PL206975B1

PL206975B1 - Immunocytokiny o modulowanej selektywności oraz ich zastosowanie

Info

Publication number: PL206975B1
Application number: PL369741A
Authority: PL
Inventors: Stephen D. Gillies
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2001-12-04
Filing date: 2002-12-04
Publication date: 2010-10-29
Also published as: CN1599867A; PT1454138E; RU2312677C9; US20070036752A1; EP1454138A2; WO2003048334A2; HU229098B1; AU2002357784A1; RU2312677C2; KR100988180B1; KR20050044862A; PL369741A1; CA2469151C; US7462350B2; ES2381025T3; CN100390282C; US7186804B2; HUP0402541A2; EP1454138A4; US20030166163A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku są białka fuzyjne zawierające cytokinę o zwiększonej wydajności terapeutycznej oraz sposoby zwiększania wydajności terapeutycznej takich białek fuzyjnych. Takie białka fuzyjne są zdolne do wiązania więcej niż jednego typu kompleksu receptora cytokiny wytwarzanego na komórce a także do wiązania więcej niż jednego typu komórek. Ponadto białka fuzyjne według wynalazku wykazują dłuższy okres półtrwania w krążeniu w organizmie pacjenta niż odpowiednia cytokina występująca naturalnie.

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy ogólnie białek fuzyjnych zawierających cytokinę oraz sposobów zwiększania wydajności terapeutycznej takich białek fuzyjnych, a w szczególności białek fuzyjnych cytokiny, które wykazują dłuższy okres półtrwania w krążeniu w organizmie pacjenta niż odpowiednia naturalnie występująca cytokina i które posiadają ulepszone właściwości lecznicze. Przedmiotem wynalazku jest zwłaszcza białko fuzyjne IL-2 o ulepszonych właściwościach leczniczych.

lnterleukina-2 (IL-2) jest silną cytokiną, która działa na układ odpornościowy generując w pierwszej kolejności odpowiedź immunologiczną za pośrednictwem komórek. We właściwych warunkach IL-2 wytwarzana jest miejscowo w wysokich stężeniach w pobliżu miejsca występowania antygenu w celu zapewnienia koniecznych współ -sygnał ów do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej na ten antygen. Ze względu na jej rolę we wzroście i różnicowaniu limfocytów T, IL-2 uważa się ją za potencjalnie korzystną w immunoterapeutycznych podejściach do leczenia nowotworów. Poza stymulacją limfocytów T, wykazano także, że IL-2 stymuluje limfocyty B, komórki NK, aktywowane limfokiną komórki zabójcze (ang. lymphokine activated killer cells- LAK), monocyty, makrofagi i komórki dendryczne.

IL-2 jest zatwierdzonym czynnikiem terapeutycznym w leczeniu złośliwego raka nerki oraz czerniaka złośliwego ale jej zastosowanie jest ograniczone ze względu na toksyczne działanie uboczne, które obejmuje gorączkę, nudności, krwotoki naczyniowe oraz obniżone ciśnienie. Spośród różnych działań ubocznych obserwowanych w przypadku podania IL-2, efektem toksycznym, który jest najmniej pożądany i który, jak się uważa, zasadniczo koliduje z leczeniem IL-2 jest zespół nieszczelności naczyń (ang. vascular leak syndrome) oraz związane z nim komplikacje.

Istnieje zatem potrzeba dalszego ulepszenia terapeutycznej użyteczności białek IL-2.

Wynalazek opiera się częściowo na identyfikacji mutacji w jednostce IL-2 białka fuzyjnego IL-2 w celu zwiększenia maksymalnej tolerowanej dawki białka w powiązaniu z dawką o maksymalnej efektywności dla tego białka podczas podawania pacjentowi. Korzystne białka fuzyjne są zdolne do wiązania w wyniku bezpośrednich oddziaływań z więcej niż jednym rodzajem receptora wytwarzanego na tej samej komórce w organizmie pacjenta. Korzystne białka fuzyjne cytokiny obejmują cytokinę, która jest zdolna do wiązania więcej niż jednego typu kompleksu receptora cytokiny i więcej niż jednego typu komórek. Wynalazek dostarcza także sposobów do identyfikacji odmian danego białka fuzyjnego cytokiny o użytecznych właściwościach.

Istotą wynalazku jest białko fuzyjne zawierające jednostkę nie będącą IL-2 połączoną z jednostką zmutowanej IL-2, charakteryzujące się tym, że jednostka zmutowanej IL-2 zawiera substytucję aminokwasową zmieniającą kwas asparaginowy na treoninę na pozycji odpowiadającej pozycji 20 (D20T) sekwencji aminokwasowej dojrzałego, ludzkiego białka IL-2 zdefiniowanego sekwencją SEQ ID NO: 3, rzeczona jednostka nie będąca IL-2 zawiera domenę przeciwciała przy białko fuzyjne wykazuje większą selektywność niż białko odniesienia względem komórek wyrażających receptor o wysokim powinowactwie, gdzie czym biał ko odniesienia zawiera jednostkę nie bę d ą c ą IL-2 połączoną z jednostką niezmutowanej IL-2, a rzeczoną selektywność wyznacza się jako stosunek aktywacji komórek wyrażających receptor IL-2RaeY do aktywacji komórek wyrażających receptor IL-2ReY.

Mutacje w białku fuzyjnym według wynalazku zmieniają selektywność białek fuzyjnych względem fuzyjnego białka odniesienia i mogą także skutkować różnicującymi zmianami w powinowactwie białka fuzyjnego do receptora IL-2R/Y·- względem powinowactwa białka fuzyjnego do receptora IL-2RaeY. Korzystne mutacje lub zmiany zmniejszają aktywację przez białko fuzyjne komórek wyrażających receptor IL-2RaeY względem aktywacji przez białko fuzyjne komórek wyrażających receptor IL-2RaeY.

Korzystne białka fuzyjne według wynalazku wykazują ogólnie efekt różnicujący, który jest około 2-krotnie większy. Pod jednym względem efekt różnicujący mierzony jest poprzez odpowiedź proliferacyjną komórek lub linii komórkowych, których wzrost zależy od IL-2. Taką odpowiedź na białko fuzyjne określa się poprzez wartość ED50, którą otrzymuje się kreśląc wykres zależności dawki i odpowiedzi oraz określając stężenie białka, które skutkuje połową maksymalnej odpowiedzi. Stosunek wartości ED50 otrzymanych dla komórek wyrażających receptor IL-2R^y do komórek wyrażających receptor IL-2Ra/Y przypadku białka fuzyjnego do stosunku wartości ED50 dla fuzyjnego białka odniesienia daje pomiar efektu różnicującego dla tego białka fuzyjnego.

Korzystne jest, aby selektywność względem komórek wyrażających receptor o wysokim powinowactwie wynosiła od około 0,1% do około 100% selektywności fuzyjnego białka odniesienia zawierającego jednostkę nie będącą IL-2 połączoną z jednostką zmutowanej ludzkiej IL-2, która zawiera

PL 206 975 B1 substytucję aminokwasową asparaginy na argininę na pozycji odpowiadającej pozycji 88 (N88R) sekwencji aminokwasowej dojrzałego ludzkiego białka IL-2 zdefiniowanego sekwencją SEQ ID NO: 3.

W korzystnej realizacji aminokwas aspargina w pozycji 88 ulega substytucji argininą (N88R). W innej korzystnej realizacji aminokwas kwas asparginowy w pozycji 20 ulega substytucji treoniną (D20T). W innej korzystnej realizacji glutamina w pozycji 126 ulega substytucji kwasem asparginowym (Q126D). Substytucje różnych aminokwasów skutkują selektywnością w działaniu białek fuzyjnych według wynalazku na komórki posiadające receptor IL-2Ra)/ względem komórek posiadających receptor IL-2Rey , która znajduje odzwierciedlenie w powinowactwie białka fuzyjnego do receptora IL-2ReY względem powinowactwa białka fuzyjnego do receptora IL-2Ra3y.

Rzeczona selektywność wynosi korzystnie od około 0,1% do około 30%, korzystniej od około 1% do około 20%, a najkorzystniej od około 2% do około 20% selektywności rzeczonego fuzyjnego białka odniesienia.

Korzystne jest, aby komórki wyrażające receptor IL-2Ra3y wybrane były spośród komórek CTLL-2, Kit 225 i dojrzałych limfocytów T.

Korzystne jest, aby komórki wyrażające receptor IL-2Rapy wybrane były spośród komórek TF-1p i komórek NK.

Korzystne jest, aby jednostka IL-2 była zmutowana na więcej niż jednej pozycji aminokwasowej.

Korzystne jest ponadto, aby jednostka nie będącą IL-2 była zmutowana.

Korzystne jest również, aby jednostka nie będącą IL-2 zawierała zmutowaną domenę przeciwciała.

Korzystne jest, aby jednostka nie będącą IL-2 zawierała domenę przeciwciała wybraną z grupy obejmującej KS-1/4, dl-KS, dl-KS(y4h)(FN>AQ), huKS, huKS(N na Q), dl-NHS76(y2h), dl-NHS(y4h), dl-NHS76(y2h)(FN>AQ), dl-NHS76(y4h)(FN>AQ) oraz 14.18.

Białko fuzyjne według wynalazku stanowi korzystnie białko fuzyjne typu przeciwciało-IL-2 wybrane z grupy obejmującej

KS-ala-IL2(D20T)

KS(y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T)

NHS76(y2h)-ala-IL2(D20T)

NHS76(y2h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T)

NHS76(y2)-ala-IL2-(D20T).

Białko fuzyjne według wynalazku ma korzystnie zastosowanie do leczenia nowotworów.

Istotą wynalazku jest ponadto zastosowanie białka fuzyjnego według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia nowotworów.

Białka fuzyjne z mutacjami w jednej lub większej liczbie pozycji opisanych powyżej wykazują efekt różnicujący, który jest ponad 2-krotnie większy. Korzystnie, efekt różnicujący jest pomiędzy 5-krotny a 10-krotny a bardziej korzystnie pomiędzy około 10-krotny a około 1000-krotny.

Oprócz mutowania aminokwasów w jednostce IL-2, można zmutować aminokwasy w jednostce nie będącej IL-2. W korzystnej realizacji jednostką nie będącą IL-2 jest domena przeciwciała. Domena przeciwciała może zostać wybrana spośród różnych immunoglobulinowych (Ig) przeciwciał, korzystnie przeciwciał IgG, w tym na przykład domen przeciwciał IgG gamma 1, IgG gamma 2, IgG gamma 4 lub dowolnej kombinacji tych domen przeciwciała. Termin „przeciwciało i „immunoglobulina według wynalazku oznacza (i) całe przeciwciało (na przykład monoklonalne lub poliklonalne przeciwciało), (ii) ich fragmenty wiążące antygen, w tym na przykład fragment Fab, fragment Fab', fragment (Fab')2, fragment Fv, jednołańcuchowe miejsce wiążące antygen, sFv, (iii) przeciwciała o podwójnej specyficzności i ich fragmenty wiążące antygen, oraz (iv) przeciwciała o wielokrotnej specyficzności oraz ich fragmenty wiążące antygen. W białkach według wynalazku region Fc immunoglobuliny może także obejmować przynajmniej jeden stały ciężki region immunoglobuliny, na przykład domenę stałą ciężką 2 (ang. constant heavy 2 - CH2) immunoglobuliny, domenę stałą ciężką 3 (CH3) immunoglobuliny, oraz w zależności od typu immunoglobulin zastosowanych do wygenerowania regionu Fc, opcjonalnie domenę stałą ciężką immunoglobuliny (CH4), lub połączenia powyższych. W szczególnych realizacjach w regionie Fc immunoglobuliny może brakować domeny stałej ciężkiej 1 (CH1) immunoglobuliny. Chociaż regiony Fc immunoglobuliny mogą być oparte na dowolnej klasie immunoglobulin, na przykład IgA, IgD, IgE, IgG oraz IgM, korzystne są regiony Fc immunoglobuliny oparte na IgG. Jednostka przeciwciała zawarta w białku fuzyjnym według wynalazku jest korzystnie ludzka, ale może pochodzić z przeciwciała mysiego, lub immunoglobuliny innego ssaka lub zwierzęcia nie będącego ssakiem. Uwzględnia się fakt, że region Fc zastosowany w białku fuzyjnym według wynalazku może zostać

PL 206 975 B1 wykorzystany do konkretnego zastosowania takiej cząsteczki. W jednej z realizacji region Fc pochodzi z izotypu γ 1 immunoglobuliny lub jego odmiany. W innej realizacji region Fc pochodzi z izotypu γ 2 immunoglobuliny lub jego odmiany. W kolejnej realizacji region Fc może pochodzić z izotypu γ3 immunoglobuliny lub jego odmiany. Region Fc może zawierać region zawiasowy, który pochodzi z innych izotypów immunoglobulin niż sam region Fc. Na przykład region Fc może pochodzić z izotypu γ2 immunoglobuliny i zawierać region zawiasowy pochodzący z izotypu γ1 lub jego odmiany. W innej korzystnej realizacji wynalazku region Fc pochodzi z izotypu γ4 immunoglobuliny. Szczególnie korzystne są izotypy γ4, które zostały zmodyfikowane w ten sposób, że zawierają region zawiasowy pochodzący od izotypu γ1 immunoglobuliny lub jego odmiany.

W jednej z realizacji białka fuzyjne według wynalazku zawierają mutacje w jednostce Ig. Użyteczną mutacją jest mutacja w sekwencji QYNSTYR (SEQ ID NO: 1) IgG gamma 1 zmieniająca N na Q; szczególnie użyteczną jest mutacja w sekwencji QFNST (SEQ ID NO: 2) gamma 2 lub 4 zmieniająca motyw dipeptydowy FN na AQ.

Wynalazek obejmuje także konstrukcje DNA kodujące różne białka fuzyjne według wynalazku. Białka fuzyjne według wynalazku są szczególnie użyteczne w leczeniu raka, infekcji wirusowych i zaburzeń odpornościowych.

Te i inne cele, zalety i cechy ujawnionego staną się bardziej klarowne na podstawie następującego opisu i rysunku, na którym:

fig. 1 przedstawia połączenie cytokiny z drugą jednostką białkową, które zmienia naturalne właściwości wiązania cytokiny. Rysunek fig. 1A przedstawia przyłączaną część do IL-2 jako dimeryczną cząsteczkę, taką jak przeciwciało lub fragment Fc białka fuzyjnego zawierającego Fc, i dlatego dwie cząsteczki IL-2 są transportowane na powierzchnię komórki gdy jednostka IL-2 białka fuzyjnego oddziałuje z jego receptorem. Rysunek fig. 1B przedstawia drugi mechanizm, który powoduje ten sam efekt, a fig. 2 przedstawia typowy profil farmakokinetyczny białka fuzyjnego immunocytokiny huKS-IL2 (przedstawiony za pomocą trójkątów) i dwóch odmian huKS-ala-IL2 (przedstawionego za pomocą kółek) oraz huKS-ala-IL2(N88R) (przedstawionego za pomocą gwiazdek).

Wynalazek dostarcza sposobów i kompozycji, które polepszają indeks terapeutyczny białek fuzyjnych IL-2 oraz w szczególności immunocytokin IL-2. Według wynalazku indeks terapeutyczny leczniczej cząsteczki mierzony jest stosunkiem maksymalnej tolerowanej dawki tej cząsteczki do dawki, przy której występuje maksymalna efektywność tej cząsteczki. Wynalazek obejmuje ulepszone odmiany IL-2 immunocytokin, które wykazują znacząco dłuższy okres półtrwania w krwiobiegu w porównaniu do wolnej IL-2. Wynalazek dostarcza także białek fuzyjnych IL-2, a szczególnie immunocytokin IL-2, które wykazują odpowiedź selektywną dla IL-2, która odzwierciedla się obniżoną aktywacją komórek o różnych funkcjach efektorowych przez białka fuzyjne według wynalazku, która jest wiodącą przyczyną działań toksycznych) IL-2. Ponadto wynalazek dostarcza białek fuzyjnych IL-2 o ulepszonej aktywności. Białko fuzyjne IL-2 według wynalazku zawiera zmiany w jednej lub większej liczbie pozycji aminokwasów, które zmieniają względne powinowactwo białka fuzyjnego IL-2 do różnych receptorów IL-2, co skutkuje zmianą biologicznych właściwości białka fuzyjnego IL-2. Wynalazek jest przydatny do obniżenia lub zminimalizowania jakiejkolwiek toksyczności związanej z leczeniem IL-2. Nie wnikając w zarysowany mechanizm jakiejkolwiek toksyczności IL-2, takiej jak VLS, toksyczność ta wynika w części z faktu, że IL-2 jest podawana dożylnie i dlatego działa ogólnoustrojowo w całym organizmie, nawet jeśli efekt działania IL-2 pożądany jest w konkretnym miejscu. Problem ten ulega zaostrzeniu ze względu na fakt, że podanie ustrojowe IL-2 wymaga o wiele wyższej dawki niż wymagałoby podanie miejscowe, które z kolei może powodować toksyczność, nie zaobserwowaną przy niższych dawkach. Wynalazek dostarcza białek fuzyjnych IL-2 o obniżonej toksyczności. Wynalazek dostarcza także sposobów do sporządzania białek fuzyjnych IL-2 o obniżonej toksyczności.

Ogólnie wynalazek ma zastosowanie do białek fuzyjnych zawierających jednostkę IL-2 połączoną z jednostką nie będącą IL-2. Według wynalazku jednostka nie będąca IL-2 może być syntetycznym lub naturalnym białkiem lub jego fragmentem lub odmianą (w tym odmianami gatunkowymi, allelowymi i mutacyjnymi). Korzystne jednostki nie będące IL-2 obejmują jednostki Fc i albuminy. Według wynalazku jednostka IL-2 może być naturalną cząsteczką IL-2 lub jej fragmentem lub odmianą (w tym odmianami gatunkowymi, allelowymi i mutacyjnymi), które zachowują przynajmniej jedną aktywność lub funkcję IL-2 (jednostka IL-2 może być jednostką IL-2, która jest tak zmodyfikowana, że posiada inne powinowactwo wiązania receptora IL-2 według wynalazku).

PL 206 975 B1

Według wynalazku komórki odpowiadają na IL-2 za pośrednictwem specyficznych receptorów na powierzchni komórki (IL-2R), które występują w dwóch formach. Ten receptor o wysokim powinowactwie jest heterotrimeryczny i składa się z podjednostek α, β i y; receptor o pośrednim powinowactwie jest heterodimeryczny i składa się z podjednostek β i γ. Stałe wiązania IL-2 przez te dwie formy IL-2R różnią się o dwa rzędy wielkości. Przenoszenie sygnału odbywa się po cytoplazmatycznej stronie receptora za pośrednictwem oddziaływań pomiędzy kompleksem βγ. Różne typy komórek wytwarzają podjednostki α, β i γ w różnych ilościach. Na przykład aktywowane limfocyty T wyrażają wszystkie podjednostki w celu wytworzenia IL-2RaeY o wysokim powinowactwie, podczas gdy dojrzałe spoczynkowe limfocyty T i komórki NK wytwarzają podjednostki β i γ w celu otrzymania IL-2ReY o pośredniej aktywności. Zatem komórki wymagają różnych poziomów narażenia na IL-2 do pobudzenia, i odwrotnie, poprzez regulowanie aktywnością IL-2 przez specyficzny komórkowy mechanizm, rodzaj odpowiedzi immunologicznej może być kontrolowany.

Sposoby i kompozycje według wynalazku są szczególnie użyteczne w znaczeniu białek fuzyjnych IL-2 takich jak immunocytokiny niosące IL-2. Według wynalazku immunocytokiny niosące IL-2 są syntetycznymi cząsteczkami, które jak wykazano znacząco zwiększają wydajność leczenia IL-2 przez bezpośrednie ukierunkowanie IL-2 do mikrośrodowiska nowotworu. Immunocytokiny są białkami składającymi się z jednostki przeciwciała i jednostki cytokiny, takiej jak jednostka IL-2. Według wynalazku jednostką przeciwciała może być całe przeciwciało lub immunoglobulina lub ich fragment lub odmiana (w tym odmiany gatunkowe, allelowe i mutacyjne), które mają funkcję biologiczną taką jak powinowactwo specyficznego wiązania antygenu. Podobnie jednostka cytokiny według wynalazku może być naturalną cytokiną lub jej fragmentem lub odmianą (w tym odmianą gatunkową, allelową i mutacyjną), która zachowuje przynajmniej pewną aktywność cytokiny. Korzyści z terapii immunocytokiną są oczywiste. Na przykład jednostka przeciwciała immunocytokiny rozpoznaje specyficzny dla nowotworu epitop co skutkuje umieszczeniem cząsteczki immunocytokiny w miejscu nowotworu. Dlatego też wysokie stężenia IL-2 mogą zostać dostarczone do mikrośrodowiska nowotworu, i w ten sposób skutkować aktywacją i proliferacją różnych odpornościowych komórek efektorowych wymienionych powyżej, stosując o wiele niższą dawkę immunocytokiny niż byłaby wymagana dla wolnej IL-2. Ponadto zwiększony czas półtrwania w krwiobiegu immunocytokiny w porównaniu z wolną IL-2 przyczynia się do efektywności tej immunocytokiny. I w końcu naturalne funkcje efektorowe przeciwciała także mogą być wykorzystane, na przykład poprzez aktywowanie cytotoksyczności zależnej od przeciwciała (ang. antibody dependent cellular cytotoxicity - ADCC) w komórkach NK posiadających FcyRIII.

Immunocytokiną IL-2 posiada większą wydajność względem wolnej IL-2. Jednakże pewne cechy immunocytokin IL-2 mogą pogorszyć potencjalne efekty uboczne cząsteczki IL-2. Z powodu znacząco dłuższego czasu półtrwania immunocytokin IL-2 w krwiobiegu w porównaniu do wolnej IL-2, prawdopodobieństwo aktywowania przez IL-2 lub inne fragmenty cząsteczki białka fuzyjnego składników powszechnie występujących w naczyniach zostaje zwiększone. To samo podejście stosuje się do innych białek fuzyjnych, które zawierają IL-2 połączoną z inną jednostką taką jak Fc lub albuminą, co skutkuje zwiększonym okresem półtrwania IL-2 w krwiobiegu.

Wynalazek dostarcza zmienionych białek fuzyjnych IL-2, takich jak IL-2 połączona z całym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała, lub z albuminą, o obniżonej toksyczności w porównaniu z niezmienioną formą takich białek fuzyjnych. Wynalazek dostarcza także białek fuzyjnych z jedną lub większą liczbą zmian w jednostkach IL-2 i/lub jednostkach nie będących IL-2, które zmieniają względną reaktywność białka fuzyjnego w komórkach produkujących podjednostki α, β i γ receptora IL-2 w porównaniu z komórkami produkującymi podjednostki β i γ receptora IL-2. Wynalazek dostarcza także zmienionych białek fuzyjnych zawierających IL-2, które wykazują zmienione powinowactwo do podjednostki α, β lub y receptora IL-2 w porównaniu do niezmienionych form takich białek fuzyjnych.

Wiele białek fuzyjnych IL-2 zawierających przeciwciało wykazuje aktywność IL-2, która jest ilościowo zmieniona w odniesieniu do wolnej IL-2, ale nie jest jakościowo optymalna dla zastosowań terapeutycznych. Wynalazek dostarcza zmodyfikowanych form białek fuzyjnych przeciwciała IL-2, w których IL-2 lub przeciwciało, lub obie jednostki, są zmienione w celu jakościowego polepszenia aktywności IL-2 dla danego zastosowania.

Wynalazek dostarcza także strategii do określania typów modyfikacji, które są szczególnie przydatne w projektowaniu zmodyfikowanych białek fuzyjnych do leczenia chorób.

Rysunek fig. 1 ilustruje możliwe mechanizmy w jakich białko fuzyjne może wiązać się z powierzchnią komórki, w taki sposób, że właściwości wiązania receptora dla jednostki w obrębie białka fuzyjnego zostają zmienione. Na przykład rysunek fig. 1A przedstawia partnera fuzyjnego dla IL-2 jako

PL 206 975 B1 cząsteczkę dimeryczną. Zwiększa to prawdopodobieństwo, że druga cząsteczka IL-2 oddziałuje ze swoim receptorem, na przykład poprzez obniżenie współczynnika eliminacji, co prowadzi do zwiększenia wiązania. Rysunek fig. 1B przedstawia drugi mechanizm, który powoduje ten sam efekt. W komórkach, w których wystę pują oba receptory dla IL-2 jak i dla partnera fuzyjnego IL-2 biał ka fuzyjnego (np. receptor Fc dla części Fc jednostki Ig), taki receptor dla partnera fuzyjnego (np. receptor Fc) może angażować białko fuzyjne i wiązać je na powierzchni komórki, gdzie ma teraz większe prawdopodobieństwo związania receptora IL-2.

Faza l/ll próby białka fuzyjnego przeciwciała-cytokiny, nazwanego huKS-IL2 została niedawno zakończona. huKS-IL2 jest białkiem fuzyjnym składającym się z przeciwciała KS-1/4 połączonego z cytokiną , interleukiną 2. KS-1/4 rozpoznaje powierzchniowy antygen komórek nowotworowych EpCAM (ang. epithelial cell adhesion molecule) i wywiera efekt koncentrowania IL-2 w miejscu nowotworu. W trakcie tej próby mierzono odpowiedź pacjenta na leczenie. Pacjent, który wykazywał znaczącą odpowiedź na terapię doświadczył częściowej reakcji klinicznej, po której nastąpiła stabilizacja choroby i obniżenie zużycia leków znieczulających. Pacjent taki otrzymał wcześniej uprzednią standardową kurację, która zawiodła. Czas życia pacjenta wydłużył się znacząco poza czas oczekiwany w przypadku niezastosowania takiego leczenia.

Zadziwiająco w skutek uprzedniej chemoterapii, populacja limfocytów T tego pacjenta była zasadniczo zniwelowana. Pacjent ten miał o wiele niższą liczbę limfocytów T niż inni pacjenci uczestniczący w próbie. Zakładając, że IL-2 jest znana z aktywacji limfocytów T oraz, że na przykład wiadomo, iż podnosi cytotoksyczność limfocytów T CD8(+) względem komórek nowotworowych, silna reakcja tego pacjenta, u którego w sposób oczywisty brakowało limfocytów T, była nieoczekiwana.

Obserwacja ta skłoniła do dalszych badań nad nowymi białkami fuzyjnymi przeciwciała-IL-2, w których jednostka IL-2 mogła wykazywać zmienioną specyficzność komórkową skutkując polepszeniem indeksu terapeutycznego białek fuzyjnych IL-2.

Z badań struktury krystalicznej IL-2, porównania sekwencji pokrewnych cytokin oraz badań nad ukierunkowana mutagenezą, osiągnięto znaczący postęp w wyjaśnieniu, które aminokwasy w IL-2 wchodzą w kontakt z różnymi podjednostkami receptora IL-2 i ich znaczenia dla aktywności biologicznej. Na przykład reszta D20 konserwatywna w IL-2 u wszystkich gatunków ssaków, jest krytyczną resztą dla wiązania się z podjednostką β receptora IL-2 i różne substytucje w tej pozycji mają wyraźne działania. Na przykład odmiana IL-2(D20K) nie jest zdolna do wiązania jakiegokolwiek kompleksu IL-2R i jest ogólnie nieaktywna, podczas gdy warianty IL-2(D20E) lub IL-2(D20T) zachowują jej biologiczną aktywność. Pozycje aminokwasów R38 i F42 są krytyczne dla wiązania podjednostki α, a podczas gdy mutacje w tych miejscach zmniejszają oddziaływanie IL-2 z receptorem IL-2RaeY o wysokim powinowactwie, ciągle wiąże się to z receptorem IL-2ReY o pośrednim powinowactwie i stąd pewna bioaktywność jest zachowana. N88 jest kolejną resztą, która jest zaangażowana w oddziaływania pośredniczące z podjednostką β, podczas gdy odmiana IL-2 (N88R) ma znacząco obniżone powinowactwo do receptora o pośrednim powinowactwie, jej powinowactwo do receptora o wysokim powinowactwie pozostaje zasadniczo niezmienione. Forma zmutowana N88R IL-2 jest zatem nadal zdolna do aktywowania limfocytów T.

Powinowactwo wiązania białek fuzyjnych według wynalazku dla różnych receptorów można określić wieloma sposobami znanymi w praktyce w tym, na przykład, metodami radioimmunologicznymi.

Możliwe jest zatem zakłócenie struktury IL-2 w taki sposób, aby wykazywała większe powinowactwo w stosunku do jednego z kompleksu receptora IL-2 w porównaniu z innym kompleksem receptora IL-2 poprzez zmutowanie danego aminokwasu, który wchodzi w kontakt z jedną z podjednostek receptora albo poprzez zmianę kombinacji reszt aminokwasów. W konsekwencji cząsteczka ta wykazuje większą aktywność względem jednego typu komórek niż innych typów. Według wynalazku możliwe jest manipulowanie strukturą IL-2 w znaczeniu białka fuzyjnego lg-IL2 w celu otrzymania pożądanego efektu. Ponadto w pewnych okolicznościach odmiana lg-IL2 białka fuzyjnego posiada inne cechy biologiczne niż odpowiednie zmutowane białko wolnej IL-2.

Ponadto możliwe jest, według wynalazku, manipulowanie jednostką IL-2 w białku fuzyjnym, w taki sposób aby wykazywało zmienione powinowactwo względem jednej lub większej liczby podjednostek receptora (α, β lub γ) i powodowało całkowite obniżenie bioaktywności białka fuzyjnego. Takie warianty zdolne są do aktywowania komórek odpowiadających na IL-2, ale wymagają wyższych stężeń niż wolna IL-2. Odpowiednio jeśli białko fuzyjne IL-2 ulega koncentracji w pożądanym miejscu

PL 206 975 B1 docelowym, na przykład poprzez jednostkę kierującą, takie odmiany posiadają ulepszony indeks terapeutyczny.

Wydaje się, że podjednostką α receptora IL-2R odgrywa funkcję wiążącą: ten receptor o niskim powinowactwie wiąże się z IL-2 i utrzymuje IL-2 w pobliżu powierzchni komórki w taki sposób, że efektywne stężenie w sąsiedztwie podjednostek receptora IL-2Re i IL-2Ry na powierzchni komórki zostaje zwiększone. Łącznie podjednostka α i podjednostki β i γ receptora IL-2 tworzą kompleks IL-2R o wysokim powinowactwie. Wynalazek jest oparty częściowo na odkryciu, że białka fuzyjne IL-2 mogą uczestniczyć w złożonych i bezpośrednich oddziaływaniach z receptorami na powierzchni komórki. Na przykład w przypadku białek fuzyjnych zawierających jednostkę przeciwciała, ta jednostka przeciwciała sama może promować wiązanie białka fuzyjnego do powierzchni komórki i ponadto, IL-2 może występować w wielu kopiach w białku fuzyjnym. W wyniku tego IL-2 może być wiązana do komórki wyrażającej tylko podjednostki β i γ IL-2R i posiadać zwiększoną zdolność do aktywowania takich komórek.

Na przykład dimeryczna immunoglobulina (Ig) połączona z IL-2 posiada dwie kopie IL-2, w taki sposób, że wiązanie jednej jednostki IL-2 do jej receptora zwiększa prawdopodobieństwo oddziaływania drugiej jednostki IL-2 z cząsteczką receptora na powierzchni tej samej komórki. Diagram na rysunku fig. 1A przedstawia możliwe konfiguracje białka fuzyjnego lg-IL2 na powierzchni komórki. Wynalazek dostarcza białek fuzyjnych lg-IL2, w których jednostka IL-2 jest zmieniona w celu obniżenia wiązania z receptorem IL-2ReY.

Drugim mechanizmem, w jaki białka fuzyjne Ig-IL2 mogą zmienić wiązanie na powierzchni pewnych komórek odpornościowych jest ten, w którym receptor Fc na powierzchni komórki może wiązać tę część Fc jednostki Ig i stąd wiązać IL-2 na powierzchni komórki posiadającej zarówno receptor Fc jak i receptor IL-2 (rysunek fig. 1B). Takie komórki obejmują komórki NK, limfocyty B oraz makrofagi. Wynalazek dostarcza białek fuzyjnych lg-IL2, w których jednostka Ig jest zmieniona w celu obniżenia wiązania z receptorem Fc. Wynalazek ponadto dostarcza białek fuzyjnych, w których zarówno jednostka Ig oraz jednostka IL-2 zawierają zmiany o charakterze opisanym powyżej.

W oparciu o pogląd, że białka fuzyjne lg-IL2 mogą być sztucznie związane z komórkami posiadającymi podjednostki receptora IL-2, możliwe jest zaprojektowanie wariantów białek fuzyjnych, w których jednostka wiążąca jest zmieniona. Na przykład przydatna jest zmiana właściwości wiązania receptora Fc białka fuzyjnego lg-IL2. Można to uczynić na przykład poprzez zmutowanie miejsc kontaktu znanych aminokwasów w obrębie jednostki Fc lub poprzez usunięcie N-przyłączonych miejsc glikozylacji, albo poprzez mutację lub przez enzymatyczne trawienie tego białka.

Podobnie według wynalazku przydatne jest wprowadzenie mutacji w obrębie jednostki IL-2, która wykazuje efekt wiązania do podjednostek receptora IL-2. Szczególnie przydatnym jest zmutowanie aminokwasów w IL-2, które wchodzą w kontakt z podjednostką β receptora IL-2. Szczególnie użytecznym typem mutacji jest ta, która redukuje energie wiązania pomiędzy IL-2 a IL-2Re ale nie powstrzymuje sterycznie tych oddziaływań. Na przykład mutacje kontaktowego aminokwasu na aminokwas o mniejszym łańcuchu bocznym są szczególnie przydatne. Efektem takich mutacji jest obniżenie powinowactwa IL-2 do postaci β-γ receptora IL-2 w znaczącym stopniu a także aktywacja ścieżki sygnałowej, w której pośredniczą te receptory, ale przy zachowaniu relatywnie małego albo braku efektu wiązania z formą α-β-γ receptora IL-2 lub wpływ na aktywność wywołaną przez IL-2 w komórkach posiadających takie receptory IL-2. W korzystnej realizacji wynalazku mutacje redukują powinowactwo do formy β-γ receptora IL-2, ale nie eliminują go.

Podobnie korzystnym jest wprowadzenie mutacji do aminokwasów na powierzchni IL-2, które oddziałują z podjednostką α receptora IL-2. Szczególnie korzystnym typem mutacji jest ten, który obniża energię wiązania pomiędzy IL-2 a IL-2Ra, ale sterycznie nie przeszkadza w tych oddziaływaniach. Na przykład mutacja kontaktowego aminokwasu na aminokwas o mniejszym łańcuchu bocznym jest szczególnie przydatna. Efektem takich mutacji jest obniżenie powinowactwa dla formy α-β-γ receptora IL-2 w znaczącym zakresie, ale ma ona relatywnie mały efekt lub nie wywiera efektu na wiązanie formy β-γ receptora IL-2. W korzystnej realizacji wynalazku mutacja obniża powinowactwo do formy α-β-γ-receptora IL-2, ale nie eliminuje go.

Podobnie użytecznym jest wprowadzenie mutacji do aminokwasów na powierzchni IL-2, które oddziałują z podjednostką γ receptora IL-2. Tak jak w poprzednich przypadkach szczególnie przydatny typ mutacji obniża energię wiązania pomiędzy IL-2 a IL-2Ry, ale sterycznie nie przeszkadza w tych oddziaływaniach. Na przykład mutacja kontaktowego aminokwasu na aminokwas o mniejszym łańcuchu bocznym jest szczególnie korzystna. Efektem takich mutacji jest obniżenie powinowactwa dla formy β-γ receptora IL-2 w znaczącym zakresie, ale ma ona relatywnie mały efekt lub nie wywiera

PL 206 975 B1 efektu na wiązanie formy α-β-γ receptora IL-2. W korzystnej realizacji wynalazku mutacja obniża powinowactwo do formy β-γ receptora IL-2, ale nie eliminuje go.

Przydatnym jest także wprowadzenie kombinacji mutacji aminokwasów do IL-2, które oddziałują z powierzchniami róż nych podjednostek receptora IL-2. Podczas gdy każ da mutacja niezależnie mo ż e wywierać nieznaczny efekt bądź w ogóle nie wywierać efektu na wiązanie z IL-2 ani na formę α-β-γ ani na formę β-γ receptora IL-2, połączenie mutacji może przynieść pożądaną redukcję powinowactwa IL-2 do jej receptora lub bioaktywności IL-2.

Według wynalazku mutacje w innych częściach IL-2 pośrednio przyczyniają się do zmian oddziaływania IL-2 albo z formą β-γ albo z formą α-β-γ receptora IL-2 i stąd skutkują cząsteczką IL-2 o zmodulowanej aktywnoś ci. Na przykł ad mutacja moż e nieznacznie zmienić budowę czą steczki i zmienić jej wł a ś ciwoś ci wiązania.

Według wynalazku korzystne jest także wytworzenie białek fuzyjnych, które zawierają mutacje w jednostce IL-2, które modulują wiązanie jednostki IL-2 do kompleksu receptora IL-2, a takż e mutacje w jednostce przeciwciała. Takie białka fuzyjne mogą być szczególnie przydatne, jeśli pożądana jest zmiana oddziaływania białka fuzyjnego lg-IL2 z danymi receptorami Fc.

Wolna jednostka IL-2 może wykazywać odmienne właściwości wiązania względem kompleksu IL-2R, niż w przypadku gdy jednostka IL-2 połączona jest z inną jednostką białkową jak Ig. Jeden z moż liwych mechanizmów za pomocą którego nastę puje takie dział anie jest przedstawiony powyż ej. Innym możliwym mechanizmem jest taki, w którym IL-2 jest sterycznie lub konformacyjnie związana w immunocytokinie i ż e dane powią zanie odbija się na wł a ś ciwoś ciach wią zania jednostki IL-2 wzglę dem różnych typów receptora IL-2. Zatem przydatnym jest wprowadzenie zmian w białku fuzyjnym, które będą modulowały takie powiązanie. Na przykład zmiany w jednostce nie będącej IL-2 są przydatne w modulowaniu aktywności IL-2.

Przydatność danego białka fuzyjnego IL-2, takiego jak połączenie lg-IL2 lub białka fuzyjnego IL-2 zawierającego Fc lub albuminę, do konkretnego zastosowania, takiego jak leczenie chorób ludzi, jest badane na właściwym modelu komórkowym lub zwierzęcym. Jeśli jest to możliwe korzystne jest badanie na zwierzętach, ponieważ takie badania są bardziej zbliżone do złożoności reakcji układu odpornościowego w przypadku chorób ludzi. Na przykład szczególna równowaga pewnych komórek może być optymalna do zwalczania choroby leżącej z zakresie zainteresowania, takiej jak rak lub infekcja bakteryjna, wirusowa lub pasożytnicza. Na przykład relatywnie wysoki poziom aktywności limfocytów T może być przydatny przeciwko pewnym typom nowotworu, podczas gdy relatywnie wysoki poziom aktywności komórek NK może być przydatny przeciwko innym typom nowotworów.

Inną cechą wynalazku są odmiany białka fuzyjnego IL-2, takiego jak połączeń lg-IL2 lub połączeń IL-2 zawierających Fc lub albuminę, o lepszych profilach toksyczności. Na przykład białko fuzyjne lg-IL2 zawierające mutację D20T wykazuje obniżoną toksyczność u zwierząt takich jak myszy w porównaniu z odpowiadają cymi białkami fuzyjnymi lg-IL2 z D w pozycji 20. W kolejnym przykł adzie białko fuzyjne lg-IL2 zawierające mutację N88R lub kombinację mutacji L85T, I86T, N88R w jednostce IL-2 wykazuje obniżoną toksyczność u zwierząt takich jak myszy w porównaniu z odpowiadającymi białkami fuzyjnymi z N w pozycji 88. Ponadto białko fuzyjne przeciwciała-IL2 zawierające mutację D20T lub mutację N88R w jednostce IL-2 wykazuje porównywalną siłę z odpowiednim wyjściowym białkiem fuzyjnym przeciwciała-IL2 podczas stosowania w leczeniu nowotworu, który wytwarza antygen docelowy dla tego przeciwciała.

Właściwości odmiany D20T białek fuzyjnych lg-IL2 są szczególnie nieoczekiwane w świetle odnotowanych właściwości mutacji D20T w wolnym białku IL-2. Konkretnie mutacja D20T w wolnym białku IL-2 nie wykazuje różnicy względem białka IL-2 dzikiego typu pod kątem aktywności względem komórek z receptorami IL-2RaeY lub komórek z receptorami IL2-R©y (Shanafelt et al. opis patentowy PCT WO99/60128). Jednakże białko fuzyjne lg-IL2 zawierające mutację D20T ma drastycznie obniżony potencjał aktywowania komórek z receptorem IL2R©y, ale ma zasadniczo normalny potencjał aktywowania komórek z receptorem IL-2RaeY.

Odpowiednio mutacja kilku aminokwasów w obrębie jednostki IL-2 białka fuzyjnego lg-IL2 prowadzi do obniżenia toksyczności przy zachowaniu względnie nieznacznego działania na siłę białka fuzyjnego w leczeniu różnych chorób. Na przykład zakres do którego powinowactwo odmiany białka fuzyjnego IL-2 do jego receptorów można zmieniać w zależności od tego jak dobrze dane białko fuzyjne ulega koncentracji w zamierzonym dla niego miejscu docelowym. Jest szczególnie przydatnym zmutowanie jednego lub większej liczby następujących aminokwasów w obrębie jednostki IL-2: Lys8, Gln13, Glu15, His16, Leu19, Asp20, Gln22, Met23, Asn26, Arg38, Phe42, Lys43, Thr51, His79,

PL 206 975 B1

Leu80, Arg81, Asp84, Asn88, Val91, Ile92 oraz Glu95. Korzystne jest także zmutowanie jednej lub większej liczby następujących aminokwasów w obrębie jednostki IL-2: Leu25, Asn31, Leu40, Met46, Lys48, Lys49, Asp109, Glu110, Ala112, Thr113, Val115, Glu116, Asn119, Arg120, Ile122, Thr123, Gln126, Ser127, Ser130 oraz Thr131.

Wynalazek ujawnia formy jednostki Ig połączonej z IL-2, na przykład połączenia przeciwciało-IL2 takie jak huKS-IL2 lub dl-NHS76-IL2, w których zmiany w jednostce Ig połączonej z IL-2 wpływają na właściwości wiązania białka fuzyjnego z kompleksem IL-2R. Zmiany takie mogą być substytucjami aminokwasu w sekwencji aminokwasów ciężkiego łańcucha lub chemicznymi modyfikacjami. Przydatne substytucje aminokwasów obejmują te, które wpływają na glikozylację białka fuzyjnego lub te, które bezpośrednio wpływają na oddziaływanie z receptorem Fc. Szczególnie przydatną substytucją może być ta, która hamuje glikozylację naturalnie występującą w pozycji N297 (nomenklatura EU) ciężkiego łańcucha IgG. Chemiczne i biochemiczne modyfikacje obejmują przyłączenie PEG (ang. PEGylation) do cząsteczki lub zadania N-glikonazą w celu usunięcia N-przyłączonych łańcuchów glikozylowych. Bez wnikania w teorię, można sobie wyobrazić, że pewne zmiany we fragmencie przeciwciała takiej cząsteczki mogłyby wpływać na konformację IL-2, na przykład w wyniku zmiany sprężystości cząsteczki przeciwciała. W przypadku huKS-IL2 takie zmiany mogą prowadzić do cząsteczki KS-IL2, która obecnie wykazuje zwiększoną selektywność względem limfocytów T w komórkowej analizie biologicznej.

W przypadku białek fuzyjnych przeciwciała-IL2 często przydatny jest wybór jednostki Ig, która wnosi inne pożądane właściwości do cząsteczki. Na przykład jednostka Ig podklasy gamma 1 może być korzystna w celu zapewnienia immunologicznych funkcji efektorowych takich jak ADCC. Alternatywnie jednostka IgG podklas gamma 2 lub gamma 4 może być korzystna na przykład w celu zredukowania interakcji z receptorem FcR. Jeśli stosuje się jednostki IgG podklas gamma 2 lub gamma 4, szczególnie korzystne jest włączenie zawiasowego regionu pochodzącego od gamma 1.

Często przydatne jest zastosowanie mutacji i chemicznych lub biochemicznych modyfikacji białek fuzyjnych lg-IL2 w połączeniu z innymi mutacjami mającymi wyraźne właściwości praktyczne, takie jak mutacja lizyny na końcu C pewnych regionów Fc na alaninę lub inną resztę hydrofobową. Na przykład szczególnie przydatne jest zastosowanie modyfikacji według wynalazku w przypadku białka fuzyjnego przeciwciała huKS-ala-IL2 lub dl-NHS(76)-ala-IL2. Korzystnym jest także wprowadzenie dalszych mutacji do cząsteczki, które eliminują potencjalne epitopy limfocytu T. Jest szczególnie korzystne, gdy te mutacje zasadniczo nie zmieniają pożądanych właściwości cząsteczki.

Wynalazek ponadto ujawnia formy jednostki Ig połączonej z IL-2, na przykład połączenia przeciwciało-IL2 takiego jak huKS-IL2, w którym specyficzne zmiany sekwencji aminokwasów IL-2, na przykład IL2(D20T) lub IL2(N88R) zmieniają właściwości wiązania białka fuzyjnego z kompleksem IL-2R. Sekwencja aminokwasów dojrzałego białka ludzkiej IL-2 jest zobrazowana w SEQ ID NO: 3. Zmiany we właściwościach wiązania ulegają odzwierciedleniu w zwiększonej selektywności względem limfocytów T w komórkowej analizie biologicznej. Szczególna mutacja wpływa na stopień selektywności względem limfocytów T. Ponadto takie zmiany skutkują cząsteczką fuzyjną, na przykład huKS-ala-IL2(D20T) lub huKS-ala-IL2(N88R), o mniejszych efektach toksycznych podczas ogólnoustrojowego podawania myszom niż na przykład w przypadku huKS-ala-IL2. Także takie zmiany prowadzą do białka fuzyjnego, na przykład huKS-ala-IL2(N88R), które jest przynajmniej tak wydajne jak normalne huKS-IL2 lub huKS-ala-IL2 w leczeniu nowotworu w wielu mysich modelach nowotworu.

Ponieważ reakcje immunologiczne wymagane do oczyszczenia nowotworu są różnorodne a także różnią się w zależności od rodzaju nowotworu, mogłoby nie być pożądane całkowite wyeliminowanie funkcjonalności cząsteczki gdy stosuje się cząsteczkę o obniżonej toksyczności. Na przykład w mysim modelu, przy wywołaniu przerzutów raka jelita do płuc, huKS-IL2 wykazało efektywne leczenie raka poprzez mechanizm za pośrednictwem limfocytów T, który nie wymaga komórek NK, podczas gdy w mysim modelu nerwiaka niedojrzałego, wykazano, że eliminacja nowotworu przez huKS-IL2 wymaga komórek NK a nie wymaga limfocytów T. Dlatego istnieją przypadki, w których profil selektywności może być w bardziej właściwy sposób modulowany aby nadal zapewnić odpowiedź za pośrednictwem NK. W jednej z realizacji wynalazku bardziej pożądanym podejściem jest subtelna zmiana profilu selektywności tej cząsteczki w taki sposób, aby ciągle osiągać odpowiedź wymagającą wielu typów receptorów, najbardziej korzystnie w miejscach gdzie cząsteczka ta ulega koncentracji. Na przykład wynalazek dostarcza zmian białka fuzyjnego lg-IL2, w którym selektywność względem IL-2RaeY, w porównaniu do IL-2ReY, jest polepszona 2- do 10-krotnie, 10- do 100-krotnie, 100- do

PL 206 975 B1

1000-krotnie, lub więcej niż 1000-krotnie, w porównaniu z odpowiadającym niezmodyfikowanym białkiem fuzyjnym lg-IL2.

Kolejnym celem wynalazku jest zapewnienie optymalnego zastosowania białek fuzyjnych lg-IL2 o obniżonej toksyczności w leczeniu raka i chorób zakaźnych. Podczas gdy zmieniona selektywność może prowadzić do obniżonej toksyczności naczyniowej, może nie prowadzić do optymalnego wzrostu indeksu terapeutycznego po zwiększeniu dawki białka fuzyjnego. Na przykład takie wzrosty dawki mogą prowadzić do wywołania negatywnych mechanizmów regulujących, które regulują reakcje odpornościowe. Dlatego może być to przydatne do zastosowania modeli leczenia, które łączą białka fuzyjne lg-IL2 o niskiej toksyczności z czynnikami, które powodują spadek takich efektów.

Jednym z ostatnich zidentyfikowanych silnych inhibitorów komórkowej odpowiedzi odpornościowej jest klasa CD4⁺CD25⁺ regulatorowych limfocytów T, która wykazuje wysokie powinowactwo do IL-2R (przegląd patrz: Maloy i Powrie, (2001) Nature Immunol. 2:816). Według wynalazku zwiększone dawki białek fuzyjnych o niskiej toksyczności mogą dodatkowo aktywować te komórki. Po pobudzeniu, komórki te regulują wstecznie (ang. up-regulate) CTLA-4 na powierzchni ich komórek, co angażuje powierzchniowe cząsteczki B7-1 i B7-2 na komórkach odpornościowych i z kolei wywołuje silny ujemny sygnał (Takahashi et al. (2000) J. Exp. Med. 192: 303). Zatem inhibitory tych procesów mogłyby być przydatne w terapii skojarzonej z białkami fuzyjnymi według wynalazku. W jednej z realizacji można zastosować przeciwciała neutralizujące CTLA-4 i ich działanie. W kolejnej realizacji można stosować inne białka o podobnej aktywności, takie jak rozpuszczalne receptory B7 i ich białka fuzyjne (np. B7-lg). Kolejne realizacje obejmują zastosowanie przeciwciał, które niszczą lub hamują własne regulatorowe limfocyty T takie jak przeciwciała przeciwko CD4 i przeciwko CD25. W korzystnej realizacji te drugie przeciwciała są podawane raczej sekwencyjnie niż równocześnie.

Według wynalazku kolejny przydatny mechanizm wykorzystuje nadmierne pobudzenie cyklooksygenazy 2 (C0X-2) prowadzące do wytwarzania prostaglandyn, które jak wiadomo hamują odpowiedzi immunologiczne (patrz opis patentowy PCT US99/08376). Dlatego kolejna realizacja łączy zastosowanie cząsteczek lg-IL2 o niskiej toksyczności z inhibitorami COX-2 takimi jak indometacyna, lub bardziej specyficznymi inhibitorami Celecoxib (Pfizer) i Rofecoxib (Merck&Co). Zrozumiałym jest fakt, iż nadal inne mechanizmy odpornościowe mogą być aktywowane poprzez zwiększenie dawek białek fuzyjnych lg-IL2 o niskiej toksyczności i, że można opracować terapie skojarzone pod kątem zastosowania w tych mechanizmach. Ponadto niskie dawki pewnych leków cytotoksycznych, takich jak cyklofosfamid, które wykazują efekt zwiększający odporność w warunkach in vivo mogą być przydatnymi czynnikami leczniczymi w terapii skojarzonej.

Połączenia albuminy zostały opracowane w celu wytworzenia leczniczych białek fuzyjnych o zwiększonym okresie półtrwania w surowicy. Na przykład Yeh et al. (Yeh P, et al. Proc Natl. Acad Sci USA. [1992] 89:1904-8) skonstruowali białko fuzyjne albuminy-CD4, które miało znacznie dłuższy okres półtrwania w surowicy niż sama odpowiednia jednostka CD4.

Przydatne jest konstruowanie połączeń albuminy z IL-2, erytropoetyną, interferonem alfa i innymi ligandami. Te białka fuzyjne mają dłuższy okres półtrwania w surowicy niż sam odpowiadający ligand. Takie połączenia można stworzyć w kierunku od N do C końca, jako połączenia typu ligand albumina lub typu albumina-ligand, stosując standardowe techniki inżynierii genetycznej i ekspresji białek. Alternatywnie albuminę i ligand można połączyć w wyniku chemicznego sprzęgania.

Jednakże białka fuzyjne typu albumina-ligand często wykazują niepożądane właściwości. Bez wnikania w teorię, jednym z powodów dlaczego białka fuzyjne typu albumina-ligand mogą wykazywać niepożądane właściwości jest fakt, iż istnieją receptory dla albuminy na komórkach śródbłonka naczyniowego (Tiruppathi et al. Proc Natl Acad Sci USA. [1996] 93: 250-4). W wyniku tego, działanie ligandu na komórki śródbłonka naczyniowego może być zwiększone.

Na przykład białko fuzyjne albuminy-IL2 wykazuje zwiększony okres półtrwania w surowicy, ale także powoduje zwiększone wycieki naczyniowe. Bez wnikania w teorię, odnotowano, że aktywacja odpowiedzi za pośrednictwem IL2 w naczyniach jest zwiększona z powodu wiązania się białek fuzyjnych do receptorów albuminowych obecnych na komórkach śródbłonka naczyń. Wiązanie się białek fuzyjnych albuminy-IL2 do komórek, które posiadają receptory zarówno dla albuminy jak i IL-2 jest zwiększone poprzez mechanizm analogiczny do tego przedstawionego na rysunku fig. 1b dla zwiększenia wiązania białka fuzyjnego typu Ig-ligand na powierzchni komórki.

W celu zmniejszenia wycieków naczyniowych wywołanych przez albuminę-IL2 przydatne jest wprowadzenie mutacji do jednostki IL-2, która specyficznie zredukuje powinowactwo IL-2 do receptorów IL2R-eY. Na przykład zostało opracowane białko fuzyjne albuminy-IL2(N88R) lub albuminy-IL2(D20T) i następnie

PL 206 975 B1 odkryto, że posiada zredukowaną toksyczność i ulepszony indeks terapeutyczny w przypadku modelu choroby na zwierzętach takich jak mysz.

Cząsteczki według wynalazku są przydatne do leczenia nowotworów złośliwych i guzów, szczególnie do leczenia guzów litych. Przykładami nowotworów, które mogą być leczone według wynalazku są nowotwory pochodzenia naskórkowego, takie jak występują w przypadku, ale nie ograniczają się do: raka jajników, raka prostaty, raka żołądka, raka wątroby, pęcherza moczowego, głowy i karku. Równorzędnie, według wynalazku, nowotwory złośliwe i pochodzenia neuroektodermalnego są odpowiednimi kandydatami do leczenia, w tym takie jak, ale nie ograniczając się do: czerniak, drobnokomórkowy rak płuc, mięsak tkanek miękkich oraz nerwiak niedojrzały.

Według wynalazku przydatne jest dla czynników leczniczych, aby były ukierunkowane na lokalizacje nowotworowe lub lokalizacje nowotworów złośliwych lub przerzutów. Szczególnie przydatne są białka fuzyjne Ig zawierające przeciwciała skierowane przeciwko antygenom preferencyjnie prezentowanym przez komórki raka lub nowotworu złośliwego. Na przykład szczególnie przydatne są białka zawierające jednostkę przeciwciała o specyficzności względem EpCAM (np. KS1/4), lub embrionową Fibronecytynę (np. BC1), lub CEA, lub kompleksy chromatynowe (np. NHS76), lub GD2 (np. 14.18), lub CD19, lub CD20, lub CD52, lub HER2/neu/c-erbB-2, lub MUC-1, lub PSMA. Ponadto przeciwciała skierowane na różne antygeny wirusowe są szczególnie przydatne.

PRZYKŁADY

P r z y k ł a d 1: Konstruowanie genów połączenia lg-IL2 z substytucjami w kodonie w sekwencji kodującej IL-2 lub w sekwencji kodującej przeciwciało:

Wektor ekspresji dla immunocytokin został opisany w Gillies et al., (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203. Pewne modyfikacje w sekwencji nukleotydowej umożliwiły addycję sekwencji kodującej do końca 3' ludzkiego genu y-1. W ludzkim genie y-1 kodującym ciężki łańcuch zostało zniszczone miejsce restrykcyjne Xmal zlokalizowane 280 par zasad od kodonu zatrzymującego translację poprzez wprowadzenie cichej mutacji (TCC na TCA). Kolejną cichą mutację (TCT do TCC) wprowadzono do kodonu Ser trzy reszty ponad C-końcową lizyną ciężkiego łańcucha w celu utworzenia sekwencji TCC CCG GGT AAA (SEQ ID NO: 4), która zawiera nowe miejsce Xmal [Lo et al., (1998) Protein Engineering 11:495-500].

cDNA IL-2 został skonstruowany w wyniku chemicznej syntezy i zawiera nowe i wyjątkowe miejsce restrykcyjne Pvull [Gillies et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1428-1432]. Zarówno miejsce Xmal jak i Pvull są unikalne w wektorze ekspresji, i umożliwiają konstrukcję odmian przeciwciała-IL2, w tym następujących):

1) huKS-ala-IL2. Ta konstrukcja huKS-ala-IL2 została opisana uprzednio (np. opis patentowy WO 01/58957). Otrzymane białko zawiera substytucję aminokwasu w połączeniu pomiędzy stałym regionem ciężkiego łańcucha Ig a dojrzałą hulL-2. Takie połączenie normalnie posiada sekwencję SPGK-APT (SEQ ID NO: 5), w której -SPGK- jest końcem C ciężkiego łańcucha a -APT- końcem N dojrzałego białka IL-2. W huKS-ala-IL2 wprowadzono substytucję K na A (oznaczona jako pozycja K[-1]) i połączenie ma teraz sekwencję SPGA-APT (SEQ ID NO: 6). W konsekwencji polepszył się czas półtrwania tego białka w surowicy (patrz przykład 5).

2) dl-KS-ala-IL2. To białko fuzyjne zawiera substytucje w KS-ala-IL2 w celu wytworzenia odmiany białka fuzyjnego, w której wyeliminowano potencjalne epitopy limfocytu T (opisano w równoległych zgłoszeniach patentowych U.S.S.N. 10/112,582 i 10/138,727, których całkowite ujawnienie jest zawarte w odniesieniach).

Stały region fragmentu Ig białka fuzyjnego według wynalazku może być wybrany spośród stałego regionu normalnie związanego ze zmiennym regionem, lub innych stałych regionów co prowadzi do białka fuzyjnego z fragmentem Ig zawierającym regiony zmienny i stały z różnych podklas cząsteczek IgG lub od różnych gatunków. Na przykład region stały gamma 4 z IgG (SEQ ID NO: 7) można zastosować zamiast regionu stałego gamma 1 (SEQ ID NO: 8). Zamiana taka ma przewagę w tym, że łańcuch gamma 4 powoduje dłuższy okres półtrwania w surowicy. Odpowiednio można także zastosować stały region gamma 2 IgG (SEQ ID NO: 9) zamiast stałego regionu gamma 1 IgG (SEQ ID NO: 8). Ponadto region zawiasowy pochodzący od gamma 1 IgG (SEQ ID NO: 10) można zastąpić regionem zawiasowym normalnie występującym w gamma 2 IgG (SEQ ID NO: 11) lub regionie stałym gamma 4 IgG (SEQ ID NO: 12). Składnik Ig białka fuzyjnego może także zawierać mutacje w regionie stałym, w taki sposób, że IgG ma obniżone powinowactwo wiązania do przynajmniej jednego z FcyRI, FcyRII lub FcyRIII. Białka fuzyjne według wynalazku mogą zawierać mutacje w regionach stałych IgG w celu usunięcia potencjalnych) miejsc glikozylacji i epitopów limfocytu T. Na przykład różne stałe regiony

PL 206 975 B1 mogą zawierać zmiany w C-terminalnej części stałych regionów w celu usunięcia potencjalnych epitopów limfocytu T. Na przykład potencjalne epitopy limfocytu T w C-terminalnej części różnych regionów stałych cząsteczek IgG usuwa się poprzez zmianę sekwencji aminokwasu KSLSLSPGK (SEQ ID NO: 13) w stałych regionach gamma 1 IgG i gamma 2 IgG oraz sekwencji aminokwasów KSLSLSLGK (SEQ ID NO: 14) w stałym regionie gamma 4 IgG na sekwencję aminokwasów KSATATPGA (SEQ ID NO: 15).

3) huKS-ala-IL2(N88R). Ta odmiana huKS-IL2 zawiera tę samą substytucję aminokwasu w połączeniu pomiędzy stałym regionem ciężkiego łańcucha Ig a dojrzałej hulL-2 jak opisano powyżej (K[-1]A, wytworzoną przez zamianę kodonu AAA na GOC), oraz dodatkowo zawiera substytucję w pozycji N88 w sekwencji dojrzałej hulL-2 korzystnie na R (wytworzoną przez zamianę kodonu aAT na aGG). Kolejna zmiana została wprowadzona do sekwencji nukleotydów hulL-2 w celu eliminacji istniejącego miejsca restrykcyjnego dla Bam HI poprzez wprowadzenie cichej mutacji (pozycja aminokwasu G98, kodon został zmieniony z ggA tcc na ggC tcc).

Zastosowano strategię mutagenezy opartą na PGR w konstruowaniu huKS-ala-IL2(N88R). Wytworzono dwa nakładające się fragmenty PGR, które oplatają sekwencję kodującą ukształtowanej hulL2 stosując jako wzorzec hulL2 w wektorze Bluescript (Stratagene). Postępujący fragment PGR zawierający zmianę nukleotydów kodujących K[-1]A oraz N88R poprzez wbudowanie tych mutacji odpowiednio do primerów sensownego i antysensownego. Zmiany te zostały zaznaczone pogrubionymi nukleotydami w sekwencjach primera. Sensowny primer był następujący:

5'CCCCGGGTGCCGCCCCAACTTCAAGTTCTACA3' (SEQ ID NO: 16); sekwencja primera antysensownego była następująca:

5'AGCCCTTTAGTTCCAGAACTATTACGTTGATCCTGCTGATTAAGTCCCTA GGT3' (SEQ ID NO: 17). Podkreślony nukleotyd przedstawia zmianę, która niszczy miejsce Bam HI. Drugi, zstępujący fragment PGR zawierał 20 nukleotydów nakładających się na region fragmentem wstępującym PGR i pozostałą sekwencję IL2. Sensownym primerem zastosowanym w tej reakcji był 5' AGTTCTGGAACTAAAGGGCTCCGAAACAACATTCATGTGT (SEQ ID NO: 18). Ponownie, podkreślony nukleotyd oznacza cichą mutację, która niszczy miejsce Bam HI. Zastosowanym primerem antysensownym był odwrotny primer M13, który wtapia się do sekwencji w wektorze pBluescript. Te nakładające się fragmenty PGR zastosowano w reakcji z primerem w SEQ ID 16 i odwrotnym primerem M13 w celu wytworzenia końcowego produktu PGR, który był stopniowo włączany do wektora TA (lnvitrogen).

Sekwencja wstawionego fragmentu była weryfikowana, i zastosowano fragment 442 bp Xma l/Xho I zawierający zmodyfikowaną sekwencję IL2 (z plazmidu TA-IL2(N88R)) w celu zastąpienia sekwencji hulL-2 dzikiego typu w wyjściowym plazmidzie ekspresji immunocytokiny (kodującym huKS-IL2). Otrzymany plazmid ekspresji immunocytokiny kodujący huKS-ala-IL2(N88R) był weryfikowany poprzez mapowanie restrykcyjne i sekwencjonowanie.

4) huKS M1-IL2(TTSR (SEQ ID NO: 19)). Ten wariant immunocytokiny huKS M1-IL2 został skonstruowany standardowymi technikami rekombinacji DNA (jak opisano w zgłoszeniu patentowym U.S.S.N. 10/112,582 w fazie postępowania, ujawnienie którego zawarte zostało w odniesieniu). Zawiera on wiele substytucji aminokwasów w regionie łączącym przeciwciało-IL-2 białka fuzyjnego, które eliminują potencjalne epitopy limfocytu T i prowadzą do mniej immunogenicznego białka. Sekwencje te zostały zmienione z KSLSLSPGA-APT (SEQ ID NO: 20) na KSATATPGA-APT (SEQ ID NO: 21) (myślnik oznacza miejsce połączenia lg/IL-2, a podstawione aminokwasy zostały podkreślone) i oznaczone jako „M1. Także włączono w ten wariant zmianę K na A w ostatnim aminokwasie przed połączeniem, co, jak wykazano zwiększa okres półtrwania immunocytokiny w surowicy.

huKS M1-IL2(TTSR) zawiera kolejne substytucje aminokwasów zlokalizowane we fragmencie IL-2 immunocytokiny. W celu wyeliminowania potencjalnych epitopów limfocytu T wytworzonych przez opisaną powyżej substytucję N88R, sekwencja ta zostaje zmieniona z -DLjSNI-(SEQ ID NO: 22) naturalnej hulL-2 na -DTTSRI (SEQ ID NO: 23).

Podejście mutagenezy opartej na PCR zastosowano w celu wprowadzenia zmian do sekwencji nukleotydów genu hulL-2, poprzez wbudowanie mutacji do sensownego primera. Sekwencję TTxR stworzone poprzez zmiany kodonu odpowiednio ACC, ACC i AGG. Zmutowany fragment 197 bp PCR zawierający 3' koniec sekwencji hu IL-2 został wytworzony z wzorcowego plazmidu ekspresji immunocytokiny kodującego huKS-ala-IL2(N88R) z zastosowaniem sensownego primera o sekwencji:

5' ACTTAAGACCTAGGGACACCACCAGCAGGATCAACGTAATAGT3' (SEQ ID NO: 24) oraz antysensownego primera o sekwencji 5'ATCATGTCTGGATCCCTC3' (SEQ ID NO: 25). Fragment PCR został sklonowany do wektora TA a sekwencja zweryfikowana. W celu wytworzenia kompletnej

PL 206 975 B1 sekwencji IL-2 fragment ten przyłączono jako miejsce trawienia restrykcyjnego AfI ll/Xho I do fragmentu 2 kb Hind III/ AfI II otrzymanego z plazmidu ekspresji immunocytokiny kodującego huKS-alaIL2(N88R) i wstawiono do wektora restrykcyjnego Hind lll/Xho I pBluescript. Zmutowany gen IL-2 został następnie podmieniony w miejscu naturalnej sekwencji hulL-2 w kodującym plazmidzie ekspresji immunocytokiny na KS M1-IL2 na drodze potrójnej ligacji.

5) huKS(N na Q)-IL2. Plazmid ekspresji immunocytokiny kodujący huKS(N na Q)-IL2 został skonstruowany z zastosowaniem standardowych technik rekombinacji DNA. huKS(N na Q)-IL2 zawiera substytucję aminokwasu w domenie CH2 stałego regionu przeciwciała Fc gamma 1, która eliminuje glikozylację poprzez N-wiązanie. Została zmieniona sekwencja aminokwasów z QYNSTYR (SEQ ID NO: 1) na QYQSTYR (SEQ ID NO: 26), z podstawionym aminokwasem zaznaczonym czcionką pogrubioną. Podobnie skonstruowano białka fuzyjne zawierające stałe regiony gamma 2 i gamma 4, które zawierały mutacje zmieniające sekwencję aminokwasów QFNST (SEQ ID NO: 2) na QAQST (SEQ ID NO: 27), aby w ten sposób dodatkowo wyeliminować potencjalny epitop limfocytu T.

P r z y k ł a d 2: Chemiczne lub enzymatyczne modyfikacje białka fuzyjnego lg-IL2 prowadzące do zmodyfikowanej specyficzności receptorowej:

Przykład ten opisuje biochemiczne manipulacje immunocytokiny stosowane w celu wytworzenia połączonej z PEG huKS-IL2 lub zdeglikozylowanej huKS-IL2, oraz ich odmian. Te same sposoby można zastosować do innych białek fuzyjnych IL-2, takich jak połączenia immunocytokiny typu 14.18-IL2 lub albumina-cytokina. Odmiany te zostały zastosowane w kolejnym przykładzie w celu zbadania ich wpływu na odpowiedź proliferacyjną różnych linii komórkowych w analizie biologicznej opartej o komórki (tabela 1) lub na farmakokinetycze właściwości cząsteczki.

Przyłączenie PEG do huKS-IL2.

PEG (20 000) został kowalencyjnie przyłączony do białka poprzez grupy aminowe obecne na tym białku. W tym celu wykorzystano reaktywną pochodną PEG zawierającą sukcynoimidowy łącznik (Propionian mPEG-Sykcynoimidylowy, nazwany poniżej „SPA-PEG). huKS-IL2 było intensywnie dializowane w buforze wolnym od amin zawierającym 50 mM fosforanu sodu (pH 7,5), 0.05% Tween 80 oraz zatężane. Nadmiar SPA-PEG łączył się z huKS-IL2 w stosunku molowym albo 5:1 lub 10:1. Bezpośrednio przed zastosowaniem sporządzano 5 mM roztwór wzorcowy SPA-PEG w dejonizowanej wodzie. Właściwą objętość roztworu SPA-PEG łączono z huKS-IL2 i reakcję inkubowano na wytrząsarce przez 30 do 40 minut w temperaturze pokojowej. Dodawano nadmiar 5 do 10 moli glicyny w celu zatrzymania reakcji, a produkty reakcji oczyszczano z zastosowaniem chromatografii sączenia molekularnego. Na kolumnę Superdex 200, utrzymywaną w stanie równowagi za pomocą 50 mM HEPES i 150 mM NaCI, wprowadzono próbkę poreakcyjną i wyeluowane frakcje zawierające białko z przyłączonym PEG łączono i zatężano.

Reakcja huKS-IL2 z N-Glikonazą.

huKS-IL2 (1,5 mg) inkubowano z 30 mU PNG-azą F (New England Biolabs) przez noc w temperaturze 37°C. Produkt reakcji oczyszczano przez przepuszczenie przez kolumnę ProteinA-Sepharose i elucję związanego huKS-IL2 przy pH 3. Eluat zobojętniano i zatężano w zwrotnej kolumnie w buforze PBS i 0,05% Tween 80. Deglikozylację huKS-IL2 potwierdzano w chromatografii sączenia molekularnego i na żelu mocznikowym.

P r z y k ł ad 3: Ekspresja i oczyszczanie lq-IL2 i odmian lq-IL2

Ogólną procedurę opisaną tutaj dla huKS-ala-IL(N88R) można stosować dla szerokiego zakresu białek fuzyjnych Ig-cytokiny, w tym Ig-połączeń ze zmutowanymi cytokinami. W celu otrzymania stabilnie transfekowanych klonów, które wytwarzają huKS-ala-IL(N88R) wprowadzono DNA plazmidu ekspresji immunocytokiny kodujący huKS-aIa-IL(N88R) do mysich komórek szpiczaka NS/0 za pomocą elektroporacji. Komórki NS/0 hodowano na pożywce Eagle'a zmodyfikowanej według Dulbecco uzupełnionej 10% płodową byczą surowicą inaktywowaną temperaturą, 2 mM glutaminą i penicyliną/streptomycyną. Około 5x10⁶ komórek płukano jednorazowo PBS i ponownie zawieszano w 0,5 ml PBS. 10 gg liniowego plazmidu DNA inkubowano następnie z tymi komórkami w kuwecie Gene Pulser (odstęp miedzy elektrodami 0,4 cm, BioRad) w lodzie przez 10 minut. Elektroporację przeprowadzano z zastosowaniem Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) i parametrów 0,25 V i 500 gF. Komórki pozostawiano do odzyskania na 10 minut w lodzie, po czym były ponownie zawieszane w pożywce wzrostowej i przenoszone na płytkę z 96 studzienkami. Przeprowadzano selekcję stabilnie transfekowanych klonów na podstawie ich wzrostu w obecności 100 nM metotreksatu (MTX), którego dodano do pożywki wzrostowej dwa dni po transfekcji. Komórki odżywiano co 3 dni dwa do trzech razy, klony oporne na MTX pojawiły się po 2 do 3 tygodniach. Supernatanty z hodowli klonów były analizowane

PL 206 975 B1 metodą ELISA anty-Fc w celu zidentyfikowania komórek wysoce wydajnych. Klony wysoce wydajne zostały wyizolowane i namnożone w pożywce wzrostowej zawierającej 100 nM MTX.

Immunocytokina została oczyszczona z tkankowego supernatantu hodowli za pomocą kolumnowej chromatografii powinowactwa Protein A. W przypadku huKS-ala-IL2(N88R), rekombinowaną kolumnę Protein A (rPA) Agarose prekondycjonowano dziesięcioma objętościami buforu nośnego, takiego jak 100 mM argininy, 5 mM cytrynianu, 0,01% Tween 80 o pH 5.6, a na kolumnę wprowadzono przefiltrowany supernatant z hodowli zawierający przypadku huKS-ala-IL2(N88R) z prędkością 16 ml/min do związania 40 mg/ml żywicy rPA. Kolumnę przemywano obficie tym samym buforem i w końcu immunocytokinę eluowano 50 mM glicyną przy pH 3. Zbierano piki frakcji i pH doprowadzono do obojętnego za pomocą 1 N NaOH.

P r z y k ł a d 4: Aktywność odmian lg-IL2 w metodach biologicznych.

Do celów biologicznych metod opartych na komórkach, wykorzystano linie komórkowe, których wzrost zależał od IL-2 oraz oznaczono aktywność białek fuzyjnych Ig, na przykład huKS-IL2 i odmian huKS-IL2 poprzez proliferację tych komórek. Na przykład CTLL-2 (ATCC# TIB-214; Matesanz i Alcina, 1996) i TF-Ιβ (Farner et al., [1995] Blood 86:4568-4578) zastosowano w celu śledzenia odpowiednio odpowiedzi limfocytów T i odpowiedzi NK komórkowo-podobnej. CTLL-2 jest mysią linią komórkową limfoblastów T, która wykazuje wysokie powinowactwo IL-2RaeY, a TF-1 β jest ludzką linią komórkową pochodzącą z niedojrzałych prekursorowych komórek erytroidowych, które wykazują pośrednie powinowactwo IL-2ReY. Inną przydatną w tych badaniach linią komórkową jest, na przykład, linia komórkowa pochodząca od dorosłych limfocytów T chłoniaka Kit-225 (K6) (Uchida et al., [1987] Blood 70:1069-1072). Po połączeniu z linią komórkową TF-Ιβ, aktywność białek fuzyjnych ocenia się w parach linii komórkowych zajmujących receptory tego samego gatunku ssaka. Analizy takie można także przeprowadzić z populacjami komórek pochodzących z ludzkich PBMC (ang. Peripherial Blood Mononuclear Cells), albo w celu wyizolowania NK, które posiadają IL-2ReY, lub w celu wytworzenia limfocytów T, które wytwarzają IL-2RaeY. Techniki izolacji tych populacji komórek z hu PBMC są znane znawcom tej problematyki. Na przykład limfocyty T lub PHA-blasty otrzymuje się przez inkubowanie PBMC przez 3 dni w 10 mikrogramach/ml fitohemoaglutyniny (PHA-P; L9017, Sigma, St. Louis). Spoczynkowe komórki NK są powszechnie otrzymywane za pomocą protokołu negatywnej selekcji, na przykład stosując zestaw do izolacji komórek NK (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) dla komórek ludzkich. W celu skorelowania aktywności tych białek fuzyjnych z wynikami otrzymanymi z modeli mysich nowotworów, jest także przydatnym przeprowadzenie takich analiz na populacjach komórek otrzymanych z myszy wytwarzającej jeden lub inny kompleks receptora IL-2. Na przykład można otrzymać populację komórek NK ze śledzion rekombinowanych z niedoborem (SCID) Balb/C myszy stosując zestaw SPINSEP™ do wzbogacenia mysich komórek NK (Stemcell Technologies Inc., Vancouver, BC, Canada). Czystość każdej z tych wzbogaconych populacji można ocenić za pomocą analizy FACS.

W skrócie, wypłukane komórki umiejscawiano na płytce z gęstością 10 000 komórek/studzienkę na 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania i inkubowano w pożywce komórkowej uzupełnionej, na przykład, oczyszczoną huKS-IL2 lub odmianami huKS-IL2. Ponadto, białko hulL-2 dzikiego typu, otrzymane z R&D Systems (Minneapolis, MN) było analizowane jako wzorzec. Dodawane białko było sporządzane jako serie rozcieńczeń w 1000-krotnym zakresie stężeń pomiędzy 0,45 ng/ml a 420 ng/ml (normalizowany w odniesieniu do molowych równoważników IL2). Po 32 godzinach dodano 0,3 μ Ci [metylo-3H]tymidyny (Dupont-NEN-027) do każdej studzienki i komórki inkubowano przez dodatkowe 16 godzin. Komórki były następnie przenoszone i poddawane lizie na szklanych filtrach. 3H-tymidynę wbudowaną do DNA mierzono licznikiem scyntylacyjnym.

Otrzymano wartość ED50 dla każdej odmiany białka huKS-IL2 w odniesieniu do proliferacji komórkowej na podstawie wykresu krzywej zależności odpowiedzi i dawki oraz określając stężenie białka, które skutkuje połową maksymalnej odpowiedzi. Selektywność odpowiedzi wyrażano jako stosunek wartości ED50 na przykład ED50 [TF1-e] / ED50 [CTLL-2]. Zatem wysoki stosunek ED50 wskazuje, że względnie wyższa dawka białka wymagana była do wywołania odpowiedzi komórkowej TF-1e w porównaniu z odpowiedzią komórkową CTLL-2. Stosunek wartości ED50 dla odmian huKS-IL2 został porównany z białkami wolnej hulL-2 i wyjściowej huKS-IL2. Tak znormalizowana wartość jest zmianą efektu różnicującego. Wartość większa od wartości otrzymanej dla białka referencyjnego wskazuje na wzrost selektywności względem komórek CTLL-2. W niektórych przypadkach korzystnym może być otrzymanie wartości stosunku ED50 z linii komórkowych, które pochodzą z tych samych gatunków, w taki sposób, że na aktywności IL-2 nie wpływają dodatkowo różnice międzygatunkowe w ich oddziaływaniach z receptorami. Następujący przykład wykorzystuje mysie komórki CTLL-2

PL 206 975 B1 i ludzkie TF-1B do wyliczenia wartości stosunku ED50 z białkami fuzyjnymi lg-IL2 i wolną IL-2, a przykładowe wyniki takiego doświadczenia są przedstawione w tabeli 1.

T a b e l a 1

Białko	Stosunek ED50
IL-2	0,81
HUKS-IL2	0,11
HuKS-ala-IL2	0,17
KS(NtoQ)-IL2	0,72
HuKS-ala-IL2(N88R)	2300
KS-IL2(TTSR)	>6
HuKS-IL2 połączone z PEG	1,99
HUKS-IL2 + Glikanaza	0,45
14.18-IL2	0,07
14.18-IL2 połączone z PEG	1,34
14.18-IL2 + Glikanaza	0,21

W tym przykładzie porównując stosunek ED50 otrzymany dla wolnej IL-2 (0,81), otrzymano około 5-krotnie niższy stosunek ED50 dla huKS-IL2 (0,17). Wskazuje to, że białko fuzyjne zostało ulepszone pod kątem jego profilu selektywności, wykazując większą selektywność względem komórek TF-1p. Inna kombinacja przeciwciała / IL-2, 14.18-IL2, także była bardziej selektywna względem TF1-p niż sama IL-2 (stosunek ED50 0,07), wskazując, że efekt ten nie jest ograniczony do specyficznego przeciwciała zawartego w białku fuzyjnym przeciwciała-IL2, a obniżona aktywność ludzkich białek fuzyjnych lg-IL2 względem mysich komórek posiadających receptor o wysokim powinowactwie w porównaniu do hulL-2 może odzwierciedlać ogólną cechę białek fuzyjnych lg-IL2.

Inne odmiany miały zmieniony stosunek ED50 tak, że odpowiedź komórek CTLL-2 była korzystna. Dramatyczny efekt obserwowano dla huKS-ala-IL2(N88R), dla której stosunek ED50 był większy od 2000, co znalazło odzwierciedlenie w tym, że proliferacja komórek TF-1p, w której uczestniczyły w tych komórkach receptory o pośrednim powinowactwie, była z łatwością wykrywalna. Zatem podczas gdy huKS-ala-IL2(N88R) aktywowała proces sygnalizacji komórek z IL-2RaeY, znacząco nie aktywowała komórek z IL-2ReY. Aktywność huKS-ala-IL2(N88R) można było także wyznaczać na oczyszczonych mysich komórkach NK wyrażających mysi kompleks IL-2ReY; w przeciwieństwie do tego, co odnotowano dla wolnego ludzkiego białka IL2(N88R) - co wskazywało, że selektywność ta była faktycznie utracona gdy badano mysie limfocyty T i komórki NK (patrz Wetzel et al., ASCO 2001 Meeting Abstract) - wartość ED50 dla huKS-ala-IL2(N88R) w mysich komórkach NK była zbliżona do wartości obserwowanej z komórkami TF-1 β.

Subtelny wzrost selektywności odpowiedzi względem komórek CTLL-2 zaobserwowano w odmianach lg-IL2 ze zmianami, które wpływają na glikozylację fragmentu przeciwciała białka fuzyjnego. Szczególnie KS(NtoQ)-IL2, w którym brakuje miejsca glikozylacji we fragmencie Fc przeciwciała, wykazywało 3-krotny wzrost stosunku ED50 (0,72) w porównaniu z huKS-IL2, podczas gdy huKS-IL2 zadane N-glikanazą wykazywało 2-krotny wzrost (stosunek ED50 wynosił 0,45) w porównaniu do huKS-IL2. Podobnie zadanie N-glikanazą IL-2 połączonej z inną cząsteczką przeciwciała prowadziło do podobnego wyniku; na przykład zadanie N-glikanazą 14.18-IL2 przyniosło 3-krotny wzrost stosunku ED50 w porównaniu do niezadanej 14.18-IL2. Wyniki te wskazują, że pewne zmiany we fragmencie przeciwciała cząsteczki same wpływają na właściwości wiązania i aktywacji cząsteczki IL-2 połączonej z nim.

Przyłączenie PEG do białka fuzyjnego także zmieniało jego profil selektywności. Ponownie zaobserwowano wzrost względem aktywności stymulacyjnej CTLL-2. W przypadku huKS-IL2 odmiany z przyłączonym PEG skutkowały 9-krotnym wzrostem selektywności na korzyść komórek CTLL-2 (stosunek ED50 wynoszący 1,99), a dla 14.18-IL2 20-krotny wzrost wywołany był przyłączeniem PEG (stosunek ED50 wynosił 1,34).

W niektórych przypadkach takie wzrosty selektywności dla danego białka mogą także odzwierciedlać szczególną kombinację komórek wykorzystanych w tych badaniach, jak zostało to zilustrowa16

PL 206 975 B1 ne w tabeli 2 przedstawiającej reprezentatywne wyniki. Na przykład, gdy porównywano KS-IL2, KS-ala-IL2 i IL2 stosując linię komórkową Kit 225 zawierającą ludzki IL-2RaeY zamiast mysiej CTLL-2, nie otrzymana takiego charakteru wzrostu selektywności. Szczególnie w odniesieniu do komórek Kit 225 te trzy białka wykazywały zasadniczo taką samą aktywność. Jednakże okazało się, że w większości przypadków, trendy w odpowiedzi selektywnej odmian lg-IL2 pomiędzy komórkami TF-1p a komórkami Kit-225 były zbliżone do tych, ustalonych z komórkami TF-1p i komórkami CTLL-2, w tym efekt deglikozylacji jednostki Fc białka fuzyjnego lg-IL2 (patrz wyniki reprezentatywne poniżej w tabeli 2 i przykładzie 10).

T a b e l a 2

Białko	Stosunek ED50 TF-1 p/Kit-225
IL-2	2,8
HUKS-IL2	4
HuKS-ala-IL2	10,4
HuKS-ala-IL2(N88R)	52 000

Ponadto okazało się że komórki Kit-255 były bardziej wrażliwe na IL-2 i białka fuzyjne IL-2 oraz ich odmiany niż komórki CTLL-2. Na przykład wartość ED50 dla huKS-ala-IL2 wynosiła 0,08 dla komórek Kit-225 i 5,0 dla komórek CTLL-2, a dla KS-ala-IL2(N88R) wynosiła 0,13 dla Kit 225 i 3 dla komórek CTLL-2, co wskazuje na około 10-50-krotny wzrost czułości komórek Kit 225 w tych badaniach. Zatem wartość stosunku ED50 dla danego białka zależy od szczególnej kombinacji wykorzystanych typów komórek.

P r z y k ł a d 5: Farmakokinetyka białek fuzyjnych IL-2 o zmodyfikowanych właściwościach wiązania receptora

Profil farmakokinetyczny (PK) huKS-ala-IL2(N88R) porównano z profilem huKS-ala-IL2 i huKS-IL2. W przypadku każdego białka wykorzystano trzy 6-8 tygodniowe myszy. Wstrzykiwano dwadzieścia pięć μg białek fuzyjnych, rozcieńczonych do stężenia 125 μg/ml w PBS, do żyły ogonowej myszy, i pobierano 50 μI próbki krwi z tylnego ujścia oczodołowego zaraz po wstrzyknięciu (0 godz.) i 0,5; 1; 2; 4; 8 i 24 godz. po wstrzyknięciu. Próbki krwi pobierano do probówek pokrytych heparyną w celu zapobieżeniu krzepnięcia krwi, a poziom immunocytokiny w supernatancie z pozbawionego komórek osocza oznaczano metoda ELISA. Ta procedura dla metody ELISA zastosowana do badań nad farmakokinetyką została wcześniej opisana (opis patentowy WO 01/58957). Metoda ta mierzy obecność całej immunocytokiny. Wychwytywanie immunocytokiny z osocza przeprowadzono na płytkach pokrytych EpCAM, detekcję przeprowadzono z użyciem przeciwciała sprzężonego z HRP skierowanego przeciwko IL-2. Wykazano uprzednio, że odmiana huKS-IL2 z substytucją K na A w miejscu połączenia, czyli huKS-ala-IL2, wykazuje znaczne polepszenie czasu półtrwania w krążeniu w porównaniu z huKS-IL2 (opis patentowy WO 01/58957). W rzeczywistości odkryto, że czas półtrwania w krążeniu huKS-ala-IL2(N88R) był w podobny sposób zwiększony, co wskazuje, że zmiana N88R we fragmencie IL-2 tej cząsteczki nie ma zasadniczego wpływu na farmakokinetykę. Wyniki reprezentatywnego doświadczenia są przedstawione na rysunku fig. 2, który przedstawia zmianę w czasie stężenia immunocytokiny obecnej w surowicy (wyrażoną jako procent stężenia białka pozostającego w surowicy w odniesieniu do wyjściowego stężenia występującego zaraz po podaniu dożylnym) przez okres 24 godzin. Stężenie białka określano metodą ELISA, w której immunocytokina jest wyłapywana za pośrednictwem fragmentu przeciwciała i wykrywana za pośrednictwem fragmentu cytokiny. Oś X = czas t w godzinach; oś Y = log (% pozostałego stężenia białka).

P r z y k ł a d 6: Toksyczność białek fuzyjnych lg-IL2 o zmodyfikowanych właściwościach wiązania receptora u ssaków

Zbadano względną toksyczność odmian KS-IL2 huKS-IL2, huKS-ala-IL2 i huKS-ala-IL2(N88R) u myszy. Jak wykazano w przykładzie 5 huKS-ala-IL2 i huKS-ala-IL2(N88R) wykazywały istotnie zwiększony PK w porównaniu z huKS-IL2. Niemniej jednak, dla celów porównawczych, zastosowano taki sam schemat dawkowania dla różnych cząsteczek pomimo różnic w PK. Podczas gdy dłuższy okres półtrwania w surowicy prawdopodobnie zwiększa wydajność leku, może to także prowadzić do zwiększonej toksyczności. W tym przykładzie wykazano, że o ile huKS-ala-IL2 wykazuje zwiększoną toksyczność w porównaniu z huKS-IL2 (z powodu dłuższego okresu półtrwania w krążeniu), to huKSPL 206 975 B1

-ala-IL2(N88R) wykazała zmniejszoną toksyczność w porównaniu z huKS-IL2 mimo dłuższego czasu półtrwania w krążeniu.

Myszom Balb/C (3 zwierzęta na dane warunki doświadczenia) podawano codziennie dożylne wstrzyknięcia jednego z trzech białek przez pięć kolejnych dni. Białka fuzyjne rozcieńczono w 200 gl PBS i podawano w następujących dawkach: huKS-IL2 i huKS-ala-IL2 25, 50 lub 75 gg na mysz, a huKS-ala-IL2(N88R) 50, 75 lub 100 gg na mysz. Grupa kontrolna otrzymywała dożylne wstrzyknięcia PBS. Przeżywalność mysz monitorowano codziennie i badano efekt przeżywalności myszy. Myszy przeżyły podanie wszystkich dawek huKS-IL2. Jednak huKS-ala-IL2 było bardziej toksyczne. Podczas gdy myszy tolerowały dawkę 25 gg huKS-ala-IL2, to wszystkie 3 myszy zdechły 6 dnia po dawce 50 gg, a przy dawce 75 gg zdechły dwie myszy w dniu 4,5, a trzecia mysz zdechła 5 dnia. Z drugiej strony huKS-ala-IL2(N88R) było dobrze tolerowane we wszystkich dawkach w tym 100 gg. W rzeczywistości huKS-ala-IL2(N88R) podano myszom także w dawce 200 gg i myszy przeżyły. Zatem huKS-alaIL2(N88R) było znacząco mniej toksyczne niż huKS-ala-IL2.

Myszy, które zdechły podczas podawania huKS-ala-IL2 były poddane sekcji, a ich organy pobrane. Wszystkie organy, w tym płuco, śledziona, wątroba, żołądek i nerka były w znacznym stopniu powiększone, co wskazywało na znaczne wycieki naczyniowe. Pobrano także organy ze zwierząt, którym podawano huKS-ala-IL2(N88R). Myszy te poddano procedurze opisanej powyżej i okazało się, że masa organów zwierząt, którym podawano huKS-ala-IL2(N88R) była ogólnie podobna do tej u zwierząt kontrolnych, szczególnie jeśli chodzi o płuca i wątrobę. Nie wnikając w teorię, uważa się, że wzrost masy śledziony w większym stopniu spowodowany jest wzrostem liczby komórek wywołanym przez odpowiedź odpornościową przeciwciał przeciwko temu białku ludzkiemu niż wyciekom naczyniowym. Wywnioskowano, że huKS-ala-IL2(N88R)powoduje mniej ostre wycieki naczyniowe niż huKS-ala-IL2. Tabela 3 dostarcza przykładu przybliżonych wartości x-krotnego wzrostu masy organu w porównaniu z organami myszy kontrolnych:

T a b e l a 3

NARZĄD	WZROST MASY (x-krotnie)
huKS-ala-IL2 (20 gg/mysz)	huKS-ala-IL2(N88R) (100 gg/mysz)
Płuco	4	1,7
Śledziona	3	3
Wątroba	1,5	1
Nerka	1	1

Wpływ różnych szczepów mysich o znanych zmianach w ich działaniu ich układu odpornościowego, oceniono w odniesieniu do toksyczności białek fuzyjnych lg-IL2. Wykorzystano mysie szczepy DBA/2, Balb/C, Be.CBIZ-Prkdc^scid/SzJ (SCID), beige (beżowy) oraz SCID/beige. Białka fuzyjne podawano tak jak powyżej w dawce 25 gg i 50 gq na mysz w przypadku huKS-ala-IL2 i w dawce 200 gg na mysz w przypadku huKS-ala-IL2(N88R) i oceniano przeżywalność i masę w okresie 2 tygodni.

W przypadku huKS-ala-IL2, większość szczepów mysich dała wyniki podobne do tych, jakie zaobserwowano w powyższym przypadku u myszy Balb/C: dawka 50 gg prowadziła do śmierci zwierząt w 5 dniu, podczas gdy przy niższej dawce zwierzęta przeżywały i ich masa powróciła do masy wyjściowej ale nie osiągnęła przyrostu obserwowanego w przypadku pozornie leczonych kontrolnych zwierząt. Interesujące było to, że myszy beżowe (ang. beige), które nie mają funkcjonalnych komórek NK, były w lepszym stopniu zdolne do tolerowania wysokich dawek 50 gg; dwa zwierzęcia zdechły w 9 dniu, ale jedno choć straciło znacząco masę (około 25% 7 dnia), przeżyło, i w 15 dniu osiągnęło masę ciała pozornie leczonych zwierząt i tych, którym podawano niższą dawkę. Myszy DBA/2 były bardziej wrażliwe na huKS-ala-IL2; nawet w przypadku niższej dawki, zwierzęta DBA/2 zdychały 5 i 9 dnia.

W przypadku huKS-ala-IL2(N88R) także widoczna była zwiększona podatność myszy DBA/2 na białko fuzyjne lg-IL2: 8 dnia wszystkie zwierzęta zdechły, a nawet przy połowie dawki (100 gg) zwierzęta zdechły 9 dnia. Ponownie białko fuzyjne było najlepiej tolerowane u myszy beżowych, podczas gdy myszy SCID/beige utraciły znacząco swoją masę (pozostała niezmieniona przy około 80% masy pozornie leczonej kontroli do dnia 10).

PL 206 975 B1

P r z y k ł ad 7: Wydajność białek fuzyjnych lg-IL2 o zmodyfikowanych właściwościach wiązania receptora w leczeniu różnych nowotworów u ssaków.

a) Leczenie podskórnego guza CT26/KSA u myszy Balb/C. Komórki jelitowego raka CT26, transdukowane genem kodującym ludzki antygen KS (KSA), zastosowano do wywołania podskórnego nowotworu. 2x10⁶ żywych komórek zawieszono w 100 μI PBS i wstrzyknięto podskórnie do grzbietu 6 tygodniowych myszy Balb/C. Gdy rozmiar guza osiągnął 100-200 mm³, grupy po 8 myszy poddawane były jednemu z trzech rodzajów kuracji: podawano przez 5 kolejnych dni dożylne iniekcje 15 μg albo huKS-ala-IL2 lub huKS-ala-IL2(N88R) rozcieńczonych w 200 μl PBS, lub sam PBS. Postęp choroby oceniano mierząc rozmiar guza dwa razy w tygodniu przez okres 50 dni. U kontrolnych zwierząt objętość guza zwiększała się stale, osiągając rozmiar około 3500 do 6000 mm³ w momencie śmierci, która następowała około 32 dnia. W przeciwieństwie, objętości guza w przypadku dwóch doświadczalnych grup pozostawały zasadniczo stałe do 50 dnia, wskazując, że huKS-ala-IL2(N88R) była skuteczna tak jak huKS-ala-IL2 w zapobieganiu wzrostowi guza.

b) Leczenie podskórnego guza LLC/KSA u myszy C57BL/6. W modelu drugiego nowotworu, wywołano podskórnego guza stosując komórki Lewis Lung Carcinoma transdukowane genem kodującym antygen KS. Zawieszono 1x10⁶ żywych komórek LLC wytwarzających EpCAM w 100 μI PBS i wstrzyknięto podskórnie do grzbietu 6-8 tygodniowym myszom C57BL/6. Gdy rozmiar guza osiągnął 100 - 150 mm³ grupy ośmiu myszy poddano procedurze jak powyżej, z takim wyjątkiem, że podawana dawka wzrosła do 20 μg na iniekcję. U zwierząt kontrolnych objętość guza wzrosła gwałtownie, przekraczając 6500 mm³ w ciągu 20 dni; wzrost guza w obu przypadkach eksperymentalnych był opóźniony w takim samym zakresie osiągając 4000 mm³ w tym samym czasie, co ponownie wskazuje, że nie było różnicy w skuteczności pomiędzy leczeniem huKS-ala-IL2 a huKS-ala-IL2(N88R) przy tej samej dawce.

c) Leczenie podskórnego guza LLC/KSA u myszy B6.CB17-Prkdc^scidSzJ. Białka fuzyjne według wynalazku mogą także działać na komórki inne niż dojrzałe limfocyty T. Na przykład, w jednym z doświadczeń białka fuzyjne według wynalazku doprowadziły do opóźnienia wzrostu nowotworu nawet u myszy, którym brakowało dojrzałych limfocytów T. Wyniki te wskazują, że białka fuzyjne według wynalazku mogą być przydatne w leczeniu nowotworów u, przykładowo, pacjentów z upośledzoną odpornością.

Modelowy guz podskórny LLC/KSA rozwinął się u jedenastotygodniowych myszy B6.CB17Prkdc^scidSzJ, które były upośledzone pod kątem odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem limfocytów T i B. Zastosowano ten sam protokół leczenia jak opisany powyżej. Guzy u zwierząt kontrolnych rosły gwałtownie, do 3500 mm² w ciągu 15 dni. Zarówno huKS-ala-IL2 jak i huKS-ala-IL2(N88R) były podobnie skuteczne w opóźnianiu wzrostu guza do rozmiarów mniejszych o połowę w tym samym czasie. Ponadto różnice w prędkości wzrostu guza pomiędzy myszami C57BL/6, które miały nienaruszony układ odpornościowy, a myszami B6.CB17-Prkdc^scidSzJ, którym brakowało limfocytów T i B, były minimalne.

Ponadto fakt, że KS-ala-IL2 prowadzi do leczenia nowotworu tak samo skutecznie u myszy z nienaruszonym układem odpornościowym jak i u myszy z funkcjonalnym brakiem limfocytów T, wskazało, że w tym modelu nowotworów reakcja odpornościowa przebiega przez mechanizm za pośrednictwem innych komórek niż limfocyty T. Zatem cenną cechą jest zapewnienie w cząsteczce leczniczej opcji stymulowania odpowiedzi immunologicznej przez różne komórki efektorowe. W przypadku KS-ala-IL2(N88R), które było tak skuteczne jak KS-ala-IL2 w obu wariantach myszy, aktywność komórek efektorowych, które działają niezależnie od limfocytów T, była wyraźnie zachowana.

d) Leczenie przerzutów LLC/KSA do płuc u myszy C57BL/6. Komórki LLC/KSA zastosowano także w modelu przerzutów do płuc. 1x10⁶ żywych komórek zawieszono w 200 μl PBS i wstrzyknięto dożylnie 6-8 tygodniowym myszom C57BL/6. Czwartego dnia grupy po 8 myszy były poddane jednej z następujących procedur leczenia: przez pięć kolejnych dni myszom podawano dożylnie 200 μI PBS, lub 20 μg albo KS-ala-IL2 lub KS-ala-IL2(N88R) rozcieńczonych w 200 μI PBS. Zwierzęta zabijano około 27 dnia, pobierano płuca i umieszczano je w roztworze Bouina. Zakres przerzutów w płucach określano poprzez ocenę ile procent powierzchni jest zajęta przez przerzuty oraz przez ocenę masy płuca.

Płuca grupy kontrolnej miały ponad 96% ich powierzchni zajętej przez przerzuty, i około 5-krotny wzrost masy płuca (0,75 g) ponad normalną masę płuca. W przeciwieństwie do tego, płuca myszy leczonych huKS-ala-IL2 były minimalnie zajęte przez przerzuty (5,6%), a płuca myszy leczonej KS-ala-IL2(N88R) były praktycznie wolne od przerzutów (0%). Płuca zwierząt leczoPL 206 975 B1 nych huKS-ala-IL2 i KS-ala-IL2(N88R) miały normalną masę. Zatem KS-ala-IL2(N88R) okazało się tak wydajne jak huKS-ala-IL2 w leczeniu przerzutów do płuc przy dawce wielokrotnie niższej niż wartość, która mogłaby wpływać na ich przeżywalność.

P r z y k ł ad 8: Odmiany KS-IL2 w terapii skojarzonej.

Zbadano działanie podawanej odmiany KS-IL2 o niskiej toksyczności, takiej jak huKS-alaIL2(N88R), w połączeniu z drugim czynnikiem immunomodulującym podczas leczenia nowotworów, wykorzystując podskórny model guza LLC/KSA na myszach tak jak opisano w przykładzie 7b.

a) Odmiany huKS-ala-IL2 i cyklofosfamid. W celu zastosowania terapii skojarzonej, podawano cyklofosfamid dootrzewnowo w dawce 75 mg/kg dnia 0, gdy guzy miały około 90 mm³, a następnie podawano białko fuzyjne codziennie przez 5 dni (od 1 dnia przez 5 dni). huKS-ala-IL2(N88R) podawano albo w dawce 20 gg lub 100 gg. Kontrolne warunki obejmowały pozornie leczone zwierzęta oraz zwierzęta leczone albo wyłącznie huKS-ala-IL2 w dawce 20 gg, lub wyłącznie huKS-ala-IL2(N88R) w dawce 20 gg lub 100 gg. Guzy u zwierząt leczonych pozornie rozrosły się do około 5000 mm³19 dnia, podczas gdy guzy myszy leczonych w huKS-ala-IL2 miały około 2200 mm³, a myszy leczonych 20 gg lub 100 gg huKS-ala-IL2(N88R) miały odpowiednio około 2600 mm³ i 1700 mm³. Podawanie jednoczesne cyklofosfamidu skutkowało rozmiarami guza 1700 mm³ przy dawce 20 gg huKS-ala-IL2(N88R) i 1250 mm³ przy dawce wyższej, znacząco mniejszymi niż podczas leczenia wyłącznie huKS-ala-IL2(N88R).

b) Odmiany huKS-ala-IL2 i indometacyna. W celu zastosowania terapii skojarzonej podawano indometacyna doustnie w dawce 35 gg/mysz/dzień łącznie z codziennym podawaniem białka fuzyjnego przez okres pięciu dni (od 1 dnia przez 5 dni). Guzy początkowo osiągały około 90 mm³. huKS-ala-IL2(N88R) podawano w dawce 20 gg. Warunki kontrolne obejmowały pozornie leczone zwierzęta oraz zwierzęta, którym podawano albo wyłącznie huKS-ala-IL2 w dawce 20 gg lub wyłącznie huKS-ala-IL2(N88R) w dawce 20 gg. Guzy u pozornie leczonych zwierząt rozrastały się do około 5000 mm³do 19 dnia, podczas gdy guzy u myszy leczonych huKS-ala-IL2 miały około 2200 mm³, a u myszy leczonych 20 gg huKS-ala-IL2(N88R) miały odpowiednio około 2600 mm³ i 1700 mm³. Podawanie jednoczesne indometacyny skutkowało zmniejszeniem rozmiaru guza do 850 mm³ przy dawce 20 gg huKS-ala-IL2(N88R), znacząco mniejszych niż w przypadku leczenia wyłącznie huKS-ala-IL2.

P r z y k ł ad 9: Odmiany KS-IL2 o ulepszonym indeksie terapeutycznym.

Skonstruowano odmiany KS-IL2 z mutacjami w danych pozycjach w sekwencji II-2. Na przykład utworzono substytucje w pozycjach, które prawdopodobnie łączą się z podjednostką β receptora IL-2. Odpowiednią resztą, jest na przykład F42 w dojrzałej sekwencji hulL-2. Uważa się, że struktura pierścienia aromatycznego tego aminokwasu stabilizuje lokalną konformację w IL-2 (Mott et al., JMB 1995, 247:979), i okazało się, że sybstytucje w tej pozycji na przykład z Y, A lub K w immunocytokinie prowadzą do cząsteczki, ze znacznie obniżonym powinowactwem do receptora IL-2 i bioaktywnością. Cząsteczki takie testowano na zwierzętach i okazało się, że osiągnięto zwiększenie indeksu terapeutycznego w leczeniu nowotworów w porównaniu z niezmienioną formą immunocytokiny. Inne skuteczne substytucje przebiegają w pozycjach R38 i K43.

Inne substytucje we fragmencie IL-2 immunocytokiny przebiegają w regionie, który prawdopodobnie łączy się z podjednostką β, na przykład, w pozycji E15 lub L19 dojrzałej hulL-2. Okazało się, że jeśli zmutuje się te pozycje, na przykład na A lub R w immunocytokinie odmiany immunocytokiny mają obniżone powinowactwo do podjednostki β receptora IL-2 w porównaniu do niezmienionej formy immunocytokiny. Ogólnie okazało się, że efekty substytucji na R są bardziej wyraźne niż substytucji na A, co może być związane ze sprężystością bocznego łańcucha w R. Cząsteczki te badano na zwierzętach i okazało się, że osiągnięto zwiększenie terapeutycznego indeksu w przypadku leczenia nowotworów w porównaniu do niezmienionych form immunocytokiny. Inne substytucje wprowadza się z pozycjach D84 i V91 i jak wykazano, są również skuteczne w zwiększaniu indeksu terapeutycznego.

Substytucja we fragmencie IL-2 immunocytokiny, która jak się wydaje wpływa na obszar cząsteczki, oddziałujący z podjednostką γ receptora IL-2, zostaje wprowadzona w pozycji N119 dojrzałej IL-2. Bardziej stabilną odmianę immunocytokiny tworzy się poprzez mutację na A, a mniej trwałą mutacje tworzy się poprzez mutację na R. Działanie tych odmian badano na zwierzętach z guzami i odkryto, że te odmiany immunocytokin rzeczywiście mają polepszony indeks terapeutyczny w porównaniu do niezmienionej formy immunocytokiny.

Okazało się także, że wzrost indeksu terapeutycznego można osiągnąć poprzez wytworzenie wielu mutacji w immunocytokinie IL-2, szczególnie w przypadku cząsteczek, w których pojedyncze mutacje wykazały tylko marginalny lub nieznaczny wzrost indeksu terapeutycznego. Na przykład oka20

PL 206 975 B1 zało się, że immunocytokina zawierająca połączenie F42A z L19A, lub L19A z N119A jest bardziej skuteczna niż jakakolwiek inna odmiana immunocytokiny. W przypadku zastosowania wielu mutacji, szczególnie korzystnym jest wykorzystanie mutacji, które zmniejszają rozmiar bocznego łańcucha aminokwasu. Kolejną substytucją wprowadzoną do fragmentu IL-2 immunocytokiny jak T51 w dojrzałej hulL-2. Podczas gdy mutacja na A nie wykazuje polepszenia indeksu terapeutycznego, mutacja na P tworzy immunocytokinę o polepszonym indeksie terapeutycznym, w porównaniu z niezmienioną formą immunocytokiny stosowanej w leczeniu nowotworów.

P r z y k ł ad 10: Odmiana huKS-ala-IL2(D20T) białka fuzyjnego lg-IL2 i jej pochodne.

Wytworzono odmiany oparte na lg-IL2(D20T), które zawierają substytucję asparginianu na treoninę w pozycji 20 dojrzałej hulL-2. Odmiany te zawierają dodatkową substytucję w domenie Ig, tak jak we fragmencie Fc lub w domenach, na które ukierunkowane jest przeciwciało. W celu stworzenia konstrukcji DNA kodujących takie cząsteczki, stosowano procedury zasadniczo takie jak w przykładzie 1, stosując podejście PGR ze specyficznymi dla tej konstrukcji primerami w celu wprowadzenia mutacji i właściwe strategie klonowania, znane specjalistom danej dziedziny.

a) huKS-ala-IL2(D20T). Aby wprowadzić mutację D20T zastosowano podejście z metagenezą PCR z zastosowaniem primera

5'-CAGCTGCAACTGGAGCATCTCCTGCTGACCGTCCAGATGATTCTGAAT -3' (pogrubione nukleotydy wskazują podstawiony kodon) (SEQ ID NO: 28) oraz primer T3 (5'- ATTAACCCTCACTAAAGGGA -3') (SEQ ID NO: 29), fragment DNA został poddany amplifikacji z DNA dzikiego typu hulL-2 na plazmidzie pBS i wstawiony do wektora TA (lnvitrogen) w celu wytworzenia TA-IL2(D20T). Mutagenezę potwierdzono poprzez sekwencjonowanie. W celu podstawienia za oryginalną sekwencję IL-2 w huKS-ala-IL2, sklonowane fragment Pvull/Xhol o długości 385 bp z TA-IL2(D20T) do plazmidu wyjściowej immunocytokiny na drodze reakcji potrójnego przyłączenia. Wytworzono białko fuzyjne i oczyszczono zasadniczo tak, jak opisano w przykładzie 3. Sekwencje aminokwasów odpowiadające zmiennym regionom ciężkiego i lekkiego łańcucha hu-KS przedstawiono odpowiednio w SEQ ID NO: 30131.

Wytworzono inne odmiany huKS-ala-IL2(D20T), wbudowując ten sam fragment pochodzący od PGR do różnych szkieletów plazmidowych.

b) dl-KS-ala-IL2(D20T). Uprzednio opisano odmianę KS-ala-IL2 ze zmianami usuwającymi potencjalny epitop limfocytu T. To białko fuzyjne zostało wytworzone i oczyszczone zasadniczo tak, jak opisano w przykładzie 3. Sekwencja aminokwasu odpowiadająca ciężkiemu łańcuchowi przeciwciała dl-KS połączonemu z odmianą IL2(D20T) została zobrazowana w SEQ ID NO: 32. SEQ ID NO: 33 i 34 odpowiadają zmiennym regionom odpowiednio ciężkiego i lekkiego łańcucha dl-KS.

c) Deglikolizowana dl-KS-ala-IL2(D20T). Przeprowadzono enzymatyczną deglikozylację stosując N-glikanazę białka dl-KS-ala-IL2(D20T) zasadniczo tak jak opisano w przykładzie 2.

d) dl-KS(y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T). Jednostka Ig dla tego białka fuzyjnego IL-2(D20T) pochodziła od stałego regionu podklasy y4 IgG (SEQ ID NO: 7), która dodatkowo posiada cechy regionu zawiasowego y1 IgG (SEQ ID NO: 10). Ponadto wprowadzono mutacje, które usuwają potencjalne epitopy limfocytu T. Dodatkowo to białko fuzyjne zawiera substytucję asparginy na glutaminę, która eliminuje miejsce N-glikozylacji w Fc (patrz przykład 4). Jednoczesna substytucja fenyloalaniny na alaninę usuwa potencjalny epitop limfocytu T. Białko fuzyjne wytworzono i oczyszczono zasadniczo tak, jak opisano w przykładzie 3.

e) dl-NHS76(y2h)-ala-IL2(D20T). Jednostka Ig dla tego białka fuzyjnego pochodziła ze stałego regionu podklasy y2 IgG, która dodatkowo posiada cechy regionu zawiasowego yl IgG. W NHS76 zmienne regiony Ig są skierowane przeciwko epitopom zawartym w kompleksach DNA-histonowych i specyficznie rozpoznają centra nekrotyczne nowotworów (Williams et al., opis patentowy PCT WO 00/01822). Także wprowadzono mutację, która eliminuje potencjalny epitop limfocytu T w zmiennym regionie. Ta reszta, leucyna 104, leży na połączeniu CDR3 V-J, i została podstawiona przez walinę. Białko fuzyjne wytworzono i oczyszczono zasadniczo tak, jak opisano w przykładzie 3.

f) dl-NHS76(y2h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T). Białko to, oparte na białku z przykładu 10e, dodatkowo zawiera mutacje, które eliminują N-glikozylację w Fc i potencjalny epitop limfocytu T, tak jak opisano w przykładzie 10d. Wytworzono takie białko fuzyjne i oczyszczono zasadniczo tak, jak opisano w przykładzie 3. W jednej z realizacji białka fuzyjne według wynalazku zawierały sekwencję ciężkiego łańcucha cząsteczki NHS76(y2h)(FN>AQ) połączoną z odmianą IL2(D20T) jak zobrazowano w SEQ ID NO: 35, oraz sekwencji zmiennego i stałego regionu lekkiego łańcucha odpowiadającej SEQ ID NO: 36. Jednakże region stałego łańcucha z SEQ ID NO: 35 można zastosować w połączeniu z dowolnym zmiennym lub stałym regionem lekkiego łańcucha IgG.

PL 206 975 B1

g) dl-NHS76(Y4h)-ala-IL2(D20T). Białko to jest zbliżone do białka opisanego w przykładzie 10e, ale zawiera ciężki łańcuch pochodzący z podklasy γ4 a nie γ2 IgG. Wytworzono takie białko fuzyjne i oczyszczono zasadniczo tak, jak opisano w przykładzie 3.

h) dl-NHS76(Y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T).Białko to, oparte na białku z przykładu 10 g, dodatkowo zawiera mutację, która eliminuje N-glikozylację w Fc i potencjalny epitop limfocytu T tak, jak opisano w przykładzie 10d. Wytworzono takie białko fuzyjne i oczyszczono zasadniczo tak, jak opisano w przykładzie 3. W jednej z realizacji białka fuzyjne według wynalazku zawierały sekwencję ciężkiego łańcucha cząsteczki dl-NHS76(Y4h)(FN>AQ) połączoną z odmianą IL-2(D20T), zobrazowaną w SEQ ID NO: 37, oraz sekwencję zmiennego i stałego regionu lekkiego łańcucha odpowiadającą SEQ ID NO: 36. Jednakże region ciężkiego łańcucha SEQ ID NO: 37 można stosować w połączeniu z dowolnym zmiennym lub stałym regionem lekkiego łańcucha IgG.

Jednostka Ig białka fuzyjnego według wynalazku może zawierać domeny stałych regionów ciężkiego łańcucha pochodzące z dowolnej podklasy IgG, w tym połączenia zawierające domeny cząsteczek IgG pochodzące od innych gatunków. Odpowiednio białka fuzyjne według wynalazku mogą zawierać regiony zawiasowe pochodzące z dowolnej podklasy IgG, na przykład region zawiasowy pochodzący z gamma 1 (SEQ ID NO: 10), gamma 2 (SEQ ID NO: 11) lub gamma 4 IgG (SEQ ID NO: 12).

Aktywność odmian lg-IL2(D20T) w metodach biologicznych: Białka fuzyjne Ig-IL2(D20T) badano metodami biologicznymi, które mierzą zdolność komórek zależnych od IL-2 do wzrostu w celu proliferacji, która była wyrażana jako wartość ED50 (patrz przykład 4). Badania przeprowadzono na mysich komórkach CTLL-2 lub ludzkich komórkach Kit-225 (które wytwarzają IL-2RaeY), oraz ludzkich komórkach TF-1p lub izolowanych mysich komórkach NK (które wytwarzały IL-2ReY).

Na przykład w reprezentacyjnym doświadczeniu okazało się, że w porównaniu z huKS-ala-IL2, wartość ED50 dla dl-KS-ala-IL2(D20T) w komórkach CTLL-2 posiadających IL-2RaeY była bez zmian, podczas gdy w komórkach TF-1p posiadających IL-2ReY była w przybliżeniu 900-krotnie wyższa. Dlatego stosunek ED50, określony w przykładzie 4, wynosił około 150 dając wzrost około 750-krotny selektywności względem komórek CTLL-2 posiadających IL-2aeY w porównaniu z huKS-ala-IL2. W porównaniu ze wzrostem selektywności około 20 000-krotnym (w porównaniu do KS-ala-IL2) obserwowanego w przypadku huKS-ala-IL(N88R) w obrębie tej pary linii komórkowych, selektywność była obniżona około 10 do 20-krotnie w przypadku dl-KS-ala-IL2(D20T), co znalazło odzwierciedlenie w mierzalnej odpowiedzi proliferacyjnej otrzymanej z komórek wytwarzających IL-2ReY. Trend ten był także widoczny gdy stosowano ludzkie komórki Kit 225. Tak jak to miało miejsce w przypadku innych białek fuzyjnych zawierających przeciwciało KS, deglikozylacja fragmentu przeciwciała miała mały ale jednolity wpływ na obniżenie aktywności tego białka fuzyjnego w komórkach wytwarzających IL-2ReY.

Wyznaczano także proliferację komórkową zależną od IL-2 w przypadku odmian Ig-IL(D20T) zawierających różne jednostki przeciwciała. Okazało się, że w porównaniu do dl-NHS76(Y2)-ala-IL2, wartość ED50 dla dl-NHS76(Y2)-ala-IL2(D20T) w przypadku komórek Kit-225 posiadających IL-2RaeY wzrosła 3-krotnie, podczas gdy w przypadku komórek TF-1p posiadających IL-2ReY wzrosła około 230-krotnie. Otrzymany stosunek ED50 wynosił 350 i mieścił się w tym samym zakresie jaki obserwowano w przypadku dl-KS(Y4)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T), i były przynajmniej 10-krotnie mniej selektywne niż huKS-ala-IL2(N88R). Przykładowe wyniki przedstawiono w tabeli 4.

T a b e l a 4

Białko	Stosunek ED50 TF-1p/CTLL-2	Stosunek ED50 TF-1 p/Kit-225
dl-KS-ala-IL2(D20T)	150	3000
dl-KS(y4)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T)		5600*
dl-NHS76(y2)-ala-IL2(D20T)		350

* = ś rednia z róż nych serii

Farmakokinetyka odmian lg-IL2(D20T): W celu oceny oddziaływania odmian Ig-IL2(D20T) z receptorami Fc na powierzchni komórki, oceniano wiązanie się białek fuzyjnych lg-IL2 z receptorami FcyR metodą ELISA z wykorzystaniem komórek U937. Białka fuzyjne (huKS-ala-IL2, dl-huKS-ala-IL2, dl-KS-ala-IL2(D20T) oraz dl-KS(Y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T)) rozcieńczono 2-krotnie w zakresie od 100 μg/ml do 780 ng/ml, inkubowano z komórkami i wykrywano wiązanie stosując Ab F(ab')₂ przeciwko ludzkiej IgG Fc sprzężone z FITC (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Stężenie, przy którym występowała połowa maksymalnego wiązania huKS-ala-IL2 i dl-KS-ala-IL2 w przypadku tych

PL 206 975 B1 komórek wynosiło 5 pg/ml, i co ciekawe, wzrosło dwukrotnie w przypadku białka dl-KS-ala-IL2(D20T). Gdy wprowadzono mutację, która zapobiegała glikozylacji jednostki Ig (dl-KS(Y4h)(FN>AQ)-alaIL2(D20T)) obniżono wiązanie tego białka z komórkami U973 5- do 10-krotnie, przy czym wiązanie nie zostało całkowicie zniesione.

Zbadano właściwości farmakokinetyczne odmian lg-IL2(D20T) na myszach zasadniczo tak, jak opisano w przykładzie 5. Nieoczekiwanie, w porównaniu z dl-KS-ala-IL2 okres półtrwania dl-KS-ala-IL2(D20T) uległ drastycznemu obniżeniu. Analiza profilu PK wskazała, że efekt ten był szczególnie dramatyczny podczas fazy a: podczas gdy 50% dl-KS-ala-IL2 było nadal dostępne po 1 godzinie, w przypadku dl-KS-ala-IL2(D20T) tylko około 5% było nadal obecne. Spadek fazy β profilu PK dla tych białek był zbliżony. Zasadniczo taki sam profil PK jak profil obserwowany w przypadku dl-KS-ala-IL2(D20T) otrzymano w przypadku białka fuzyjnego dl-NHS76(Y2h)-ala-IL2(D20T), które zawiera IgG podklasy γ2, które normalnie wykazuje najmniejsze powinowactwo wiązania FcR. Zatem, wpływ jednostki białkowej IL(D20T) tego białka fuzyjnego nie ogranicza się do przeciwciała dl-KS.

Ogólnie zaobserwowano, że deglikozylacja białka fuzyjnego Ig ma wpływ na polepszenie fazy a profilu PK. Dlatego zbadano wpływ enzymatycznej deglikozylacji dl-KS-ala-IL2(D20T) na profil PK. W rzeczywistości faza a profilu PK zasadniczo powróciła do postaci, jaką obserwowano w przypadku dl-KS-ala-IL2. Ten sam efekt osiągnięto, gdy glikozylację wykluczono na drodze mutagenezy, tak jak w przypadku białka fuzyjnego dl-KS(Y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T). Zatem prawdopodobnie wpływ na profil PK wynika ze zmniejszonego wiązania FcR.

Toksyczność odmian lg-IL2(D20T): Toksyczność odmiany lg-IL2(D20T), KSfy4h)(FN>AQ)-alaIL2(D20T) porównano z toksycznością dl-KS-ala-IL2 u myszy Balb/C tak jak opisano w przykładzie 6.

Oba białka fuzyjne miały zbliżony okres półtrwania w surowicy u myszy. dl-(Y4h)(FN>AQ)-alaIL2(D20T) podawano w pięciu dziennych dawkach wynoszących albo 100 pg/mysz, 200 pg/mysz albo 400 pg/mysz podczas gdy dl-KS-ala-IL2 podawano w pięciu dziennych dawkach wynoszących 40 pg/mysz. Okazało się, że myszy przeżywają nawet przy dawce dl-KS(Y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) wynoszącej 400 pg/mysz, podczas gdy myszy kontrolne, które otrzymały jedną dziesiąta dawki dl-KS-ala-IL2, zdechły w ciągu 6 dni. Miało to nieznaczny wpływ na wartości masy ciała myszy, którym podawano dl-KS(Y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T), gdyż spadł on przejściowo do 97% wyjściowej masy w 7 dniu. Różnica wynosząca ponad 10-krotność tolerowanej dawki może wskazywać na zasadnicze poprawienie się indeksu terapeutycznego.

Wydajność odmian lg-IL(D20T) w leczeniu nowotworów: Wydajność odmian Ig-IL(D20T) oceniono na myszach Balb/C z podskórnym guzem pochodzącym z komórek CT26/KSA, tak jak opisano w przykładzie 7a.

Białko fuzyjne dl-KS(Y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) podawano w dawkach 15 pg/mysz i 30 pg/mysz. Wzrost guzów inicjował się od średniego rozmiaru 126 mm³ i osiągał rozmiary pomiędzy 1800 mm³i 5000 mm³ w ciągu 28 dni. Guzy w przypadku myszy leczonych dawką 15 pg/mysz dl-KS-ala-IL2 urosły do średniego rozmiaru 355 mm³, podczas gdy guzy u myszy leczonych dawką 15 pg/mysz dl-KS-ala-IL2(D20T) osiągnęły średni rozmiar 2250 mm³. Najprawdopodobniej spowodowane było to gorszym PK tej cząsteczki. Guzy w przypadku myszy leczonych dl-KS(Y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) przy niższej dawce 15 pg/mysz urosły do pewnego zakresu, do średniego rozmiaru 1450 mm³; jednakże przy dawce 30 pg/mysz guzy osiągnęły średni rozmiar 950 mm³, co istotne, u ponad połowy myszy guzy nie urosły znacznie. Zatem, zwiększone dawki dl-KS(Y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) mają znaczący wpływ na hamowanie wzrostu guza. W istocie dawka zastosowana w doświadczeniu była przynajmniej 12-krotnie niższa niż maksymalna tolerowana dawka dla tej cząsteczki i dlatego prawdopodobnie ma lepszy indeks terapeutyczny niż huKS-ala-IL2, która dla porównania była podawana w jednej trzeciej do jednej drugiej maksymalnej tolerowanej dawki.

P r z y k ł a d 11: Względne powinowactwo białek fuzyjnych IL2 dzikiego typu i zmutowanych do różnych receptorów IL-2.

Można zmierzyć różnicujące powinowactwo różnych typów białek fuzyjnych według wynalazku do receptora IL-2ReY w porównaniu do receptora IL-2RaeY stosując taką metodę jak metoda radioimmunologiczna. Równe ilości komórek wytwarzających receptor IL-2RaeY lub komórek wytwarzających receptor IL-2ReY nakładano na plastikowe płytki. Otrzymano serię rozcieńczeń dodając równe ilości białka fuzyjnego IL-2 albo dzikiego typu albo zmutowanego do równej liczby komórek wytwarzających receptor IL-2RaeY lub komórek wytwarzających receptor IL-2ReY w celu otrzymania krzywej kalibracji. Niezwiązane białka fuzyjne wymywano, a ilość białka fuzyjnego związanego z każdym typem komórki wykrywano za pomocą radioznakowanego liganda. W przypadku białka fuzyjnego Fc-IL2 ligandem

PL 206 975 B1 może być cząsteczka taka jak białko A gronkowca, które wiąże się ze fragmentem Fc IgG. Ligandem takim może być także inne przeciwciało, które rozpoznaje fragment danej podklasy cząsteczki IgG, na przykład przeciwciała stałych regionów gamma 1 IgG, gamma 2 IgG lub gamma 4 IgG. Niezwiązany ligand wypłukuje się i mierzy się licznikiem gamma radioaktywność płytki zawierającej albo komórki wytwarzające IL-2RaeY związane z białkiem fuzyjnym IL-2 dzikiego typu; komórki wytwarzające IL-2ReY związane ze zmutowanym białkiem fuzyjnym IL-2; komórki wytwarzające IL-2ReY związane z białkiem fuzyjnym dzikiego typu albo komórki wytwarzające IL-2ReY związane ze zmutowanym białkiem fuzyjnym. Dane otrzymane na podstawie analizy wiązania normalizuje się w celu uwzględnienia liczby komórek i receptorów wytworzonych przez te komórki.

W innym sposobie same białka fuzyjne mogą być znakowane, albo radioaktywnie, albo nieradioaktywnie stosując różne techniki dobrze znane w praktyce. Podobnie do sposobu znakowania liganiu opisanego powyżej, dodaje się znakowane białko fuzyjne albo dzikiego typu albo zmutowane i mierzy się ilość znakowanego białka fuzyjnego.

Powinowactwo wiązania białka fuzyjnego w przypadku danego receptora mierzy się jako stosunek stężenia związanego liganda lub związanego białka fuzyjnego, tak jak opisano powyżej, do całkowitego stężenia białka fuzyjnego dodanego do każdej reakcji. Porównując białko fuzyjne IL2 dzikiego typu, pewne mutacje w jednostce IL-2 zmieniają względne powinowactwo białka fuzyjnego do receptora IL-2ReY oraz receptora IL-2RaeY.

ROZWIĄZANIA EKWIWALENTNE

Wynalazek można wykorzystać w inny sposób bez odchodzenia od jego sensu i zasadniczych właściwości. Podane powyżej realizacje należy uważać za ilustrujące raczej niż ograniczające wynalazek. Zakres wynalazku jest określony przez dołączone zastrzeżenia, raczej niż przez powyższy opis, i wszelkie zmiany, które wchodzą w znaczenie i zakres ekwiwalentności zastrzeżeń zawierają się w nich.

Wszystkie patenty, zgłoszenia patentowe i publikacje naukowe przytoczone w opisie, są tu w całości zawarte poprzez odniesienie.

PL 206 975 B1

WYKAZ SEKWENCJI

<110>	Gillies, Stephen
<120>	Immunocytokiny o modulowanej selektywności
<130>	LEX-02QPC
<150> <151>	60/337,113 2001-12-04
<150> <151>	60/371,966 2002-04-12
cl60>	37
<170>	Patentln wersja 3.1
<210> <211> <212> <213>	1 7 PRT Sztuczna sekwencja

<220> <223>	Sekwencja gamma 1 IgG
<400>	1

Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 1 5

<210> <211> <212> <213>

2 5 PRT Sztuczna sekwencja

<220> <223>	Sekwencja gamma 2 lub 4 Ig
<400>	2

Gin Phe Asn Ser Thr 1 5

<210> <211> <212> <213>	3 133 PRT Homo sapiens
<400>	3

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His 15 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30

PL 206 975 B1

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gin Ser Ile 115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Miejsce Xma I w ludzkim gamma 1 ciężkiego łańcucha <400> 4 tccccgggta aa <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> poleczenie huKS-ala-IL2 typ dzik <400> 5

Ser Pro Gly Lys Ala Pro Thr

5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

PL 206 975 B1 <223> zmutowane połączenie huKS-ala-IL2 <400> 6

Ser Gly Pro Ala Ala Pro Thr

5 <210> 7 <211> 327 <212> PRT <213 > Homo sapiens <220>

<221> zróżnicowany <222> (1)..(327) <223> stały region ludzkiego gamma 4 <400> 7

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 1 5

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 20

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 35 40

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 50 55

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 65 70

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 85

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 100

Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 115 120

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 130 135

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 140

Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu 145 150

Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 155 160

PL 206 975 B1

Gly

Val

Glu

Val

His 165

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin

Phe

170

175

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

180

185

190

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

195

200

205

Pro

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

210

215

220

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Gin

Glu

Met

Thr

Lys

225

230

235

240

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

245

250

255

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

260

265

270

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

275

280

285

Arg

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Glu

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

290

295

300

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

305

310

315

320

Leu

Ser

Leu

Ser

Leu

Gly

Lys

325

<210> <211> <212> <213>	8 330 PRT Homo	sapiens
<220>
<221>	zróżnicowany
<222>	ii)..	(330)
<223>	stały	region

<400> 8

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

PL 206 975 B1

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thp His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

PL 206 975 B1

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

<210>	9
<211>	326
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<220>
<221>	zróżnicowany
<222>	(1)..(326)
<223>	stały region ludzkiego gamma 2

<400> 9

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

PL 206 975 B1

PL 206 975 B1 <211> 14 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Region zawiasowy ludzkiej IgG gamma 1 <400> 10

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 15 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Region zawiasowy ludzkiej Ig gamma 2 <400> 11

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 15 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Region zawiasowy ludzkiej IgG gamma 4 <400> 12

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Sztuczna <220>

<223> Koniec C stałych regionów IgG gamma 1 i gamma 2 <400> 13

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Sztuczna

PL 206 975 B1

<220> <223>	Koniec C stałego regionu IgG gamma 4
<400>	14

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

1	5
<210> <211> <212> <213>	15 9 PRT Sztuczna

<220> <223>	zmutowany koniec C stałych regionów IgG gamma
<400>	15

Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala

1	5
<210> <211> <212> <213>	16 32 DNA Sztuczna sekwencja
<220> <223>	sensowny primer do wytworzenia białka fuzyjnego huKS-ala-IL2 (N88R)
<400>	16

ccccgggtgc cgccccaact tcaagttcta ca 32

<210> <211> <212> <213>	17 53 DNA Sztuczna sekwencja
<220> <223>	antysensowny primer do wytworzenia białka fuzyjnego huKS-ala-IL2 (N88R)

<400> 17 agccctttag ttccagaact attacgttga tcctgctgat taagtcccta ggt 53

<210> <211> <212> <213>	18 40 DNA Sztuczna sekwencja
<220> <223>	drugi sensowny primer

<400> 18 agttctggaa ctaaagggct ccgaaacaac attcatgtgt 40

PL 206 975 B1

<210> <211> <212> <213>

19 4 PRT Sztuczna sekwencja

<220> <223>	zmutowana sekwencja w odmianie huKS Ml IL-2
<400>	19

Thr Thr Ser Arg

<210> <211> <212> <213>

20 12 PRT Sztuczna sekwencja

<220> <223>	sekwencja łucznika przeciwciało-IL2
<400>	20

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Ala Pro Thr

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	21 12 PRT Sztuczna sekwencja

<220> <223>	sekwencja zmutowanego łucznika przeciwc±ało-IL2
<400>	21

Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Ala Pro Thr

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	22 6 PRT Sztuczna sekwencja

<220> <223>	sekwencja w odmianie huKS M1-IL2
<400>	22

Asp Leu Ile Ser Asn Ile

1	S
<210> <211> <212> <213>	23 6 PRT Sztuczna sekwencja

PL 206 975 B1 <220>

<223> zmutowana sekwencja w odmianie huKS M1-IL2 <400> 23

Asp Thr Thr Ser Arg Ile

5 <210> 24 <211» 43 <212> DNA <213» Sztuczna sekwencja <220>

<223> sensowny primer do wytworzenia mutacji N88R <400> 24 acttaagacc tagggacacc accagcagga tcaacgtaat agt 43 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> antysensowny primer dla mutacji N88R <400> 25 atcatgtctg gatccctc 18 <210> 26 <211» 7 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220» <223> mutacja N na Q w domenie CH2 stałego regionu Fc gamma 1 <400» 26

Gin Tyr Gin Ser Thr Tyr Arg i 5 <210» 27 <211> 5 <212> PRT <213» Sztuczna sekwencja <220>

<223> Mutacja FN na AQ we fragmencie Fc stałych regionów gamma 2 lub 4 <400» 27

Gin Ala Gin Ser Thr

PL 206 975 B1 <210> 28 <211> 48 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<22 3 > Sensowny primer dla mutacji D20T <400> 28 cagctgcaac tggagcatct cctgctgacc ctccagatga ttctgaat 48 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Antysensowny primer dla mutacji D20T <400> 29 attaaccctc actaaaggga 20 <210> 30 <211> 116 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> zmienny region ciężkiego łańcucha hu-KS <400> 30

Gin Ile 1

Gin Leu Val 5

Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 10

Gly 15

Glu

Thr

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gin

Thr

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Tyr

Thr

Gly

Glu

Pro

Thr

Tyr

Ala

Asp

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Ala

Phe

Ser

Leu

Glu

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Ala

Phe

65

70

75

80

Leu

Gin

Ile

Asn

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

PL 206 975 B1

Val Arg Phe Ile Ser Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val 100 105 no

Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 106 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> zmienny region lekkiego łańcucha hu-KS <400> 31

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro

Gly

1

5

10

15

Glu

Arg

Val

Thr

Leu

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Val

Ser

Tyr

Met

20

25

30

Leu

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Ser

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Phe

35

40

45

Asp

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Phe

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Ile

Ser

Met

Glu

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Ala

Thr

Tyr

Cys

His

Gin

Arg

Ser

Gly

Tyr

Pro

Tyr

Thr

85

90

95

Phe

Gly Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100 105 <210> 32 <211> 579 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> ciężki łańcuch dl-KS-ala IL2 (D20T) połączony z odmianą IL-2 <400> 32

Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

PL 206 975 B1

Glu Val Thr

Cys Val Val 260

Val Asp

Lys Phe Asn 275

Trp Tyr Val

Asp Gly 280

Lys Pro Arg 290

Glu Glu Gin

Tyr Asn 295

Leu Thr Val 305

Leu His Gin 310

Asp Trp

Val ser 265

Val Glu

Ser Thr

Leu Asn

His Glu Asp Pro Glu 270

Val His Asn Ala Lys 285

Tyr Arg Val Val Ser 300

Gly Lys Glu Tyr Lys 315

Lys Val Ser

Asn Lys Ala 325

Leu Pro

Ala Pro 330

Ile Glu Lys Thr Ile 335

Lys Ala Lys

Gly Gin Pro 340

Arg Glu

Pro Gin 345

Val Tyr Thr Leu Pro 350

Ser Arg Glu 355

Glu Met Thr

Lys Asn 360

Gin Val

Ser Leu Thr Cys Leu 355

Lys Gly Phe 370

Tyr Pro Ser

Asp Ile 375

Ala Val

Glu Trp. Glu Ser Asn 380

Gin Pro Glu 385

Asn Asn Tyr 390

Lys Thr

Thr Pro

Pro Val Leu Asp Ser 395

Gly Ser Phe

Phe Leu Tyr 405

Ser Lys

Leu Thr 410

Val Asp Lys Ser Arg 415

Gin Gin Gly

Asn Val Phe 420

Ser Cys

Ser Val 425

Met His Glu Ala Leu 430

Asn His Tyr 435

Thr Gin Lys

Ser Ala 440

Thr Ala

Thr Pro Gly Ala Ala 445

Thr Ser Ser 450

Ser Thr Lys

Lys Thr 455

Gin Leu

Gin Leu Glu His Leu 460

Leu Thr Leu 465

Gin Met Ile 470

Leu Asn

Gly Ile

Asn Asn Tyr Lys Asn 475

Lys Leu Thr

Arg Met Leu 485

Thr Phe

Lys Phe 490

Tyr Met Pro Lys Lys 495

Val

Thr

Val

Cys

320

Ser

Pro

Val

Gly

Asp

400

Trp

His

Pro

Leu

Pro

480

Ala

PL 206 975 B1

Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu 500 505 510

Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro 515 520 525

Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly 530 535 540

Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile 545 550 555 560

Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gin Ser Ile Ile Ser 565 570 575

Thr Leu Thr

<210»	33
<211»	116
<212>	PRT
<213>	Sztuczna sekwencja
<220» <223»	zmienny region ciężkiego	łańcucha dl-KS
<400>	33
Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly	Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ser

10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Ala Glu Thr Ser Thr Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Leu Asn Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90· 95

Val Arg Phe Ile Ser Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr val

PL 206 975 B1

100 105 110

Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 106 <212> PRT <213 > Sztuczna sekwencja <220>

<223 > zmienny region lekkiego łahcucha dl-KS <400> 34

Gin 1	Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val	Ser	Pro Gly 15
5	10
Gin	Arg Ala Thr Ile Thr Cys	Ser Ala Ser Ser Ser Val	Ser	Tyr Ile
	20	25	30
Leu	Trp Tyr Gin Gin Lys Pro	Gly Gin Pro Pro Lys Pro	Trp	Ile Phe
	35	40 45
Asp	Thr Ser Asn Leu Ala Ser	Gly Phe Pro Ser Arg Phe	Ser	Gly Ser
	50 55	60
Gly	Ser Gly Thr Ser Tyr Thr	Leu Thr Ile Asn Ser Leu	Glu	Ala Glu
65	70	75		80
Asp	Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys	His Gin Arg Ser Gly Tyr	Pro	Tyr Thr
	85	90		95
Phe	Gly Gly Gly Thr Lys Val	Glu Ile Lys
	100	105
<210> 35
<211> 580
<212> PRT
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> ciężki łańcuch dl-NHS76(gamma2h)#(FN>AQ)-ala	-IL2(D20T) połączony z odmiany IL2
<400> 35

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15

PL 206 975 B1

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val 20

Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly 25 30

Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gin 35 40

Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 45

Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly 50 55

Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val 65 70

Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 85

Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Arg Gly Lys Trp Ser Lys Phe 100

Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Ser 115 120

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 130 135

Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 185 190

Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr 195 200

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val 210 215

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230

Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 250 255

PL 206 975 B1

Pro Glu Val Thr Cys 260

Val Val Val Asp Val 265

Ser His Glu

Asp Pro Glu 270

Val Gin Phe Asn Trp 275

Tyr Val Asp Gly Val 280

Glu Val His 285

Asn Ala Lys

Thr Lys Pro Arg Glu 290

Glu Gin Ala Gin Ser 295

Thr Phe Arg 300

Val Val Ser

Val Leu Thr Val Val 305

His Gin Asp Trp Leu 310

Asn Gly Lys 315

Glu Tyr Lys 320

Cys Lys Val Ser Asn 325

Lys Gly Leu Pro Ala 330

Pro Ile Glu

Lys Thr Ile 335

Ser Lys Thr Lys Gly 340

Gin Pro Arg Glu Pro 345

Gin Val Tyr

Thr Leu Pro 350

Pro Ser Arg Glu Glu 355

Met Thr Lys Asn Gin 360

Val Ser Leu 365

Thr Cys Leu

Val Lys Gly Phe Tyr 370

Pro Ser Asp Ile Ala 375

Val Glu Trp 380

Glu Ser Asn

Gly Gin Pro Glu Asn 385

Asn Tyr Lys Thr Thr 390

Pro Pro Met 395

Leu Asp Ser 400

Asp Gly Ser Phe Phe 405

Leu Tyr Ser Lys Leu 410

Thr Val Asp

Lys Ser Arg 415

Trp Gin Gin Gly Asn 420

Val Phe Ser Cys Ser 425

Val Met His

Glu Ala Leu 430

His Asn His Tyr Thr 435

Gin Lys Ser Ala Thr 440

Ala Thr Pro 445

Gly Ala Ala

Pro Thr Ser Ser Ser 450

Thr Lys Lys Thr Gin 455

Leu Gin Leu 460

Glu His Leu

Leu Leu Thr Leu Gin 465

Met Ile Leu Asn Gly 470

Ile Asn Asn 475

Tyr Lys Asn 480

Pro Lys Leu Thr Arg 485

Met Leu Thr Phe Lys 490

Phe Tyr Met

Pro Lys Lys 495

PL 206 975 B1

Ala Thr Glu Leu	Lys His Leu Gin	Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys	Pro
	500	505	510
Leu Glu Glu	Val	Leu Asn Leu Ala	Gin Ser	Lys Asn Phe His Leu	Arg
515		520		525
Pro Arg Asp	Leu	Ile Ser Asn Ile	Asn Val	Ile Val Leu Glu Leu	Lys
530		535		540
Gly Ser Glu	Thr	Thr Phe Met Cys	Glu Tyr	Ala Asp Glu Thr Ala	Thr
545		550		555	560
Tle Val Glu	Phe	Leu Asn Arg Trp	Ile Thr	Phe Cys Gin Ser Ile	Ile
		565	570	575
Ser Thr Leu	Thr
	580
<210> 36
<211> 229
<212> PRT
<213> .Sztuczna	sekwencja
<220>
<223> zmienny region lekkiego	łańcucha	dI-NHS76(gamma4th)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T)

<400> 36

Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gin 15 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His 85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly His Gin

PL 206 975 B1

100 105 110

Asp Ser Asp Pro Leu Pro Leu Ile His Pro Ala Gly Gin Pro Lys Ala 115 120 125

Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gin Ala 130 135 140

Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala 145 150 155 160

Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val 165 170 175

Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser ISO 185 190

Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser His Lys Ser Tyr 195 200 205

Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala 210 215 220

Pro Thr Glu Cys Ser 225 <210> 37 <211> 580 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> ciężki łańcuch dI-NHS76(gamma4th)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) połączony z odmianę IL-2 <400> 37

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30

Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45

Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60

PL 206 975 B1

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser 65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Lys Trp Ser Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr val Pro Ser Ser Ser 180 185 190

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu 260 265 270

Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Ala Gin Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300

PL 206 975 B1

Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350

Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415

Trp Gin Gin Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Ala 435 440 445

Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His Leu 450 455 460

Leu Leu Thr Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn 465 470 475 480

Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys 485 490 495

Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro 500 505 510

Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg 515 520 525

Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys ' 530 535 540

PL 206 975 B1

Gly

Ser

Glu

Thr

Phe

Met

Cys

Glu

Tyr

Ala Asp

Glu

Thr

Ala

Thr

545

550

555

560

Ile

Val

Glu

Phe

Leu

Asn

Arg

Trp

Ile

Thr

Phe Cys

Gin

Ser

Ile

565 570 575

Ser Thr Leu Thr

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Białko fuzyjne zawierające jednostkę nie będącą IL-2 połączoną z jednostką zmutowanej IL-2, znamienne tym, że jednostka zmutowanej IL-2 zawiera substytucję aminokwasową zmieniającą kwas asparaginowy na treoninę na pozycji odpowiadającej pozycji 20 (D20T) sekwencji aminokwasowej dojrzałego ludzkiego białka IL-2 zdefiniowanego sekwencją SEQ ID NO: 3 a rzeczona jednostka nie będąca IL-2 zawiera domenę przeciwciała przy czym białko fuzyjne wykazuje większą selektywność niż białko odniesienia względem komórek wyrażających receptor o wysokim powinowactwie, gdzie białko odniesienia zawiera jednostkę nie będącą IL-2 połączoną z jednostką niezmutowanej IL-2, a rzeczoną selektywność wyznacza się jako stosunek aktywacji komórek wyrażających receptor IL-2RaeY do aktywacji komórek wyrażających receptor IL-2ReY.
2. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że selektywność względem komórek wyrażających receptor o wysokim powinowactwie wynosi od około 0,1% do około 100% selektywności fuzyjnego białka odniesienia zawierającego jednostkę nie będącą IL-2 połączoną z jednostką zmutowanej ludzkiej IL-2, która zawiera substytucję aminokwasową asparaginy na argininę na pozycji odpowiadającej pozycji 88 (N88R) sekwencji aminokwasowej dojrzałego ludzkiego białka IL-2 zdefiniowanego sekwencją SEQ ID NO: 3.
3. Białko fuzyjne według zastrz. 2, znamienne tym, że selektywność wynosi od około 0,1% do około 30% selektywności fuzyjnego białka odniesienia.
4. Białko fuzyjne według zastrz. 2, znamienne tym, że selektywność wynosi od około 1% do około 20% selektywności fuzyjnego białka odniesienia.
5. Białko fuzyjne według zastrz. 2, znamienne tym, że selektywność wynosi od około 2% do około 20% selektywności fuzyjnego białka odniesienia.
6. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że komórki wyrażające receptor IL-2RaeY wybrane są spośród komórek CTLL-2, Kit 225 i dojrzałych limfocytów T.
7. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że komórki wyrażające receptor IL-2ReY wybrane są spośród komórek TF-1 β i komórek NK.
8. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że jednostka IL-2 jest zmutowana na więcej niż jednej pozycji aminokwasowej.
9. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że jednostka nie będącą IL-2 jest zmutowana.
10. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że domena przeciwciała jest zmutowana.
11. Białko fuzyjne według zastrz. 1 albo 9, znamienne tym, że jednostka nie będącą IL-2 zawiera domenę przeciwciała wybraną z grupy obejmującej KS-1/4, dl-KS, dl-KS(Y4h)(FN>AQ), huKS, huKS(N na Q), dl-NHS76(Y2h), dl-NHS(Y4h), dl-NHS76(Y2h)(FN>AQ), dl-NHS76(Y4h)(FN>AQ) oraz 14.18.
12. Białko fuzyjne według zastrz. 1 albo 11, znamienne tym, że stanowi białko fuzyjne typu przeciwciało-IL-2 wybrane z grupy obejmującej

KS-ala-IL2(D20T)

KS(Y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T)

NHS76(Y2h)-ala-IL2(D20T)

NHS76(Y2h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T)

NHS76(Y2)-ala-IL2-(D20T).
13. Białko fuzyjne zdefiniowane w dowolnym z zastrz. 1-12, znamienne tym, że ma zastosowanie do leczenia nowotworów.
14. Zastosowanie białka fuzyjnego zdefiniowanego w dowolnym z zastrz. 1-12 do wytwarzania leku do leczenia nowotworów.