzkim Fc a ludzką erytropoetyna zawiera nieswoiste sekwencje peptydowe. Drugi zestaw mutacji obejmujący substytucję pojedynczego aminokwasu K na A w C-terminalnym aminokwasie regionu CH3 jest ujawniony w opisie patentowym U.S. 09/780,668.

Otrzymany plazmid był transfekowany do komórek NS/0 i białko fuzyjne Fc-EPO było wydzielane i oczyszczane według procedur z przykładu 1 i 2. Po oczyszczeniu opartym na wiązaniu z białkiem A, białko huFcY2h-huEPO zawierające substytucje CH3 z lgG2 i erytropoetyny opisane powyżej było analizowane z zastosowaniem chromatografii sączenia molekularnego i stwierdzono, że zawiera 97% monomeru oraz 90% monomeru z dwóch niezależnych procedur przygotowawczych. Odkryto, że białko huFcY2h-huEPO zawierające substytucje CH3 z lgG2 i erytropoetyny opisane powyżej jest prawie tak aktywne na poziomie molekularnym, jak ludzka erytopoetyna w opartej na komórce metodzie, która mierzyła zdolność białka erytropoetyny do stymulacji działu komórek TF-1. Metoda była przeprowadzona jak przedstawiono w opisie patentowym WO01/S6489.

Ponadto, analizowane były połączenia nie zmutowanej ludzkiej erytropoetyny z końcem C regionu Fc składającego się albo z IgG1 (region zawiasowy-CH2-CH3), lgG2(region zawiasowy-CH2-CH3) albo z IgG1 (region zawiasowy)-lgG2(CH2-CH3). Plazmidy ekspresji zawierające niezmutowane sekwencje ludzkiego Fc i niezmutowane sekwencje erytropoetyny były stworzone analogicznie do plazmidu opisanego powyżej i w przykładzie 1. Komórki NS/0 były transfekowane plazmidami ekspresji Fcy1-Epo, Fcy2-Epo i FcY2h-Epo, a stabilne klony były izolowane po przeglądnięciu w przybliżeniu równej liczby klonów dla każdego plazmidu. Najlepiej wytwarzające klony dawały 50 μg/ml dla Fcy1-Epo, 20 μg/ml dla FcY2-Epo i 120 μg/ml dla FcY2h-Epo.

Wynalazek może być realizowany w innych specyficznych formach bez odejścia od ich charakteru czy zasadniczych właściwości. Przedstawione powyżej realizacje powinny być zatem traktowane wyłącznie jako ilustracje niż jako ograniczenia zakresu jego ochrony, którego istota została określona w zastrzeżeniach patentowych. Zakłada się, że wszystkie zmiany, które wchodzą w znaczenie i zakres równoważności zastrzeżeń zawierają się w nich.

Wszystkie patenty, zgłoszenia patentowe i naukowe publikacje wymienione w opisie są załączone w całości poprzez odesłanie.

PL 206 701 B1

WYKAZ SEKWENCJI <110>Lexigen Pharmacutical Corp.

Gillies, Stephen Way, Jeffrey <120> Technologia ekspresji dla białek zawierających jednostkę będącą hybrydą izotypów przeciwciała.

<130>LEX-016PC <150>US 60/274,096 <151 >2001-03-07 <160>50 <170> Patentln wersja 3.0 <210> 1 <211>12 <212> PRT PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> sekwencja zawiasowa lgG2 <400>1

Glu Arg Lys Ser Ser Val Glu Cys Pro Cys Pro

5 10 <210>2 <211> 12 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> Sekwencja zawiasowa hybrydy lgG2-lgG4 <400> 2

Glu Ser Lys Tyr Gly Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

5 10 <210>3 <211>5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja

PL 206 701 B1 <220 <223> sekwencja CH2 domeny IgE <4003

Val Asn Leu Thr Trp

5 <2104 <211>5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> sekwencja CH2 domeny lgG1 <400>4

Val Lys Phe Asn Trp

5 <210>5 <211>5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> sekwencja CH2 domeny lgG3 <400>5

Val Gin Phe Lys Trp

5 <210>6 <211>5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> miejsce glikozylacji z IgD <400>6

Asn Thr Ser Gly Phe

5

PL 206 701 B1 <210>7 <211>5 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> miejsce glikozylacji z IgD <400>7

Leu Asn Ala Ser Arg

5 <210>8 <211>29 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223>primer przedni dla ludzkiego Fc gamma 2 <400>8 ccttaagcga gcgcaaatgt tgtgtcgag 29 <210>9 <211>21 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> region kodujący region zawiasowy ludzkiego Fc gamma 2 <400>9 gagcgcaaat gttgtgtcga g 21 <210>10 <211 >29 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> primer tylny dla ludzkiego Fc gamma 2 <400>10 cctcgagtca tttacccggg gacagggag 29 <210> 11 <211 >30

PL 206 701 B1 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> sekwencja DNA dla wyższego regionu CH3 <400> 11 ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 30 <210>12 <211 >30 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223>primer przedni do wprowadzenia substytucji C na A w górnym regionie CH3 <400>12 ctgcccccat cacgggagga gatgaccaag 30 <210>13 <211 >34 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> primer tylny do wprowadzenia substytucji C na A w regionie CH3 <400>13 ggtcatctcc tcccgtgatg ggggcagggt gtac 34 <210>14 <211>12 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> region zawiasowy gamma 2 <400>14

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210>15 <211 >62 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja

PL 206 701 B1 <220>

<223>egzon regionu zawiasowego gamma 2 <400>15 cttaagcgag cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ct <210>16 <211>15 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> sekwencja zawiasowa gamma 1 z mutacją Cys na Ser <400>16

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 15 10 15 <210> 17 <211>71 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223>fragment DNA zawierający egzon regionu zawiasowego gamma 1 <400>17 cttaagcgag cccaaatctt ctgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc caggtaagcc agcccaggcc t <210> 18 <211>112 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> sekwencja kodująca peptyd glukagonopodoby 1 <400>18 cttaagccat gctgaaggga cctttactag tgatgtaagt tcttatttgg aaggccaagc 60 tgccaaggaa ttcattgctt ggctggtgaa aggccgagga ggatccttaa gc 112

PL 206 701 B1 <210>19 <211>31 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> peptyd glukagonopodoby 1 <40019

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr leu Glu Gly

10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210>20 <211> 19 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> primer przedni dla stałego regionu immunoglobuliny gamma 2 <40020 caagctttct ggggcgagc 19 <210>21 <211>29 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> primer tylni dla stałego regionu immunoglobuliny gamma 2 <40021 cctcgagtca tttacccggg gacagggag 29 <210>22 <211>19 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> primer przedni dla regionu zawiasowego gamma 1

PL 206 701 B1 <40022 ctgcagagcc caaatcttc 19 <210>23 <211>19 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223>primer tylni dla regionu zawiasowego gamma 1 <400>23 cagctggggc ctgtccctg 19 <21024 <211>10 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220 <223>sekwencja w pDHL2-huKs przeciwciała <400>24 gggtaaatga 10 <210>25 <211 >89 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223>egzon regionu zawiasowego lgA1 <400>25 cttaagtccc tcaactccac ctaccccatc tccctcaact ccacctaccc catctccctc 60 atgctgccac ggtaagccag cccaggcct 89 <210>26 <211>21 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> region zawiasowy lgA1

PL 206 701 B1 <40026

Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser

10 15

Pro Ser Cys Cys His 20 <210>27 <211>85 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> górne pasmo zastąpienia <40027 ttaagtccct caactccacc taccccatct ccctcaactc cacctacccc atctccctca 60 tgctgccacg gtaagccagc ccagg 85 <210>28 <211>81 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223>dolne pasmo zastąpienia <400>28 cctgggctgg cttaccgtgg cagcatgagg gagatggggt aggtggagtt gagggagatg 60 gggtaggtgg agttgaggga c 81 <21029 <211 >33 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223>primerdla IgM CH3 i CH4 <40029 gcagccggcc ctgagccttg gcttcccaga gcg 33

PL 206 701 B1 <210>30 <211 >34 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> primer dla IgM CH3 i CH4 <400>30 gctcccgggt cagtagcagg tgccagctgt gtcg 34 <210>31 <211>33 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> primer do zmutowania IgM w końcu C z cysteiny na serynę <400>31 gcagccggcc ctgagccttg gcttcccaga gcg 33 <210>32 <211 >34 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> primer do zmutowania IgM w końcu C z cysteiny na serynę <400>32 gctcccgggt cagtagctgg tgccagctgt gtcg 34 <210>33 <211>460 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223>stały region dla hybrydy lgG1-lgM.

<400>33

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15

PL 206 701 B1

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ale Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Vla Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Asp 210 215 220

Gin Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser 225 230 235 240

Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu 245 250 255

Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gin Asn Gly Glu 260 265 270

PL 206 701 B1

Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr 275 280 285

Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser 290 295 300

Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro 305 310 315 320

Leu Cys Gin Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro 325 330 335

Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gin Leu Asn Leu Arg Glu 340 345 350

Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val 355 360 365

Phe Val Gin Trp Met Gin Arg Gly Gin Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr 370 375 380

Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gin Ala Pro Gly Arg Tyr Phe 385 390 395 400

Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu 405 410 415

Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr 420 425 430

Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val 435 440 445

Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr 450 455 460 <210>34 <211>7 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> sekwencje peptydowa w hybrydzie lgG1-lgM <400>34

Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp 1 5

PL 206 701 B1 <210>35 <211> 12 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> region zawiasowy lgG4 z mutacją Ser na Pro <400>35

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

5 10 <210>36 <211 >56 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223>dupleks oligonukleotydów <400>36 acgtctcagg tttataccag ggggtacggg tggaacgggt ccattcggtt gggtcc 56 <210>37 <211>11 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> region zawiasowy lgG4 <400>37

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys

5 10 <210>38 <211>40 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> primer dla regionu zawiasowego lgG4, regionów CH2 i CH3 <400>38 cttaagcgag tccaaatatg gtcccccatg cccatcatgc 40

PL 206 701 B1 <210>39 <211 >4 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> sekwencja peptydowe w pobliżu końca C regionu kodującego Fc gamma 4 <400>39

Ser Leu Gly Lys <210>40 <211>4 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> sekwencja peptydowa w pobliżu końca C regionu kodującego Fc gamma 4 z mutacją Leu na Pro <400> 40

Ser Pro Gly Lys <210>41 <211>15 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223>sekwencje peptydowe w pobliżu końca C regionu kodującego Fc gamma 4 <400>41 tctctgggta aatga 15 <210>42 <211>15 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> sekwencja w pobliżu końca C regionu kodującego Fc gamma 4 z mutacją Leu na Pro

PL 206 701 B1 <40042 tccccgggta aatga 15 <21043 <211>31 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223>IFN beta sensowny primer <400>43 cccgggtatg agctacaact tgcttggatt c 31 <210>44 <211 >30 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223>IFN beta primer tylny <400>44 ctcgagtcag tttcggaggt aaccgtaag 30 <210>45 <211>12 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> region zawiasowy Fc gamma 4 z mutacją Ser na Pro <400 45

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210>46 <211 >58 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

PL 206 701 B1 <223>dupleks oligonukleotydów kodujący Fc gamma 4 zawierający mutację Ser na Pro <400>46 ttaagcgagt ccaaatatgg tcccccatgc ccaccttgcc caggtaagcc aacccagg 58 <210>47 <211>166 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> sekwencja białkowa dla zmutowanej formy białka erytropoetyny <40047

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu

10 15

Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu Gly 20 25 30

Pro Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45

Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala Val Glu Val Trp 50 55 60

Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu

70 75 80

Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Cys Glu Gly Leu Gin Leu His Val Asp 85 90 95

Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110

Gly Ala Gin Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125

Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140

Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160 ·

Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165

PL 206 701 B1 <210>48 <211>17 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> sekwencja na połączeniu CH3-Epo <400>48

Thr Gin Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Ala Pro Pro Arg Leu 15 10 15

Ile <210>49 <211>8 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> sekwencja CH3 lgG2 <400>49

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 <210>50 <211>8 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> region CH3 lgG2 <400>50

Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly 1 5

PL 206 701 B1

Claims (14)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Immunoglobulinowe białko fuzyjne będące hybrydą izotypów składające się z jednostki immunoglobuliny połączonej z jednostką niebędącą immunoglobuliną, znamienne tym, że jednostka immunoglobuliny zawiera pierwszą domenę z pierwszego izotypu przeciwciała i drugą domenę z drugiego izotypu przeciwciała, przy czym pierwsza domena z pierwszego izotypu przeciwciała jest regionem zawiasowym lgG1, zaś druga domena z drugiego izotypu przeciwciała jest domeną lgG2 CH2 i CH3 lub domeną lgG4.
2. 2. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że cysteina leżąca najbliżej końca N regionu zawiasowego lgG1 jest zmutowana.
3. 3. Białko fuzyjne według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że miejsce połączenia pomiędzy jednostką Ig i jednostką niebędącą Ig jest zmutowane.
4. 4. Białko fuzyjne według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienne tym, że jednostka niebędąca immunoglobuliną jest połączona do końca C jednostki immunoglobuliny.
5. 5. Białko fuzyjne według zastrz. 3 albo 4, znamienne tym, że miejsce połączenia pomiędzy jednostką Ig i jednostką nie będącą Ig jest zmutowane poprzez zmianę lizyny na końcu C jednostki immunoglobuliny na alaninę lub leucynę.
6. 6. Białko fuzyjne według dowolnego z zastrz. od 1 do 5, znamienne tym, że jednostka immunoglobuliny zawiera domenę CH1.
7. 7. Białko fuzyjne według zastrz. 6, znamienne tym, że jednostka immunoglobuliny zawiera region zawiasowy igG1, domenę CH1, CH2 i CH3 lgG2 i miejsce wiążące antygen.
8. 8. Białko fuzyjne według dowolnego z zastrz. od 1 do 4, znamienne tym, że ma strukturę X - Fc, Fc - X lub X - Fc - Y, gdzie Fc oznacza jednostkę immunoglobuliny a X, Y oznacza jednostkę nie będącą immunoglobuliną.
9. 9. Białko fuzyjne według dowolnego z zastrz. od 1 do 8, znamienne tym, że jednostka niebędąca immunoglobuliną jest cytokiną lub cząsteczką erytropoetyny.
10. 10. Białko fuzyjne według zastrz. 9, znamienne tym, że cytokina jest przyłączona do końca C jednostki immunoglobuliny, zawierającej regiony V, które rozpoznają antygen EPCAM (przeciwciało KS), oraz region CH1 - CH2 - CH3 lgG2 i region zawiasowy IgGI zmutowany z cysteiny na serynę w miejscu najbliższym końcowi N, przy czym miejsce połączenia pomiędzy jednostką immunoglobuliny a jednostką niebędącą immunoglobuliną jest zmutowane poprzez zmianę lizyny C końca jednostki immunoglobuliny na alaninę.
11. 11. Kwas nukleinowy kodujący białko fuzyjne zdefiniowane w dowolnym z zastrz. od 1 do 10.
12. 12. Replikujący wektor ekspresji zawierający kwas nukleinowy zdefiniowany w zastrz. 11.
13. 13. Eukariotyczna komórka gospodarza zawierająca wektor ekspresji zdefiniowany w zastrz. 12.
14. 14. Sposób zwiększania ekspresji immunoglobulinowego białka fuzyjnego specyficznego izotypu Ig typu dzikiego mającego niepoprawną strukturę z powodu niewłaściwie utworzonego wiązania disulfidowego w czasie homomodernizacji ciężkiego łańcucha przeprowadzany w warunkach in vitro, znamienny tym, że obejmuje zastąpienie regionu zawiasowego immunoglobulinowego białka fuzyjnego regionem zawiasowym z innego izotypu Ig mającego zredukowaną liczbę reszt cysteinowych, prowadzące do utworzenia białka fuzyjnego będącego hybrydą izotypów zdefiniowanego w dowolnym z zastrz. 1-10.