RS58149B1 - Fuzioni proteini interleukina-2 i njihova upotreba - Google Patents

Fuzioni proteini interleukina-2 i njihova upotreba

Info

Publication number
RS58149B1
RS58149B1 RS20190003A RSP20190003A RS58149B1 RS 58149 B1 RS58149 B1 RS 58149B1 RS 20190003 A RS20190003 A RS 20190003A RS P20190003 A RSP20190003 A RS P20190003A RS 58149 B1 RS58149 B1 RS 58149B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
fusion protein
dp47gs igg
treg
amino acid
Prior art date
Application number
RS20190003A
Other languages
English (en)
Inventor
Christian Klein
Pablo Umana
Ekkehard Moessner
Ralf Hosse
Laurence Bernard Peterson
Linda Wicker
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS58149B1 publication Critical patent/RS58149B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

OPIS
Oblast pronalaska
Sadašnji pronalazak se uglavnom odnosi na fuzione proteine imunoglobulina i interleukina-2 (IL-2). Preciznije, pronalazak se odnosi na fuzione proteine imunoglobulina i mutantnog IL-2 koji pokazuju poboljšana svojstva za upotrebu kao terapeutska sredstva, npr. u lečenju autoimunih bolesti i imunosupresivnih inflamatornih oboljenja. Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na polinukleotide koji kodiraju takve fuzione proteine, vektore i ćelije domaćina koji sadrže takve polinukleotide. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na postupke za proizvodnju fuzionih proteina pronalaska i na postupke njihove primene u lečenju bolesti.
Osnova
Regulatorne T ćelije (Treg) predstavljaju specifične podskupove T limfocita koji su ključni za održavanje samotolerancije. Ove CD4+CD25<hi>ćelije sa supresorskom funkcijom mogu se razlikovati od efektorskih T ćelija pomoću intracelularne ekspresije transkripcionog faktora FOXP3, kao i drugih ćelijskih markera kao što su CD127<niske>, CTLA-4+, LAP, CD39+, PD-1+, GARP, itd. FOXP3 je kritičan za Treg diferencijaciju i funkciju, a nedostatak FOXP3 gena i mutacije, kod miševa i pacijenata sa imunodisregulativnom poliendokrinopatijom vezanom za X hromozom (sindrom IPEX), rezultiraju u razgradnji samotolerancije i razvoja autoimunih bolesti zbog nedostatka Treg ili nedostatka funkcije.
Autoimuni odgovori kod dijabetesa tipa 1, sistemskog eritemskog lupusa (SLE), multiple skleroze i mnogih drugih bolesti, u vezi su sa nedostatkom Treg ili funkcija Treg. Podaci iz životinjskih modela potvrđuju hipotezu da su autoimuni odgovori olakšani neuspehom Trega da kontrolišu destruktivni imuni odgovor na sebe, u velikoj meri zbog efekata autoreaktivnih CD4+memorijskih T efektorskih ćelija. Dijabetes tipa 1 je autoimuna bolest koja se javlja nakon uništenja većine β ćelija koje proizvode insulin u pankreasu. Učestalost dijabetesa tipa 1 je ~0,3% populacije u SAD, a njegova incidenca nastavlja da se povećava u SAD, Evropi, a naročito u Skandinaviji (skoro 1%) i očekuje se da će se udvostručiti u narednih dvadeset godina.
IL-2 citokin igra glavnu ulogu u aktivaciji i funkciji oba Trega, kao i efektorskih T ćelija (Teff). Nedostatak proizvodnje IL-2 ili nedostatak odgovora, poželjno dovodi do gubitka Treg funkcije i povećanja verovatnoće autoimunosti. Pošto Treg neprestano eksprimiraju IL-2 receptor visokog afiniteta u većim količinama nego Teff, niske doze IL-2 poželjno podržavaju održavanje Treg u poređenju sa Teff-ćelijama.
Sa preferencijalnim efektom IL-2 za aktiviranje Treg in vitro i in vivo, potencijal dugotrajne terapije IL-2 u malim dozama izgleda da ima veliku perspektivu za uspeh u autoimunim bolestima. Dvostruko slepo, sa 200 pacijenata placebom kontrolisano kliničko ispitivanje dijabetesa tipa 1 sa IL-2, (Proleukin®, rekombinantni humani IL-2), počinje krajem 2013. godine. Nedavna klinička ispitivanja sa malom dnevnom dozom Proleukina poboljšala su neke od znakova i simptoma hronične reakcije organizma na graft (graft versus host disease – GvHD) i vaskulitisa izazvanog virusom hepatitisa C (Koreth et al., New Engl J Med 365, 2055-2066 (2011), Saadoun et al., New Engl J Med 365, 2067-2077 (2011)). U obe studije, mala doza Proleukina<®>indukovala je Treg i povećala razmeru Treg:Teff. Međutim, loša FK svojstva Proleukina® čine ga podoptimalnim za održavanje niskih, konzistentnih nivoa IL-2 kod čoveka. Drugi postupci koji se testiraju u kliničkim ispitivanjima su personalizovano proširenje Treg ex vivo praćene reinfuzijom, ali ovaj pristup nije idealn i predstavlja izazovnu grupu problema kontrole kvaliteta.
Stoga, novi terapeutski pristup koji ponovo uspostavlja prirodnu regulatornu T ćeliju (Treg) koja posreduje dominantnom imunološkom tolerancijom i ozbiljno smanjuje bilo koji potencijalni stimulativni efekat na CD4+ memoriju T efektorske ćelije, u velikoj bi meri povećao sposobnost lečenja pacijenata sa autoimunim bolestima kao što su tip 1 dijabetes, multipla skleroza, sistemski eritematozni lupus, Kronova bolest, kao i druge autoimune bolesti i imunološka proinflamatorna oboljenja, kao što su hronična bolest reakcije organizma na graft, astma, plućna fibroza, hronična opstruktivna plućna bolest, kardiovaskularne bolesti, kao što su ateroskleroza i akutni koronarni sindrom i odbacivanje transplantata, kako solidnog organa tako i koštane srži.
WO 2009/135615 opisuje upotrebu prethodno poznatog IL-2 muteina (IL-2 N88R, BAY50-4798, opisan u WO 1999/60128) za terapiju ili profilaksu autoimune bolesti. Navodi se da IL-2 mutein ima povećanu aktivnost na Treg ćelijama u poređenju sa IL-2 divljeg tipa, dok je njegov efekat na CD8+T ćelije i NK ćelije mali. Ne opisuju se fuzioni proteini IL-2 muteina.
WO 2010/85495 opisuje varijante IL-2 koje selektivno promovišu aktivnost u Treg ćelijama preko neregulatornih T ćelija, za lečenje zapaljenskih poremećaja. Opisane varijante IL-2 sadrže kombinaciju osam ili više aminokiselinskih supstitucija koje utiču na vezivanje za različite podjedinice IL-2 receptora.
WO 2012/178137 opisuje fuzione proteine imunoglobulina i citokina. IL-2 je prikazan kao primer citokina. Opisani imunoglobulin se vezuje za površinski antigen koji je povezan sa karcinomom, a fuzioni protein može biti pogodan za lečenje karcinoma aktivacijom imunog odgovora.
WO 03/048334 opisuje fuzioni protein koji sadrži dve IL-2 varijante. Opisani fuzioni proteini sadrže mutantnu IL-2 komponentu i komponentu bez IL-2, a korisni su za lečenje karcinoma i virusnih infekcija. Antitela protiv različitih tumorskih i virusnih antigena se koriste kao komponente bez IL-2.
WO 2012/146628 opisuje imunokonjugate IL-2 koji su korisni za lečenje karcinoma. Opisani imunokonjugati sadrže jednu, tj. ne više od jedne IL-2 komponente
IL-2 fuzioni proteini predmetnog pronalaska u najboljem slučaju aktiviraju humane i nehumane Treg ćelije sa malo ili bez uticaja na ljudske CD4+ memorijske T efektorske ćelije, narušavajući ravnotežu ka višoj razmeri Treg:Teff i smanjujući autoimuni odgovor. Oni su dugotrajni, omogućavaju praktičan raspored doziranja, a bez efektorskih funkcija, smanjuju potencijalne neželjene efekte i gubitak efikasnosti.
Sažetak pronalaska
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje fuzioni protein koji sadrži (i) molekul imunoglobulina koji nije sposoban za specifično vezivanje za antigen, i (ii) dva mutantna interleukin-2 (IL-2) molekula koji sadrže mutaciju aminokiselina, što smanjuje afinitet mutiranog molekula IL-2 za IL-2 receptor intermedijarnog afiniteta, u poređenju sa molekulom IL-2 divljeg tipa, pri čemu mutantni IL-2 molekuli sadrže aminokiselinske supstitucije T3A, N88D i C125A (SEQ ID NO: 58).
U jednom primeru izvođenja, pomenuti molekul imunoglobulina je molekul imunoglobulina IgG klase, tačnije molekul imunoglobulina potklase IgG1. U jednom primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina je molekul humanog imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina je sposoban za specifično vezivanje za antigen. U jednom primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina je monoklonsko antitelo. U jednom primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca na bazi humane Vh3-23 germinativne sekvence. U konkretnom primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 9. U jednom primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca na bazi humane Vk3-20 germinativne sekvence. U konkretnom primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 11. U još konkretnijem primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 9 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 11. U jednom primeru izvođenja, pomenuti molekul imunoglobulina nije sposoban za specifično vezivanje antigena i sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca zasnovanu na humanoj Vh3-23 germinativnoj sekvenci i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca zasnovanu na humanoj Vk3-20 germinativnoj sekvenci.
U jednom primeru izvođenja, pomenuti molekul imunoglobulina sadrži smanjeni modifikacijski afinitet vezivanja molekula imunoglobulina za Fc receptor u poređenju sa odgovarajućim molekulom imunoglobulina bez navedene modifikacije. U jednom primeru izvođenja, pomenuti Fc receptor je Fcγ receptor, naročito humani Fcγ receptor. U jednom primeru izvođenja, pomenuti Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. U jednom primeru izvođenja, navedeni Fc receptor je izabran iz grupe FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIIa (CD32) i FcαRI (CD89). U konkretnom primeru izvođenja, navedeni Fc receptor je FcγRIIIa, naročito humani FcγRIIIa. U jednom primeru izvođenja, navedena modifikacija smanjuje efektorsku funkciju molekula imunoglobulina. U konkretnom primeru izvođenja, navedena efektorska funkcija je ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC). U jednom primeru izvođenja, pomenuta modifikacija je u regionu Fc, posebno u regionu CH2 navedenog molekula imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, pomenuti molekul imunoglobulina sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 329 (EU numeracija) teških lanaca imunoglobulina. U konkretnom primeru izvođenja, navedena supstitucija aminokiselina je P329G. U jednom primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 234 i 235 (EU numeracija) teških lanaca imunoglobulina. U konkretnom primeru izvođenja, navedene supstitucije aminokiselina su L234A i L235A (LALA). U jednom primeru izvođenja, pomenuti molekul imunoglobulina sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 234, 235 i 329 (EU numeracija) teških lanaca imunoglobulina. U posebnom primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina sadrži aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329G (EU numeracija) u teškim lancima imunoglobulina.
U jednom primeru izvođenja, pomenuti mutanti IL-2 molekula sadrže mutaciju aminokiselina na poziciji koja odgovara ostatku 88 humane IL-2 (SEQ ID NO: 1); pomenuta aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiselina; i pomenuta supstitucija aminokiselina je N88D. U jednom primeru izvođenja, pomenuti molekuli IL-2 dalje sadrži mutaciju aminokiseline koja ne menja afinitet vezivanja navedenih IL-2 molekula za receptor IL-2 u poređenju sa prirodnim, nativnim IL-2. U jednom izvođenju, pomenuti molekuli IL-2 sadrže mutaciju aminokiselina na poziciji koja odgovara ostatku 125 humane IL-2; i pomenuta mutacija aminokiselina je supstitucija aminokiselina C125A. U jednom primeru izvođenja, navedeni mutantni IL-2 molekul dalje sadrži aminokiselinsku mutaciju koja eliminiše položaj O-glikozilacije IL-2 na poziciji koja odgovara ostatku 3 humanog IL-2; i pomenutu aminokiselinsku mutacijau koja eliminiše mesto O-glikozilacije IL-2 na poziciji koja odgovara ostatku 3 humanog IL-2 je T3A. U jednom primeru izvođenja, navedeni mutantni IL-2 molekuli su humani IL-2 molekuli. U konkretnom primeru izvođenja, pomenuti mutantni IL-2 molekuli sadrže sekvencu SEQ ID NO: 58. U jednom primeru izvođenja, pomenuti mutantni IL-2 molekuli imaju sekvencu SEQ ID NO: 58. U jednom primeru izvođenja, pomenuti mutirani molekuli IL-2 su spojeni na svojim N-terminalnoj aminokiselini sa C-terminalnom aminokiselinom jednog od teških lanaca imunoglobulina pomenutog molekula imunoglobulina, po mogućstvu peptidnim linkerom. U jednom primeru izvođenja, pomenuti mutantni molekuli IL-2 su spojeni sa molekulom imunoglobulina preko peptidnog linkera. U jednom primeru izvođenja, navedeni peptidni linker sadrži najmanje 10, a u posebnom primeru 15 aminokiselina. U jednom primeru izvođenja, pomenuti peptidni linker sadrži sekvencu aminokiselina (G4S)3 (SEQ ID NO: 66).
U konkretnom primeru izvođenja, pomenuti fuzioni protein sadrži polipeptidne sekvence SEQ ID NO: 19 i SEQ ID NO: 50. U konkretnom primeru izvođenja, pomenuti fuzioni protein sadrži laki lanac imunoglobulina SEQ ID NO: 19 i fuzioni polipeptid teškog lanca-IL-2 od SEQ ID NO: 50. U jednom primeru izvođenja, pomenuti fuzioni protein se sastoji uglavnom od molekula imunoglobulina, dva mutantna interleukin-2 (IL-2) molekula koji sadrže mutaciju aminokiseline koja smanjuje afinitet mutiranog molekula IL-2 za IL-2 receptor intermedijarnog afiniteta, u poređenju sa molekulom IL-2 divljeg tipa, i opciono jedan ili više peptidnih linkera. U jednom primeru izvođenja, pomenuti fuzioni protein se sastoji od dva imunoglobulinska laka lanca SEQ ID NO: 19 i dva imunoglobulinska teška lanca IL-2 fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 50.
U jednom primeru izvođenja, pomenuti fuzioni protein selektivno aktivira regulatorne T ćelije. U jednom primeru izvođenja, navedeni fuzioni protein selektivno aktivira regulatorne T ćelije preko efektorskih T ćelija, posebno preko konvencionalnih CD4+ T ćelija i CD8+ T ćelija. U jednom primeru izvođenja, navedeni fuzioni protein selektivno aktivira regulatorne T ćelije preko konvencionalnih CD4+ memorijskih T ćelija. U jednom primeru izvođenja, navedeni fuzioni protein aktivira regulatorne T ćelije najmanje 10 puta, najmanje 100 puta ili najmanje 1000 puta više od konvencionalnih CD4+ memorijskih T ćelija. U jednom primeru izvođenja, pomenuta aktivacija se određuje merenjem intracelularnog STAT, posebno STAT5, nivoa fosforilacije. U jednom primeru izvođenja, pomenuto merenje intracelularnih nivoa fosforilacije STAT se vrši protočnom citometrijskom analizom.
Pronalazak dalje obezbeđuje polinukleotid koji kodira fuzioni protein iz pronalaska. Dodatno se obezbeđuje vektor, naročito ekspresioni vektor, koji sadrži polinukleotid iz ovog pronalaska. U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži polinukleotid ili vektor predmetnog pronalaska. Pronalazak takođe nudi postupak za proizvodnju fuzionog proteina u skladu s predmetnim pronalaskom, koji obuhvata korake (i) kultivacije ćelije domaćina predmetnog pronalaska u uslovima pogodnim za ekspresiju fuzionog proteina, i (i) izolovanja fuzionog proteina. Takođe je obezbeđen fuzioni protein koji sadrži (i) molekul imunoglobulina koji nije sposoban za specifično vezivanje antigena i (ii) dva molekula interleukina-2 (IL-2) koji sadrže mutaciju aminokiselina koja smanjuje afinitet mutantnog IL-2 molekula prema IL-2 receptoru intermedijarnog afiniteta, u poređenju sa molekulom IL-2 divljeg tipa, pri čemu mutant IL-2 molekuli sadrže sekvencu SEQ ID NO: 58, proizvedenu tim postupkom.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata fuzioni protein iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. Fuzioni protein ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku takođe je obezbeđena za upotrebu kao lek, i za upotrebu u lečenju ili profilaksi autoimune bolesti, posebno dijabetesa tipa 1, multiple skleroze (MS), sistemskog eritematoznog lupusa (SLE), inflamatorne bolesti creva, Kronove bolesti ili ulcerativnog kolitisa, naročito dijabetes tipa 1 ili bolest hronične reakcije organizma na graft ili odbacivanja transplantata. Dodatno je obezbeđena upotreba fuzionog proteina pronalaska za proizvodnju leka za lečenje bolesti kod pojedinaca kojima to treba, i postupak lečenja bolesti kod pojedinaca, koji obuhvata davanje navedenom pojedincu terapeutski efikasne količine kompozicije koja sadrži fuzioni protein pronalaska u farmaceutski prihvatljivom obliku. U jednom primeru izvođenja, navedena bolest je autoimuna bolest. U konkretnijem primeru izvođenja, pomenuto autoimuno oboljenje je dijabetes tipa 1, multipla skleroza (MS), sistemski eritematozni lupus (SLE), inflamatorna bolest creva, Kronova bolest ili ulcerativni kolitis. U još konkretnijem primeru izvođenja, navedena autoimuna bolest je dijabetes tipa 1. U sledećem primeru izvođenja, pomenuta bolest je odbacivanje transplantata ili bolest hronične reakcije organizma na graft. U jednom primeru izvođenja, navedena osoba je sisar, tačnije čovek.
Dodatno je obezbeđen fuzioni protein pronalaska za upotrebu u selektivnoj aktivaciji regulatornih T ćelija in vitro. U jednom primeru izvođenja, pomenuta aktivacija obuhvata indukciju proliferacije regulatornih T ćelija i/ili indukciju signalizacije IL-2 receptora, posebno fosforilacije STAT5, u regulatornim T ćelijama. U jednom primeru izvođenja, pomenuta upotreba je in vitro i navedeni fuzioni protein se koristi u koncentraciji od oko 10 ng/mL ili manje, posebno oko 1 ng/mL ili manje.
Pronalazak takođe daje postupak selektivne aktivacije regulatornih T ćelija in vitro, koji obuhvata kontaktiranje regulatornih T ćelija sa fuzionim proteinom iz pronalaska. U jednom primeru izvođenja, pomenuta aktivacija obuhvata indukciju proliferacije regulatornih T ćelija i/ili indukciju signalizacije IL-2 receptora, posebno fosforilacije STAT5, u regulatornim T ćelijama. U jednom primeru izvođenja, navedeni postupak je in vitro i navedeni fuzioni protein se koristi u koncentraciji od oko 10 ng/mL ili manje, posebno oko 1 ng/mL ili manje.
Kratak opis slika
Slika 1. Prečišćavanje DP47GS IgG-IL-2 fuzionog proteina (vidi SEQ ID NO 13, 15, 19). (A) Eluacijski profil proteina A nakon jednog koraka afinitetne hromatografije. (B) Eluacijski profil nakon koraka hromatografije na molekularnim sitima. Prinos 4 mg/L. (C) Analitička kapilarna elektroforeza SDS (Caliper) finalnog proizvoda. Opažen je sledeći opseg: neredukovana – 7,5% površine na 111 kDa, 92,5% površine na 174 kDa; redukovana – 23,6% površine na 29 kDa, 23,5% površine na 67 kDa, 52,9% površine na 82 kDa. Proizvod sadrži oko 7,5% „polovine molekula IgG”. (D) Analitička hromatografija finalnog proizvoda na molekularnim sitima TSKgel G3000 SW XL (sadržaj monomera 91%).
Slika 2. Prečišćavanje DP47GS IgG-(IL-2)2 fuzionog proteina (vidi SEQ ID NO. 17, 19). (A) Eluacijski profil proteina A nakon jednog koraka afinitetne hromatografije. (B) Eluacijski profil nakon koraka hromatografije na molekularnim sitima. Prinos 13 mg/L. (C) Analitička kapilarna elektroforeza SDS (Caliper) finalnog proizvoda. Opažen je sledeći opseg: neredukovana – 2,3% površine na 172,5 kDa, 97,7% površine na 185 kDa; redukovana – 18,3% površine na 27,3 kDa, 0,6% površine na 29,2 kDa, 81,1% površine na 78,3 kDa. (D) Hromatografija finalnog proizvoda na molekularnim sitima na koloni Superdex 200 (sadržaj monomera 100%).
Slika 3. Prečišćavanje fuzionog proteina DP47GS IgG-IL-2 N88D (videti SEQ ID NO 15, 19, 48). (A) Eluacijski profil proteina A nakon jednog koraka afinitetne hromatografije. (B) Eluacijski profil nakon koraka hromatografije na molekularnim sitima. Prinos 23,7 mg/L. Prikupljene frakcije su uokvirene. (C) Analitička kapilarna elektroforeza SDS (Caliper) finalnog proizvoda. Opaženi su sledeći glavni opsezi: neredukovani – 100% površine na 167,0 kDa; redukovani – 31,5% površine na 28,6 kDa, 31,7% površine na 63,5 kDa, 35,3% površine na 77,5 kDa. (D) Analitička hromatografija finalnog proizvoda na molekularnim sitima TSKgel G3000 SW XL (sadržaj monomera 97,3%).
Slika 4. Prečišćavanje DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2 fuzionog proteina (videti SEQ ID NO 19 i 50). (A) Eluacijski profil proteina A nakon jednog koraka afinitetne hromatografije. (B) Eluacijski profil nakon koraka hromatografije na molekularnim sitima. Prinos 32,9 mg/L. Prikupljene frakcije su uokvirene. (C) Analitička kapilarna elektroforeza SDS (Caliper) finalnog proizvoda. Opaženi su sledeći glavni opsezi: neredukovani – 20,7% površine na 180,4 kDa; 78,0% površine na 184,0 kDa; redukovani – 16,2% površine na 27,3 kDa, 82,7% površine na 76,0 kDa. (D) Analitička hromatografija finalnog proizvoda na molekularnim sitima TSKgel G3000 SW XL (sadržaj monomera 98,3%).
Slika 5. Prečišćavanje DP47GS IgG-(IL-2 E95A)2 fuzionog proteina (videti SEQ ID NO 19 i 52). (A) Eluacijski profil proteina A nakon jednog koraka afinitetne hromatografije. (B) Eluacijski profil nakon koraka hromatografije na molekularnim sitima. Prinos 8,0 mg/L. Prikupljene frakcije su uokvirene. (C) Analitička kapilarna elektroforeza SDS (Caliper) finalnog proizvoda. Opaženi su sledeći glavni opsezi: neredukovani – 10,3% površine na 166,0 kDa, 61,4% površine na 175,5 kDa, 28,2% površine na 181,2 kDa; redukovani – 16,0% površine na 26,1 kDa, 83,1% površine na 75,0 kDa. (D) Analitička hromatografija finalnog proizvoda na molekularnim sitima TSKgel G3000 SW XL (sadržaj monomera 100%).
Slika 6. CD25 (IL-2RA) i CD122 (IL-2RB) ekspresija na podskupovima CD4+Treg, podskupovima NK ćelija i NKT ćelija. Markeri površine ćelija su korišćeni za definisanje CD4+ Treg podskupova, NKT ćelija i NK ćelija. Da bi se optimizovalo bojenje za CD25 i CD122, intracelularno bojenje FOXP3 nije izvršeno. (A, B) Tri regulatorne populacije CD4+ T ćelija (Treg): naivne (CD45RA+, CD25+, tačkasta linija), memorijske (CD45RA-, CD25+, puna linija) i aktivirane (CD45RA-, CD25<hi>; isprekidana linija). (C, D) NKT (tačkasta linija), CD56<svetle>NK ćelije (isprekidana linija), CD56<intermedijske>NK ćelije (puna linija). Siva: kontrola izotipa (IC).
Slika 7. CD25 (IL-2RA) i CD122 (IL-2RB) ekspresija na CD4+ i CD8+ konvencionalnim podskupovima T ćelija. Markeri površine ćelija korišćeni su za definisanje naivnih (CD45RA+, tačkasta linija) i memorijskih (CD45RA<->puna linija) konvencionalnih CD4+ T ćelija (A, B), memorijskih konvencionalnih CD8<+>T ćelija (CD45RA<->puna linija) i CD45RA+ CD8 T ćelija (kombinacija naivnih i TEMRA podskupova; TEMRA se odnosi na efektorske memorijske ćelije koje su vraćene da eksprimiraju CD45RA; tačkasta linija) (C, D). Siva: kontrola izotipa (IC).
Slika 8. Indukcija pSTAT5a u podskupovima ćelija periferne krvi u odgovoru na DP47GS IgG-IL-2. Tri različita ljudska donora (C4 do C6) procenjena su u odvojenim vremenima za delovanje različitih doza DP47GS IgG-IL-2 na indukciju STAT5a fosforilacije. Rezultati su prikazani za podskupove CD4+ Treg: aktivirani, memorijski i naivni Treg; konvencionalne CD4+ memorijske T efektorske ćelije; CD56<svetle>NK ćelije; CD8+ memorijske T efektorske ćelije; CD4+ naivne T efektorske ćelije; NK ćelije; NKT ćelije; i CD8+ naivne T efektor CD45RA+ memorijske ćelije.
Slika 9. Indukcija pSTAT5a u podskupovima ćelija periferne humane krvi u odgovoru na DP47GS IgG-(IL-2)2. Pet različitih ljudskih donatora (N1, N2, C4-C6) procenjeni su u odvojenim vremenima za delovanje različitih doza imunokonjugata DP47GS IgG-(IL-2)2 na indukciju STAT5a fosforilacije. Rezultati su prikazani za podskupove CD4+ Treg: aktivirani, memorijski i naivni Treg; konvencionalne CD4+ memorijske T efektorske ćelije; CD56<svetle>NK ćelije; CD8+ memorijske T efektorske ćelije; CD4+ naivne T efektorske ćelije; NK ćelije; NKT ćelije; i CD8+ naivne T efektor CD45RA+ memorijske ćelije.
Slika 10. Indukcija pSTAT5a u podskupovima ćelija periferne humane krvi: poređenje DP47GS IgG-IL-2 i DP47GS IgG-(IL-2)2. Rezultati za svaku ćelijsku podgrupu normalizovani su do maksimalno opaženog efekta iz svakog podskupa, a približni EC50 za Treg su predstavljeni u Tabeli 2. (A) normalizovani rezultati za DP47GS IgG-IL-2, (B) normalizovani rezultati za DP47GS IgG-(IL-2)2.
Slika 11. Detaljan pregled osetljivosti podskupova Treg ćelija kod tri donatora upoređuje DP47GS IgG-IL-2 i DP47GS IgG-(IL-2)2. Grafovi predstavljaju srednju vrednost ± SD pSTAT5a MFI za tri donatora. (A) ukupno CD3+CD4+FoxP3<+>Treg. (B) aktivirani Treg. (C) memorijski Treg. (D) naivni Treg.
Slika 12. Indukcija pSTAT5a u podskupovima ćelija periferne humane krvi u odgovoru na DP47GS IgG-(IL-2E95A)2. Tri različita ljudska donora (C4 do C6) procenjena su u odvojenim vremenima za delovanje različitih doza DP47GS IgG-(IL-2E95A)2 na indukciju STAT5a fosforilacije. Rezultati su prikazani za podskupove CD4+Treg: aktivirani, memorijski i naivni Treg; konvencionalne CD4+ memorijske T efektorske ćelije; CD56<svetle>NK ćelije; CD8+ memorijske T efektorske ćelije; CD4+ naivne T efektorske ćelije; NK ćelije; NKT ćelije; i CD8+ CD45RA+ naivne T efektorske ćelije.
Slika 13. Indukcija pSTAT5a u podskupovima ćelija periferne humane krvi u odgovoru na DP47GS IgG-(IL-2N88D)2. Pet različitih ljudskih donatora (C4, C5, C6, N1, N2) procenjeni su u odvojenim vremenima za delovanje različitih doza DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 na indukciju STAT5a fosforilacije. Rezultati su prikazani za podskupove CD4+Treg: aktivirani, memorijski i naivni Treg; konvencionalne CD4+ memorijske T efektorske ćelije; CD56<svetle>NK ćelije; CD8+ memorijske T efektorske ćelije; CD4+ naivne T efektorske ćelije; NK ćelije; NKT ćelije; i CD8+ CD45RA+ naivne T efektorske ćelije.
Slika 14. Indukcija pSTAT5a u podskupovima ćelija periferne humane krvi: poređenje DP47GS IgG-IL-2, DP47GS IgG-(IL-2)2, DP47GS IgG-(IL-2E95A)2, DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2 i DP47GS IgG-IL-2N88D. Rezultati su prikazani za CD4+ Treg podskupove (A-C): aktivirani (A), memorijski (C) i naivni (B) Tregovi; konvencionalne CD4+ memorijske T efektorske ćelije (D); CD56<svetle>NK ćelije (E).
Slika 15. Indukcija pSTAT5a u podskupovima ćelija humane periferne krvi u odgovoru na DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 i DP47GS IgG-(IL-2)2. Deset različitih ljudskih donatora ocenjeno je u odvojenim danima za delovanje širokog (≥ 6 log) opsega doza DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 i DP47GS IgG-(IL-2)2 na indukciju STAT5a fosforilacije. Rezultati su prikazani za sledeće ćelijske podskupove: (A) memorijski Treg, (B) naivni Treg, (C) CD56<svetle>NK ćelije, (D) ukupne NK ćelije, (E) centralne memorijske CD4+ T ćelije, (F) efektorske memorijske CD4+ T ćelije, (G) naivni CD4+ T ćelija, (H) centralne memorijske CD8+T ćelije, (I) efektorske memorijske CD8+ T ćelije, (J) naivne CD8+ T ćelije, (K) Temra [Teff memorijske RA<+>] CD8+ T limfociti, (L) NKT ćelije i (M) CD3+ CD4-CD8-CD56<->T ćelije. Svi rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± SEM (n = 10 donatora).
Slika 16. Poređenje in vitro dejstava DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 i DP47GS IgG-(IL-2)2 na humane NK ćelije i CD8+ T ćelije. PBMC od normalnih humanih donora (n = 10) kultivisane su u 5 x 10<6>ćelija / ploča za uzorke s okruglim dnom sa 50 ng/ml DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 (otvoreni simboli) ili DP47GS IgG-(IL-2)2 (simboli sive boje) tokom 6 dana, a za to vreme brojevi ćelija su kvantifikovani protočnom citometrijom. Dejstva na NK ćelije su kvantifikovana na CD56<dim>i CD56<svetle>NK ćelije (A). Dejstva na CD8+ T ćelije su prikazana pod (B). Rezultati su prikazani kao srednji ± interkvartilni opseg, statističke razlike su određene pomoću U testa Mann-Whitney.
Slika 17. Poređenje in vivo efekata DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 i DP47GS IgG-(IL-2)2 na humanizovane miševe sa CD34+ matičnim ćelijama. Deset do 12 nedelja nakon ubrizgavanja matičnih ćelija CD34+, miševi su tretirani dva puta nedeljno vehikulumom (DP47GS IgG, IL-2), DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 ili DP47GS IgG-(IL-2)2. Maksimalna povećanja humanih Treg i NK ćelija u krvi videla su se nakon 3 tretmana i rezultati su prikazani u (A) za Treg i (B) za ćelije NK. Rezultati su prikazani kao srednji ± interkvartilni opseg; vehikulum (n = 21), IgG-(IL-2N88D)2 (n = 22) i IgG-(IL-2)2 (n = 24).
Slika 18. Upoređivanje in vivo efekata DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 i DP47GS IgG-(IL-2)2 na stopu preživljavanja humanizovanih miševa sa matičnim ćelijama CD34+. Deset do 12 nedelja nakon uzimanja matičnih ćelija CD34+, miševi su tretirani dva puta nedeljno vehikulumom (DP47GS IgG, bez IL-2), DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 ili DP47GS IgG-(IL-2)2 sve dok ozbiljnost reakcije organizma domaćina na humani ksenogeni graft nije dostigla unapred utvrđenu fazu (gubitak težine ≥ 15%), što zahteva njihovo isključivanje iz studije. Rezultati su prikazani kao Kaplan–Meier krivulja preživljavanja pomoću softvera GraphPad Prism za vehikulum (n = 7), DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 (n = 12) i DP47GS IgG-(IL-2)2 (n = 13).
Slika 19. Upoređivanje in vivo efekata DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 i DP47GS IgG-IL-2)2 na Treg, NK ćelijama i CD8+ T ćelijama u CD34+ matičnim ćelijama u humanizovanim miševima. Deset do 12 nedelja nakon ubrizgavanja matičnih ćelija CD34+ miševi se tretiraju dva puta nedeljno sa bilo kojim vehikulumom (DP47GS IgG, bez IL-2), DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 ili DP47GS IgG-(IL-2)2 sve dok ozbiljnost reakcije organizma na humani ksenogeni graft nije dostigla unapred utvrđenu fazu (gubitak težine ≥ 15%), što zahteva njihovo isključivanje iz studije, a tom prilikom je krv ispitana na individualne podskupove humanih ćelija. Prikazani su ljudski Treg, NK ćelije i CD8+ ćelije u krvi kao % humanih CD45+ ćelija. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± SEM za vehikulum (n = 6), DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 (n = 9) ili DP47GS IgG-(IL-2) 2 (n = 9).
Slika 20. Indukcija Treg pSTAT5a u krvi cinomolgus majmuna u odgovoru na DP47GS IgG-(IL-2)2 i DP47GS IgG-(IL-2N88D)2. Tri normalna zdrava donatora (C1-C3) procenjena su u isto vreme za efekte maksimalne doze (20 ng/mL) DP47GS IgG-(IL-2)2 i DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 na indukciju STAT5a fosforilacije u Treg. (A) strategija protočne citometrije sa FOXP3 (y-osa) i CD45RA (x-osa) koja se koristi za identifikaciju CD4+CD25+ Treg podskupova: naivni Treg (CD45RA+ FOXP3+), memorijski Treg (CD45RA<->FOXP3+), i aktivirani (CD45RA-FOXP3<hi>). (B) ekspresija kontrastirane površine CD25+ ćelija u Treg podskupovima pre stimulacije. (C) pSTAT5a odgovori za CD4+ CD25+ Treg podskupove: aktivirani, memorijski i naivni za svaki od tri majmuna cinomolgus (C1-C3).
Slika 21. Aktivacija konvencionalne CD4+ memorije T efektorske ćelije pSTAT5a u cinomolgus krvi u odgovoru na DP47GS IgG-(IL-2)2 ili DP47GS IgG-(IL-2N88D)2. Koristeći iste stimulisane uzorke krvi od po 20 ng/mL tri majmuna donora opisanih na Slici 11, ispitivana je indukcija pSTAT5a u konvencionalnim CD4+ memorijskim T efektorskim ćelijama. (A) strategija protočne citometrije koja se koristi za identifikaciju konvencionalnih CD4<+>FOXP3-CD45RA-memorijskih T efektorskih ćelija sa CD45RA na y-osi i CD25 na x-osi. (B) pSTAT5a odgovori za ukupne CD4<+>FOXP3-CD45RA<->memorijske T efektorske ćelije. (C) pSTAT5a odgovora za memorijske T efektorske ćelije koje su takođeCD25-. (D) pSTAT5a odgovori za memorijske T efektorske ćelije koje su takođe CD25+.
Slika 22. Indukcija pSTAT5a u podskupovima T ćelija periferne krvi u cinomolgusu kao odgovor na DP47GS IgG-(IL-2)2 i DP47GS IgG-(IL-2N88D)2. Dva zdrava odrasla donatora procenjena su za efekte različitih doza (0,03 ng/mL – 300 ng/mL) DP47GS IgG-(IL-2)2 i DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 na indukciju STAT5a fosforilacije. Rezultati su prikazani za podskupove CD4+ Treg (AC): aktivirani (A), memorijski (C) i naivni (B) Tregovi i konvencionalne CD4+ memorijske T efektorske ćelije (D). Slični rezultati su dobijeni i za majmune, i rezultati jednog donatora koji su prikazani kako bi ilustrovali efekte DP47GS IgG-(IL-2)2 i DP47GS IgG-(IL-2N88D)2.
Slika 23. Kod miševa, DP47GS IgG-IL-2 ima superiorne farmakokinetičke (FK) osobine u poređenju sa DP47GS IgG-(IL-2)2 dok je DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 intermedijeran. (A) NOD i NOD. scid miševi su injektirani intravenozno (iv) sa 0,3 mg/kg DP47GS IgG-IL-2 ili 0,3 mg/kg DP47GS IgG-(IL-2)2. (B) NOD. scid.IL2Rα<-I->miševi su injektirani iv sa 0,1 mg/kg DP47GS IgG-IL-2, 0,3 mg/kg DP47GS IgG-(IL-2) 2 ili 0,1 mg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D )2. Humani IL-2 je procenjen u uzorcima seruma u navedenim vremenima pomoću testa hvatanja zasnovanog na mAb.
Slika 24. CD25 i FoxP3 povećavaju murinske Tregove posle tretmana sa Proleukinom®, DP47GS IgG-IL-2, DP47GS IgG-(IL-2)2 i DP47GS IgG-(IL-2N88D)2. BALB/c miševi tretirani su Proleukinom® (20.000 i 100.000 IU/miš, n = 3), DP47GS IgG-IL-2, DP47GS IgG-(IL-2) 2 ili DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 (60, 300 ili 1.500 IU/miš, n = 3), miševi tretirani vehikulumima uključeni su kao nestimulisana kontrola grupa (n = 4). Dvadeset i četiri sata nakon tretmana, Treg ćelije slezine su procenjene za nivoe CD25 i FOXP3. (A) promene zavisne od doze na površini ćelija CD25 i (B) promene zavisne od doze u intracelularnom FoxP3 su primećene za sva četiri IL2 molekula. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SD, crni stupci predstavljaju najveću dozu koja se koristi, a svetlo sivi stupci najmanju dozu.
Slika 25. Karakteristike FK DP47GS IgG-IL-2 i DP47GS IgG-(IL-2)2 procenjene su kod normalnih zdravih odraslih biološko naivnih cinomolgus majmuna. (A) DP47GS IgG-IL-2 se injektira intravenozno (iv) kao kratki bolus u dozama od 10, 25 i 100 μg/kg (n = 2 po dozi). (B) DP47GS IgG-(IL-2)2 je injektiran iv kao kratki bolus u dozama od 10 i 25 μg/kg (n = 2 po dozi). Humani IL-2 je procenjen u uzorcima seruma u navedenim vremenima pomoću testa hvatanja zasnovanog na mAb.
Slika 26. DP47GS IgG-IL2 ima dejstvo koje zavisi od doze kod cinomolgus majmuna povećavajući regulatorne T ćelije. Promene CD4+CD25+FOXP3+ regulatornih T ćelija (Treg) u punoj krvi 7. dana nakon tretmana prikazane su kao (A) apsolutni broj ćelija Treg po mm<3>pune krvi i (B) vrednost promene Treg. Svi podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SD. Otvoreni stupci: DP47GS IgG-IL-2 (n = 6); zasenčeni stupci: vehikulum (n = 3).
Slika 27. Vreme i dejstva niske doze DP47GS IgG-IL-2 na Treg kod majmuna cinomolgus. (A) vremenski zavisne promene u Treg povećavaju se nakon doziranja sa 2 ili 6 μg/kg DP47GS IgG-IL-2 (n = 4 i 6, datim redosledom). (B) vremenski zavisne promene u Treg apsolutnim vrednostima u krvi nakon doziranja sa 2 ili 6 μg/kg DP47GS IgG-IL-2 (n = 4 i 6, datim redosledom). Svi podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD.
Slika 28. Jednokratna doza leka Proleukin stimuliše prolazni odziv Treg ćelija zavisan od doze kod cinomolgus majmuna. (A) promene Treg brojeva u perifernoj krvi nakon lečenja pojedinačnom dozom od 3x10<4>do 3x10<5>IU/kg Proleukina. (B) promene Treg pSTAT5a posle tretmana pojedinačnom dozom od 3x10<4>do 3x10<5>IU/kg Proleukina. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD.
Slika 29. Niska doza DP47GS IgG-IL-2 efikasnija je od visoke doze Proleukina® na indukciju Treg kod cinomolgus majmuna. Normalni zdravi cinomolgus majmuni (grupe od n = 5) tretirani su malom dozom DP47GS IgG-IL-2 ili visokom dozom Proleukina, a promena regulatornih T ćelija testirana je 10. dana. Dana 0. i 7, DP47GS IgG-IL-2 je dat potkožno (SC) u dozi od 16,800 IU/kg (12 μg/kg). Proleukinski tretman (200.000 IU/kg) je dat SC 3 puta nedeljno (MWF) u ukupno 5 doza. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± SD za (A) promena ukupnog broja Treg ćelija po mm<3>krvi, (B) porast broja Treg i (C) promena u odnosu broja Treg i konvencionalnih CD4+ FOXP3<->ćelija. Otvoreni stupci prikazuju lečenje IL-2, a zasenčeni stupci kontrolu vehikuluma.
Slika 30. Ex vivo fosforilisane STAT5 ćelije pune krvi kao osetljiv biomarker za DP47GS IgG-IL-2 Treg aktivaciju in vivo. Jedan i 3 dana nakon in vivo primene jedne niske doze DP47GS IgG-IL-2 (12 µg/kg) na zdrave majmune cinomolgus (n = 5), puna krv je sakupljena i testirana odmah, bez stimulacije za fosforilisan STAT5 (pSTAT5a). Svakom majmunu je uzeta krv nultog dana pre tretmana i izmerena količina pSTAT5a (zasenčeni stupci) i korišćena je pojedinačno kako bi se procenila vrednost promene nakon tretmana (otvoreni stupci). (A) vrednost promene u Treg pSTAT5a 1. i 3. dana, (B) vrednost promene pSTAT5a u konvencionalnim CD4+ CD45-memorijskim T ćelijama i (C) prikazana je promena u preostalim T ćelijama pSTAT5a. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD.
Slika 31. Ex vivo pSTAT5a ćelije pune krvi kao osetljiv biomarker za nisku dozu DP47GS IgG-IL-2 Treg aktivacije in vivo. Od jednog do sedam dana nakon in vivo primene jedne niske doze DP47GS IgG-IL-2 na zdravim cinomolgus majmunima, puna krv je sakupljena i testirana odmah, bez stimulacije, na pSTAT5a. Svakom majmunu je uzeta krv nultog dana pre tretmana radi utvrđivanja nestimulisanih nivoa pSTAT5a i upoređena sa promenama u pSTAT5a nakon tretmana. (A) Treg pSTAT5a pre i posle tretmana sa 2 μg/kg DP47GS IgG-IL-2 (n = 4). (B) Treg pSTAT5a pre i nakon tretmana sa 6 μg/kg DP47GS IgG-IL-2 (n = 6). Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD.
Slika 32. Ex vivo cinomolgus puna krv Ki-67 služi kao marker za DP47GS IgG-IL-2 indukovanu proliferaciju T ćelija in vivo. Cinomolgus majmuni tretirani sa 2 i 6 µg/kg DP47GS IgG-IL-2, kao što je opisano na Slici 14, takođe su nadgledani ex vivo za promene intracelularnog markera Ki-67 radi procene stepena proliferacije in vivo. Procenat normalnog stabilnog stanja ćelija u ćelijskom ciklusu (Ki-67+) је kvantifikovan nultog dana pre lečenja, a zatim praćen svakodnevno u narednih 7 do 11 dana. Prikazani su (A) % Ki-67+ za Treg, (B) % Ki-67+ za konvencionalne CD4+ CD45<->memorijske/efektorske T ćelije i (C) % Ki-67+ za naivne CD4+ CD45RA+ T ćelije. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD.
Slika 33. Vreme i dejstva niske doze DP47GS IgG-(IL-2)2 na Treg kod naivnih zdravih cinomolgus majmuna. (A) vremenski uslovljene promene u Treg apsolutnim brojevima nakon 6 µg/kg DP47 IgG-(IL-2)2. (B) vremenski uslovljene promene u Treg pSTAT5a nakon tretmana, (C) vremenski uslovljene promene u porastu Treg i (D) poređenje promena Treg kod majmuna tretiranih DP47Gs IgG-IL-2 (otvoreni stupci, 2 do 36 µg/kg) u odnosu na one tretirane DP47GS IgG(IL-2)2 (zasenčeni stubac, 6 µg/kg). Svi podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD (n = 4 do 6).
Slika 34. Dejstva zavise od doze i vremena u slučaju veoma niske doze DP47GS IgG-(IL-2)2 na Treg kod naivnih zdravih majmuna cinomolgus. (A) vremenski uslovljene promene Treg povećavaju se nakon primene 0,7 i 2 µg/kg DP47GS IgG-(IL-2)2. (B) vremenski uslovljene promene u Treg pSTAT5a izmerene nultog dana pre lečenja i u prva četiri dana nakon lečenja, (C) vremenski uslovljene promene u Teff/mem ćeliji pSTAT5a. Svi podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD (n = 3 na 0,7 µg/kg i n = 8 na 2 µg/kg).
Slika 35. Poređenje u zavisnosti od doze DP47GS IgG-IL-2 u odnosu na DP47GS IgG-(IL-2)2 i njihova sposobnost da povećaju Treg pune krvi cinomolgusa. Svi podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SD (n = 3 do 6).
Slika 36. Sledeća generacija sekvencioniranja (NGS) korišćena je za analizu demetilacije DNK specifične za podskup T ćelija za faktor transkripcije FOXP3 i imunosupresivni molekul CTLA-4. Krv iz odraslih bioloških naivnih cinomolgus majmuna analizirana je pre i posle tretmana sa optimalnom dozom DP47GS IgG-IL-2 (25 µg/kg, n = 4) i DP47GS IgG-(IL-2) 2 (6 µg/kg, n = 4). Podskupovi CD4+ T ćelija su sortirani pomoću BD FACSAria iz PBMC pune krvi, a 100.000 ćelija po podskupu je korišćeno za demetilaciju DNK specifičnu za gen. Slični rezultati su vidljivi iu oba lečenja, a podaci o majmunima tretiranim DP47GS IgG-(IL-2)2 prikazani su za FOXP3 u gornjem panelu i za CTLA-4 u donjem panelu (n = 4, srednja vrednost ± SD).
Slika 37. Karakteristike FK DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 su procenjene kod normalnih zdravih biološki naivnih cinomolgus majmuna. (A) DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 je injektiran intravenozno (iv) u kratkom bolusu u dozama od 30 i 100 µg/kg (n = 2 po dozi). (B) DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 je ubrizgan subkutano (sc) u 0,2 ml u bočnom dorsumu u dozama od 30 i 100 µg/kg (n = 2 po dozi). Humani IL-2 je procenjen u uzorcima plazme u navedenim vremenima uz pomoć testa hvatanja zasnovanog na monoklonskim antitelima. (C) Kao biomarker izloženosti IL-2, u plazmi je izmeren rastvorljiv CD25 nakon injekcije IgG-(IL-2N88D)2 u dozama od 30 i 100 µg/kg; cinomolgus sCD25 je meren u humanom sCD25 pomoću testa hvatanja zasnovanog na mAb koji je poznat po tome da reaguje sa cinomolgus sCD25. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± SEM (n = 4).
Slika 38. In vivo vreme i efekti uslovljeni dozom DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 na Treg u naivnim zdravim cinomolgus majmunima. Vremenski uslovljene promene u apsolutnom broju (x10<6>/ml krvi) ukupnih Treg, CD4+ memorijskog Treg, CD4+ naivnog Treg i CD8+FOXP3<+>Treg nakon injekcije sa (A) 100 μg/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2 ili (B) 30 μg/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2. Vremenski uslovljene promene u Tregu kao% CD4+ ili CD8+ T ćelija za ukupni Treg, CD4+ memorijski Treg, CD4+ naivni Treg i CD8+FOXP3<+>Treg nakon injekcije 100 μg/kg DP47 IgG-(IL-2N88D )2 (C) ili 30 μg/kg DP47 IgG-(IL-2N88D) 2 (D). Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± SEM (n = 4).
Slika 39. In vivo vreme i efekti uslovljeni dozom DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 na limfocite kod naivnih zdravih majmuna cinomolgus. Vremenski uslovljene promene u CD4+ memorijskim T efektorima su prikazani kao % ukupnih CD4+ T ćelija nakon injekcije 100 µg/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2 ili 30 µg/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2 (A). Vremenski uslovljene promene u CD4+CD25<hi>memorijiskim T efektorima su prikazani kao % CD4+ memorijskih T efektora nakon injekcije 100 μg/kg DP47 IgG-(IL-2N88D)2 ili 30 μg/kg DP47 IgG-(IL- 2N88D)2 (B). Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± SEM (n = 4).
Slika 40. Ex vivo puna krv pSTAT5a je osetljiv biomarker za aktivaciju IL-2 in vivo. Od 1 do 11 dana nakon in vivo primene pojedinačne doze DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 na cinomolgus majmune, puna krv je sakupljena i testirana odmah bez stimulacije za pSTAT5a. Svakom majmunu je uzeta krv nultog dana pre tretmana radi utvrđivanja nestimulisanih nivoa pSTAT5a i upoređena sa promenama u pSTAT5a nakon tretmana. (A) pSTAT5a (MFI, maksimalna srednja vrednost intenziteta fluorescencije) pre i nakon tretmana sa 100 µg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2, n = 4. (B) pSTAT5a pre i posle tretmana sa 30 µg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2, n = 4. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM za navedene ćelijske podskupove.
Slika 41. Ex vivo bojenje površine CD25 ćelije pune krvi osetljiv je biomarker za aktivaciju IL-2 in vivo. Od 1 do 14 dana nakon in vivo primene pojedinačnih doza DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 na cinomolgus majmune, puna krv je sakupljena i testirana odmah bez stimulacije za površinu CD25 na naznačenim tipovima ćelija. Svakom majmunu je uzeta krv nultog dana pre tretmana radi utvrđivanja nestimulisanih nivoa CD25 i upoređena sa promenama CD25 nakon tretmana. (A) Bojenje CD25 (maksimalna MFI, srednja vrednost intenziteta fluorescencije) pre i posle tretmana sa 100 μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2, n = 4. (B) Bojenje CD25 pre i posle tretmana sa 30 μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2, n = 4. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM za navedene ćelijske podskupove.
Slika 42. Ex vivo bojenje intracelularnih Ki-67 pune krvi osetljiv je biomarker za proliferaciju ćelija nakon aktivacije IL-2 in vivo. Od 1 do 14 dana nakon in vivo primene jedne doze DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 na cinomolgus majmune, puna krv je sakupljena i testirana odmah bez stimulacije za intracelularni Ki-67 na naznačenim tipovima ćelija. Svakom majmunu je uzeta krv nultog dana pre tretmana radi utvrđivanja nestimulisanih nivoa Ki-67+ ćelija i upoređena sa promenama u % Ki-67+ ćelija nakon tretmana. (A) Ki-67 bojenje (% ćelija Ki-67+) pre i posle tretmana sa 100 μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2, n = 4. (B) Ki-67 (% ćelija Ki-67+) kontrastriranje pre i posle tretmana sa 30 μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2, n = 4. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± SEM za navedene ćelijske podskupove.
Slika 43. Uporedni prikaz sažetih in vivo efekata IL-2 na cinomolgus Treg ćelijama. Maksimalan porast ukupnih Treg kao % CD4+T ćelija je prikazan za Proleukin, IgG-IL-2, IgG-(IL-2)2 i IgG-(IL-2N88D)2; za poređenje, sve in vivo doze su pretvorene u pmoles/kg. Proleukin je davan 3 puta nedeljno (MWF) tokom 2 nedelje, a IL-2 fuzioni proteini su primenjeni kao pojedinačna injekcija. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± SEM; Proleukin (n = 5), IgG-IL-2 (n = 6), IgG-(IL-2)2 (n = 6) i IgG-(IL-2N88D)2 (n = 4).
Slika 44. Visoka doza IL-2 indukuje eozinofiliju kod majmuna cinomolgus. Promene u krvnoj slici eozinofila pratile su se u svim testovima sa Proleukinom ili imunokonjugatima IL-2. Eozinofilija je otkrivena 7 do 14 dana nakon tretmana sa visokom dozom Proleukina (2x10<5>IU/kg 3 puta nedeljno tokom 2 nedelje) ili veće doze DP47GS IgG-IL-2 ali ne sa DP47GS IgG-(IL-2)2 ili DP47GS IgG-(IL-2N88D)2. Utvrđivanje osnovne vrednosti eozinofila predstavljeno je otvorenim krugovima prikazanim kao „0” za dozu IL-2 i izvedeno je dva puta, jednom za ispitivanje molekula divljeg tipa IL-2, a drugi put za testiranje DP47GS IgG-(IL-2N88D)2. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD.
Slika 45. In vivo terapija sa DP47GS IgG-IL-2 potiskuje odloženu preosetljivost (DTH) murinskih crvenih krvnih ćelija u ovci. Svi podaci su prikazani za pojedinačne miševe tretirane vehikulumom (100% odgovor), IgG-IL-2 (4.000 IU/miš) ili CTLA-4-Ig miša kao pozitivna kontrola (200 μg/miš). (A) rezultati NOD miševa i (B) C57BL/6 miševa. Veličina DTH odgovora četvrtog dana prikazana je kao promena u težini šape u poređenju sa neimuniziranim miševima (A težina šape). Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD.
Slika 46. In vivo tretman sa DP47GS IgG-IL-2 (4.000 IU/miš) potiskuje odgovore murinskog IgG antitela na KLH kod (A) C57BL/6 miševa 21 dana nakon imunizacije i kod (B) NOD miševa sedam dana nakon imunizacije. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD.
Detaljan opis pronalaska
Definicije
Termini se ovde koriste na način uobičajen u struci, osim ako nije drugačije definisano u nastavku.
U smislu ovog dokumenta, termin „fuzioni protein” se odnosi na molekul fuzionog polipeptida koji sadrži molekul imunoglobulina i molekul IL-2, pri čemu su komponente fuzionog proteina vezane jedna za drugu peptidnim vezama, bilo direktno ili preko peptidnih linkera. Za jasnoću, pojedinačni peptidni lanci imunoglobulinske komponente fuzionog proteina mogu biti povezani nekovalentno, npr. disulfidnim vezama.
„Spojeni” se odnosi na komponente koje su vezane peptidnim vezama, bilo direktno ili preko jednog ili više peptidnih linkera.
Pod „specifičnim vezivanjem“ podrazumeva se da je vezivanje selektivno za antigen i može se razlikovati od neželjenih ili nespecifičnih interakcija. Sposobnost imunoglobulina da se veže za antigen može se izmeriti putem enzimskog imunosorbent testa (ELISA) ili drugih tehnika poznatih u struci, npr. površinska plazmonska rezonanca (SPR) (ispitano na BIAcore instrumentu) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323–329 (2000)) i tradicionalni testovi kompetitivnog vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217–229 (2002)). U jednom primeru izvođenja, obim vezivanja imunoglobulina za nepovezani protein manji je od oko 10% od vezivanja imunoglobulina za antigen kao što je izmereno, npr. tehnikom SPR. U određenim primerima izvođenjima, imunoglobulin koji se vezuje za antigen ima konstantu disocijacije (KD) ≤1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10-8 M ili manje, npr. od 10-8 M do 10-13 M, npr. od 10-9 M do 10-13 M).
„Afinitet” ili „afinitet vezivanja” odnosi se na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja” se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može se generalno predstaviti preko konstante disocijacije (KD), koja predstavlja odnos konstanti brzine disocijacije i brzine asocijacije (koff, odnosno kon). Tako ekvivalentni afiniteti mogu da uključe različite konstante brzine, dokle god odnos konstanti brzine ostaje isti. Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one koje su ovde opisane. Poseban postupak merenja afiniteta je površinska plazmonska rezonanca (SPR).
„Ograničena svojstva vezivanja”, na primer, smanjeno vezivanje za Fc receptor ili receptor IL-2, odnosi se na smanjenje afiniteta za odgovarajuću interakciju, kao što je mereno na primer SPR. Radi jasnoće, termin uključuje i smanjenje afiniteta na nulu (ili ispod granice detekcije analitičkog postupka), odnosno potpunog ukidanja interakcije. Nasuprot tome, „pojačana svojstva vezivanje” se odnose na povećanje afiniteta vezivanja za odgovarajuću interakciju.
U smislu ovog dokumenta, termin „antigena determinanta” predstavlja sinonim termina „antigen” i odnosi se na mesto (npr. kontinuirani niz aminokiselina ili konformaciona konfiguracija sačinjena od različitih regiona nekontinuiranih aminokiselina) na polipetidnom makromolekulu za koji se vezuje antigen, formirajući vezujući kompleks antitelo-antigen. Korisne antigenske determinante mogu se pronaći, na primer, na površinama ćelija, slobodni u serumu krvi, i/ili u ekstracelularnoj matrici (ECM).
U smislu ovog dokumenta, termin „jedinstveni lanac” odnosi se na molekul koji čine monomeri aminokiselina linearno povezanih peptidnim vezama.
Termin „antitelo” ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela uključujući, bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu antigen-vezujuću aktivnost.
„Fragment antitela” ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, a koji sadrži deo netaknutog antitela i vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, bez ograničenja, Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab')2, dijatela, linearna antitela, molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv) i antitela s jednim domenom.
Termin „molekul imunoglobulina” odnosi se na protein koji ima strukturu prirodnog antitela. Na primer, imunoglobulini IgG klase su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-kraja do C-kraja, svaki teški lanac imunoglobulina ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3), koji se takođe zovu konstantni region teškog lanca. Slično tome, od N- do C-kraja, svaki laki lanac imunoglobulina ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen, koji se takođe zove konstantni region lakog lanca. Teški lanac imunoglobulina može se svrstati u jednu od pet klasa, nazvanu α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) ili μ (IgM), od kojih se neke mogu dalje deliti na potklase, npr. γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1(IgA1) i α2 (IgA2). Laki lanac imunoglobulina može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena. Imunoglobulin se u suštini sastoji od dva Fab molekula i Fc domena, povezanih preko regiona zgloba imunoglobulina.
U smislu ovog dokumenta, „Fab fragment” se odnosi na fragment imunoglobulina koji sadrži VL domen i konstantni domen lakog lanca (CL) i VH domena i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca.
„Klasa” antitela ili imunoglobulina ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.
Termin „varijabilni region” ili „varijabilni domen” ukazuje na domen teškog ili lakog lanca imunoglobulina ili antitela koje je uključeno u vezivanje imunoglobulina ili antitela za antigen. Međutim, imunoglobulin koji se sastoji od fuzionog proteina iz ovog pronalaska može sadržati varijabilne regione koji nemaju specifičnost vezivanja antigena. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH, odnosno VL) imunoglobulina ili antitela generalno imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). Videti, npr., Kindt et al., Kuby Immunology, 6<th>ed., W.H. Freeman and Co., strana 91 (2007). Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen-vezujuće specifičnosti.
Termin „hipervarijabilni region” ili „HVR”, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena imunoglobulina ili antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje”). Generalno, nativna četvorolančana antitela uključuju šest HVR-a, tri u VH (H1, H2, H3), i tri u VL (L1, L2, L3). HVR generalno sadrže ostatke aminokiselina iz hipervarijabilnih petlji i/ili „regiona koji određuju komplementarnost” (CDR), gde ovi drugi imaju najveću varijabilnost sekvenci i/ili su uključeni u prepoznavanje antigena. Primeri hipervarijabilnih petlji koje se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3); (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Primeri CDR koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) (Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); Sa izuzetkom CDR1 u VH, CDR generalno sadrže aminokiselinske ostatke koji formiraju hipervarijabilne petlje. CDR-ovi takođe sadrže "ostatke koji određuju specifičnost", ili "SDR", koji su ostaci koji stupaju u kontakt sa antigenom. SDR se nalaze u okviru regiona CDR-ova koji se nazivaju skraćeni CDR, ili a-CDR. Primeri za a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 i a-CDR-H3) javljaju se na aminokiselinskim ostacima 31-34 kod L1, 50-55 kod L2, 89-96 kod L3, 31-35B kod H1, 50-58 kod H2 i 95-102 kod H3 (vidite Almagro i Fransson, Front. Biosci.13, 1619-1633 (2008)). Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su nabrojani prema radu Kabat et al, gore (poznat kao „Kabatova numeracija”).
„Okvir” ili „FR” se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Prema tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
„Humani imunoglobulin” je onaj koji ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci koju proizvodi čovek ili humana ćelija, ili je dobijen iz ne-humanog izvora koji koristi humani repertoar imunoglobulina ili druge sekvence za kodiranje humanog imunoglobulina. Ova definicija humanog imunogloulina posebno isključuje humanizovani imunoglobulin koji sadrži nehumane antigen-vezujuće ostatke.
Termin „monoklonsko antitelo”, u smislu ovog dokumenta, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačnih antitela koja su sadržana u populaciji su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom proizvodnje preparata monoklonskog antitela, a takve su varijante uopšteno prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela usmereno je prema pojedinačnoj determinanti na antigenu. Tako, reč “„monoklonsko” ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela i ne bi je trebalo tumačiti kao zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na postupak hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke displeja faga i postupke koje koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.
Termin „Fc domen” ili „Fc region” ovde se koristi da definiše region C-kraja imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Termin uključuje nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. IgG Fc region sadrži IgG CH2 i IgG CH3 domen. „CH2 domen” humanog IgG Fc regiona obično se proteže od aminokiselinskog ostatka na približno položaju 231 do aminokiselinskog ostatka na približno položaju 340. U jednom primeru izvođenja, lanac ugljenih-hidrata je povezan sa CH2 domenom. Ovde domen CH2 može biti domen CH2 domen nativne sekvence ili varijanta CH2 domena. „CH3 domen” obuhvata delove ostatka C-terminala u domenu CH2 u Fc regionu (tj. iz aminokiselog ostatka na položaju 341 na aminokiselinski ostatak na približno položaju 447 IgG). Ovde CH3 region može biti nativna sekvenca CH3 domena ili varijanta CH3 domena (npr. CH3 domen sa postojećim ispupčenjem („čvor”) u jednom njegovom lancu i odgovarajućom šupljinom („otvor”) u drugom lancu, vidi US Patent 5,821,333). Ovakve varijante CH3 domena mogu se koristiti za promovisanje heterodimerizacije dva neidentična imunoglobulinska teška lanca, kako je ovde opisano. U jednom primeru izvođenja, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) Fc regiona može, ali ne mora biti prisutan. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, numerisanje ostataka aminokiselina u Fc regionu ili konstantnom regionu u skladu je sa EU sistemom numeracije, koji se takođe naziva EU indeks, kao što je opisano u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Termin „efektorske funkcije” ukazuje na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu imunoglobulina, čiji izotip imunoglobulina varira. Primeri efektorskih funkcija imunoglobulina uključuju: Vezivanje C1q i komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), vezivanje Fc receptora, ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), sekreciju citokina, vezivanje antigena posredstvom imunog kompleksa od strane antigen prezentujućih ćelija, nishodnu regulaciju površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor) i aktivaciju B-ćelija.
„Aktivirajući Fc receptor” je Fc receptor koji nakon angažovanja Fc regiona imunoglobulina izaziva signalizirajuće događaje koji stimulišu receptorsku ćeliju da izvede efektorske funkcije. Aktivirajući Fc receptori uključuju FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) i FcαRI (CD89). Određeni aktivacijski Fc receptor je humani FcγRIlIa (pogledati UniProt pristupni broj P08637 (verzija 141)).
Termin „interleukin-2” ili „IL-2”, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki nativni IL-2 koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naglašeno. Termin obuhvata neobrađeni IL-2, kao i svaki oblik IL-2 koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante IL-2, npr. splajsovane ili alelne varijante. Serija aminokiselina primernog humanog IL-2 je prikazana u SEQ ID NO: 1. Neobrađeni humani IL-2 dodatno sadrži N-terminal 20 aminokiselinski signalni peptid, koji je odsutan u zrelom IL-2 molekulu.
Pod imenom „nativni IL-2”, takođe nazvan „IL-2 divljeg tipa”, podrazumeva se IL-2 koji se pojavljuje u prirodi. Sekvenca nativnog humanog IL-2 je prikazana u SEQ ID NO: 1. Za potrebe predmetnog pronalaska, termin nemutirani (divlji tip) obuhvata oblike IL-2 koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih mutacija koje ne utiču na vezivanje IL-2 receptora u poređenju sa prirodnim, nativnim IL-2, kao što je, npr. supstitucija cisteina na poziciji koja odgovara ostatku 125 humanog IL-2 do alanina. U nekim primerima izvođenja, nemutirani IL-2, za potrebe predmetnog pronalaska, sadrži aminokiselinsku supstituciju C125A (videti SEQ ID NO: 3).
Termin „CD25” ili „IL-2 receptor α”, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki nativni CD25 koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naglašeno. Termin obuhvata neobrađen, CD25 „pune dužine”, kao i svaki oblik CD25 koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante CD25, npr. splajsovane ili alelne varijante. U određenim izvođenjima CD25 je humani CD25. Sekvenca aminokiselina egzemplarnog humanog CD25 (sa signalnom sekvencom, Avi-tagom i His-tagom) prikazana je u SEQ ID NO: 25.
Termin „receptor IL-2 visokog afiniteta”, kako se ovde koristi, odnosi se na heterotrimerni oblik receptora IL-2, koji se sastoji od receptorske γ-podjedinice (takođe poznate kao uobičajena γ-podjedinica za citokin receptor, γc ili CD132), receptorska β-podjedinica (takođe poznata kao CD122 ili p70) i α-podjedinica receptora (takođe poznata kao CD25 ili p55). Termin „receptor intermedijarnog afiniteta IL-2” ili „IL-2 receptor βγ”odnosi se na receptor IL-2 koji uključuje samo γ-podjedinicu i β-podjedinicu, bez α-podjedinice (za pregled vidi npr. Olejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)). Aminokiselinske sekvence primernog humanog CD122 i CD132 (spojene sa Fc regionom sa His-tagom) su prikazane u SEQ ID NO 21 i 23, respektivno.
Pod „regulatornom T ćelijom” ili „Treg ćelijom” podrazumeva se specijalizovani tip CD4<+>T ćelija koji može potisnuti odgovore drugih T ćelija (efektorske T ćelije). Treg ćelije se karakterišu eksprimiranjem CD4, α-podjedinice receptora IL-2 (CD25) i transkripcionog faktora za kutiju P3 (FOXP3) (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)) i igraju kritičnu ulogu u indukciji i održavanju periferne samotolerancije na antigene, uključujući i one eksprimovane iz tumora.
Pod „konvencionalnim CD4+ T ćelijama” podrazumevaju se CD4+ T ćelije, osim regulatornih T ćelija. Konvencionalne CD4+ memorijske T ćelije karakteriše izraz CD4, CD3, ali ne FOXP3. „Konvencionalne CD4+ memorijske T ćelije” su podskup konvencionalnih CD4+ T ćelija, dodatno se karakterišu nedostatkom ekspresije CD45RA, za razliku od „konvencionalnih CD4+ naivnih T ćelija” koje eksprimiraju CD45RA.
Pod „selektivnom aktivacijom Treg ćelija” podrazumeva se aktivacija Treg ćelija u suštini bez istovremene aktivacije drugih podskupova T ćelija (kao što su ćelije CD4+ T pomoćne ćelije, CD8+ citotoksične T ćelije, NK T ćelije) ili ćelije prirodne ubice (NK). Postupci za identifikaciju i razlikovanje ovih tipova ćelija su opisani u Primerima. Aktivacija može uključivati indukciju signalizacije IL-2 receptora (mereno npr. detekcijom fosforilisane STAT5a), indukcijom proliferacije (kao što je mereno npr. detekcijom Ki-67) i/ili unapređenjem ekspresije aktivacionih markera (kao npr. CD25).
Termin „peptidni linker” odnosi se na peptid koji sadrži jednu ili više aminokiselina, obično oko 2–20 aminokiselina. Peptidni linkeri su poznati u struci ili su ovde opisani. Odgovarajući neimungeni peptidni linkeri obuhvataju, na primer, (G4S)n, (SG4)n ili G4(SG4)n peptidne linkere, pri čemu je n obično broj između 1 i 10, po pravilu između 2 i 4.
Izraz „modifikacija” odnosi se na svaku manipulaciju okosnice peptida (npr. aminokiselinska sekvenca) ili postrattranslacionu modifikaciju polipeptida (npr. glikozilacija) polipeptida.
„Modifikacija čvor u otvor” odnosi se na modifikaciju unutar interfejsa između dva teška lanca imunoglobulina u domenu CH3, pri čemu i) u domenu CH3 jednog teškog lanca, aminokiselinski ostatak zamenjuje se sa aminokiselinskim ostacima koji imaju veći volumen bočnog lanca, čime se generiše ispupčenje („čvor”) unutar interfejsa u domenu CH3 jednog teškog lanca koji se može postaviti u šupljinu („otvor”) unutar interfejsa u domenu CH3 drugog teškog lanca, i ii) u domenu CH3 drugog teškog lanca, aminokiselinski ostatak se zamenjuje aminokiselinskim ostacima koji imaju manji volumen bočnog lanca, čime stvaraju šupljnu („otvor”) unutar interfejsa u drugom CH3 domenu unutar kog je pozicionabilno ispupčenje („čvor”) unutar interfejsa u prvom CH3 domenu. U jednom primeru izvođenja, „modifikacija čvor u otvor” sadrži aminokiselinsku supstituciju T366W i opciono supstituciju aminokiselina S354C u jednom od teških lanaca antitela, i zamene aminokiselina T366S, L368A, Y407V i opciono Y349C u drugom od teških lanaca antitela. Tehnologija čvor u otvor je opisana, na primer, u US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617–621 (1996) and Carter, J Immunol Meth 248, 7–15 (2001). Uglavnom, postupak obuhvata uvođenje ispupčenja („čvor”) na sučelju prvog polipetida i odgovarajuće šupljine („otvor”) u sučelju drugog polipeptida, tako da ispupčenje može da se postavi u šupljinu tako da podstiče formaciju heterodimera i ometa formaciju heterodimera. Ispupčenja se stvaraju zamenom malih bočnih lanaca aminokiselina sa sučelja prvog polipeptida dužim bočnim lancima (npr. tirozin ili triptofan). Kompenzujuće šupljine iste ili slične veličine kao ispupčenja stvaraju se na sučelju drugog polipeptida, zamenom dugih bočnih lanaca aminokiselina manjim (npr. alanin ili treonin). Uvođenjem ova dva cisteinska ostatka na pozicije S354 i Y349, datim redosledom, dolazi do stvaranja disulfidnog mosta između dva teška lanca u Fc regionu, što dodatno ojačava dimer (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
„Supstitucija” aminokiseline se odnosi na zamenu u polipeptidu jedne aminokiseline sa drugom aminokiselinom. U jednom primeru izvođenja, aminokiselina se zamenjuje drugom aminokiselinom koja ima slična strukturalna i/ili hemijska svojstva, npr. zamene konzervativne aminokiseline. „Konzervativne” aminokiselinske zamene se mogu napraviti na osnovu sličnosti u polaritetu, naelektrisanju, rastvorljivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti i/ili amfipatskoj prirodi uključenih ostataka. Na primer, nepolarne (hidrofobne) aminokiseline uključuju alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenilalanin, triptofan i metionin; polarne neutralne aminokiseline uključuju glicin, serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin i glutamin; pozitivno naelektrisane (bazne) aminokiseline uključuju arginin, lizin i histidin; a negativno naelektrisane (kisele) aminokiseline uključuju asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu. Nekonzervativne supstitucije zahtevaju izmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom. Na primer, supstitucije aminokiselina mogu takođe rezultirati zamenom jedne aminokiseline sa drugom aminokiselinom koja ima različite strukturne i/ili hemijske osobine, na primer, zamenu aminokiseline iz jedne grupe (npr. polarna) sa drugom aminokiselinom iz druge grupe (npr. osnovna). Zamene aminokiseline mogu se generisati pomoću genetičkih ili hemijskih postupaka koje su dobro poznate u struci. Genetski postupci mogu obuhvatiti mutagenezu usmerenu na lokaciju, PCR, sintezu gena i slično. Smatra se da su takođe korisni postupci izmene grupe bočnih lanaca aminokiseline drugim postupcima osim genetskog inženjeringa, kao što je hemijska modifikacija. U smislu ovog dokumenta, mogu se koristiti različite oznake za iste zamene aminokiselina. Na primer, supstitucija iz prolina na poziciji 329 teškog lanca imunoglobulina u glicin može se naznačiti kao 329G, G329, G329, P329G ili Pro329Gly.
„Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence” u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci za ovu oblast mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti sekvence aminokiselina dobijene pomoću kompjuterskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Kompjuterski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali. U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja sekvenci aminokiselina, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što drugačije može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:
100 puta količnik X/Y
gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti sekvence aminokiseline A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti sekvence aminokiseline B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije navedeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti sekvence aminokiseline dobijene su kako je opisano u prethodnom paragrafu pomoću ALIGN-2 kompjuterskog programa.
Termini „Polinukleotid” ili „nukleinska kiselina” koji se, u smislu ovog dokumenta, koriste kao sinonimi, odnose se na polimere nukleotida bilo koje dužine i uključuju DNK i RNK. Nukleotidi mogu biti dezoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze i/ili njihovi analozi ili bilo koji supstrat koji se može inkorporirati u polimer putem DNK ili RNK polimeraze ili sintetičkom reakcijom. Polinukleotid može da sadrži modifikovane nukleotide, kao što su metilovani nukleotidi i njihovi analozi. Niz nukleotida može biti prekinut nenukleotidnim komponentama. Polinukleotid može sadržati modifikacije koje su napravljene nakon sinteze, kao što je konjugacija za označenu komponentu.
Za nukleinsku kiselinu ili polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu bar, na primer, 95% „identičnu” referentnoj nukleotidnoj sekvenci predmetnog pronalaska, predviđeno je da je nukleotidna sekvenca polinukleotida identična referentnoj sekvenci osim kada polinukleotidna sekvenca može uključivati do pet tačkastih mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, da bi se dobio polinukleotid sa nukleotidnom sekvencom najmanje 95% identičnom referentnoj sekvenci nukleotida, do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može biti uklonjeno ili supstituisano drugim nukleotidom ili broj nukleotida do 5% ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci može biti ubačen u referentnu sekvencu. Te izmene referentne sekvence mogu se desiti na 5' ili 3' terminalnim mestima referentne sekvence nukleotida ili bilo gde između tih terminalnih mesta, pojedinačno razbacane između ostataka u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa u referentnoj sekvenci. Da bi bilo praktično, klasično se pomoću poznatih kompjuterskih programa (npr. ALIGN-2)., kao što su oni gorenavedeni za polipeptide, može odrediti da li je neka konkretna polinukleotidna sekvenca najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična ovde opisanoj nukleotidnoj sekvenci.
Termin „vektor”, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji može da propagira drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Termin uključuje vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju kao „ekspresioni vektori”.
Termini „ćelija domaćin”, „linija ćelija domaćina” i „kultura ćelija domaćina” koriste se kao sinonimi i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante” i „transformisane ćelije”, koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde je obuhvaćeno mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano ili odabrano u originalno transformisanoj ćeliji. Ćelija domaćin je bilo koja vrsta ćelijskog sistema koji se može koristiti za dobijanje proteina iz ovog pronalaska. Ćelije domaćini uključuju uzgajane ćelije, između ostalih, npr. uzgajane ćelije sisara, kao što su CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, YO ćelije mijeloma, P3X63 ćelije mišjeg mijeloma, PER ćelije, PER.C6 ćelije ili ćelije hibridoma, ćelije kvasaca, ćelije insekata i biljne ćelije, ali i ćelije koje se nalaze u transgenoj životinji, transgenoj biljci ili uzgajenom biljnom ili životinjskom tkivu.
„Efikasna količina” agensa odnosi se na količinu koja je neophodna da bi nastala fiziološka promena u ćeliji ili tkivu na koji se primenjuje.
„Terapeutski efikasna količina” agensa, npr. farmaceutske kompozicija, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata. Terapeutski efikasna količina agensa na primer eliminiše, smanjuje, odlaže, minimizira ili sprečava štetne efekte bolesti.
„Pojedinac” ili „ispitanik” je sisar. Sisari uključuju, bez ograničenja, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i nehumane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). Posebno, pojedinac ili ispitanik je čovek.
Termin „farmaceutska kompozicija” odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasnu biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj nalazi i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.
„Farmaceutski prihvatljiv nosač” upućuje na sastojak farmaceutske kompozicije koji nije aktivni sastojak, a koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, bez ograničenja, pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
U smislu ovog dokumenta, „lečenje” (i njegovi gramatički oblici, kao što je „lečiti”) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, a može se primenjivati radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim primerima izvođenja, antitela iz ovog pronalaska se koriste da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.
„Autoimuna bolest” se odnosi na nemalignu bolest ili poremećaj, koja nastaje iz i usmerena je protiv sopstvenih tkiva pojedinca. Primeri autoimunih bolesti ili poremećaja uključuju, bez ograničenja, inflamatorne reakcije kao što su inflamatorne bolesti kože, uključujući psorijazu i dermatitis (npr. atopijski dermatitis); odgovore koji se odnose na zapaljensku bolest creva (kao što je Kronova bolest i ulcerativni kolitis); dermatitis; alergijski uslovi kao što su ekcem i astma; reumatoidni artritis; sistemski eritematozni lupus (SLE) (uključujući, bez ograničenja, lupus nefritis, kožni lupus); dijabetes melitus (npr. dijabetes melitus tipa 1 ili dijabetes melitus zavisan od insulina); multipla skleroza i dijabetes melitus koji se javlja u detinjstvu.
Fuzioni proteini predmetnog pronalaska
Pronalazak obezbeđuje nove fuzione proteine imunoglobulina IL-2 sa posebno pogodnim svojstvima za upotrebu u terapeutskim postupcima kao što je ovde opisano.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje fuzioni protein koji sadrži (i) molekul imunoglobulina koji nije sposoban za specifično vezivanje za antigen, i (ii) dva mutanta interleukin-2 (IL-2) molekula koji sadrže mutaciju aminokiselina, što smanjuje afinitet mutiranog molekula IL-2 za IL-2 receptor intermedijarnog afiniteta, u poređenju sa molekulom IL-2 divljeg tipa, pri čemu mutantni IL-2 molekuli sadrže sekvencu SEQ ID NO: 58.
U jednom primeru izvođenja, pomenuti fuzioni protein se sastoji od molekula imunoglobulina koji nije sposoban za specifično vezivanje za antigen, dva mutanta interleukin-2 (IL-2) molekula koji sadrže mutaciju aminokiseline koja smanjuje afinitet mutiranog IL-2 molekula na IL-2 receptor intermedijarnog afiniteta, u poređenju sa molekulom IL-2 divljeg tipa, pri čemu mutantni IL-2 molekuli sadrže sekvencu SEQ ID NO: 58 i opciono jedan ili više peptidnih linkera.
Kao što je prikazano u Primerima, fuzioni protein koji sadrži dva IL-2 molekula iznenađujuće obezbeđuje značajno poboljšanu efikasnost i selektivnost u aktivaciji regulatornih T ćelija, u poređenju sa odgovarajućim fuzionim proteinom koji sadrži jedan molekul IL-2. Štaviše, samo fuzioni protein koji sadrži dva (umesto samo jednog) mutantna IL-2 molekula sa smanjenim vezivanjem za IL-2 receptor intermedijarnog afiniteta zadržava značajne stimulativne aktivnosti na regulatornim T ćelijama.
U jednom primeru izvođenja, pomenuti molekul imunoglobulina je molekul imunoglobulina IgG klase, tačnije molekul imunoglobulina potklase IgG1. U jednom primeru izvođenja, pomenuti molekul imunoglobulina je molekul humanog imunoglobulina, tj. obuhvata potpuno humane varijabilne i konstantne regione. Sekvenca konstantnog regiona primernog humanog IgG1 je prikazana u SEQ ID NO: 8. Molekul imunoglobulina klase IgG sadrži (i) dva laka lanca imunoglobulina, od kojih svaki sadrži od N- do C-terminusa laki lanac varijabilnog domena (VL) i laki lanac konstantnog domena(CL) i (ii) dva teška lanca imunoglobulina, od kojih svaki sadrži od N-terminusa do C-terminusa teški lanac varijabilnog domena (VH), teški lanac konstantnog domena (CH) 1, region imunoglobulina, CH2 domen i CH3 domen. Poslednja dva domena čine deo Fc regiona molekula imunoglobulina. Dva teška lanca dimerizuju se u regionu Fc.
U jednom primeru izvođenja fuzionog proteina u skladu s predmetnim pronalaskom, pomenuti mutirani molekuli IL-2 su spojeni na svojoj N-terminalnoj aminokiselini sa C-terminalnom aminokiselinom jednog od teških lanaca imunoglobulina pomenutog molekula imunoglobulina, po mogućstvu peptidnim linkerom. Fuzija dva (identična) molekula IL-2 sa teškim lancima imunoglobulina omogućava jednostavnu proizvodnju fuzionog proteina, izbegavajući stvaranje neželjenih nusproizvoda i odbacujući potrebu za modifikacijama koje promovišu heterodimerizaciju neidentičnih teških lanaca, kao što je modifikacija čvor u otvor.
U određenim primerima izvođenja fuzionog proteina u skladu sa pronalaskom, navedena dva mutanta IL-2 molekula su spojena sa pomenutim molekulom imunoglobulina putem peptidnog linkera. U jednom primeru izvođenja, pomenuta dva mutanta IL-2 molekula su spojeni sa molekulom imunoglobulina preko peptidnog linkera. U jednom primeru izvođenja, pomenuta dva mutirana molekula IL-2 su spojeni na svojoj N-terminalnoj aminokiselini sa C-terminalnom aminokiselinom jednog od teških lanaca imunoglobulina pomenutog molekula imunoglobulina peptidnim linkerom. U jednom primeru izvođenja, svaki od mutiranih molekula IL-2 je spojen sa pomenutim molekulom imunoglobulina putem peptidnog linkera koji ima identičnu aminokiselinsku sekvencu. U jednom primeru izvođenja, pomenuti peptidni linker sadrži najmanje 10 aminokiselina. U posebnom primeru izvođenja, pomenuti peptidni linker sadrži najmanje 15 aminokiselina. Bez želje da se ograniči teorijom, peptidni linker ove dužine može obezbediti fleksibilnost za optimalno vezivanje mutantnih IL-2 molekula na receptor IL-2, naročito visokoafinitetnog (heterotrimernog) IL-2 receptora. U konkretnom primeru izvođenja, pomenuti peptidni linker sadrži 15 aminokiselina. U još konkretnijem primeru izvođenja, pomenuti peptidni linker sadrži sekvencu aminokiselina (G 4 S) 3 (SEQ ID NO: 66). U jednom primeru izvođenja, pomenuti peptidni linker je dužine 15 aminokiselina. U jednom primeru izvođenja, navedeni peptidni linker ima aminokiselinsku sekvencu (G4S) 3 (SEQ ID NO: 66). U jednom primeru izvođenja, pomenuti peptidni linker se sastoji od 15 aminokiselina. U jednom primeru izvođenja, navedeni peptidni linker se sastoji od aminokiselinske sekvence (G4S) 3 (SEQ ID NO: 66).
Fuzija molekula IL-2 sa molekulom imunoglobulina obezbeđuje povoljne farmakokinetičke osobine, uključujući i dugotrajni poluživot u serumu (usled recikliranja putem vezivanja za FcRn i veličine molekula znatno iznad praga za bubrežnu filtraciju), u poređenju sa slobodnim (nespojenim) IL-2. Štaviše, prisustvo molekula imunoglobulina takođe omogućava jednostavno prečišćavanje fuzionih proteina npr. afinitetnom hromatografijom proteina A. Interesantno, kako je prikazano u Primerima, fuzioni protein koji sadrži dva mutanta IL-2 molekula sa redukovanim vezivanjem na IL-2 receptor intermedijarnog afiniteta ima duži poluživot u serumu od odgovarajućeg fuzionog proteina koji sadrži dva IL-2 molekula divljeg tipa. Fuzija sa molekulom imunoglobulina, tj. prirodnim tipom molekula, takođe može smanjiti toksičnost fuzionog proteina kroz formiranje antitela protiv leka.
Iako je prisustvo molekula imunoglobulina, posebno Fc regiona molekula imunoglobulina, povoljno za farmakokinetička svojstva fuzionog proteina, može istovremeno dovesti do neželjenih ciljanja fuzionog proteina na ćelije koje eksprimiraju Fc receptore, a ne na željene ćelije koje nose IL-2 receptore. Štaviše, angažovanje Fc receptora može dovesti do oslobađanja (proinflamatornih) citokina i neželjene aktivacije različitih imunih ćelija, pored regulatornih T ćelija. Prema tome, u određenim primerima izvođenja, pomenuti molekul imunoglobulina koji se sastoji od fuzionog proteina prema pronalasku sadrži modifikacijski afinitet smanjenog vezivanja molekula imunoglobulina za Fc receptor, u poređenju sa odgovarajućim molekulom imunoglobulina bez navedene modifikacije. U konkretnom primeru izvođenja, navedeni Fc receptor je Fcγ receptor, posebno humani Fcγ receptor. Afinitet vezivanja za Fc receptore može se lako utvrditi npr. testom ELISA ili površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) pomoću standardnih instrumenata kao što su instrumenti BIAcore (GE Healthcare), a takvi Fc receptori se mogu dobiti rekombinantnom ekspresijom. Specifično ilustrativan primer izvođenja merenja afiniteta vezivanja opisan je u nastavku. Prema jednom izvođenju, Afinitet vezivanja za Fc receptor se meri površinskom plazmonskom rezonancom pomoću mašine BIACORE® T100 (GE Healthcare) na 25° C sa ligandima (Fc receptor) koji su imobilisani na CM5 čipovima. Ukratko, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, GE Healthcare) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Rekombinantni ligand je razblažen 10 mM natrijum-acetata, pH 5,5, do 0,5 μg/ml – 30 μg/ml pre injektovanja pri stopi protoka od 10 μl/minutu da bi se dobilo oko 100–5000 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja liganda, injektovan je1 M etanolamin da bi blokirao neizreagovale grupe. Za kinetička merenja, u HBS-EP+(GE Healthcare, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% surfaktant P20, pH 7,4) ubrizgava se trostruki do petostruki serijski rastvor antitela (raspon od ~ 0,01 nM do 300 nM) na 25° C pri protoku od oko 30 μl/min – 50 μl/min. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE® Evaluation Software verzija 1.1) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) je izračunata kao odnos koff/kon. Videti, npr. Chen et al. J. Mol. Biol.
293:865-881 (1999). Alternativno, afinitet vezivanja antitela za Fc receptore može se proceniti pomoću ćelijskih linija za koje je poznato da eksprimiraju određene Fc receptore, kao što su NK ćelije koje eksprimiraju Fcγllla receptor.
U jednom primeru izvođenja, modifikacija sadrži jednu ili više aminokiselina koji smanjuju afinitet vezivanja imunoglobulina za Fc receptor. U jednom primeru izvođenja, aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiselina. Obično je ista mutacija ili više mutacija aminokiselina prisutna u svakoj od dva teška lanca imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, navedena aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja imunoglobulina za Fc receptor za najmanje dva puta, najmanje pet puta ili najmanje 10 puta. U primerima izvođenja gde postoji više od jedne aminokiselinske mutacije koja smanjuje afinitet vezivanja imunoglobulina za Fc receptor, kombinacija ovih aminokiselinskih mutacija može smanjiti afinitet vezivanja imunoglobulina na Fc receptor za najmanje 10 puta, najmanje 20 puta ili čak najmanje 50 puta. U jednom primeru izvođenja, pomenuti molekul imunoglobulina pokazuje manje od 20%, naročito manje od 10%, posebno manje od 5% afiniteta vezivanja za Fc receptor u poređenju sa imunoglobulinom bez pomenute modifikacije.
U jednom primeru izvođenja, pomenuti Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. U konkretnom primeru izvođenja, navedeni Fc receptor je izabran iz grupe FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) i FcαRI (CD89). U konkretnom primeru izvođenja, Fc receptor je Fcγ receptor, konkretnije i FcγRIIIa, FcγRI ili FcγRIIa receptor. Poželjno je da se smanji afinitet vezivanja svakog od ovih receptora. U još konkretnijem primeru izvođenja, pomenuti Fc receptor je FcγIIIa, naročito humani FcγIIIa. U nekim primerima izvođenja, takođe se smanjuje afinitet vezivanja komplementne komponente, posebno afinitet vezivanja za C1q. U jednom primeru izvođenja, afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) nije smanjen. Suštinski slično vezivanje za FcRn, odnosno očuvanje afiniteta vezivanja imunoglobulinskog molekula prema navedenom receptoru, postiže se kada molekul imunoglobulina pokazuje afiniteta vezivanja veći od oko 70% neizmenjenog oblika molekula imunoglobulina za FcRn. Molekuli imunoglobulina koji se sastoje od fuzionih proteina pronalaska mogu biti veći od oko 80% i čak i veći od oko 90% takvog afiniteta.
U jednom primeru izvođenja, pomenuta modifikacija za smanjivanje afiniteta vezivanja molekula imunoglobulina za Fc receptor je u regionu Fc, posebno regionu CH2 molekula imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, pomenuti molekul imunoglobulina sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 329 (EU numeracija) teških lanaca imunoglobulina. U konkretnijem primeru izvođenja, pomenuta zamena aminokiselina je na P329A ili P329G, naročito P329G. U jednom primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 234 i 235 (EU numeracija) teških lanaca imunoglobulina. U konkretnom primeru izvođenja, navedene supstitucije aminokiselina su L234A i L235A (LALA). U jednom primeru izvođenja, pomenuti molekul imunoglobulina sadrži supstituciju aminokiselina na poziciji 329 (EU numeracija) teških lanaca antitela i dalju supstituciju aminokiselina na poziciji izabranoj od položaja 228, 233, 234, 235, 297 i 331 teških lanaca imunoglobulina (EU numeracija). U konkretnijem primeru izvođenja, dalja supstitucija aminokiselina je S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S. U posebnom primeru izvođenja, pomenuti imunoglobulin obuhvata aminokiselinske supstitucije na pozicijama P329, L234 i L235 (EU numeracija) teškog lanca imunoglobulina. U sledećem posebnom izvođenju, pomenuti molekul imunoglobulina sadrži aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329G (LALA P329G; EU numeracija) u teškim lancima imunoglobulina. Ova kombinacija aminokiselinskih supstitucija naročito efikasno ukida vezivanje Fcγ receptora na imunoglobulin humane IgG klase, kako je opisano u publikaciji PCT br. WO 2012/130831. PCT publikacija br. WO 2012/130831 takođe opisuje postupke za pripremu takvog modifikovanog imunoglobulina i metode za određivanje njegovih svojstava, kao što su vezivanje Fc receptora ili efektorske funkcije.
Imunoglobulini koji sadrže modifikacije u teškim lancima imunoglobulina mogu se dobiti brisanjem aminokiselina, zamenom, umetanjem ili modifikacijom pomoću genetskih ili hemijskih postupaka dobro poznatih u struci. Genetički postupci mogu obuhvatiti mutagenezu specifičnu za mesto kodiranja DNK sekvence, PCR, sintezu gena i slično. Tačne promene nukleotida mogu se potvrditi, na primer, sekvenciranjem.
Imunoglobulini ili antitela koja sadrže modifikacije koje smanjuju vezivanje Fc receptora uglavnom imaju smanjene efektorske funkcije, naročito smanjene ADCC, u poređenju sa odgovarajućim nemodifikovanim imunoglobulinima ili antitelima. Prema tome, u jednom primeru izvođenja, pomenuta modifikacija koja smanjuje afinitet vezivanja molekula imunoglobulina za Fc receptor smanjuje efektorsku funkciju molekula imunoglobulina. U konkretnom primeru izvođenja, navedena efektorska funkcija je ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC). U jednom primeru izvođenja, ADCC je smanjen na manje od 20% ADCC, izazvanog odgovarajućim molekulom imunoglobulina bez navedene modifikacije. Efektorska funkcija imunoglobulina ili antitela može se meriti postupcima poznatim u struci. Primeri in vitro analiza za procenu aktivnosti ADCC molekula od interesa opisani su u U.S. Patent No. 5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) i Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); U.S. Patent No.5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Alternativno, za testove mogu da se koriste neradioaktivni postupci pogledajte, npr. ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); i CytoTox 96® neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost ispitivanog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj objavljen u Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652–656 (1998). U nekim primerima izvođenja, smanjeno je vezivanje molekula imunoglobulina za komplementarnu komponentu, specifično za C1q. Shodno tome, citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) takođe može biti smanjena. C1q testovi kompetitivnog vezivanja može se sprovesti tako da se odredi da li imunoglobulin ima sposobnost vezivanja za C1q, a samim tim i da li ima CDC aktivnost. Pogledajte, npr. C1q i C3c vezujući ELISA test u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Za procenu komplementne aktivnosti, može se obaviti CDC test (videti, npr. Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045–1052 (2003); i Cragg and Glennie, Blood 103, 2738–2743 (2004)).
Pored opisanih molekula imunoglobulina u ovom dokumentu i onih u PCT izdanju br. WO 2012/130831, Fc domeni sa smanjenim afinitetom vezivanja i/ili smanjenom efektorskom funkcijom uključuju i one sa zamenom jednog ostatka ili više ostataka Fc domena na pozicijama 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. Patent br. 6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa zamenama aminokiselina na dva ili više mesta 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA” Fc mutanta sa zamenom ostataka 265 i 297 u alanin (US Patent br.7,332,581).
IgG4 potklasa imunoglobulina pokazuje smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptore i smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa IgG1 imunoglobulinima. Dakle, u nekim primerima izvođenja, pomenuti molekul imunoglobulina sadržan u fuzijskom proteinu pronalaska je IgG4 -potklasa imunoglobulina, posebno humane IgG4 potklase imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, pomenuti imunoglobulin IgG4 potklase sadrži aminokiselinske supstitucije u Fc regionu na poziciji S228 (EU numeracija), konkretno supstituciju aminokiseline S228P. Da bi se dodatno smanjio afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili njegovu efektorsku funkciju, u jednom izvođenju, pomenuti imunoglobulin IgG 4 potklasa sadrži aminokiselinsku supstituciju na položaju L235, posebno aminokiselinsku supstituciju L235E (EU numeracija). U sledećem primeru izvođenja, pomenuti imunoglobulin IgG 4 potklasa sadrži aminokiselinsku supstituciju na položaju P329, konkretno supstituciju aminokiselina P329G (EU numeracija). U posebnom primeru izvođenja, pomenuti imunoglobulin potklase IgG 4 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama S228, L235 i P329, konkretno supstitucije aminokiselina S228P, L235E i P329G (EU numeracija). Takvi modifikovani imunoglobulini potklase IgG 4 i njihova svojstva vezivanja Fcγ receptora opisani su u publikaciji PCT br. WO 2012/130831.
U jednom primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina je sposoban za specifično vezivanje za antigen. U jednom primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina je monoklonsko antitelo. U jednom primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina nije sposoban za specifično vezivanje antigena, naročito nije sposoban za specifično vezivanje za humani antigen. Odsustvo specifičnog vezivanja takvog molekula imunoglobulina sa antigenom (tj. odsustvo bilo kakvog vezivanja koje može biti diskriminisano od nespecifične interakcije) može se odrediti npr. ELISA ili površinskom plazmonskom rezonancom kako je ovde opisano. Takav molekul imunoglobulina je naročito koristan, npr. za poboljšanje poluživota seruma fuzionog proteina, gde ciljanje na određeno tkivo nije poželjno.
U jednom primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca na bazi humanog Vh3-23 germinativne sekvence. U konkretnom primeru izvođenja, pomenuti molekul imunoglobulina sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 9. U jednom primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca zasnovanu na humanoj germinativnoj sekvenci Vk3-20 čoveka. U konkretnom primeru izvođenja, pomenuti molekul imunoglobulina sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 11. U još konkretnijem primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 9 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 11. Molekuli imunoglobulina koji sadrže ove sekvence varijabilnog regiona nisu sposobni za specifično vezivanje za antigen, posebno humani antigen. Oni nemaju sposobnost vezivanja za normalna tkiva, kao i za PBMC, nemaju polireaktivnost i ne pokazuju nespecifičnu akumulaciju in vivo snimanjem (podaci nisu prikazani). Sekvence varijabilnog regiona su u potpunosti zasnovane na humanim sekvencama germinativnih linija, sa izuzetkom CDR 3 teškog lanca pri čemu je uvedena GSG sekvenca za generiranje neobavezujućeg imunoglobulina.
U jednom primeru izvođenja, pomenuti mutanti IL-2 molekula sadrže mutaciju aminokiselina na poziciji koja odgovara ostatku 88 humanog IL-2 (SEQ ID NO: 1); pomenuta aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiselina; i pomenuta supstitucija aminokiselina je N88D. U jednom primeru izvođenja, navedeni mutantni IL-2 molekuli su humani IL-2 molekuli. U jednom primeru izvođenja, pomenuti mutanti IL-2 molekula sadrže samo jednu aminokiselinsku mutaciju koja smanjuje afinitet mutiranog IL-2 molekula na IL-2 receptor intermedijarnog afiniteta, u poređenju sa molekulom IL-2 divljeg tipa. U jednom primeru izvođenja, pomenuti mutanti IL-2 molekula ne sadrže mutaciju aminokiselina koja menja afinitet mutiranog IL-2 molekula na receptor visokog afiniteta IL-2 u poređenju sa molekulom IL-2 divljeg tipa. U jednom primeru izvođenja, pomenuti mutanti IL-2 molekula sadrže samo jednu aminokiselinsku mutaciju koja menja afinitet mutiranog IL-2 molekula za IL-2 receptor, u poređenju sa molekulom IL-2 divljeg tipa.
U jednom primeru izvođenja, pomenuti mutirani IL-2 molekuli dalje obuhvataju supstituciju aminokiselina na poziciji koja odgovara ostatku 125 humanog IL-2; pomenuta supstitucija aminokiselina je C125A.
Mutantni molekuli IL-2 sadržani u fuzionom proteinu iz ovog pronalaska mogu takođe biti ne-glikozilovani molekuli IL-2. Na primer, eliminacija lokacije O-glikozilacije dovodi do homogenijeg proizvoda kada je fuzirani protein eksprimiran u ćelijama sisara kao što su CHO ili HEK ćelije. Prema tome, u određenim primerima izvođenja, mutantni IL-2 molekuli dalje obuhvataju modifikaciju koja eliminiše mesto O-glikozilacije IL-2 na poziciji koja odgovara ostatku 3 humanog IL-2; pomenuta modifikacija koja eliminiše mesto O-glikozilacije IL-2 na poziciji koja odgovara ostatku 3 humanog IL-2 je aminokiselinska supstitucija; i pomenuta supstitucija aminokiselina je T3A.
U posebnom primeru izvođenja, mutantni IL-2 molekuli sadrže aminokiselinske supstitucije T3A, N88D i C125A. U konkretnom primeru izvođenja, pomenuti mutantni IL-2 molekuli sadrže sekvencu SEQ ID NO: 58 (IL-2 T3A N88D C125A).
U jednom primeru izvođenja, vezivanje fuzionog proteina prema pronalasku za IL-2 βγ receptor je najmanje 1,5 puta, poželjno najmanje 2 puta ili najmanje 3 puta smanjeno u poređenju sa vezivanjem odgovarajućeg fuzionog proteina koji sadrži dva molekula IL-2 divljeg tipa za IL-2 βγ receptor. U jednom primeru izvođenja, fuzioni protein pronalaska se vezuje za receptor IL-2 βγ sa afinitetnom konstantom (KD) najmanje 2 puta većom od KD odgovarajućeg fuzionog proteina koji sadrži dva IL-2 molekula divljeg tipa, kada se meri SPR na 25° C. U konkretnom primeru izvođenja, navedeni receptor IL-2 βγ je humani IL-2βγ receptor. U jednom primeru izvođenja, vezivanje fuzionog proteina prema pronalasku za IL-2 α receptor je približno jednako vezivanju odgovarajućeg fuzionog proteina koji sadrži dva IL-2 molekula diveg tipa za IL-2 α receptor. U jednom primeru izvođenja, fuzioni protein pronalaska se vezuje za receptor IL-2 α sa afinitetnom konstantom (KD) jednakoj KD odgovarajućeg fuzionog proteina koji sadrži dva IL-2 molekula divljeg tipa, kada se meri pomoću SPR na 25° C. U konkretnom primeru izvođenja, navedeni receptor IL-2 α je humani IL-2α receptor. Ovde je opisan postupak za merenje afiniteta vezivanja za IL-2 βγ ili IL-2 α receptor pomoću SPR. Prema jednom izvođenju, afinitet vezivanja (KD) se meri površinskom plazmonskom rezonancom pomoću mašine BIACORE® T200 (GE Healthcare) na 25° C sa IL-2 receptorima koji su imobilisani na CM5 ili Streptavidin čipovima. Afinitetna konstanta disocijacije (KD) je izračunata kao odnos koff/kon. Videti, npr. Chen et al. J. Mol. Biol.
293:865-881 (1999).
U posebnom aspektu, pronalazak obezbeđuje fuzioni protein koji sadrži (i) molekul imunoglobulina potklase IgG 1, koji sadrži aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329G (EU numeracija) u teškim lancima imunoglobulina, i (ii) dva mutantna interleukin- 2 (IL-2) koji sadrže aminokiselinsku supstituciju N88D, svaki spojen na N-terminalnoj aminokiselini za C-terminalnu aminokiselinu jednog od teških lanaca imunoglobulina putem peptidnog linkera. U jednom primeru izvođenja, pomenuti molekul imunoglobulina i navedeni molekuli IL-2 su humani. U konkretnom primeru izvođenja, navedeni molekul imunoglobulina sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 9 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 11. U sledećem konkretnom primeru izvođenja, svaki od pomenutih IL-2 molekula sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 58. U sledećem primeru izvođenja, pomenuti peptidni linker sadrži sekvencu aminokiselina (G 4 S) 3 (SEQ ID NO: 66). U još konkretnijem primeru izvođenja,navedeni fuzioni protein sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100 % identične sekvenci SEQ ID NO: 50, i polipetidna sekvenca koji je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 19.
Kao što je prikazano u Primerima, fuzioni protein iz pronalaska selektivno aktivira regulatorne T ćelije (tj. u suštini bez istovremene aktivacije drugih T ćelijskih podloga i/ili ćelija prirodnog ubica (NK)). Prema tome, u jednom aspektu pronalazak obezbeđuje fuzioni protein koji sadrži molekul imunoglobulina i dva mutanta IL-2 molekula, pri čemu navedeni fuzioni protein selektivno aktivira regulatorne T ćelije preko efektorskih T ćelija i NK ćelija, posebno preko konvencionalnih CD4+ T ćelija, CD8+ T ćelije i NK ćelije. U jednom primeru izvođenja, navedeni fuzioni protein aktivira regulatorne T ćelije najmanje 10 puta, najmanje 100 puta ili najmanje 1000 puta više od efektorskih T ćelija i NK ćelija. U jednom primeru izvođenja, navedeni fuzioni protein selektivno aktivira regulatorne T ćelije preko konvencionalnih CD4+memorijskih T ćelija. U jednom primeru izvođenja, navedeni fuzioni protein aktivira regulatorne T ćelije najmanje 10 puta, najmanje 100 puta ili najmanje 1000 puta više od konvencionalnih CD4+memorijskih T ćelija. U jednom primeru izvođenja, navedena aktivacija se određuje merenjem intracelularnog STAT, posebno STAT5, nivoa fosforilacije. U jednom primeru izvođenja, pomenuto merenje intracelularnih nivoa fosforilacije STAT se vrši protočnom citometrijskom analizom. U jednom primeru izvođenja, vrednost EC 50 pomenutog fuzionog proteina za indukciju signala IL-2 receptora u regulatornim T ćelijama je najmanje 10 puta, najmanje 100 puta ili najmanje 1000 puta niža od njegove EC 50 vrednosti za indukciju IL-2 receptora koji signalizira efektorne T ćelije i NK ćelije. U jednom primeru izvođenja pomenuta indukcija signala IL-2 je indukcija STAT fosforilacije. U jednom primeru izvođenja, vrednost EC 50 pomenutog fuzionog proteina za indukciju signala IL-2 receptora u regulatornim T ćelijama je najmanje 10 puta, najmanje 100 puta ili najmanje 1000 puta niža od njegove EC 50 vrednosti za indukciju signala IL-2 receptora u konvencionalne CD4+ memorijske T ćelije. U jednom aspektu pomenuta indukcija IL-2 receptorske signalizacije je indukcija STAT fosforilacije.
U daljem aspektu, pronalazak posebno obezbeđuje fuzioni protein za upotrebu u selektivnoj aktivaciji regulatornih T ćelija in vitro. U jednom primeru izvođenja, pomenuta upotreba sadrži kontaktiranje regulatornih T ćelija sa navedenim fuzionim proteinom in vitro. U jednom primeru izvođenja, pomenuta upotreba dalje sadrži kontaktiranje drugih (neregulativnih) T ćelija sa navedenim fuzionim proteinom. U jednom primeru izvođenja, pomenuta upotreba je in vitro i navedeni fuzioni protein se koristi u koncentraciji od oko 10 ng/mL ili manje, posebno oko 1 ng/mL ili manje.
Pronalazak takođe daje postupak selektivne aktivacije regulatornih T ćelija in vitro, koji obuhvata kontaktiranje pomenutih regulatornih T ćelija sa fuzionim proteinom iz pronalaska. U jednom primeru izvođenja, navedeni postupak dalje sadrži kontaktiranje drugih (neregulativnih) T ćelija sa navedenim fuzionim proteinom. U jednom primeru izvođenja, pomenuta aktivacija obuhvata indukciju proliferacije i/ili indukciju signalizacije IL-2 receptora. U jednom primeru izvođenja, navedeni postupak je in vitro i navedeni fuzioni protein se koristi u koncentraciji od oko 10 ng/mL ili manje, posebno oko 1 ng/mL ili manje.
Prema određenim primerima izvođenja fuzionog proteina, upotreba ili postupak opisan u prethodnim paragrafima, pomenuta aktivacija obuhvata indukciju proliferacije regulatornih T ćelija i/ili indukciju signalizacije IL-2 receptora u regulatornim T ćelijama. Indukcija proliferacije može se meriti npr. detekcijom intracelularnog markera proliferacije Ki-67, kako je opisano u Primerima. U jednom primeru izvođenja, proliferacija regulatornih T ćelija aktiviranih fuzionim proteinom iz pronalaska se povećava najmanje oko 1,5 puta, najmanje oko 2 puta, ili bar oko 3 puta, u poređenju sa proliferacijom neaktiviranih regulatornih T ćelija. U jednom primeru izvođenja, proliferacija drugih (neregulativnih) T ćelija i/ili NK ćelija kontaktiranih sa fuzionim proteinom pronalaska povećava se manje od oko 1,5 puta, manje od oko 1,2 puta ili manje od oko 1,1 puta u poređenju sa na proliferaciju odgovarajućih ćelija koje nisu kontaktirane sa navedenim fuzionim proteinima. Indukcija signalizacije IL-2 receptora može se meriti npr. detekcijom fosforilisane STAT5, kako je opisano u Primerima. U jednom primeru izvođenja, signalizacija IL-2 receptora u regulatornim T ćelijama aktivirana fuzionim proteinom iz pronalaska povećava se najmanje oko 1,5 puta, barem oko 2 puta, najmanje oko 3 puta ili najmanje oko 5 puta, u poređenju sa signalizacijom IL-2 receptora u neaktiviranim regulatornim T ćelijama. U jednom primeru izvođenja, signalizacija IL-2 receptora u drugim (neregulativnim) T ćelijama i/ili NK ćelijama kontaktiranih sa fuzionim proteinom ili pronalaskom je povećana manje od oko 1,5 puta ili manje od oko 1,2 puta ili manje od oko 1,1 puta, u poređenju sa signalizacijom IL-2 receptora u odgovarajućim ćelijama koje nisu kontaktirane sa navedenim fuzionim proteinom.
Polinukleotidi
Pronalazak dalje daje polinukleotide koji kodiraju fuziju kako je ovde opisano.
Polinukleotidi pronalaska uključuju one koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sekvencama navedenim u SEQ ID NOs 10, 12, 20, 51 i 59, uključujući funkcionalne fragmente ili njihove varijante.
Polinukleotidi koji kodiraju fuzione proteine predmetnog pronalaska mogu biti eksprimirani kao pojedinačni polinukleotid koji kodira celokupni fuzioni protein ili kao višestruki (npr. dva ili više) polinukleotida koji su koeksprimovani. Polipeptidi kodirani polinukleotidima koji su koeksprimovani mogu se povezati putem, na primer, disulfidnih veza ili drugih sredstava za stvaranje funkcionalnog fuzionog proteina. Na primer, deo lakog lanca imunoglobulina može biti kodiran zasebnim polinukleotidom iz dela teškog lanca imunoglobulina. Kad su koeksprimovani, teški lanac polipeptida će se povezati sa lakim lancem polipeptida kako bi formirali imunoglobulin.
U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak je usmeren na polinukleotid koji kodira fuzioni protein molekula imunoglobulina i dva IL-2 molekula, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO 9 ili 11. U još jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak je usmeren na polinukleotid koji kodira fuzioni protein molekula imunoglobulina i dva molekula IL-2, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO 19 ili 50. U još jednom primeru izvođenja, pronalazak je dalje usmeren na polinukleotid koji kodira fuzioni protein molekula imunoglobulina i dva IL-2 molekula, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95% 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci nukleinske kiseline prikazanoj u SEQ ID NO 10, 12, 20, 51 ili 59. U još jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na polinukleotid koji kodira fuzioni protein molekula imunoglobulina i dva molekula IL-2, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline prikazane u SEQ ID NO 10, 12, 20, 51 ili 59. U još jednom primeru izvođenja, pronalazak je usmeren na polinukleotid koji kodira fuzioni protein molekula imunoglobulina i dva IL-2 molekula, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona koja je najmanje oko 80%, 85%, 90 %, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO 9 ili 11. U još jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na polinukleotid koji kodira fuzioni protein molekula imunoglobulina i dva molekula IL-2, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO 19 ili 50. Pronalazak obuhvata polinukleotid koji kodira fuzioni protein molekula imunoglobulina i dva IL-2 molekula, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvence varijabilnog regiona SEQ ID NO 9 ili 11 konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. Pronalazak takođe obuhvata polinukleotid koji kodira fuzioni protein molekula imunoglobulina i dva IL-2 molekula, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidne sekvence SEQ ID NO 19 ili 50 sa konzervativnim supstitucijama aminokiselina.
U određenim primerima izvođenja, polinukleotid ili nukleinska kiselina jeste DNK. U drugim primerima izvođenja, polinukleotid predmetnog pronalaska je RNK, na primer, u obliku informacione RNK (mRNA). Ovdeopisana RNK može biti jednolančana ili dvolančana.
Postupci rekombinacije
Fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu se dobiti, na primer, sintezom peptida u čvrstom stanju (npr. sinteza na Merifildovoj smoli) ili rekombinantnom proizvodnjom. Za rekombinantnu proizvodnju jednog ili više polinukleotida koji kodiraju fuzioni protein (fragment), npr. kao što je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takav polinukleotid može biti lako izolovan i sekvenciran korišćenjem konvencionalnih procedura. U jednom primeru izvođenja, obezbeđen je eksprimirajući vektor koji sadrži jedan ili više polinukleotida pronalaska. Postupci koji su dobro poznati stručnjacima za ovu oblast mogu se primeniti za konstrukciju ekspresionih vektora koji sadrže kodirajuću sekvencu fuzionog proteina (fragment) uz odgovarajuće signale transkripcione/translacione kontrole. Ti postupci uključuju in vitro tehnike rekombinacije DNK, sintetičke tehnike i in vivo rekombinaciju/genetsku rekombinaciju. Pogledajte na primer, tehnike opisane u Maniatis et al., Molecular Cloning: A L<ABORATORY>M<ANUAL>, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); and Ausubel et al., C<URRENT>P<ROTOCOLS IN>M<OLECULAR>B<IOLOGY>, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). Vektor ekspresije može biti deo plazmida, virusa ili može biti fragment nukleinske kiseline. Vektor ekspresije uključuje ekspresionu kasetu u koju je kloniran polinukleotid koji kodira fuzioni protein (fragment) (tj. kodirajući region) u operabilnoj asocijaciji sa promoterom i/ili drugim elementima kontrole transkripcije ili translacije. U smislu ovog dokumenta, „kodirajući region” je deo nukleinske kiseline koji se sastoji od kodona transliranih u aminokiseline. Iako „stop kodon” (TAG, TGA ili TAA) nije transliran u aminokiselinu, može se smatrati delom kodirajućeg regiona, ako je prisutan, ali sve ostale granične sekvence, kao što su promoteri, mesta vezivanja ribozoma, terminatori transkripcije, introni, 5' i 3' netranslirani regioni i slično, nisu deo kodirajućeg regiona. Dva kodirajuća ili više kodirajućih regiona mogu da se nalaze u jednom konstruktu polinukleotida, npr. u jednom vektoru ili u odvojenim konstruktima polinukleotida, npr. na odvojenim (različitim) vektorima. Štaviše, svaki vektor može da sadrži jedan kodirajući region ili može da sadrži dva kodirajuća ili više kodirajućih regiona, npr. vektor predmetnog pronalaska može da kodira jedan polipeptid ili više polipeptida, koji su posttranslaciono ili kotranslaciono razdvojeni u krajnje proteine putem proteolitičkog sečenja. Pored toga, vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina predmetnog pronalska mogu kodirati heterologne kodirajuće regione sjedinjene ili nesjedinjene sa polinukleotidima koji kodiraju fuzioni protein (fragment) predmetnog pronalaska, njegovu varijantu ili derivat. Heterologni kodirajući regioni uključuju, bez ograničenja, specijalizovane elemente ili motive, kao što su sekretorni signalni peptid ili heterologni funkcionalni domen. Funkcionalna asocijacija se odvija kada se kodirajući region genskog proizvoda, npr. polipeptida, poveže sa jednom regulatornom sekvencom ili više regulatornih sekvenci tako da postavi ekspresiju genskog proizvoda pod uticaj ili kontrolu regulatorne sekvence (regulatornih sekvenci). Dva DNK fragmenta (kao što je kodirajući region polipeptida i asocirani promoter) „funkcionalno su asocirani” ukoliko indukcija promoterske funkcije izaziva transkripciju mRNK koja kodira željeni genski proizvod i ako priroda veze između dva DNK fragmenta ne utiče na sposobnost ekspresije regulatornih sekvenci za usmeravanje ekspresije genskog proizvoda ili na sposobnost transkripcije DNK obrasca. Stoga, region promotera bi se funkcionalno asocirao sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid ako je promoter sposoban za sprovođenje transkripcije te nukleinske kiseline. Promoter može da bude promoter određen ćelijom koji usmerava značajnu transkripciju DNK samo u predodređenim ćelijama. Drugi elementi koji kontrolišu transkripciju, pored promotera, na primer pojačivači, operatori, represori i signali okončanja transkripcije, mogu se funkcionalno asocirati sa polinukleotidom radi usmeravanja transkripcije specifične za određene ćelije. Ovde su opisani odgovarajući promoteri i drugi regioni koji kontrolišu transkripciju. Veliki broj regiona koji kontrolišu transkripciju poznat je stručnjacima za ovu oblast. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, regione koji kontrolišu transkripciju, a funkcionišu u ćelijama kičmenjaka, kao što su, bez ograničenja, segmenti za promociju i pojačavanje iz citomegalovirusa (npr. momentalni rani promoter u konjukciji sa intron-A), virusa 40 viših primata (npr. rani promoter) i retrovirusa (kao što je, npr: Raus sarkoma virus). Drugi regioni koji kontrolišu transkripciju obuhvataju one dobijene iz gena kičmenjaka, kao što su aktin, protein toplotnog stresa, hormon rasta goveda i â-globin zeca, kao i druge sekvence sposobne za kontrolu ekspresije gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni odgovarajući regioni koji kontrolišu transkripciju uključuju promotere specifične za tkivo i pojačivače, kao i inducibilne promotere (npr. inducibilni promoter tetraciklina). Slično tome, veliki broj elemenata koji kontrolišu translaciju poznat je stručnjacima za ovu oblast. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, mesta vezivanja ribozoma, kodone početka i kraja translacije i elemente dobijene iz viralnih sistema (naročito unutrašnje ribozomalno ulazno mesto ili IRES, poznato i kao CITE sekvenca). Transporter ekspresije može da sadrži i druge karakteristike kao što je mesto početka replikacije i/ili elemente integracije hromozoma, kao što su duga terminalna ponavljanja retrovirusa (LTR) ili invertovana terminalna ponavljanja (ITR) adenoasociranih virusa (AAV).
Kodirajući regioni polinukleotida i nukleinske kiseline predmetnog pronalaska mogu biti asocirani sa dodatnim kodirajućim regionima koji kodiraju sekretorne ili signalne peptide, što usmerava sekreciju polipetida kodiranog polinukleotidom predmetnog pronalaska. Na primer, ako je poželjna sekrecija fuzije, DNK koja kodira signalnu sekvencu može se postaviti uzvodno od nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein predmetnog pronalaska. U skladu sa hipotezom signala, proteini koji se luče putem ćelija sisara imaju signalni peptid ili sekretornu vodeću sekvencu koja je isečena iz zrelog proteina nakon što je započet izvoz lanca proteina rasta širom endoplazmatičnog retikuluma. Osobe sa uobičajenim znanjem u struci svesne su da polipeptidi izlučeni iz ćelija kičmenjaka obično imaju signalni peptid sjedinjen za N-kraj polipeptida, koji je isečen iz transliranog polipeptida radi proizvodnje sekretornog ili „zrelog” oblika peptida. U određenim primerima izvođenja, koristi se nativni signalni peptid, npr. teški lanac imunoglobulina ili laki lanac signalnog peptida ili funkcionalni derivat te sekvenca koji zadržava sposobnost usmeravanja izlučivanja polipeptida s kojim je funkcionalno asociran. Alternativno, može se koristiti heterologni signalni peptid sisara ili njegov funkcionalni derivat. Na primer, nemutirana vodeća sekvenca može se zameniti vodećom sekvencom humanog tkivnog aktivatora plazminogena (TPA) ili β-glukuronidaze miša. Primeri aminokiselinske inukleotidne sekvence sekretornih signalnih peptida prikazane su u SEQ ID NO 39–47.
DNK koja kodira kratku sekvencu proteina koja bi se mogla koristiti za olakšanje kasnijeg prečišćavanja (npr. histidinski rep) ili kao pomoć u obeležavanju fuzionog proteina može biti uključena unutar ili na krajevima fuzionog proteina (fragmenta) kodiranih polinukleotidom.
U sledećem primeru izvođenja, obezbeđena je ovdeopisana ćelija domaćin koja sadrži jedan takav polinukleotid ili više njih. U određenim primerima izvođenja, obezbeđena je ovdeopisana ćelija domaćin koja sadrži jedan takav vektor ili više njih. Polinukleotidi i vektori mogu da sadrže bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je ovde opisano u vezi sa polinukleotidima i vektorima, datim redom. U jednom konkretnom izvođenju takvog primera, ćelija domaćin sadrži (npr. prethodno je transformirana ili transfektovana) vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira (deo) fuzionog proteina predmetnog pronalaska. Kao što je korišćen ovde, termin „ćelija domaćin” odnosi se na bilo koji ćelijski sistem koji može biti projektovan da proizvodi fuzione proteina predmetnog pronalaska ili njihove fragmente. Ćelije domaćini koje imaju sposobnost replikacije i podržavanja ekspresije fuzionih proteina dobro su poznate u struci. Takve ćelije mogu da budu transfektovane ili transdukovane u skladu sa određenim vektorom ekspresije, a velike količine ćelija koje sadrže vektore mogu se uzgajati za rasejavanje velike količine fermentera za dobijanje dovoljnih količina fuzionog proteina za kliničku primenu. Odgovarajuće ćelije domaćini sadrže prokariotske mikroorganizme, kao što je E. coli ili različite eukariotske ćelije, kao što su jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), ćelije insekata i slično. Na primer, polipeptidi se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija. Nakon ekspresije, polipeptid može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, a može i dalje da se prečišćava. Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju polipeptid, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani”, što dovodi do proizvodnje polipeptida sa delimično ili potpuno humanim glikozilacionim obrascem. Videti Gerngross, Nat Biotech 22, 1409–1414 (2004) i Li et al., Nat Biotech 24, 210–215 (2006). Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju (glikozilovanih) polipeptida, isto tako, izvedene su od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda. Kulture biljnih ćelija se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Videti, npr. US Patent br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama). Ćelije kičmenjaka se, isto tako, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Drugi primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara predstavljaju CV1 linije iz bubrega majmuna transformirane pomoću SV40 (COS-7); humane embrionske linije iz bubrega (ćelije 293 ili 293T, kao što je opisano u npr. Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), sertoli ćelije miša (TM4 ćelije kao što je opisano u npr. Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), humane ćelije cervikalnog karcinoma (HELA), ćelije bubrega psa (MDCK), ćelije jetre bufalo pacova (BRL 3A), humane ćelije pluća (W138), humane ćelije jetre (Hep G2), tumorske ćelije mlečne žlezde miša (MMT 060562), TRI ćelije (kao što je opisano u npr. Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383:44-68 (1982)); MRC 5 ćelije i FS4 ćelije. Druge primere upotrebe ćelijskih linija domaćina sisara predstavljaju jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), uključujući dihidropteroate reduktaze CHO ćelije (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, kao što su: YO, NS0, P3X63 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju proteina, videti, npr., Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ), str. 255-268 (2003). Ćelije domaćini obuhvataju gajene ćelije, između ostalog, gajene ćelije sisara, ćelije kvasca, ćelije insekata, bakterijske ćelije i biljne ćelije, ali i ćelije sačinjene od transgenih životinja, transgenih biljaka ili gajenog biljnog ili životinjskog tkiva. U jednom primeru izvođenja, ćelija domaćin je eukariotska ćelija, poželjno ćelija sisara, kao što je jajna ćelija kineskog hrčka (CHO), humana embrionska ćelija bubrega (HEK) ili limfna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija). U struci su poznate standardne tehnologije za ekspresiju stranih gena u ovim sistemima. Ćelije koje eksprimiraju polipeptide sa teškim ili lakim lancem imunoglobulina, mogu se projektovati tako da takođe eksprimiraju druge lance imunoglobulina na takav način da je eksprimirani proizvod imunoglobulin koji poseduje teški i laki lanac.
U jednom primeru izvođenja, obezbeđen je postupak za proizvodnju fuzionog proteina u skladu s predmetnim pronalaskom, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelija domaćina koja sadrži polinukleotid koji kodira fuzioni protein, u skladu sa ovim dokumentom, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju fuzionog proteina i dobijanje fuzionog proteina iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelije domaćina).
U fuzionim proteinima pronalaska, komponente (imunoglobulinski molekul i IL-2 molekul) genetski su spojene jedna za drugu. Fuzioni proteini mogu se kreirati tako da njegove komponente budu direktno sjedinjene jedna za drugu ili indirektno pomoću sekvence linkera . Kompozicija i dužina linkera može se odrediti u skladu sa postupcima dobro poznatim u struci i njihova se efikasnost može ispitati. Dodatne sekvence mogu se takođe uključiti radi pripajanja mesta sečenja za odvajanje pojedinačnih komponenti fuzionog proteina, ako je potrebno, na primer sekvencu prepoznavanja endopeptidaze.
U određenim primerima izvođenja, fuzioni proteini predmetnog pronalaska sadrže najmanje varijabilni region imunoglobulina sposoban za vezivanje za antigen. Varijabilni regioni mogu da formiraju deo ili da budu derivati antitela koja se nalaze ili ne nalaze u prirodi ili njihovi fragmenti. Postupci proizvodnje poliklonskih antitela i monoklonskih antitela dobro su poznati u struci (videti, npr. Harlow and Fane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Antitela koja se nalaze u prirodi mogu se izgraditi pomoću sinteze peptida na čvrstoj podlozi, mogu se proizvesti rekombinacijom (npr. kao što je opisano u U.S. patent br.
4,186,567) ili se mogu dobiti, na primer, skriningom kombinatornih kolekcija koje sadrže varijabilne teške i lake lance (videti, npr. U.S. Patent. br.5,969,108 McCafferty).
Bilo koja vrsta životinjskog imunoglobulina može se koristiti u pronalasku. Neograničavajući imunoglobulini koji su korisni u predmetnom pronalasku mogu biti murinskog, primatskog ili humanog porekla. Ako je fuzioni protein namenjen ljudskoj upotrebi, himerski oblik imunoglobulina može da se koristi pri čemu su konstantni regioni imunoglobulina humani. Humanizovani ili potpuno humani oblik imunoglobulina takođe se može dobiti u skladu sa postupcima dobro poznatim u struci (videti, npr. U.S. Patent br. 5,565,332 to Winter). Humanizacija se može postići različitim postupcima uključujući, bez ograničenja, (a) graftovanje samo nehumanih (npr. donorskih antitela) CDR na humani (npr. antitelo primalac) okvir i konstantne regione sa zadržavanjem ili bez zadržavanja kritičnih ostataka okvira (npr. onih koji su važni za održavanje dobrog afiniteta za vezivanje antigena ili funkcija antitela), (b) graftovanje samo nehumanih regiona koji određuju specifičnost (SDR ili α-CDR; ostaci kritični za interakciju antitelo-antigen) na humani okvir i konstantne regione ili (c) transplantacija čitavih nehumanih varijabilnih domena, koji se „prekrivaju” sekcijom nalik na humanu tako što se zamenjuju površinski ostaci. Humanizovana antitela i postupci njihovog dobijanja razmotreni su u, npr. Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), a dodatno su opisani u, npr. Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); US Patent br.5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 i 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (opis SDR (a-CDR) graftovanja); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (opis „vraćanja na površinu”); Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (opis „FR mešanja”); i Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) i Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (opis pristupa „usmerene selekcije” FR mešanju). Posebni imunoglobulini prema pronalasku su humani imunoglobulini. Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu se dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela načelno su opisana u van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) and Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Humani varijabilni regioni mogu da formiraju deo ili da budu derivati humanih monoklonskih antitela dobijenih tehnologijom hibridoma (videti, npr. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51–63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu se dobiti i primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigen (videti, npr. Lonberg, Nat Biotech 23, 1117–1125 (2005). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu se generisati izolovanjem sekvenci varijabilnog regiona Fv klona izabranih iz kolekcija humanizovanih faga (videti, npr., Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1–37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); and McCafferty et al., Nature 348, 552– 554; Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991)). Fagi tipično prikazuju fragmente antitela, kao jednolančanih Fv (scFv) fragmenata ili kao Fab fragmenata.
U određenim primerima izvođenja, imunoglobulini sadržani u fuzionim proteinima predmetnog pronalaska projektovani su tako da imaju poboljšan afinitet vezivanja prema, na primer, postupcima objavljenim u publikaciji PCT br. WO 2012/020006 (videti primere koji se odnose na afinitetno sazrevanje) ili US Pat. Appl. Publ. 2004/0132066. Sposobnost fuzionih proteina predmetnog pronalaska da se veže za specifičnu antigensku determinantu može se meriti pomoću enzimskog imunosorbent testa (ELISA) ili drugih tehnika poznatih u struci, npr. tehnika površinske plazmonske rezonance (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) i tradicionalni test vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Kompetitivni testovi se mogu koristiti za identifikovanje antitela koje se takmiči sa referentnim antitelom u pogledu vezivanja za određeni antigen. U određenim primerima izvođenja, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezalo referentno antitelo. Detaljni primeri postupaka za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo dati su u: Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” u Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). U primeru kompetitivnog testa, imobilizovani antigen je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za antigen i drugo neobeleženo antitelo, čija se sposobnost takmičenja sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za antigen ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani antigen je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije pod uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za antigen, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen u test-uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za antigen. Videti Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual gl.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Fuzioni proteini pripremljeni u skladu sa ovdenavedenim uputstvim mogu se pročistiti tehnikama poznatim u struci, kao što su tečna hromatografija visokih performansi, jonska hromatografija, gel elektroforeza, afinitetna hromatografija, hromatografija na molekularnim sitima i slično. Stvarno stanje korišćeno za prečišćavanje određenog proteina delimično će zavisiti od faktora kao što su ukupna naelektrisanost, hidrofobicitet, hidrofilicitet itd. i biće očigledno stručnjacima iz ove oblasti. Za afinitetnu hromatografiju kojom se prečišćava može se koristiti antitelo, ligand, receptor ili antigen za koji se fuzioni protein vezuje. Na primer, za prečišćavanje afinitetnom hromatografijom fuzionih proteina iz predmetnog pronalaska koristi se matrica sa proteinom A ili proteinom G. Afinitetna hromatografija pomoću sekvencijalnog proteina A ili G i hromatografija na molekularnim sitima mogu se koristiti za izolovanje fuzionog proteina onako kao što je opisano u Primerima. Prečišćenost fuzionog proteina može se utvrditi različitim analitičkim metodama poznatim u struci, uključujući gel elektroforezu, tečnu hromatografiju pod visokim pritiskom i slično. Na primer, fuzioni proteini eksprimirani prema opisu u Primerima,, je prikazano da su netaknuti i pravilno povezani kao što je prikazano smanjivanjem i nesmanjivanjem SDS PAGE (videti npr. Sliku 4).
Kompozicije, formulacije i načini primene
U daljem aspektu, pronalazak daje farmaceutskekompozicije koje sadrže bilo koje od ovde datih fuzionih proteina, npr. za upotrebu u bilo kojoj od dolenavedenih terapeutskih postupaka. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija uključuje bilo koji od ovdeopisanih fuzionih proteina i farmaceutski prihvatljiv nosač. U još jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija uključuje bilo koji od ovdeopisanih fuzionih proteina i najmanje jedno dodatno lekovito sredstvo, npr. kao što je dole opisano.
Dalje je dat postupak za proizvodnju fuzionog proteina pronalaska u obliku pogodnom za in vivo primenu, postupak koji obuhvata (a) dobijanje fuzionog proteina prema pronalasku, i (b) formulisanje fuzionog proteina sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, pri čemu je formulisana priprema fuzionog proteina za in vivo administraciju.
Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska sadrže terapeutski efikasnu količinu jednog ili više fuzionih proteina rastvorenih ili disperzovanih u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Fraze „farmaceutski ili farmakološki prihvatljivo” odnose se na molekularne entitete i kompozicije koje su uglavnom netoksične za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama, tj. ne dovode do neželjenih, alergijskih i drugih nepovoljnih reakcija kada se primene na životinjama ili ljudima, po potrebi. Preparat farmaceutske kompozicije koji sadrži barem jedan fuzioni protein i, po potrebi, dodatni aktivni sastojak biće poznat stručnjacima u ovoj oblasti u smislu predmetnog pronalaska, kao što je objašnjeno u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ed. Mack Printing Company, 1990. Pored toga, za primenu na životinjama (npr. ljudima), podrazumevaće se da preparati treba da ispune standarde sterilnosti, pirogenosti, opšte bezbednosti i čistoće u skladu sa zahtevima FDA Kancelarije za biološke standarde ili odgovarajućeg autoriteta u drugim zemljama. Poželjne kompozicije su liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori. U smislu ovog dokumenta, termin „farmaceutski prihvatljivi nosač” podrazumeva sve rastvarače, pufere, disperzione medije, premaze, surfaktante, antioksidante, konzervanse (npr. antibakterijske agense, antifungicidne agense), izotonične agense, agense za odlaganje apsorpcije, soli, konzervanse, antioksidanse, proteine, lekove, stabilizatore lekova, polimere, gelove, veziva, ekscipijente, dezintegratore, lubrikante, zaslađivače, arome, boje, slične materijale i njihove kombinacije, kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti (videti, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, str. 1289-1329. Osim ako se ne ukaže da je neki od konvencionalnih nosača nekompatibilan sa aktivnim sastojkom, njegova upotreba u terapeutskim ili farmaceutskim kompozicijama je razmotrena.
Ova kompozicija može da sadrži različite vrste nosača u zavisnosti od toga da li treba da se primeni u čvrstom, tečnom ili u obliku aerosola i da li je potrebno da budu sterilni za takvu vrstu primene u obliku injekcije. Fuzioni proteini predmetnog pronalaska (i bilo koji dodatni terapeutski agens) se mogu davati bilo kojim postupkom ili bilo kojom kombinacijom postupaka koji bi bili poznati stručnjacima u struci (videti, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ed. Mack Printing Company, 1990). Parenteralna primena, posebno intravenozna injekcija, najčešće se koristi za primenu molekula polipeptida kao što su fuzioni proteini predmetnog pronalaska.
Parenteralne kompozicije uključuje one namenjene primeni putem injekcija, npr. supkutano, intradermalno, intraleziono, intravenski, intraarterijski, intramuskularno, intratekalno ili intraperitonealno ubrizgavanje. Za injekcije, fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu biti formulisani kao vodeni rastvori, poželjno fiziološki kompatibilni puferi, kao što su Henksov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki slani pufer. Rastvor može da sadrži agense za formuliranje, kao što su agensi suspenzije, stabilizacije i/ili disperzije. Umesto toga,fuzioni proteini mogu da budu u obliku praha za mešanje sa odgovarajućim vehikulumu, npr. sterilnom nepirogenom vodom, pre upotrebe. Sterilni rastvori za ubrizgavanje pripremljeni su mešanjem fuzionih proteina predmetnog pronalaska u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvoru sa različitim drugim niženavedenim sastojcima, po potrebi. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Uglavnom, disperzije se pripremaju mešanjem različitih sterilnih aktivnih sastojaka u sterilnom vehikulumu koji sadrži osnovni disperzioni medij i/ili druge sastojke. U slučaju sterilnog praha za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, suspenzija ili emulzija, poželjni postupak primene je vakuumsko sušenje ili suvo zamrzavanje kojima se dobija prah aktivnog sastojka, kao i ostalih poželjnih sastojaka iz prethodno sterilno filtriranog tečnog medija. Tečni medijum treba da bude odgovarajuće puferiran, ako je potrebno, a tečni diluent izotoničan pre ubrizgavanja sa odgovarajućom količinom soli ili glukoze. Kompozicija mora biti stabilna u uslovima proizvodnje i čuvanja, i izolovana od kontaminirajućeg uticaja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Poželjno je da kontaminacija endotoksinom bude svedena na minimalni bezbedni nivo, na primer, manje od 0,5 ng/mg proteina. Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, bez ograničenja: pufere, kao što su fosfatni, citratni i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum-hlorid; heksametonijum-hlorid; benzalkonijum-hlorid, benzetonijum-hlorid; fenol, butil-alkohol ili benzil-alkohol; alkilne parabene, kao što je metilparaben ili propil-paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Vodene suspenzije za injekcije mogu da sadrže jedinjenja koja povećavaju viskoznost suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol, dekstran i slično. Po potrebi, suspenzija može da sadrži i odgovarajuće stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja i omogućavaju pripremu visokokoncentrovanih rastvora. Takođe, suspenzije aktivnih sastojaka mogu se pripremiti u obliku odgovarajućih uljanih suspenzija za injekcije. Odgovarajući lipofilni rastvarači ili vehikuli uključuju masna ulja, kao što su susamovo ulje ili sintetičke estre masnih kiselina, kao što su etil-kleat ili triglideridi ili lipozomi.
Farmaceutske kompozicije koje sadrže fuzione proteine predmetnog pronalaska mogu se proizvesti pomoću konvencionalnih postupaka mešanja, rastvaranja, emulziranja, inkapsuliranja ili liofilizovanja. Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane na konvencionalne načine pomoću jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača, diluenata, ekscipijenata ili dodatnih sredstava koja olakšavaju obradu proteina u preparate koji se mogu koristiti u farmaceutske svrhe. Pravilna formulacija zavisi od izabranog načina primene.
Fuzioni proteini mogu se formulisati u kompoziciju u obliku slobodne kiseline ili baze, u neutralnom obliku ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli su soli koje zadržavaju značajnu biološku aktivnost slobodne kiseline ili baze. U njih spadaju dodaci kiselih soli, npr. onih formiranih sa slobodnim amino grupama proteinske kompozicije ili onih formiranih sa neorganskim kiselinama kao što je, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili organske kiseline poput sirćetne, oksalne, vinske ili mandelinske kiseline. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu se dobiti iz neorganskih baza, kao što su: hidroksidi natrijuma, kalijuma, amonijaka, kalcijuma ili gvožđa, ili organskih baza izopropilamina, trimetilamina, histidina ili prokaina. Farmaceutske soli uglavnom budu rastvorljivije u vodi i drugim protičnim rastvaračima od odgovarajućih oblika slobodnih baza.
Terapeutski postupci i kompozicije
Svaki od ovdeopisanih fuzionih proteina može biti upotrebljen u postupcima lečenja.
Za upotrebu u terapeutskim postupcima, fuzioni proteini predmetnog pronalaska formulišu se, doziraju i primenjuju na način saglasan sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju konkretni poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene i ostale faktore poznate lekarima.
U jednom aspektu, obezbeđeni su fuzioni proteini pronalaska za upotrebu kao lek. U daljim aspektima, obezbeđeni su fuzioni proteini pronalaska za upotrebu u lečenju bolesti. U određenim primerima izvođenja, dati su fuzioni proteini pronalaska za upotrebu u postupku lečenja. U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje fuzioni protein kao što je ovde opisano za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kome to treba. U određenim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje fuzioni protein za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima bolest, obuhvatajući davanje pojedincu efikasne količine fuzionog proteina. U određenim primerima izvođenja, bolest koja se leči je autoimuna bolest. Primeri autoimunih bolesti uključuju dijabetes tipa 1, psorijazu, astmu, reumatoidni artritis, inflamatornu bolest creva, Kronovu bolest, ulcerativni kolitis, sistemski eritematozni lupus (SLE) i multiplu sklerozu. U jednom primeru izvođenja, bolest je odbacivanje transplantata ili hronična reakcija organizma na graft. U određenom izvođenju bolest se bira iz grupe dijabetesa tipa 1, inflamatorne bolesti creva, Kronove bolesti, ulcerativnog kolitisa, SLE i multiple skleroze. U posebnom izvođenju bolest je dijabetes tipa 1. U drugom posebnom primeru izvođenja, bolest je zapaljenska bolest creva. U jdrugom posebnom primeru izvođenja,, bolest je multipla skleroza. U sledećim primerima izvođenja, bolest je astma, plućna fibroza ili opstruktivna plućna bolest. U drugim primerima izvođenja, bolest je kardiovaskularna bolest, naročito ateroskleroza i akutni koronarni sindrom. U sledećim primerima izvođenja, bolest je alergijsko stanje, posebno alergija na hranu. U određenim primerima izvođenja, postupak se dalje sastoji od primene terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa kod pojedinca, npr. imunosupresivnog agensa, ako je lečena bolest autoimuna bolest. Prema svim gorenavedenim primerima izvođenja „pojedinac” je sisar, poželjno čovek.
U dodatnom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu fuzionog proteina predmetnog pronalaska kao što je ovde opisano u proizvodnji ili pripremi leka za lečenje bolesti kod pojedinca kom to treba. U jednom primeru izvođenja, lek je za upotrebu u postupku lečenja bolesti koji uključuje davanje pojedincu koji ima bolest terapeutski efikasne količine leka. U određenim primerima izvođenja, bolest koja se leči je autoimuna bolest. U jednom primeru izvođenja, bolest je odbacivanje transplantata ili hronična reakcija organizma na graft. U određenom izvođenju bolest se bira iz grupe dijabetesa tipa 1, inflamatorne bolesti creva, Kronove bolesti, ulcerativnog kolitisa, SLE i multiple skleroze. U posebnom izvođenju bolest je dijabetes tipa 1. U jednom posebnom primeru izvođenja, bolest je zapaljenska bolest creva. U jednom posebnom primeru izvođenja, bolest je multipla skleroza. U sledećim primerima izvođenja, bolest je astma, plućna fibroza ili opstruktivna plućna bolest. U drugim primerima izvođenja, bolest je kardiovaskularna bolest, naročito ateroskleroza i akutni koronarni sindrom. U sledećem primeru izvođenja, bolest je alergijsko stanje, posebno alergija na hranu. U jednom primeru izvođenja, postupak se dalje sastoji od primene terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa kod pojedinca, npr. imunosupresivnog agensa, ako je lečena bolest autoimuna bolest. Prema svim gorenavedenim primerima izvođenja „pojedinac” može da bude sisar, poželjno čovek.
U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje bolesti kod pojedinca koji obuhvata davanje pomenute pojedinačne terapeutski efikasne količine fuzionog proteina predmetnog pronalaska. U jednom primeru izvođenja, kompozicija se daje pomenutom pojedincu koja sadrži ovdeopisani fuzioni protein predmetnog pronalaska u farmaceutski prihvatljivom obliku. U određenim primerima izvođenja, bolest koja se leči je autoimuna bolest. U jednom primeru izvođenja, bolest je odbacivanje transplantata ili hronična reakcija organizma na graft. U određenom izvođenju bolest se bira iz grupe dijabetesa tipa 1, inflamatorne bolesti creva, Kronove bolesti, ulcerativnog kolitisa, SLE i multiple skleroze. U posebnom izvođenju bolest je dijabetes tipa 1. U jednom posebnom primeru izvođenja, bolest je zapaljenska bolest creva. U drugom posebnom primeru izvođenja, bolest je multipla skleroza. U sledećim primerima izvođenja, bolest je astma, plućna fibroza ili opstruktivna plućna bolest. U sledećim primerima izvođenja, bolest je alergijsko stanje, posebno alergija na hranu. U drugim primerima izvođenja, bolest je kardiovaskularna bolest, naročito ateroskleroza i akutni koronarni sindrom. U određenim primerima izvođenja, postupak se dalje sastoji od primene terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa kod pojedinca, npr. imunosupresivnog agensa, ako je lečena bolest autoimuna bolest. Prema svim gorenavedenim primerima izvođenja „pojedinac” može da bude sisar, poželjno čovek.
U nekim primerima izvođenja, efikasna količina fuzionog proteina pronalaska primenjuje se na ćeliju. U drugim primerima izvođenja, terapeutski efikasna količina fuzionog proteina predmetnog pronalaska se primenjuje na pojedinca radi lečenja bolesti.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza fuzionog proteina predmetnog pronalaska (kada se koristi sam ili u kombinaciji sa jednim terapeutskim agensom ili više drugih dodatnih terapeutskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, načina primene. telesne težine pacijenta, vrste fuzionog proteina, težine i toka bolesti, bilo da se fuzioni protein primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne ili istovremene terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na fuzioni protein i odluke nadležnog lekara. Lekar zadužen za primenu, u svakom slučaju, određuje koncentraciju aktivnih sastojaka u kompoziciji i odgovarajuću dozu (odgovarajuće doze) za svakog ispitanika. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Fuzioni protein se pogodno primenjuje na pacijenta jednokratno ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 μg/kg do 15 mg/kg (npr.0,1 mg/kg – 10 mg/kg) fuzionog proteina je kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, bilo kao, na primer, u vidu jedne ili više odvojenih primena ili u vidu kontinualne infuzije. Jedna tipična dnevna doza može biti u rasponu od oko 1 μg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gorenavedenih faktora. Kod ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će generalno biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza fuzionog proteina navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,005 mg/kg do oko 10 mg/kg. U drugim neograničavajućim primerima, doza može da sadrži i od približno 1 μg/kg telesne težine, približno 5 μg/kg telesne težine, približno 10 μg/kg telesne težine, približno 50 μg/kg telesne težine, približno 100 μg/kg telesne težine, približno 200 μg/kg telesne težine, približno 350 μg/kg telesne težine, približno 500 μg/kg telesne težine, približno 1 mg/kg telesne težine, približno 5 mg/kg telesne težine, približno 10 mg/kg telesne težine, približno 50 mg/kg telesne težine, približno 100 mg/kg telesne težine, približno 200 mg/kg telesne težine, približno 350 mg/kg telesne težine, približno 500 mg/kg telesne težine, do približno 1000 mg/kg telesne težine ili više po primeni, a svaki raspon se dobija iz toga. U neograničavajućim primerima rasponi dobijeni iz ovdenavedenih brojeva, raspon od približno 5 mg/kg telesne težine do približno 100 mg/kg telesne težine, približno 5 μg/kg telesne težine do približno 500 μg/kg telesne težine, itd. može se primeniti, na osnovu goreopisanih brojeva. Tako, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se dati pacijentu. Takve doze mogu se primenjivati povremeno, npr., svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od približno dve do približno dvadeset ili npr. približno šest doza fuzionog proteina). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.
Ovdeopisani fuzioni proteini predmetnog pronalaska uglavnom se koriste u efikasnim količinama dovoljnim za postizanje nameravanih svrha. Za lečenje ili prevenciju bolesti, fuzioni proteini predmetnog pronalaska ili njegove farmaceutske kompozicije, primenjuju se u terapeutski efikasnim količinama. Određivanja terapeutski efikasne količine poznato je stručnjacima iz ove oblasti, naročito u smislu ovog detaljnog obrazloženja.
U pogledu sistemske administracije, terapeutski efikasna doza se može inicijalno proceniti putem in vitro testova, kao što su testovi kulture ćelija. Doza zatim može biti formulisana prema životinjskom modelu kako bi se dostigao kružni raspon koncentracije koji uključuje IC50, kao što je utvrđeno kulturom ćelija. Takve informacije mogu da se koriste za preciznije utvrđivanje korisnih doza za ljude.
Inicijalne doze mogu se takođe proceniti na osnovu in vivo podataka, npr. životinjskih modela, koristeći tehnike koje su dobro poznate u struci. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu brzo da optimizuju administraciju namenjenu ljudima na osnovu životinjskih podataka.
Doza i interval primene mogu se pojedinačno podesiti kako bi se obezbedili nivoi plazme fuzionih proteina koji su dovoljni za održavanje terapeutskog dejstva. Uobičajena doza primene za pacijente putem injekcija ima raspon od 0,1 mg/kg/dnevno do 50 mg/kg/dnevno, obično od približno 0,5 mg/kg/dnevno do 1 mg/kg/dnevno. Terapeutski efikasni nivoi plazme mogu se dostići primenom višestrukih doza svakog dana. Nivoi u plazmi mogu se meriti, na primer, hromatografijom HPLC.
U slučajevima lokalne primene ili selektivnog unosa, efikasna lokalna koncentracija fuzionog proteina ne mora da bude u vezi sa koncentracijom u plazmi. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da optimizuju terapeutski efikasnu lokalnu dozu bez nepotrebnog eksperimentisanja.
Terapeutski efikasna doza ovdeopisanih fuzionih proteina uglavnom obezbeđuje terapeutske koristi bez izazivanja značajne toksičnosti. Toksičnost i terapeutska efikasnost fuzionog proteina mogu se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskoj kulturi ili eksperimentalnim životinjama. Testovi kulture ćelija i studije na životinjama mogu se koristiti za utvrđivanje LD50 (doza koja je smrtonosna za 50% populacije) i ED50 (doza terapeutski efikasna za 50% populacije). Odnos toksičnih i terapeutskih dejstava doze predstavlja terapeutski indeks, koji se može izraziti kao odnos LD50/ED50. Poželjni su fuzioni proteini koji pokazuju velike terapeutske indekse. U jednom primeru izvođenja, fuzioni protein prema sadašnjem pronalasku pokazuje visok terapeutski indeks. Podaci dobijeni iz testova kulture ćelija i studija na životinjama mogu se koristiti za formulisanje raspona doza pogodnih za ljudsku upotrebu. Poželjno je da se doza nalazi u kružnom rasponu koncentracija koji uključuje ED50 sa malom količinom ili bez toksičnosti. Doza može da varira u okviru raspona u zavisnosti od različitih faktora, npr. primenjeni oblik doze, način primene, stanje ispitanika i slično. Tačnu formulaciju, način primene i dozu može izabrati lekar nakon uvida u stanje pacijenta (videti, npr., Fingl et al., 1975, u: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1).
Lekar zadužen za pacijente koji se leče fuzionim proteinima predmetnog pronalaska zna kada i kako treba da okonča, prekine ili podesi primenu usled toksičnosti, nepravilnog rada organa i slično. S druge strane, lekar zna i da podesi lečenje na viši nivo, ako klinički odgovor nije adekvatan (isključujući toksičnost). Jačina primenjene doze tokom kontrole bolesti menjaće se u skladu sa ozbiljnošću stanja koje se leči, načinom primene i slično. Ozbiljnost bolesti može se, na primer, delimično, oceniti standardnim postupcima prognostičke evaluacije. Takođe, doza i možda učestalost doze će se menjati u zavisnosti od godina, telesne težine i odgovora pojedinačnih pacijenata.
Drugi agensi i tretmani
Fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu se primenjivati u kombinaciji sa jednim agensom ili više agenasa tokom terapije. Na primer, fuzioni protein predmetnog pronalaska može biti primenjen uz barem jedan dodatni terapeutski agens. Termin „terapeutski agens” obuhvata sve agense za lečenje simptoma ili bolesti pojedinca kome treba lečenje. Takvi dodatni terapeutski agensi takođe mogu da sadrže bilo koji aktivni sastojak pogodan za određene indikacije koje se leče, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. U određenim primerima izvođenja, dodatni terapeutski agens je imunosupresivni agens.
Takvi drugi agensi su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine fuzionih proteina koji se koriste, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Fuzioni proteini se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, od oko 1% do 99% doza koje su ovde opisane ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.
Takve kombinovane terapije koje su pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa uključeni u istu kompoziciju ili u različite kompozicije) i odvojenu primenu, što znači da primena fuzionih proteina predmetnog pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili adjuvansa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene.
Proizvodi
U drugom aspektu opisa predmetnog pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje goreopisanih poremećaja. Proizvod sadrži ambalažu i etiketu ili uputstvo u ambalaži, na njoj ili povezano s njom. Pogodna ambalaža uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Ambalaža može biti izrađena od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Ambalaža sadrži smešu koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom smešom efikasna za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje stanja i može da ima priključak za sterilni pristup (na primer, ambalaža može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je fuzioni protein predmetnog pronalaska. Etiketa ili uložak ambalaže ukazuju na to da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvu ambalažu sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži fuzioni protein pronalaska; i (b) drugu ambalažu sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni terapeutski agens. Proizvod iz opisa može dalje da sadrži uputstvo u ambalaži koje ukazuje na to da kompozicije mogu da se koriste za lečenje specifičnog stanja. Umesto toga, ili pored toga, proizvod može dalje da sadrži drugu (ili treću) ambalažu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Primeri
U nastavku su dati primeri postupaka i kompozicija iz pronalaska. Podrazumeva se da mogu biti primenjeni razni druge pronalasci, na osnovu opisa koje su gore dati.
Tehnike rekombinantne DNK
Za manipulaciju DNK korišćeni su standardni postupci kao što je opisano u radu Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Reagensi za molekularnu biologiju su korišćeni prema uputstvu proizvođača. Opšte informacije u vezi sa sekvencama nukleotida lakih i teških lanaca humanog imunoglobulina date su u: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242.
Sekvenciranje DNK
Sekvence DNK su određene pomoću sekvenciranja dvostrukog lanca.
Genska sinteza
Željeni segmenti gena, po potrebi, dobijeni su polimerazom PCR pomoću odgovarajućih obrazaca ili su sintetizovani pomoću uređaja Geneart AG (Regensburg, Nemačka) iz sintetičkih oligonukleotida i PCR produkata automatizovane genske sinteze. U slučajevima kada nije bila dostupna tačna sekvenca gena, prajmeri oligonukleotida su dizajnirani na osnovu sekvenci najbližih homologa i geni su izolovani pomoću RT-PCR iz RNK koja potiče iz odgovarajućeg tkiva. Segmenti gena okruženi restrikcionim mestima sečenja singularne endonukleaze klonirani su u standardne klonirane/sekvencirane vektore. DNK plazmida je prečišćena iz transformisane bakterije i koncentracija je određena UV spektroskopijom. DNK sekvenca supkloniranog genskog fragmenta je potvrđena sekvenciranjem DNK. Segmenti gena su dizajnirani s pogodnim restrikcionim mestima da bi se omogućilo supkloniranje u odgovarajuće ekspresione vektore. Za ekspresiju su svi konstrukti sadržali DNK sekvencu na 5' kraju koja kodira vodeći peptid koji cilja proteine za izlučivanje u eukariotske ćelije. SEQ ID NO 39-47 daju primere vodećih peptida i polinukleotidnih sekvenci koje ih kodiraju.
Priprema IL-2R βγ podjedinice-Fc fuzije i IL-2R α podjedinice Fc fuzije
Za proučavanje afiniteta vezivanja IL-2 receptora, napravljen je alat koji je omogućio ekspresiju heterodimernog IL-2 receptora. Β-podjedinica receptora IL-2 je spojena s Fc molekulom koji je bio projektovan za heterodimerizaciju (Fc (otvor)) (videti SEQ ID NO 21 i 22 (humane), SEQ ID NO 27 i 28 (mišje) i SEQ ID NO 33 i 34 (cinomolgus)) koristeći tehnologiju „čvor u otvor” (Merchant et al., Nat Biotech 16, 677-681 (1998)). Γ-podjedinica IL-2 receptora je zatim spojena sa varijantom Fc (čvor) (vidi SEQ ID NO 23 i 24 (humani), SEQ ID NO 29 i 30 (miš) i SEQ ID NO 35 i 36 (cinomolgus )), koji su heterodimerizovani sa Fc (otvor). Ovaj heterodimerni Fc-fuzioni protein je zatim korišćen kao podloga i za analizu interakcije IL-2/IL-2 receptora. IL-2R α-podjedinica je eksprimirana kao monomerni lanac sa mestom cepanja AcTev i Avi His tag (SEQ ID NO 25 i 26 (humane), SEQ ID NO 31 i 32 (mišje) i SEQ ID NO 37 i 38 ( cinomolgus)). Odgovarajuće IL-2R podjedinice su tranzitivno eksprimirane u HEK EBNA 293 sa serumom za konstrukciju IL-2R βγ podjedinice i bez seruma za konstrukciju α-podjedinica. IL-2R βγ konstrukt podjedinice je prečišćen na proteinu A (GE Healthcare), nakon čega je sledila hromatografija na molekularnim sitima (GE Healthcare, Superdex 200). IL-2R α-podjedinica je prečišćena preko His tag na koloni NiNTA (Qiagen) praćeno hromatografijom na molekularnim sitima (GE Healthcare, Superdex 75). Aminokiselina i odgovarajuće nukleotidne sekvence različitih receptorskih konstrukcija dati su u SEQ ID NO 21-38.
Priprema fuzionih proteina
DNK sekvence su generisane sintezom gena i/ili tehnikama klasične molekularne biologije i supklonirane u ekspresione vektore sisara pod kontrolom MPSV promotera i uzvodno od sintetičke polyA lokacije, a svaki vektor nosi EBV OriP sekvencu. Fuzioni proteini, kao što se primenjuju u dolenavedenim primerima, proizvedeni su kotransfekcijom eksponencijalno uzgajanih HEK293-EBNA ćelija sa vektorima ekspresije sisara koristeći transfekciju kalcijumfosfata. Alternativno, HEK293 ćelije uzgajane u suspenziji transfektovane su sa odgovarajućim ekspresionim vektorima pomoću polietileniminam (PEI). Alternativno, stabilno transfektovani bazeni CHO ćelija ili klonovi CHO ćelija korišćeni su za proizvodnju u medijumima bez seruma. Posle toga, fuzioni proteini su prečišćeni od supernatanta. Ukratko, fuzioni proteini su prečišćeni jednim afinitetnim korakom sa proteinom A (HiTrap ProtA, GE Healthcare) uravnoteženom u 20 mM natrijum-fosfata, 20 mM natrijum-citrata pH 7,5. Nakon punjenja supernatanta, kolona je prvo isprana sa 20 mM natrijum-fosfata, 20 mM natrijum-citrata, pH 7,5, a zatim isprana s 13,3 mM natrijum-fosfata, 20 mM natrijum-citrata, 500 mM natrijum-hlorida, pH 5,45. Fuzijski protein citokina je eluiran sa 20 mM natrijum-citratom, 100 mM natrijum-hloridom, 100 mM glicinom, pH 3 ili 10 mM natrijum-citratom pH 3. Frakcije su neutralizovane sa 0,5 M Na2HPO4 pH 8,0 (1:10), objedinjene i prečišćene hromatografijom na molekularnim sitima (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare ili HiLoad 26/60 Superdex 200, GE Healthcare) u puferu za finalnu formulaciju: 20 mM histidina, 140 mM NaCl pH 6,0. Koncentracija proteina u prečišćenim proteinskim uzorcima određena je merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću molarnog koeficijenta ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Molekularna težina je takođe određena na osnovu aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekularna težina fuzionih proteina analizirani su pomoću SDS-PAGE u prisustvu i odsustvu redukujućeg agensa (5 mM 1,4-ditiotreitol) i bojenjem bojom Coomassie blue (SimpleBlue™ SafeStain kompanije Invitrogen). Gel sistem NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen) korišćen je prema uputstvu proizvođača (4% – 20% Tris-glicin gelovi ili 3% – 12% Bis-Tris). Alternativno, čistoća i molekularna težina molekula je analizirana pomoću analiza CE-SDS u prisustvu i odsustvu redukujućeg agensa, pomoću sistema Caliper LabChip GXII (Caliper Lifescience) u skladu sa uputstvima proizvođača. Agregatni sadržaj uzoraka fuzionih proteina analiziran je pomoću analitičke hromatografije na molekularnim sitima Superdex 20010/300GL (GE Healthcare) u 2 mM MOPS, 150 mM NaCl, 0,02% NaN3 pH 7,3 pufera na 25° C. Alternativno, agregatni sadržaj uzoraka antitela analiziran je pomoću TSKgel G3000 SW XL analitičke hromatografije na molekularnim sitima (Tosoh) u 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorida, 0,02% (w/v) NaN3, pufer pH 6,7 na 25° C.
Rezultati prečišćavanja i karakterizacije DP47GS IgG-IL-2, DP47GS IgG-(IL-2)2, DP47GS IgG-IL-2 N88D, DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2 i DP47GS IgG-(IL-2 E95A)2 konstrukcije su prikazane na slikama 1, 2, 3, 4 i 5, datim redosledom.
Afinitet vezivanja za receptore IL-2
Afinitet fuzionih proteina određen je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) na Biacore T200 (GE Healthcare) za humani, murinski i cinomolgus IL-2R βγ heterodimer koristeći rekombinantni IL-2R βγ heterodimer pod sledećim uslovima: ligandi: biotinilovani humani, murinski i cinomolgus heterodimer IL-2R β čvor γ otvor koji je imobilizovan na SA čipu (nivoi imobilizacije bili su 194, 114 i 116 RU, respektivno), analiti: DP47GS IgG-IL-2 (vidi SEQ ID NO 13, 15 i 19), DP47GS IgG-(IL-2)2 (videti SEQ ID NO 17 i 19), DP47GS IgG-IL-2 N88D (videti SEQ ID NO 15, 19 i 48), DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2 (vidi SEQ ID NO 19 i 50) i DP47GS IgG-(IL-2 E95A)2 (vidi SEQ ID NO 19 i 52), temperatura: 25° C, pufer: HBS-EP, koncentracija analita: 100 nM do 1,2 nM (razblaživanje 1:3), stopa protoka: 30 μl/min, asocijacija: 120 s, disocijacija: 600 s za 2 najveće koncentracije i 120 s za niže koncentracije, regeneracija: 60 s 3M MgCl2, podešavanje: 1:1 Lengmirov model vezivanja, 0, Rmax = lokalno. Affiniteti su određeni na osnovu konstanti kinetičke brzine kon i koff. Afinitet fuzionih proteina takođe je određen za humanu, murinsku i cinomolgus IL-2R α-podjedinicu koristeći rekombinantnu monomernu IL-2R αpodjedinicu pod sledećim uslovima: ligandi: humana, murinska i cinomolgus IL-2R α-podjedinica, imobilisana na CM5 čipu putem kuplovanja preko amina (nivoi imobilizacije bili su 240, 245 i 220 RU, datim redosledom), analiti: DP47GS IgG-IL-2 (vidi SEQ ID NO 13, 15 i 19), DP47GS IgG-(IL-2)2 (videti SEQ ID NO 17 i 19), DP47GS IgG-IL-2 N88D (videti SEQ ID NO 15, 19 i 48), DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2 (vidi SEQ ID NO 19 i 50) i DP47GS IgG-(IL-2 E95A)2 (vidi SEQ ID NO 19 i 52), temperatura: 25° C, pufer: HBS-EP, koncentracija analita 300 nM do 0,41 nM (rastvor 1:3), stopa protoka: 30 μl/min, asocijacija: 120 s, disocijacija: 180 s, regeneracija: 10 mM glicina pH 1,5 za 60 s. Afiniteti su određeni analizom stabilnog stanja.
Rezultati merenja afiniteta na bazi kinetike za IL-2R βγ heterodimer i stabilno stanje za IL-2R α-podjedinicu dati su u Tabeli 1.
Tabela 1. Vezivanje fuzionih proteina za IL-2R βγ i IL-2R α.
Humane DP47GS IgG-IL-2 fuzije i mutanti ne samo da se vezuju za 3 različite humane IL-2 receptorska lance α, β i γ, već i za odgovarajuće lance receptora iz cinomolgus majmuna i miša, iako afiniteti u proseku, imaju tendenciju da budu nešto niži za poslednje dve pomenute vrste. Afiniteti ovih fuzija citokina sa humanim i cinomolgus α lancima su uporedive, u odnosu na α lanac miševa postoji razlika u afinitetu od ~2 puta u poređenju sa humanim α lancem koji se posmatra za molekule koji nose samo jedan deo citokina. Za molekule sa dva dela citokina, najverovatnije zbog avidnosti, ova razlika ne postoji. Afiniteti DP47GS IgG-IL-2 i DP47GS IgG-IL-2 N88D prema lancima α treba u teoriji da budu jednaki jer N88D mutacija ne bi trebalo da utiče na interfejs sa α lanca. N88 je pozicioniran u interfejsu sa β lancem receptora IL-2 i mutageneza do D dovodi do smanjenog afiniteta kao što se može posmatrati upoređujući vezivanje IgG-IL-2 i DP47GS IgG-IL-2 i DP47GS IgG-IL-2 N88D na IL-2R βγ svih tri vrste (0,15 nM, 0,60 nM i 0,85 nM u odnosu na 0,93 nM, 1,3 nM i 2,4 nM, respektivno). Za DP47GS IgG-(IL-2 N88D)2 koji nosi dva mutirana IL-2 citokina, barem prema humanom IL-2R βγ, ova razlika je manje izražena, najverovatnije zbog avidnosti. DP47GS IgG-(IL-2)2 i DP47GS IgG-(IL-2 E95A)2 pokazuju vrlo slične avidnosti u vezivanju na IL-2R βγ svih tri vrste. Iako je E95 takođe pozicioniran u interfejsu sa β lancem IL-2 receptora, mutageneza na A, bar kada su dva od ovih mutanata spojena sa IgG, ne dovodi do značajnog smanjenja aviditeta.
Ekspresija IL-2 receptora na imunim ćelijama
Trimerični IL-2 receptor visokog afiniteta sastoji se od α (IL-2RA, CD25), β (IL-2RB, CD122) i γ (IL-2RG, CD132) lanaca i ima KD ~ 10 spM. Samo CD25 ima nizak afinitet (KD ~ 10 nM) za IL-2. Dimer IL-2RB/IL-2RG, koji se eksprimira na nekim tipovima ćelija u odsustvu IL-2RA, takođe se vezuje za IL-2, ali ima intermedijarni afinitet (KD ~ 1 nM). Signalizacijom putem IL-2 receptora posreduju lanci IL-2RB i IL-2RG. Iz analiza kristalne strukture, izgleda da IL-2RA ne kontaktira IL-2RB ni IL-2RG. Predloženo je da je osnova kooperativnosti trimernog receptora redukcija entropije kada CD25 zauzima IL-2 na površini ćelije za prezentaciju IL-2RB i IL-2RG ili, alternativno, dolazi do alteracije indukovane CD25 u IL-2 konformaciji, čime se stabilizuje kompleks. U FOXP3+ regulatornim CD4+ T ćelijama, postoji veliki stehiometrički višak IL-2RA u odnosu na P i γ lance receptora koji podržavaju hipotezu da dimeri, ili još veći kompleksi, lanca pomažu u vezivanju IL-2. Postoje takođe dokazi da CD25 na jednoj ćeliji može predstaviti IL-2 na IL-2RB/IL-2RG dimere na drugoj ćeliji, u interćelijskoj interakciji sa visokim afinitetom, naglašavajući jedinstvenu vezu između tri lanca koje čine IL-2 receptor visokog afiniteta.
Ekspresija CD25 (IL-2RA) i CD122 (IL-2RB) na CD4+ Treg podskupovima, podskupovima NK ćelija i NKT ćelijama, kao i na CD4+ i CD8+ konvencionalnim podskupovima T ćelija određuje FACS (slika 6 i 7). Markeri površine ćelija korišćeni su za definisanje CD4+ Treg podskupova, NKT ćelija i NK ćelija (Slika 6). Da bi se optimizovalo bojenje za CD25 i CD122, intracelularno bojenje FOXP3 nije izvršeno. Ukratko, koristeći 150 μl krvi donirane od strane zdravog dobrovoljca, fluorescentna antitela su inkubirana 45 minuta na sobnoj temperaturi u mraku (mešana u vorteks mikseru na početku i nakon 20 min). Crvene krvne ćelije su lizirane sa BD puferom za lizu (BD FACS Lysing Solution, 349202) tokom 9 minuta, a preostale ćelije su isprane (2 ml PBS+0,1% BSA) i fiksirane (1% PFA). Ćelije su analizirane na LSRFortessa<™>ćelijskom analizatoru (Becton Dickinson), a podaci su analizirani pomoću FloJo softvera (TreeStar). Treg podskupovi su identifikovani pomoću antitela specifičnih za TCRαβ-FITC (IP26, BioLegend), CD4lexa Fluor 700 (RPA-T4, BioLegend), CD127-PE/CY7 (ebioRDR5, Ebioscience), CD45RA-Pacific Blue (HI100, BioLegend ), CD25PC (2A3, M®251, BD Biosciences) i CD122-PE (TU27, BioLegend). NK i NKT ćelije su bile obojene u posebnoj tubi s antitelima specifičnim za TCRαβ-FITC, CD4-Alexa Fluor<®>700, CD8-PE/CY7 (HTT8a, BioLegend), CD56-Pacific Blue (HCD56, BioLegend), CD25-APC i CD122-PE. Nakon ograničavanja limfocita zasnovanih na FSC/SSC i isključivanja dubleta, naivni Treg su identifikovani kao TCRαβ+CD4+CD127<->CD25+CD45RA+, memorijski Treg su identifikovani kao TCRαβ+CD4+CD127<->CD25+CD45RA<->i aktivirani Treg su identifikobani kao TCRαβ+CD4+CD127<->CD25<high>CD45RA-. NK ćelije su identifikovane kao TCRαβ-CD56-/<dim>i aktivirane NK ćelije identificirane kao TCRαβ-CD56<bright>. NKT ćelije su identifikovane kao TCRαβ+CD56+. Kontrole izotipa (IC) konjugovane na APC i PE su korišćene kako bi se procenila fluorescencija pozadine za CD25 i CD122, datim redosledom.
Slično tome, markeri površine ćelija su korišćeni za definisanje naivnih i memorijskih konvencionalnih CD4+ T ćelija (slike 7A i 7B), memorijskih konvencionalnih CD8+ T ćelija i CD45RA+ CD8 T ćelija (kombinacija naivnih i TEMRA podgrupa; TEMRA se odnosi na efektorske memorijske T ćelije koje su ponovo počeli da izražavaju CD45RA) (slike 7C i 7D). Bojenje i analiza su obavljeni kao što je gore opisano. Koristeći istu epruvetu opisanu iznad kako bi se karakterizovali CD4<+>Treg, CD4<+>konvencionalne naivne T ćelije su identifikovane kao TCRαβ<+>CD4<+>CD127<+>CD25<+>CD45<+>i CD4<+>konvencionalne memorijske T ćelije su identifikovane kao TCRαβ<+>CD4<+>CD127<+>CD25<-/+>CD45RA-. CD8 T-ćelije su definisane pomoću TCRαβ-FITC, CD8-Alexa Fluor<®>700 (HTT8a, BioLegend), CD28-PE/CY7 (CD28.2, BioLegend), CD45RA-Pacific Blue, CD25-APC i CD122-PE. CD8+ memorijske T ćelije su identifikovane kao TCRαβ+CD8+CD45RA-. CD8+ naivne i TEMRA ćelije identifikovane su kao TCRαβ+CD8+CD45RA+. CD28 se nije koristio za razlikovanje CD8+ naivnih T ćelija iz CD8+TEMRA T ćelija pošto CD28 marker nije bio uključen u doleopisanu analizu pSTAT5a (videti sliku 8). U nekim testovima (Slika 15) dodatni podskupovi su definisani na sledeći način: centralne memorijske CD4+ T ćelije (TCRαβ+CD4<+>CD56-FOXP3-CD45RA-CD127<+>CD25<-/+>), efektorske memorijske CD4+ T ćelije (TCRαβ<+>CD4<+>CD56-FOXP3-CD45RA-CD127-CD25<-/+>), centralne memorijske CD8+ T ćelije (TCRαβ<+>CD8<+>CD56-FOXP3-CD45RA-CD127<+>CD25<-/+>), efektorske memorijske CD8+ T ćelije (TCRαβ<+>CD8<+>CD56-FOXP3-CD45RA-CD127-CD25<-/+>) i TEMRA CD8+ćelije (TCRαβ<+>CD8<+>CD56-FOXP3-CD45RA<+>CD127-CD25<-/+>).
Na slikama 6 i 7, ekspresija IL-2RA i IL-2RB specifična za ćelije prikazana ja za podskupove T ćelija, NK ćelija i NK T ćelija u ljudskoj perifernoj krvi (IL-2RG ima suštinski sveprisutnu ekspresiju na ćelijama hematopoeze, budući da se vezuje sa velikim brojem receptora citokina). Najveći nivo IL-2RA prisutan je na tri regulatorne populacije CD4+ T ćelija (Treg): naivne (CD45RA+CD25+), memorijske (CD45RA-CD25+) i aktivirane (CD45RA-CD25<hi>) (Slika 6A). U proseku, konvencionalne memorijske CD4+ T ćelije eksprimiraju približno 10 puta manje CD25 nego Treg (slika 7A). Ekspresija CD25 na naivnim CD4+ T ćelijama znatno se razlikuje među donatorima, ali je uvek niža od one koja je primećena na memorijskim CD4+ T ćelijama (slika 7A). Eksprimiranje CD25 na NK, NKT i CD8 T ćelijama je vrlo malo ili se ne može detektovati, osim kod CD56<bright>NK ćelija (slika 6C i 1C). CD56<bright>NK i CD56+NK ćelije izražavaju najviši nivo IL-2RB (slika 6D), otprilike 10 puta više od bilo kog podskupa T ćelija, uključujući NKT ćelije (slike 6B, 6D, 7B, 7D).
Indukcija pSTAT5a u podskupovima ćelija humane periferne krvi
Nakon IL-2-indukovane oligomerizacije trimeričnog IL-2R, aktiviraju se JAK1 i JAK3 citoplazmičke proteinske tirozinske kinaze koje su povezane sa intracelularnim domenima IL-2RB i IL-2RG. Ove kinaze fosforilišu određene ostatke IL-2RB tirozina koji deluju kao mesta privezivanja za STAT5a i STAT5b koji su za uzvrat fosforilisani. Aktivacija više signalnih puteva izazvana IL-2 na kraju dovodi do transkripcije ciljnih gena koji doprinose različitim funkcijama povezanim sa IL-2/IL-2R putevima. Pošto različiti tipovi ćelija eksprimiraju različite nivoe IL-2 receptora IL-2RA i IL-2RB molekula (slike 6 i 7), izmerili smo nivoe pSTAT5a unutar pojedinačnih ćelija polihromatičnom protočnom citometrijom kako bismo razumeli integrisani signalni odgovor na IL-2 posredovan različitim kombinacijama receptora visokog i intermedijarnog afiniteta.
Efekti različitih doza DP47GS IgG-IL-2, DP47GS IgG-(IL-2)2, DP47GS IgG-(IL-2E95A)2, DP47GS IgG-IL-2N88D i DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 na indukciju STAT5a fosforilacije procenjeni su u humanim CD4+ Treg podskupovima, naivnim i memorijskim konvencionalnim CD4+ T ćelijama, memorijskim konvencionalnim CD8+ T ćelijama, CD45RA+ CD8 T ćelijama, NKT ćelijama i NK ćelijama (Slika 8-14 i Tabela 2 i 3). Svi podskupovi su okarakterisani u jednoj epruveti za svaku dozu. Ukratko, krv zdravog odraslog ljudskog dobrovoljca sakupljana je u heparinisane epruvete. Različite koncentracije DP47GS IgG-IL-2 fuzionih proteina dodate su u 500 μl krvi i inkubirane na 37° C. Posle 30 minuta, krv je lizirana i fiksirana pomoću prethodno zagrejanog pufera za liziranje/fiksiranje (Becton Dickinson # 558049) tokom 10 minuta na 37° C, oprana je 2 puta PBS sa sadržajem 0,2% BSA, nakon čega je usledila permeabilizacija metanolom prethodno ohlađenim na -20° C (Sigma, Biotech grade # 494437) tokom 20 minuta na ledu. Ćelije su zatim detaljno isprane 4 puta PBS sa sadržajem 0,2% BSA pre nego što je FACS bojenje obavljeno pomoću panela fluorescentnih antitela kako bi se razlikovale različite limfocitne i NK ćelijske subpopulacije i status pSTAT5a. Antitela koja su korišćena su anti-CD4-Alexa Fluor<®>700 (klon RPA-T4), CD3-PerCP/Cy5.5 (UCHT1), CD45RA-PE/Cy7 (HI100), CD8-Brilliant Violet 605 (RPA-T8), CD56-Brilliant Violet 421 (HCD56), FOXP3-PE (259D) (svi iz BioLegend), CD25-APC (klonovi M-A251 i 2A3) i pSTAT5a-Alexa Fluor<®>488 (pY694) (Becton Dickinson). Uzorci su nabavljeni korišćenjem LSRFortessa<™>ćelijskog analizatora (Becton Dickinson) i podataka analiziranih pomoću softvera FlowJo (FlowJo, EEC). Nakon ograničavanja limfocita i isključivanja dubleta, Treg su definisani kao CD3+CD4+FOXP3+ i podeljeni kao CD45<->FOXP3<hi>(aktivirani Treg), CD3+CD4+CD45RA-FOXP3+(memorijski Treg) i CD3+CD4+CD45+FOXP3+ (naivni Treg). Konvencionalne CD4+ T ćelije su definisane kao CD3+CD4+CD45RA+ (naivne) i CD3+CD4+CD45RA -(memorijske). CD8 T ćelije su definisane kao CD3+CD8+CD45RA -(memorijske) i CD3+CD8+CD45RA+. NKT ćelije su definisane kao CD3+CD56+, a NK ćelije su definisane kao CD3 -CD56<bright>(aktivirane NK ćelije) ili CD3<->CD56+ (NK ćelije). Intracelularni pSTAT5a nivoi su kvantifikovani u svim podskupovima ćelija u svim dozama.
Na slici 8 prikazan je odgovor na dozu imunokonjugata DP47GS IgG-IL-2 na T ćelije, NK ćelije i NK T ćelije u ljudskoj perifernoj krvi od tri pojedinačna donora, svaki od njih je testiran u različitim danima. Hijerarhija reagovanja na DP47GS IgG-IL-2 bila je ista kod svih tri donatora i istа kao i kod primene rekombinantnog humanog IL-2 (Proleukin® ) (podaci nisu prikazani). Sve tri populacije Treg, aktivirane (CD45RA<->CD25<hi>), memorijske (CD45RA<->CD25+) i naivne (CD45RA+CD25+) povećale su nivoe pSTAT5a pri koncentraciji DP47GS IgG-IL-2 od 0,1 ng/ml dok su drugim ćelijskim populacijama bile potrebne veće od 1 ng/ml (CD56<bright>NK i memorijske CD4+ T ćelije) ili 10 ng/ml – 100 ng/ml (memorijske CD8+ T ćelije, CD56+ NK ćelije, naivne CD4+ T ćelije, NKT ćelije i CD45RA+ CD8 T ćelije) DP47 IgG-IL-2 za proizvodnju detektabilnih povećanja pSTAT5a. Takođe, pogledajte Sliku 11 za detaljnije odgovore Treg populacija na doze koji pokazuju njihovu visoku osetljivost na DP47GS IgG-IL-2. Primetno je da visoka ekspresija IL-2RB na NK ćelijama sa intermedijarnim nivoima CD56 (Slika 6D) u poređenju sa IL-2RB ekspresijom na podskupovima T ćelija nije dovoljna da omogući senzitivnost IL-2 sličnu Tregu. Sve u svemu, aktivirani, memorijski i naivni Treg podskupovi pokazali su najveću osetljivost na DP47GS IgG-IL-2, dok su CD56<bright>NK ćelije i CD4+ konvencionalne memorijske T efektorske ćelije bile 20–50 puta manje osetljive. Među ostalim podskupovima ćelija koji se analiziraju na povećanja pSTAT5a, CD8+ memorijske T efektorske ćelije, CD4+ naivne T efektorske ćelije, NKT ćelije, NK ćelije „u stanju mirovanja” (pozitivne, ne svetlo bojenje za CD56) i CD8+ naivne T efektorske CD45RA+ memorijske ćelije bile su relativno neosetljive na IgG-IL-2 imunokonjugat.
Na slici 9 prikazan je odgovor na dozu DP47GS IgG-(IL-2)2 na T ćelijama, NK ćelijama i NK T ćelijama u humanoj perifernoj krvi od pet individualnih donatora koji su testirani u različitim danima. Kao što je primećeno za DP47GS IgG-IL-2 (Slika 8), tri podskupa Treg bila su najosetljivija na DP47GS IgG-(IL-2)2 indukovan pSTAT5a (slike 9 i 11) i slični hijerarhijski odgovori doze su pronađeni za ostale podskupove ćelija kod svih pet donatora.
Da bi se lakše uporedili DP47GS IgG-IL-2 i DP47GS IgG-(IL-2)2, vrednosti pSTAT5a su normalizovane (Slika 10). Da bi se normalizovale vrednosti MFI, nestimulisane vrednosti MFI pSTAT5a specifične za svaki ograničeni podskup su oduzete od svih stimulisanih vrednosti MFI za taj podskup ćelija. Dobijene vrednosti su podeljene sa najvećom vrednošću pSTAT5a MFI koja je dobijena od tog podskupa tokom odgovora na dozu. EC50 su procenjeni na osnovu količine IL-2 fuzionog proteina koji je potreban da se dostigne 50% maksimalne MFI pSTAT5aI posmatrano za taj podskup. Kao što je prikazano na Slici 10, imunokonjugat DP47GS IgG-(IL2)2 je proizveo snažniju indukciju pSTAT5a u ćelijama neprestano izražavajući CD25, potencijalno kao posledica povećanog aviditeta imunokonjugata za receptor visokog afiniteta IL-2. Prilikom direktnog upoređivanja DP47GS IgG-(IL-2)2 sa DP47GS IgG-IL-2, uočeno je da je EC50 za pSTAT5a aktivaciju 5–9 puta niži u Tregu. U tabeli 2 su prikazane reprezentativne vrednosti EC50 i razlike za pSTAT5a aktivaciju pomoću DP47GS IgG-IL-2 naspram DP47GS IgG-(IL-2)2 u različitim podskupovima ćelija.
Tabela 2. EC50 vrednosti i razlike u stepenu aktivacije pSTAT5a od DP47GS IgG-IL-2 naspram DP47GS IgG-(IL-2)2 u različitim podskupovima ćelija.
Čak i pri izuzetno ograničavajućim koncentracijama, DP47GS IgG-(IL-2)2 je proizveo je veće nivoe pSTAT5a u odnosu na DP47GS IgG-IL-2 (Slika 11). Za ovaj eksperiment, krv iz tri zdrava volontera testirana je pojedinačno istog dana za odgovore na dvostruku titraciju DP47 IgG-IL-2 i DP47 IgG-(IL-2)2 u ograničavajućim koncentracijama IL-2. Grafikoni na slici 11 predstavljaju srednju vrednost ± SD pSTAT5a MFI za tri donatora. Pored tri podskupa Treg ćelija koje su pojedinačno ispitane (Slika 11B-D), primenjeno je ograničenje za procenu pSTAT5a u ukupnom CD3+CD4+FoxP3<+>Treg (Slika 11 A). Rezultati jasno ukazuju na povećanje potencijala za aktiviranje Trega DP47GS IgG-(IL-2)25–10 puta, uprkos samo dvostrukom povećanju IL-2 po molekulu IgG. Polihromatična protočna citometrija je izvršena kao što je gore opisano (videti sliku 8).
CD4+ konvencionalne memorijske T efektorske ćelije takođe su odgovorile na niže (7 puta) koncentracije DP47GS IgG-(IL-2)2 u poređenju sa DP47GS IgG-IL-2. Dok su vrednosti EC50 bile niže za CD56<bright>NK ćelije i CD56+ NK ćelije prilikom upoređivanja DP47GS IgG-(IL-2)2 sa DP47 IgG-IL-2, spuštanje je bilo samo 3 puta i 4 puta, datim redosledom. Ovo je verovatno zbog oslanjanja ovih ćelija na intermedijarni afinitet IL-2 receptora za IL-2-posredovanu signalizaciju. Ovaj diferencijalni pomak u ED50 za Treg protiv NK ćelija povećava prednost Treg aktivacije nekoliko puta.
Na slici 12 prikazan je odgovor na dozu DP47GS IgG-(IL-2E95A)2 na T ćelijama, NK ćelijama i NK T ćelijama u humanoj perifernoj krvi od tri pojedinačna donora, od kojih je svaki testiran u različitim danima. Molekul IL-2E95A je projektovan i predviđen da smanji aktivnost vezivanja IL-2Rβγ, ali ustvari pokazuje slična vezivna svojstva za IL-2Rβγ receptor, kao i kod IL-2 divljeg tipa. Hijerarhija reagovanja na DP47GS IgG-(IL-2E95A)2 je bila ista kod sva tri donatora i ista kao i kod onih donatora sa IL-2 imunokonjugatom divljeg tipa DP47GS IgG-(IL-2)2. Sve tri populacije Treg, aktivirane (CD45RA<->CD25<hi>), memorijske (CD45RA-CD25+) i naivne (CD45RA+CD25+) povećale su nivoe pSTAT5a pri koncentracijama DP47GS IgG-(IL-2E95A)2 manjim od 0,1 ng/ml dok su druge populacije ćelija zahtevale 1 ng/ml (CD56<bright>NK i CD4+ konvencionalne memorijske T efektorske ćelije) ili 10ng/ml – 100 ng/ml (memorijske CD8+ T ćelije, CD56+ NK ćelije, naivne CD4+ T ćelije, NKT ćelije i CD45RA+CD8+ T ćelije) DP47 IgG-(IL-2E95A)2 za proizvodnju detektabilnih povećanja pSTAT5a. Primetno je da visoka ekspresija IL-2RB na NK ćelijama sa intermedijarnim nivoima CD56 (Slika 6D) u poređenju sa IL-2RB ekspresijom na podskupovima T ćelija nije dovoljna da omogući senzitivnost IL-2 sličnu Tregu. Sve u svemu, aktivirani, memorijski i naivni Treg podskupovi pokazali su najveću osetljivost na DP47GS IgG-(IL-2E95A)2, dok su CD56<bright>NK ćelije i CD4+ konvencionalne memorijske T efektorske ćelije bile 20–50 puta manje osetljive. Među ostalim podskupovima ćelija koje se analiziraju za pSTAT5a povećanja, CD8+ memorijske T efektorske ćelije, CD4+ naivne T efektorske ćelije, NKT ćelije, NK ćelije „u stanju mirovanja” (pozitivno, ne svetlo bojenje za CD56) i CD8+ CD45RA+ naivne efektorske T ćelije su relativno neosetljive na IgG-(IL-2E95A)2 imunokonjugat.
Slika 13 prikazuje odgovor doziranja DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 na T ćelijama, NK ćelijama i NK T ćelijama u humanoj perifernoj krvi od pet individualnih donatora koji su testirani u različitim danima. Molekul IL-2N88D je bio dizajniran da smanji IL2Rβγ aktivnost vezivanja i za razliku od E95A tačke mutacije, imao je 6,2 puta manji afinitet vezivanja za IL2Rβγ nakon Biacore analize (Tabela 1, KD 0,15 nM naspram 0,93 nM). Kao što je primećeno za sve imunokonjugate IL-2 do danas, tri podskupa Treg bile su ćelije koje su najosetljivije na aktivaciju pSTAT5a od strane DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 i pronađeni su slični hijerarhijski odgovori doze za ostale podskupove ćelija kod svih pet donatora. Potrebno je napomenuti nedostatak reagovanja CD4+ memorijskih T efektorskih ćelija kada su stimulisane sa DP47GS IgG-(IL-2N88D)2; čak i kod doza od 1000 ng/ml došlo je do malog efekta stimulacije ove važne populacije autoimunih ćelija.
U ovom primeru, jedinstveno dizajnirana mutacija IL-2 jedne tačke, N88D, dramatično je smanjila stimulativnu aktivnostina željenu ćelijsku populaciju, CD4+ memorijske T efektorske ćelije, sve dok je održavanje Treg stimulativnih efekata neophodnih za novi i poboljšani terapeutski entitet.
Da bi se uporedili imunokonjugati divljeg tipa IL-2 DP47GS IgG-(IL-2)2 sa imunokonjugatnim tačkama mutacije E95A i N88D IL-2, vrednosti pSTAT5a su iscrtane jedna naspram druge za svaki tip ćelija koji se testira (Slika 14). DPS47GS IgG-(IL-2E95A)2 je pokazao identičnu aktivnost kao njegov duplikat DP47GS IgG-(IL-2)2 divljeg tipa koji stimuliše svaku od populacija humanih ćelija sa podudarnim krivuljama odgovora na dozu. Nasuprot tome, smanjeni IL2Rβγ vezujući molekuli, DP47GS IgG-IL-2N88D i DP47GS IgG-(IL-2N88D2)2, imali su neznatno dejstvo na CD4+ memorijske T efektorske ćelije i samo su dvovalentni konjugatni DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 zadržali značajne stimulativne aktivnosti na različitim populacijama Treg.
Rezultati na slici 15 pokazuju odgovore pSTAT5a pune krvi prikupljene od dodatnih deset donatora za humanu krv. U odvojenim danima, svaki donator je testiran upoređujući širok (≥6 log)) titracioni opseg DP47GS IgG-(IL-2)2 i DP47GS IgG-(IL-2N88D)2. Kao što je prethodno pokazano sa DP47GS IgG-(IL-2)2 (Slika 9), memorijski Treg i naivni Treg bile su ćelije koje su najosetljivije na DP47GS IgG-(IL-2)2 i DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 indukovanu pSTAT5a (Slika 15A, B); iako je svaki fuzioni protein stimulisao maksimalne odgovore pSTAT5a, razlikovali su se po tačkama preloma aktivacije, kao i po maksimalnim dozama za aktivaciju. CD56<bright>NK ćelije prezentovane kao ćelijski podskupovi manje osetljivi od Trega na DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 u poređenju sa fuzionim proteinama IL-2 divljeg tipa (Slika 15C); tačka preloma aktivacije bila je veća i u ovom slučaju nikad nije postigla maksimalni efekat čak i kod najveće testirane doze (5000 ng/ml). Za razliku od DP47GS IgG-(IL-2)2, NK ćelije nisu reagovale na DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 (Slika 15D). Obe centralne memorijske CD4+ T ćelije (slika 15E) i efektorske memorijske CD4+ T ćelije (Slika 15F) relativno su neresponsivne na DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 sa tačkom preloma aktivacije koja je 1000 puta veća od DP47GS IgG-(IL-2)2 i indukovale su samo delimične odgovore pri najvećoj testiranoj dozi (5000 ng/ml). Dok DP47GS IgG-(IL-2)2 indukuje različite stepene aktivacije, DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 nije imao efekta na sledeće ćelijske podskupove: naivne CD4+ T ćelije (slika 15G), centralne memorijske CD8+ T ćelije (Slika 15H), efektorske memorijske CD8+ T ćelije (slika 15I), naivne CD8+ T ćelije (slika 15J), efektorske memorijske CD45RA+ CD8+ T ćelije (slika 15K), NKT ćelije (slika 15L) i CD3+CD4-CD8-CD56<->T ćelije (slika 15M).
Vrednosti EC50 su prikazane u Tabeli 3 i zasnovane su na količini fuzionih proteina IL-2 neophodnih da bi se doseglo 50% maksimalnog odgovora pSTAT5a posmatranog za taj podskup ćelija. DP47GS IgG-(IL-2E95A)2, kao što je njegov IL-2 paralelni tip divljeg tipa DP47GS IgG-(IL-2)2, proizveo je najosetniju indukciju pSTAT5a u Tregu, ćelijama koje neprestano eksprimiraju CD25 receptor visokog afiniteta (IL2Rα) potencijalno kao posledica povećane avidnosti za receptor visokog afiniteta IL-2. Odgovori na doze DP47GS IgG-(IL-2E95A)2 i DP47GS IgG-(IL-2)2 bile su podudarne. EC50 za aktivaciju pSTAT5a u Tregu je bio 6 do 7 puta niži sa DP47GS IgG-(IL-2E95A)2 i DP47GS IgG-(IL-2)2 u poređenju sa monovalentnim DP47GS IgG-IL-2. Isto tako, aktivacija EC50 za Treg bila je 7 do 10 puta niža sa monovalentnim DP47GS IgG-IL-2 u poređenju sa dvovalentnim DP47GS IgG-(IL-2N88D)2. I na kraju, aktivacija EC50 za Treg bila je 36 do 61 puta niža sa dvovalentnim DP47GS IgG-(IL-2)2 u poređenju sa dvovalentnim DP47GS IgG-(IL-2N88D)2.
Najznačajnija imunološka prednost koju DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 ima za lečenje autoimunih poremećaja najbolje je ilustrovana u Tabeli 3 koja pokazuje dramatičnu marginu specifičnosti koju DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 ima za Treg aktivaciju u odnosu na CD4+ memorijske T efektorske ćelije (> 320 puta do > 500 puta). Za razliku od toga, margina specifičnosti za Treg naspram CD4+ memorijskih T efektorskih ćelija je znatno manja za DP47GS IgG-(IL-2)2 (13 do 14 puta) i DP47GS IgG-IL-2 (10 do 16 puta).
Tabela 3. EC50 vrednosti i razlike u specifičnosti vrednosti promena za aktivaciju pSTAT5a od DP47GS IgG-(IL-2E95A)2, DP47GS IgG-IL-2 i DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 u različitim podskupovima ćelija.
Diferencijalni efekti fuzionih proteina IL-2 na humane NK ćelije i CD8+ T ćelije in vitro Sveže humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) kultivišu se in vitro bez daljeg stimulisanja, osim IL-2, uslovi za koje je poznato da favorizuju opstanak i rast NK ćelija i CD8+ T ćelija. Humane NK ćelije mogu se podeliti na one koje eksprimiraju male ili nedetektujuće količine CD56 (nazvano CD56<-/dim>) i „aktiviran” podskup koji eksprimira visok nivo CD56 (nazvan CD56<bright>); većina NK ćelija u krvi je CD56<-/dim>sa manjinom klasifikovanom kao CD56<bright>. Smatra se da su „aktivirane” NK ćelije koje su CD56<bright>prekursorske NK ćelije kojima nedostaje ekspresija CD56 (npr. CD56<-/ dim>). Nakon šest dana in vitro sa DP47GS IgG-(IL-2)2 i DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 (svaki na 0, 5, 50 i 500 ng/ml), razlike su otkrivene u rastu i preživljavanju NK CD56<-/dim>ćelija, NK CD56<bright>ćelija i CD8+ T ćelija. Značajne razlike u broju ćelija su viđeni između stimuliranja pomoću DP47GS IgG-(IL-2)2 koji stimuliše najveća povećanja u CD56<bright>ćelijama (medijana od 101x10<3>u odnosu na 38x10<3>p <0,005) (Slika 16A) i takođe u CD8+ T ćelijama (medijana od 13,6x10<3>ćelija u odnosu na 2,5x10<3>ćelija, p < 0,0001) (Slika 16B).
Efekti fuzionih proteina IL-2 kod humanizovanih miševa
Humanizovani miševi su izgrađeni korišćenjem lako ozračenog tek rođenog NOD. Prkdc
<scid>IL2rg<null>(NSG) miša kao imunokompromitovanog domaćina kom su presađene CD34+ matične ćelije humane fetalne jetre koje su ubrizgane IP. Od 8. do 10. nedelje života, testirana je krv svakog miša kako bi se utvrdilo da je došlo do reakcije organizma na humani graft. Upoređivanjem Proleukina i DP47GS IgG-(IL-2)2 utvrdili smo da su primarne ćelije koje su bile in vivo pogođene NK ćelije i Treg; nakon lečenja sa DP47GS IgG-(IL-2)2 došlo je do značajnog povećanja NK ćelija i Treg sa NK ćelijama koje su srazmerno veće. In vivo efekti Proleukina bili su slični, ali efekti na NK ćelije i Treg u grupi su bili manje konzistentni i stepen povećanja je smanjen u poređenju sa DP47GS IgG-(IL-2)2. Na humanizovanim miševima takođe su mogli da se razlikuju in vivo efekti fuzionih proteina IL-2. Divlji tip DP47GS IgG-(IL-2)2 povećao je oba Trega (Slika 17A) i NK ćelije (Slika 17B), dok DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 nije imao efekta na NK ćelije (Slika 17B), ali je povećao Treg na znatno veći stepen (slika 17A) nego divlji tip IgG-(IL-2)2.
Dugotrajna posledica humanizovanih NSG miševa je njihovo kraće vreme preživljavanja zbog reakcije organizma na humani ksenogeni graft, što izaziva gubitak težine i otkazivanje višestrukih organa. Administracija vehikuluma dva puta nedeljno nije imala efekta i rezultirala je srednjim opstankom od 36 dana nakon iniciranja terapije (slika 18). Slično vehikulumu, tretman sa DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 rezultirao je srednjim opstankom od 37 dana. Nasuprot tome, lečenjem dva puta nedeljno sa DP47GS IgG-(IL-2)2 skraćeno je srednje vreme preživljavanja ove grupe na 21 dan (Slika 18, p <0,0037 u poređenju sa DP47GS IgG-(IL-2N88D)2).
Kada je unapred utvrđena težina reakcije organizma na graft diktirala završetak trajanja života za svakog miša (gubitak težine ≥ 15%), sastav humanih ćelija je procenjen u krvi. Kada je u pitanju životna opasnost od reakcije organizma na graft, uočljive su izrazite razlike tretiranih grupa u konačnom sastavu Treg, NK ćelija i CD8+ T ćelija u krvi (slika 19). Kod miševa tretiranim vehikulumom, humani Tregovi predstavljaju manje od 1% ukupnih humanih CD45+ ćelija, a NK i CD8+ T ćelije obuhvatili su ~3% humanih CD45+ ćelija u krvi. Tretman sa DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 povećao je NK i CD8+ T ćelije na 2% i 5%, datim redosledom, dok su Treg povećani na 6%. Nasuprot tome, tretmanom DP47GS IgG-(IL-2)2 divljeg tipa povećan je udeo NK ćelija i CD8+ T ćelija na 30% ukupnih humanih CD45+ ćelija i Treg na 3,5%, što možda objašnjava značajno smanjenje vremena preživljavanja u ovoj grupi u poređenju sa miševima tretiranim DP47GS IgG-(IL-2N88D)2.
Indukcija pSTAT5a u podskupovima ćelija periferne krvi cinomolgusa
Kao što je primećeno u humanoj perifernoj krvi, postoji preferencijalna i slična indukcija zavisna od doze pSTAT5a u podskupovima Treg u perifernoj krvi cinomolgusa stimulisanih IL-2 (Proleukin) (podaci nisu prikazani). U direktnom poređenju sposobnosti DP47GS IgG-(IL-2)2 i DP47GS IgG-IL-2 da indukuju pSTAT5a u tri podskupa Treg, 2- do 8 puta manje DP47GS IgG-(IL-2)2 je bio potrebno da se dostigne 50% maksimalnog nivoa pSTAT5a nego za DP47GS IgG-IL-2. Tabela 4 sumira vrednosti EC50 za aktivaciju pSTAT5a pomoću DP47GS IgG-IL-2 u odnosu na DP47GS IgG-(IL-2)2 u različitim Treg podskupovima cinomolgusa, rezultati koji su upečatljivo slični onima viđenim sa humanom perifernom krvi (Tabela 3).
Slično punoj humanoj krvi, površina ćelije i intracelularni markeri su korišćeni za identifikaciju podskupova regulatornih T ćelija i konvencionalnih T ćelija u punoj krvi normalnih zdravih cinomolgus majmuna. Uzorci krvi su sakupljeni istog dana od tri zdrava cinomolgus majmuna u natrijum-heparinskim cevima i različite koncentracije DP47GS IgG-IL-2 ili DP47GS IgG-(IL-2)2 su dodate u 500 μl krvi i inkubirane na 37° C. Nakon 10 min. na 37° C, uzorci su lizirani i fiksirani sa prethodno zagrejanim BD Lyse/Fix puferom (BD Biosciences). Nakon pranja, ćelije su permeabilizovane sa 1 mL metanola tokom 30 min na ledu. Uzorci su isprani 3 puta i obojeni panelom FOXP3-Alexa Fluor® 647 (klon: 259D, BioLegend), CD4-V500 (klon: L200, BD Biosciences), CD45RA-V450 (klon: 5H9, BD Biosciences), CD25-PE (klon: 4E3, eBioscience), pSTAT5a-Alexa Fluor® 488 (klon: 47, BD Biosciences) i Ki-67-PerCP-Cy5.5 (klon: B56, BD Biosciences) za 1 sat na 4° C. Svi uzorci su dobavljeni pomoću LSRFortessa™ ćelijskog analizatora (Becton Dickinson), a zatim su analizirani programom FlowJo (FlowJo, LLC).
Tabela 4. Indukcija pSTAT5a u podskupovima Treg periferne krvi cinoomolgusa kao odgovor na DP47GS IgG-IL-2 i DP47GS IgG-(IL-2)2.
U daljem eksperimentu, slično testovima pSTAT5a sa humanom krvi, sveža heparinizovana krv iz normalnih zdravih odraslih cinomolgus majmuna je stimulisana in vitro sa PBS kao kontrolnim vehikulumom, DP47GS IgG-(IL-2)2 i DP47GS IgG-(IL- 2N88D)2, a ispitani su efekti na STAT5a fosforilaciju u podskupovima Treg i konvencionalnim CD4+ memorijskim T efektorskim ćelijama. Stimulaciona doza od 20 ng/mL izabrana je na osnovu maksimalnih humanih Treg odgovora na nivou od ≤ 1 ng/mL i približno maksimalnim odgovorima konvencionalnih CD4+ memorijskih T efektorskih ćelija u tom opsegu doza (rezultati su na slici 9).
Eksperimentalni uslovi su bili kako je gore opisano. Uzorci krvi su sakupljeni istog dana od tri zdrava cinomolgus majmuna (donatori C1, C2, C3) u natrijum-heparinskim epruvetama i 20 ng/mL DP47GS IgG-(IL-2)2 ili DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 je dodato u 500 μl krvi i inkubirano na 37° C 20 minuta pre lize i analize.
Strategija za protočnu citometriju za podelu cinomolgus CD4+CD25<+>Treg u naivne (FOXP3<+>CD45RA<+>), memorijske (FOXP3<+>CD45RA-) i aktivirane (FOXP3<hi>CD45RA-) podskupove za analizu prikazana je na slici 20A. Kao i kod ljudi, tri podskupa CD4+CD25+FOXP3<+>Treg iz svakog donatora su pokazali visok nivo IL-2 receptora visokog afiniteta CD25 (slika 20B). Posle in vitro stimulacije sa 20 ng/mL oba DP47GS IgG-(IL-2)2 i DP47GS IgG-(IL-2N88D)2, Treg iz svih tri donatora proizvela je značajnu STAT5a fosforilaciju (Slika 20C). Slično humanim, aktivirani i memorijski Treg cinomolgusa pokazali su veći potencijal za indukciju pSTAT5a u poređenju sa naivnim Tregom.
Humane konvencionalne CD4+ memorijske T efektorske ćelije, dok nisu tako osetljive kao Treg, mogu se stimulisati pomoću IL-2 sa procenjenim ED90 od 20 ng/mL za DP47GS IgG-(IL-2)2 koristeći pSTAT5a kao biomarker aktivacije (slika 14). Cinomolgus konvencionalne CD4+ memorijske T efektorske ćelije se na sličan način identifikuju u krvi kao CD4+FOXP3-CD45RA-ćelije sa većinom ćelija koje su CD25-, a manji je podskup CD25+ (slika 21A). Kada se uzimaju u celokupnoj populaciji, cinomolgus memorijske Teff ćelije iz sva tri donatora reagovale su na 20 ng/mL DP47GS IgG-(IL-2)2 povećanjem pSTAT5A, dok je 20 ng/mL DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 imalo malo (cyno 2) ili nimalo efekta (cyno 1 i 3) na pSTAT5a (slika 21B). Kada su memorijske Teff ćelije dalje podeljene u CD25<->i CD25+ podskupove, prvenstveno je utvrđeno da odgovor na DP47GS IgG-(IL-2)2 dolazi iz CD25+ podskupa (slika 21D) i sa malo odgovora u CD25<->podskupu ( Slika 21C). Nasuprot tome, DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 nije delovao na CD25<->memorijske Teff ćelije (slika 21C), a imao 70%–80% manje stimulativne aktivnosti na CD25+ podskupu (slika 21D).
Dodatne studije u svežoj normalnoj cinomolgus krvi direktno su upoređivale različite koncentracije DP47GS IgG-(IL-2)2 i DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 u režimu odgovora na dozu za njihovu sposobnost da stimulišu pSTAT5a u različitim podskupovima T ćelija, tj. naivni i memorijski Treg i CD4+ memorijske T efektorske ćelije. DP47GS IgG-(IL-2)2 i DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 su stimulisali Treg na način koji je zavisio od doze sa dvovalentnim fuzionim proteinom divljeg tipa IL-2 ~10 puta većim nego dvovalentni fuzioni protein IL-2N88D u svakom od Treg podskupova (Slika 22A-C). Nasuprot tome, dramatična razlika između dva molekula videla se kada su CD4+ memorijske T efektorske ćelije procenjene za indukciju pSTAT5a (slika 22D). DP47GS IgG-(IL-2)2 je predstavljen sa ~EC90 na 300 ng/mL dok je DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 praktično bez efekta u toj visokoj dozi. EC50 vrednosti za stimulaciju pSTAT5a cinomolgusa prikazane su u Tabeli 5, kao i relativne specifičnost vrednosti promene za stimulaciju Treg u odnosu na CD4+ memorijske T efektorske ćelije. Ovi rezultati u punoj krvi cinomolgusa prilično su slični rezultatima dobijenih iz humane pune krvi (Slika 14 i Tabela 3) i ukazuju na to da studije kod cinomolgusa mogu imati visoku prediktivnu vrednost za klinička ispitivanja s ljudima.
Tabela 5. EC50 vrednosti i razlike u specifičnostima vrednosti promene za aktivaciju pSTAT5a između DP47GS IgG-(IL-2)2 i DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 u podskupovima cinomolgus T ćelija.
Farmakokinetička svojstva kod miševa
Pre obavljanja funkcionalnih studija kod miševa, farmakokinetičke (FK) osobine divljih i N88D monovalentnih i dvovalentnih imunokonjugata IL-2 procenjene su u NOD, NOD. scid i NOD. scid. Il2rα<-/->miševima (slika 23).
NOD i NOD. scid miševima (n = 3) je injektirano intravenozno (iv) 0,3 mg/kg po mišu DP47GS IgG-IL-2 ili DP47GS IgG-(IL-2)2 u PBS koji sadrži 0,5% seruma miša i uzimana im je krv u različitim vremenima nakon injekcije, u rasponu od 2 minuta do 168 sati (slika 23A). Humani IL-2 je procenjen u uzorcima seruma miševa korišćenjem antihumanih IL-2 mAb (BD Pharmingen, # 555051, klon 5344.111) za premazivanje ploče za uzorke sa 96 udubljenja kako bi se izdvojio IL-2. Humani IL-2 je zatim detektovan korišćenjem biotinilovanog antihumanog IL-2 mAb (BD Pharmingen, # 555040, klon B33-2). Vezivanje IL-2 je vizuelizovano i kvantifikovano pomoću streptavidina konjugovanog sa evropijumom. Tokom prva 24 sata DP47GS IgG-(IL-2)2 je brže raščišćen od DP47GS IgG-IL-2 kod oba NOD i NOD. Scid miševa. Do isteka 48 sati serumski nivoi su bili u sličnim koncentracijama, a svi su bili ispod granice detekcije nakon 72 sata. Granica IL-2 detekcije bila je 0,05 ng/mL i označena je tačkastom linijom. Iznenađujuće brzo očuvanje monovalentnih i dvovalentnih IgG-IL-2 imunokonjugata kod miševa bez adaptivnog imunološkog sistema sugerišu da IL-2 odeljak ćelija nehematopoeze ili „umivaonik” postoji kod miševa i može podsticati brzo in vivo raščišćavanje IL-2 imunokonjugata.
Da bismo testirali ovu hipotezu, izvršili smo FK studije s NOD.scid miševima kojima su takođe nedostajali receptori IL-2 visokog afiniteta, IL2Rα (CD25), tj. NOD. scid.Il2rα<-/->miševi (slika 23B). Kod NOD.scid.Il2rα<-/->miševa, DP47GS IgG-(IL-2)2, uprkos tome što su dati uz trostruku veću dozu (0,3 mg/kg), raščišćavani su brže tokom prvih 24 do 48 sati od 0,1 mg/kg DP47GS IgG-IL-2 i 0,1 mg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2. Međutim, nakon 48 sati, nivoi krvi svakog konjugata pokazivali su sporu stabilnu fazu eliminacije sa lako prepoznatljivim IL-2 u krvi do 6 dana. Zanimljivo je da su kod ovih miševa kojima nedostaju IL-2 receptori visokog afiniteta, molekuli DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 imali inicijalnu 24-časovnu fazu raspodele nešto bržu od IgG-IL-2, ali nakon toga su prikazali fazu eliminacije sličnu monovalentnom imunokonjugatu divljeg tipa do šest dana, poslednji put kada su testirani. Ovi podaci za DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 su naročito relevantni pošto FK rezultati NOD.scid.Il2rα<-/->miševa izgleda da blisko predviđaju-FK rezultate kod nehumanih primata.
Porast FOXP3 i CD25 u mišjim Tregovima nakon tretmana IL-2
Za upoređivanje sposobnosti različitih molekularnih oblika i konfiguracija humanog IL-2 za stimulisanje FoxP3<+>Treg in vivo, miševima su supkutano injektirani vehikulum, Proleukin (rekombinantni humani IL-2), DP47GS IgG-IL-2, DP47GS IgG-( IL-2)2 ili DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 i Treg su procenjeni u pogledu promena u ekspresiji površine ćelija CD25 i intracelularne FOXP3 pri prethodno utvrđenom optimalnom vremenu od 24 sata (slika 24). Mladi zdravi BALB/c miševi (n = 3/tretirana grupa, n = 4/kohorte vehikuluma) injektirani su supkutano sa Proleukinom (20.000 ili 100.000 IU/miša), DP47GS IgG-IL-2 (60, 300 ili 1500 IU/miša), DP47GS IgG-(IL-2)
2 (60, 300 ili 1500 IU/miš) ili DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 (60, 300 ili 1500 IU/miš). Doze su isporučene u vehikulumima koji su sadržavali 100 μl sterilnog PBS pH 7,2 koji sadrži 0,5% sterilnog filtriranog mišjeg seruma. Nakon 24 sata, miševi su bili eutanazirani, a slezine su izvađene. Jedna ćelijska suspenzija splenocita je generisana u 1 ml L-15 medijumu i ostavljena na ledu, sve do dalje obrade. Filtrirani alikvot pojedinačne ćelijske suspenzije, 40 μl, prebačen je u FACS epruvete i ispran sa 2 ml FACS pufera (600 x g, 5 min). Uzorci su zatim inkubirani s antitelima konjugovanim fluorohromom usmerenim protiv ćelijskih površinskih antigena: CD4 (klon RM4-5, fluorohrom A700), CD25 (eBio7D4, Af488), CD44 (IM7, e605), CD62L (MEL-14, PE), ICOS (C398.4A, PE/Cy7), CD103 (2E7, APC). Bojenje je obavljeno tokom 30 min, na 4° C u 100 μl FACS pufera (PBS pH 7,2 0,2% BSA). Nakon bojenja površine ćelije, uzorci su isprani sa 4 ml FACS pufera (600 x g, 5 min) pre intracelularnog bojenja (u skladu sa protokolom za intracelularno bojenje eBioscience). Ukratko, uzorci su resuspendovani u 200 μl fiksacionog/permeabilizacionog pufera (eBioscience # 00-5521) i inkubirani tokom 1 h, 4° C. U uzorke je dodato 1 ml 1 x permeabilizacionog pufera (eBioscience # 00-8333) pre dodavanja 3 ml FACS pufera i pranja (600 x g, 5 min). Intracelularni antigeni, Ki-67 (B56, PerCP Cy5.5) i FOXP3 (FJK-16S, e450) su obojeni u 100 μl 1x permeabilizacionog pufera za 1 h, 4° C. Uzorci su isprani sa 4 ml FACS pufera (600 x g, 5 min – dvaput) i podaci dobijeni na BD Fortessa™ analizatoru i analizirani pomoću programa FlowJo (FlowJo, LLC). Tregovi su definisani kao CD4+FOXP3+ iz singleta u limfocitnoj kapiji; iz ove populacije, CD25 i FOXP3 srednji intenzitet fluorescencije (MFI) proračunat je za sve uzorke.
Kao što je prikazano na Slici 24, tri IL-2 imunokonjugata su ekvipotentna na stimulaciji ekspresije CD25 (24A) i FoxP3 (24B) u Tregu miša i pokazuju konzistentne odgovore zavisne od doze u rasponu doza od 60, 300 i 1500 IU/mišu. U svakom slučaju, 1500 IU svakog imunokonjugata (crni stupci) bilo je znatno efikasnije od 100.000 IU Proleukina (crni stupci). U većini slučajeva, 300 IU imunokonjugata (tamno sivi stupci) bilo je ekvivalentno 100.000 IU Proleukina, a 60 IU imunokonjugata (svetlosivi stupci) bilo je ekvivalentno 20.000 IU Proleukina (svetlo sivi stupci). U svim grupama tretmana podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD.
Farmakokinetička svojstva kod majmuna cinomolgus
Pre obavljanja funkcionalnih studija kod nehumanih primata, farmakokinetičke (FK) osobine imunokonjugata IL-2 procenjene su u biološko naivnim zdravim odraslim majmunima cinomolgus (slika 25). Majmuni (n = 2/doza) su injektirani intravenozno (iv) sa kratkim bolusom sterilnog DP47GS IgG-IL-2 ili DP47GS IgG-(IL-2)2 u PBS koji sadrži 0,5% cinomolgus seruma i krvi u različitim vremenima nakon injekcije, u rasponu od 30 minuta do 72 sata. Humani IL-2 je procenjen u uzorcima cinomolgus seruma koristeći antihumani IL-2 mAb (BD Pharmingen, Kataloški br.555051, klon 5344.111) kako bi premazali ploče sa 96 udubljenja kako bi se izdvojio humani IL-2. Humani IL-2 je zatim detektovan korišćenjem biotinilovanog antihumanog IL-2 mAb (BD Pharmingen, Catalog # 555040, klon B33-2). Vezivanje IL-2 je vizuelizovano i kvantifikovano pomoću streptavidina konjugovanog sa evropijumom. Nivo detekcije pomoću cinomolgus seruma u testu bilo je 0,05 ng/mL IL-2 (tačkasta linija na slikama). Serum cinomolgusa koji je uzet pre tretmana nije imao detektabilni IL-2 (prema tome < 0,05 ng/mL).
IL-2 je detektovan u serumu cynomolgusa od 30 minuta do 48 sati nakon iv injekcije sa svim dozama DP47GS IgG-IL-2 (Slika 25A) i DP47GS IgG-(IL-2)2 (slika 25B). Za 72 sata, serumski nivoi IL-2 bili su ispod granice detekcije (0,05 ng/ml, tačkasta linija) za sve životinje tretirane sa 10 i 25 μg/kg DP47GS IgG-IL-2 ili DP47GS IgG-(IL- 2)2. Nakon doziranja od 100 μg/kg DP47GS IgG-IL-2 detektabilnog seruma IL-2 i dalje je prisutan na 72 sata.
Indukcija Treg broja kod majmuna cinomolgus
Cinomolgus životinje tretirane in vivo sa DP47GS IgG-IL-2 imale su dozno zavisna povećanja u apsolutnom broju Treg, kao i porast promene iznad početnog doziranja od 7 dana (Slika 26A i 26B, datim redosledom). U svim testovima su korišćeni normalni zdravi cinomolgus majmuni oba pola u dobi od 3 do 6 godina i nijedna životinja nije korišćena više puta. Dok su pod anestezijom, različite doze DP47GS IgG-IL-2 (n = 4-6) ili vehikuluma (n = 3) su ubrizgane SC na bočni dorsum. Pojedinačne doze DP47GS IgG-IL-2 su se bazirale na telesnoj težini i formulisane za injekciju u vehikuluma sa sterilnim PBS pH 7,2 koji sadrži 0,5% sterilnog normalnog cinomolgus seruma. Uzorci krvi su sakupljeni u različitim trenucima nakon tretmana i testirani su na hematološke promene (CBC i Differential) pomoću uređaja Advia Automated Hematology Analyzer, kao i površine ćelija i intracelularnih markera opisanih iznad (eksperimentalne procedure za Tabela 4). Promene u CD4+CD25+FOXP3+ pune krvi, regulatorne T ćelije 7. dana nakon tretmana prikazane su na Slici 26 kao broj apsolutnih ćelija po mm<3>pune krvi (slika 26A) i promena u Tregu (slika 26B); svi podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SD. U većim dozama od 25 μg/kg i 36 μg/kg DP47GS IgG-IL-2, prosečni Treg povećava se skoro 3 puta (opseg od 111%–255%, n = 6) i 4 puta (opseg od 110%– 470%, n = 6), datim redosledom. Dalje smanjenje SC doziranja DP47GS IgG-IL-2 (12, 6 i 2 μg/kg) nastavilo je da proizvodi odgovarajuće smanjene izmena broja Treg i promena vrednosti. Bez želje da se ograniči teorijom, dvostruko povećanje Treg (u rasponu od 67%–133%, n = 6) sa dozom od 12 μg/kg DP47GS IgG-IL2 može predstavljati poželjno povećanje Trega za neke autoimune i inflamatorne bolesti. Postoji veliki opseg u broju Treg kod ljudi (20-90 Treg po mm<3>krvi, 4 do 10% CD4+ T ćelija) i razumno je pretpostaviti da povećanje Treg izazvanih IL-2 u okviru pojedinca može rezultirati ukupnim povećanjem funkcionalne supresije.
Kada su procenjene niže doze DP47GS IgG-IL-2 (2-6 μg/kg), uzorci krvi su se češće sakupljali kako bi se identifikovale optimalne vremenske prilike za detekciju promena u Treg nakon primene DP47GS IgG-IL-2 (slika 27). Iako su promene u Tregu bile prisutne na 7 dana, maksimalna stimulacija se dogodila 4. dana, ranije nego što je mereno sa većim dozama DP47GS IgG-IL-2 (dan 7, slika 26).
Proleukin i DP47GS IgG-IL-2 su uporedivi in vitro u ispitivanju pune krvi kod ljudi i cinomolgusa kada se upoređuju direktno prema jedinicama IL-2 aktivnosti koja se koristi za stimulisanje pSTAT5a u Treg i drugim ćelijama koje reaguju na IL-2 (podaci nisu prikazani). Sa poznatim kratkim poluživotom Proleukina kod ljudi, izvršena je studija pojedinačnih doza kod majmuna cinomolgus da bi se procenila in vivo Treg indukcija i aktivacija. Proleukin je proizveo dozu i vremenski uslovljenu promenu u Treg mereno vrednostima promene u apsolutnim brojevima, kao i aktivaciju pSTAT5a. Dok je porast Treg brojeva bio nominalni (Slika 28A: 10%– 40%), uvećano povećanje Treg pSTAT5a kod Proleukina® bilo je značajno i zavisilo od doze jedan dan nakon terapije (Slika 28B), ali sa kratkim in vivo vraćanjem u normalu od 2 do 3 dana.
Poređenje sposobnosti DP47GS IgG-IL-2 da indukuje povećanje Treg in vivo kod majmuna cinomolgus sa onim u Proleukinu prikazano je na slici 29. Normalni zdravi cinomolgus majmuni (grupe od n = 5) su tretirani sa niskim dozama DP47GS IgG-IL-2 ili visokim dozama Proleukina i promenom regulatornih T ćelija testiranih na dan 10. U danima 0 i 7, DP47 IgG-IL-2 je dobio SC u dozi od 16,800 IU/kg (doza od 12 μg/kg prikazana na slici 26). Na osnovu objavljenog rada na kojem je Proleukin dobio pacijente sa dijabetesom tipa 1 (4,5x10<6>IU/osoba, 3 puta/sedmično) i pokazao da povećava Treg i podatke o pojedinačnoj dozi na slici 28, Proleukin je dobio SC 3 puta nedeljno (M/W/F) za ukupno 5 doza svaka na 200.000 IU/kg (ekvivalent cinomolgusa od 4,5x10<6>IU/osoba). Rezultati su prikazani na slici 29 kao srednja vrednost ± SD za promenu ukupne Treg po mm<3>krvi (Slika 29A), porast broja Tregova (slika 29B) i odnosa Trega sa konvencionalnim CD4+FOXP3<->ćelijama (Slika 29C).
Iako je skoro 30 puta manja aktivnost DP47GS IgG-IL-2 primenjena tokom perioda od 10 dana, DP47GS IgG-IL-2 indukovao je veće povećanje broja Treg nego Proleukina (slika 29A, p = 0,06). Povećanje broja Treg brojeva iznad bazne linije (slika 29B) i povećanje Treg u odnosu na konvencionalne CD4 T ćelije (Slika 29C) takođe su bile veće (p = 0,0011 i p = 0,016, respektivno) kod majmuna doziranih sa DP47GS IgG-IL- 2 u odnosu na Proleukin. Kod ljudi odnos CD4+regulatornih T ćelija (obično definisanih kao FOXP3+ i kombinacija površinskih markera) sa neregulativnim CD4 T ćelijama (koji se nazivaju konvencionalne ili efektorske ćelije) se često koristi za definisanje funkcionalnih nivoa Trega kod pacijenata tokom vremena.
In vivo odgovor podmenija cinomolgus perifernih krvnih ćelija na lečenje DP47GS IgG-IL-2
In vivo ćelijska specifičnost lečenja IL-2 sa niskom dozom je kritičan parametar. Utvrdili smo da aktiviranje ćelija in vivo koje izaziva DP47GS IgG-IL-2 ili Proleukin može biti senzitivno nadgledano merenjem nivoa pSTAT5a ex vivo u krvi uzetim u različitim vremenima nakon doziranja cinomolgus majmuna ili miševa. In vivo odgovor svih populacija ćelija koji se mogu pratiti in vitro (slike 8-10) takođe mogu biti ispitani ex vivo.
Jedan i 3 dana nakon in vivo primene jedne male doze DP47GS IgG-IL-2 (12 μg/kg) zdravim majmunima cinomolgus (n = 5), sakupljana je cela krv i testirana na STAT5a fosforilaciju kao što je gore opisano (eksperimentalne procedure prema Tabeli 4). Svakom majmunu je ipuštana krv na dan 0 pre tretmana, a količina STAT5a fosforilacije je merena i korišćena pojedinačno kako bi se procijenila promenljivost nakon tretmana. Promena pada u pSTAT5a u Treg na danima 1 i 3 je prikazana na slici 30A, promena u pSTAT5a u konvencionalnim CD4+CD45RA<->memorijskim T efektorskim ćelijama na slici 30B, a promena u pSTAT5a u konvencionalnim CD4+CD45RA+naivnim T efektorskim ćelijama je na slici 30C. Rezultati jasno pokazuju da je krv cimnomolgusa dobivena jedan i tri dana nakon što je pojedinačna niska doza (12 μg/kg) DP47GS IgG-IL-2 pokazala preferencijalnu pSTAT5a povećanja Treg ćelija u poređenju sa memorijskim i naivnim CD4+T ćelijama (slika 30A -C). Jedna mala doza DP47GS IgG-IL-2 bila je očigledno superiornija od pojedinačne visoke doze Proleukina (slika 28B) u proizvodnji trajnog in vivo Treg-ovog stanje aktivacije.
Prvobitne studije koje su koristile fosforilaciju STAT5a kao in vivo biomarker aktivacije Treg-u vidjele su maksimalnu pSTAT5a samo 1 dana sa jednom dozom Proleukina (slika 28B) i 1 i 3 dana sa niskom dozom (12 μg/kg) DP47GS IgG-IL-2 (Slika 30A). Dalja titracija DP47GS IgG-IL-2 u kombinaciji sa dodatnim vremenima uzorkovanja pokazala je da se in vivo pSTAT5a signali mogu održavati 4 dana pre nego što vrate u normalu 7 dana (slike 31A, 31B). MFI (srednji intenzitet fluorescencije) signala pSTAT5a i za 2 μg/kg (31A, n = 4) i 6 μg/kg (31B, n = 6) pokazala su da je došlo do manjeg od maksimalne signalizacije pSTAT5a (vidi sliku 33B ). Čak i ove vrlo niske doze DP47GS IgG-IL-2 obezbeđivale su in vivo signalizaciju Trega i bile su superiornije od Proleukina (slika 28B). Ovi rezultati podržavaju našu hipotezu da vrlo nizak nivo dugotrajnog IL-2, npr. DP47GS IgG-IL-2, ali ne i Proleukin, može stimulisati Treg tokom dužeg vremenskog perioda in vivo time smanjujući učestalost lečenja potrebnog za ponovno uspostavljanje dominantne samotolerancije i poboljšanje ishoda bolesti. Povećanje Treg ćelija u perifernoj krvi nakon lečenja IL-2 sa niskom dozom može uticati na promenu u distribuciji ćelija u telu, a ne na stvarno povećanje ćelija. Da bi se potkrijepilo da se Treg povećava in vivo barem dijelom zbog indukcije deljenja ćelija pomoću lečenja IL-2, procijenjen je intracelularni marker proliferacije Ki-67. Ki-67 je protein koji se može otkriti u jezgru tokom G 1, S, G 2 i mitoze, ali je odsutan iz mirovanja ćelija koji su u fazi G 0 ćelijskog ciklusa. Cinomolgus majmuni tretirani sa 2 i 6 μg/kg DP47GS IgG-IL-2 opisani gore (slika 31) takođe su nadgledani za ex vivo promene u intracelularnom markeru Ki-67 kao što je opisano (eksperimentalne procedure u Tabeli 4) proliferacije in vivo. Procenat ćelija koji su bili u ćelijskom ciklusu (Ki-67+) na dan 0 bio je upoređen sa procentom ćelija Ki-67+na 1 do 11 dana nakon tretmana. Ki-67<+>Treg su prikazani na slici 32A, konvencionalne CD4<+>CDRA45<->memorijske T efektorske ćelije su na slici 32B, a konvencionalne CD4<+>CD45RA<+>naivne T efektorske ćelije su na slici 32C. Krvne ćelije cinomolgusa dobijene jedan do sedam dana nakon što je jedna mala doza DP47GS IgG-IL-2 (6 μgkg) pokazala preferencijalnu Ki-67 povećanje Treg/ u poređenju sa konvencionalnim CD4+naivnim T efektorskim ćelijama (Slika 32A u odnosu na 32C). Za razliku od naivnih T efektorskih ćelija, DP47GS IgG-IL-2 (6 μg/kg) je bio u stanju da stimuliše proliferaciju konvencionalnih memorijskih CD4+T efektorskih ćelija (slika 32B). U najnižoj dozi DP47GS IgG-IL-2 (2 μg/kg), u ćelijskom ciklusu i proliferaciji je zabeležena minimalna aktivacija u poređenju sa dozom od 6 μg/kg.
U humanim i cinomolgus analizama cele krvi in vitro aktivnost dvovalentnog DP47GS IgG-(IL-2) 2 je bila agregata, približno 6 puta veća na Treg-u nego monovalentni DP47GS IgG-IL-2 (tabele 2 i 4). Prema tome, prva doza kod majmuna cinomolgus bila je 6 puta manja od najveće doze DP47GS IgG-IL-2 testirane (36 μg/kg). DP47GS IgG-(IL-2) 2 primenjen na 6 μg/kg (n = 4) proizveo je velika povećanja cirkulirajućih Treg (slika 33A) koja su ostala daleko iznad normalnog 14 dana nakon terapije, značajni i produženi pSTAT5a u Treg-u koji su se vratili u normalu 1 nedelje (Slika 33B), i skoro trostruko povećanje broja Trega (slika 33C). Promene u zglobovima indukovane od strane DP47GS IgG-IL-2 (sa slike 26, otvorene šipke) upoređene su sa dozom od 6 μg/kg dvovalentnog DP47GS IgG-(IL-2) 2 (zasenčena šipka) (slika 33D). Slično čovekovim i cinomolgus testovima cele krvi, DP47GS IgG-(IL-2) 2 je pokazao poboljšanu in vivo potenciju nakon dvostrukog povećanja IL-2 po molekulu IgG.
Dodatne doze bivalentnog DP47GS IgG-(IL-2) 2 date su cinomolgus majmunima da bi se procijenili in vivo efekte u vrlo niskim dozama (2 i 0,7 μg/kg) (slika 34). Iako je 2 μg/kg izazvalo umjerene promene (srednja od 46%, u rasponu od 20 do 70%, n = 8), doza 0,7 μg/kg je imala mali efekat na brojeve T ćelija (srednji porast od 16%, n = 3 ) (Slika 34A). Obe niske doze stimulišu pSTAT5a povećavanja u Treg (slika 34B, n = 3 svaka), a imaju mali uticaj na Teff/mem ćeliju pSTAT5a (Slika 34C, n = 3).
Najvažniji efekti monovalentne i bivalentne terapije fuzionog proteina IL-2 divljeg tipa i njegove sposobnosti da povećaju Treg kod majmuna cinomolgus su prikazani na slici 35. Oba oblika dugotrajnog IgG-IL-2 su snažni induktori Treg koji se mogu pratiti in vivo sa pSTAT5a kao biomarkerom aktivacije i na ovoj slici kao povećanje broja cirkulirajućih Treg. DP47GS IgG-(IL-2) 2 sa povećanom potencijom postignutom udvostručavanjem molekula IL-2 na C-terminusu IgG ima superiornu zavisnost od doze nad DP47GS IgG-IL-2.
Demetilacija DNK FOXP3 i CTLA-4 u podskupovima T ćelija cinomolgusa.
Funkcionalno aktivni Tregovi mogu da proizvode imunosupresivne citokine CTLA-4, IL-10 i TGFβ i zahtevaju stabilnu ekspresiju faktora transkripcije FOXP3. Ekspresija FOXP3 u ljudskim i cinomolgus Treg zavisi od demetilacije deset CpG DNK lokacija metilacije u Treg specifičnom demetilovanom regionu (TSDR) unutar FOXP3 lokusa. Isto tako, ekspresija i produkcija CTLA-4 se oslanja na demetilaciju sedam CpG DNK lokacija metilacije u humanom i cinomolgus CTLA-4 lokusu. Prema tome, ocenili smo status demetilacije oba FOXP3 i CTLA-4 u različitim podskupima CD4+T ćelija pre i nakon tretmana sa DP47GS IgG-IL-2 (n = 4, 25 μg/kg sc) i DP47GS IgG-(IL-2 )2 (n = 4, 6 μg / kg sc) dati u dozama i vremenskim intervalima koji su prethodno pokazali da značajno povećavaju broj Treg u krvi. U istraživanju su korišteni samo biološki naivno odrasli muški cinomolgus majmuni, a njihova težina se kretala od 9,1 do 10,9 kg. Tretmani su davani 3 sedmice nakon početnog osnovnog sakupljanja krvi, a krv nakon lečenja je sakupljena 4-5 dana kasnije. PBMC-i iz 30 ml heparinizirane krvi su sortirani pomoću FACSAria™ (Becton Dickinson) u odgovarajuće CD4+podgrupe uključujući Treg (CD4+CD25+CD127<low>), memorijske T efektore (CD4+CD45RA<->), naivne T efektore (CD4+CD45RA+) i CD4+CD25<->CD127<->ćelije.
Podskupovi sortiranih ćelija zamrznuti su u alikvotima od 100.000 ćelija i čuvani su kao suvi peleti na -80 ° C kako bi se omogućila obrada svih uzoraka zajedno. Peletne ćelije su odmrznute i DNK je ekstrahovan i bisulfit se tretira u jednom koraku koristeći Epitect Fast Lyse All kit (Qiagen) prema uputstvima proizvođača.5 ng (u 2 μl) bisulfitne DNK korišćeno je u 20 μl prvom krugu duplex PCR koja sadrži 10 μl Multiplex PCR kit (Qiagen), 6 μl vode, 0,5 μl FOXP3 napredni prajmer tgtaaaacgacggccagtTTTAGAAGTTGTATGGGGGATGTT (SEQ ID NO: 54), 0,5 μl FOXP3 obrnuti prajmer caggaaacagctatgaccAAAATATCTACCCTCTTCTCTTCCTC (SEQ ID NO: 55), 0,5 μl CTLA-4 napredni prajmer tgtaaaacgacggccagtGGGTTTGGTTATGAAGGAGTATGA (SEQ ID NO: 56) i 0,5 μl reverzni primjer CTLA-4 caggaaacagctatgaccTTCACTTAATTTCCACTAAAAATACCC (SEQ ID NO: 57). Prvi ciklus PCRciklusa bio je 95 ° C u trajanju od 15 minuta, zatim 20 ciklusa od 95 ° C u trajanju od 30 sekundi, 60 ° C u trajanju od 90 sekundi i 72 ° C u trajanju od 60 sekundi, nakon čega sledi 10 minuta na 72 ° C. PCR proizvod je prečišćen korišćenjem AMPure XP perlica (Becton Coulter) prema uputstvima proizvođača i eluiran u 20 μl vode. Izveden je drugi krug PCR koji je dodao jedinstvenu sekvencu indeksa na početak svakog uzorka kroz 15 μl PCR koji sadrži 7,5 μl Multiplex PCR kit (Qiagen), 6,5 μl PCR proizvoda prvog kruga i 1 μl indeksnog prajmera. Uslovi ciklusa u drugom krugu bili su 95 ° C tokom 15 minuta, zatim 7 ciklusa od 95 ° C u trajanju od 30 sekundi, 54 ° C u trajanju od 90 sekundi i 72 ° C u trajanju od 60 sekundi, nakon čega sledi 5 minuta na 72 ° C. Proizvodi PCR su prečišćeni pomoću AMPure XP perlica i eluirani u 15 μl vode, a 4 μl korišćeno je za kvantifikaciju količine PCR proizvoda koristeći Shimadzu MultiNA. Jednaka molarna koncentracija svakog uzorka bila je udružena, kako bi se napravila biblioteka s sekvenciranjem koja je kvantifikovana pomoću seta za kvantifikaciju biblioteke Kapa Illumina. Biblioteka je sekvencirana pomoću Illumina MiSeq sa v3 reagensima i 2 x 300 bp uparenog završetka. Sekvencirani podaci su demultipleksirani korišćenjem ugrađenog python skripta, a program Cutadapt se koristi za uklanjanje adaptera za sekvenciranje. Prosleđivanje i obrnuto čitanje spojeno je pomoću FLASH, a sekvenca svakog metilacijskog mesta je izvučena.
Tretman cinomolgus majmuna sa DP47GS IgG-IL-2 i DP47GS IgGIL-2) 2 indukovao je značajno povećanje broja Treg-( u krvi kod svih tretiranih životinja, slično onome što je viđeno pre korištenja istog protokola tretmana (slike 33 i 35). Bitno je da brzo i dramatično povećanje Treg nakon lečenja sa DP47GS IgG-IL-2 i DP47GS IgG-(IL-2) 2 nije negativno uticalo niti smanjilo status demetilacije FOXP3 (slika 36, gornji panel) ili CTLA-4 (Slika 36, donji panel). Slični rezultati su vidđeni i za molekule, a podaci sa DP47GS IgG-(IL-2) 2 su prikazani na slici 36. Da je status demetilacije oba FOXP3 i CTLA-4 bio nepromenjen i nije smanjen tretmanom, ukazuje na to da su svi Tregovi zadržali svoj prirodni zrel funkcionalni imunosupresivni fenotip uprkos značajnom povećanju apsolutnih brojeva. Ovi Treg FOXP3 i CTLA-4 rezultati demetilacije u nehumanim primatima ukazuju na to da bi tretman malim dozama dugogodišnjih molekula sličnih molekulima IgGIL-2) 2 kod čoveka trebalo da bude u stanju da poveća broj potpuno funkcionalnih zrelih Treg koji će zauzvrat ispraviti imunoregulatorne disbalanse prisutne kod autoimunih bolesti čoveka, kao i druge hronično imunološko posredovane hronične inflamatorne bolesti.
Farmakokinetika DP47GS IgG-(IL-2N88D)2kod majmuna cinomolgus Osobine FK DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 procenjene su kod biološki naivnih cinomolgus majmuna (slika 37). Majmuni (n = 2/doza) su injektirani intravenozno (iv) i subkutano (sc) sa 30 ili 100 μg/kg sterilnog DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 u PBS koji sadrži 0,5% cinomolgus seruma i krv u različitim vremenima nakon injekcije, u rasponu od 30 minuta do 14 dana. Ljudski IL-2 je procenjen u uzorcima plazme cinomolgusa kao što je prethodno opisano. Nivo detekcije korišćenjem cinomolgus plazme u testu iznosio je 0,05 ng/mL IL-2. Plazma cinomolgusa uzeta pre tretmana nije imala detektabilni IL-2 (prema tome <0,05 ng/mL).
Za razliku od FK fuzionih proteina divljeg tipa (slika 25) gde se nivoi krvi mogu otkriti samo od 48 do 72 sata, DP47GS IgG-(IL-2N88D)2 je detektovan u cinomolgus plazmi od svih životinja u svim vremenskim intervalima 14 dana sa iv (Slika 37A) i sc (Slika 37B) načinima primene. Nivoi plazme bili su proporcionalni dozi u prva dva do tri dana i pokazali su produženi polu-život u poređenju sa molekulima fuzije IL-2 divljeg tipa.
Kao biomarker izloženosti IL-2 in vivo, izmerenii su nivoi plazme rastvorljivog CD25 (sCD25, IL-2RA) (slika 37C). Reagensi monoklonskih antitela za humani sCD25 za koje je poznato da stupaju u unakrsnu reakciju sa cinomolgus sCD25 korišćeni su u imunološkom testiranju sendviča koristeći hvatanje (MAB623, R & D sistemi) i biotinilovana detekcija (BAF223, R & D sistemi) antitela koristeći Eu<++->konjugovani streptavidin za detekciju vezanih sCD25. Povećanje sCD25 nakon primene DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 je zavisilo od doze i prisutno između 1 i 7 dana, vraćajući se na normalne nivoe do 8. dana.
Indukcija Trega kod majmuna cinomolgus sa DP47GS IgG-(IL-2N88D)2Prethodno opisani testovi kod cinomolgusa tretiranih in vivo sa DP47GS IgG-IL-2 i DP47GS IgGIL-2) 2 divljeg tipa su prikazali dozno zavisna povećanja od 2 do 4 puta u apsolutnom broju Treg, (slika 26 i 33, respektivno) koji su bili odraz njihovih in vitro aktivnosti u ispitivanju cele ljudske krvi, tj.6 do 9 puta in vitro razlike (tabele 2 i 3). Sa gubitkom in vitro potencije u celoj krvi ljudi (Tabela 3), izabrane su in vivo doze od 30 i 100 μg/kg za DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2. Slično prethodnim ispitivanjima, DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 je ubrizgan iv ili sc rutom sa pojedinačnim dozama na bazi telesne težine i formulisano za injekciju u vehikulumu sterilnog PBS pH 7,2 koji sadrži 0,5% sterilnog normalnog cinomolgus seruma (n = 2 po dozama i putu injekcije). Uzorci krvi su sakupljeni pre lečenja (dana -4 i -5), neposredno pre lečenja (dan 0) i u različitim vremenima nakon tretmana (dan 1-14) i testirani na hematološke promene (CBC i Diferencijal), kao i površine ćelija i intracelularni markeri koji su prethodno opisani.
Povećanja ukupnih CD4<+>Treg, CD4<+>memorijskih Treg, CD4<+>naivnih Treg i CD8<+>FOXP3<+>Treg prikazani su kao zavisne od odgovora kao apsolutni broj ćelija/ml krvi (Slika 38A i 38B) ili kao% ukupnih CD4<+>ili CD8<+>T ćelija (slika 38C i 38D).
Ukupni CD4<+>Treg su povećani u broju posle 100 μg/kg od 90.000/ml do 810.000/ml (9 puta) i od 4.2% do 26% ukupnih CD4<+>T ćelija (6,2 puta) i još uvijek su bili povišeni nakon 14 dana. Kod 30 μg/kg, ukupni CD4<+>Treg su povećani sa 62.000/ml na 447.000/ml (7,2 puta) i od 4,5% do 16,7% ukupnih CD4<+>ćelija (3,7 puta).
Memorijski Treg su povećani u broju kod 100 μg/kg od 42.000/ml do 536.000/ml (12,8 puta) i od 2% do 17.4% od ukupnih CD4+T ćelija (8,7 puta). Kod 30 μg/kg, memorijski Treg su povećane sa 51.000/ml na 280.000/ml (5,5 puta) i od 2,3% do 10,5% ukupnih CD4+T ćelija (4,6 puta).
Naivni Treg su povećani u broju kod 100 μg/kg od 35.000/ml do 272.000/ml (7,8 puta) i od 2% do 8,6% od ukupnih CD4+T ćelija (4,3 puta). Na 30 μg/kg, naivni Treg su se povećali sa 46.000/ml na 166.000/ml (3,6 puta) i od 2,2% do 6,2% ukupnih CD4+T ćelija (2,8 puta).
Nakon primene 100 (μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2, CD8+FOXP3<+>Treg se povećao iz retkog ćelijskog tipa na 16.000/ml do 183.000/ml (11,4 puta) i od 0,7% na 7,8 % ukupnih CD8
<+>T ćelija (11,1 puta). Na 30 (μg/kg doze DP47GS IgG-(IL-2N88D)2, ukupni CD8<+>Treg povećani su od 17.000/ml do 101.000/ml (5,9 puta) i od 0,5% do 4,3% ukupnih CD8<+>T ćelija (8,6 puta). Nije bilo povećanjapovezanog sa tretmanom CD4+memorijskih Teffovih ćelija nakon 100 μg/kg ili 30 μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 (Slika 39A); u stvari, procenti su se smanjili na dan 4, verovatno zbog velikog porasta CD4<+>Trega u to doba. CD4+CD25<hi>memorija Teff ćelije su bile nepromenjene nakon 30 μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2, ali su povišene 1,6 puta 4 dana, uz povratak na početnu vrednost na 7-10 dana (Slika 39B).
Indukcija pSTAT5a, CD25 i Ki-67 u cinomolgusu sa DP47GS IgG-(IL-2N88D)2Kao što je ranije opisano, in vivo ćelijska specifičnost lečenja IL-2 je kritičan parametar i pokazali smo da aktivacija pod-ćelija in vivo može biti praćena merenjem ex vivo pSTAT5a, ćelijske površine CD25 i intracelularnog Ki-67 u krvi uzetim u različitim vremenima nakon doziranja.
Rezultati na slikama 40A i 40B prikazuju preferencijalnu pSTAT5a indukciju i produžene pSTAT5a signalizacijske odgovore CD4+i CD8<+>Treg nakon tretmana sa DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 ; maksimalni odgovori održani su od 1. do 4. dana od strane oba 100 (μg/kg i 30 μg/kg, vraćajući se na početnu vrijednost na 7 dana. CD4+CD25<hi>memorijske Teff su odgovorila sa ~ polu-maksimalnim odgovorima na dan 1 i vratili se u normalu do 4. dana. Svi ostali tipovi ćelija pokazali su malo ili su bili bez indukcije pSTAT5a nakon tretmana.
Povećanje površine ćelija CD25 je posledica aktivacije IL-2 i osjetljivog biomarkera in vivo aktivacije. Kratko nakon tretmana sa 100 μg/kg i 30 μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D)2, CD25 je preferencijalno povećan u CD4+memorijskim i naivnim Treg-om, kao i CD8+FOXP3<+>Treg (slika 41A, 41B). CD25 odgovori CD4+memorijskih i naivnih Treg su postigli vrhunac dana 4 i vratili se na početnu vrednost za 7 dana, dok je rast CD25+ kod CD8<+>FOXP3<+>Treg održavani tokom 10-14 dana.
U testovima sa fuzijskim proteinom divljeg tipa IL-2 pokazali smo da je Ki-67 osjetljiv intracelularni marker za ćelije koje su počele da se proliferišu in vivo i bio osjetljiv biomarker za aktivaciju IL-2 kod cinomolgus majmuna. Odgovori na 100 μg/kg DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 pokazali su 80-90% CD4+i CD8<+>Treg postali su Ki-67<+>(Slika 42A), dok je 60-90% postao Ki-67<+>nakon 30 μg/kg (slika 42B). Kao što je prikazano, ostali testirani podskupovi ćelija su manje reaktivni u odnosu na Treg.
Da bi se uzeli pretposlednji in vivo efekti povećanja broja Trega sa novim inženjerovanim IL-2 molekulima, sve doze citomolgusa pretvorene su u pmol/kg, što omogućava direktna poređenja bez obzira na molekularnu težinu; odgovori zasnovani na dozama su upoređeni sa glave do glave kao maksimalno povećanje CD4<+>Treg/ kao% ukupnih CD4<+>T ćelija (Slika 43). Uprkos gubitku in vitro potencijala u poređenju sa fuzionim proteinima divljeg tipa, DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 je izazvao neočekivano velika povećanja cinomolgus Treg, možda dijelom zbog povećanja sistemske ekspozicije nakon iv i sc administracije.
Eozinofilija kao posledica in vivo primene IL-2
Proleukin kod ljudi stimuliše eozinofiliju kada se daje dnevno u dozama od 1x10<6>do 4,5x10<6>IU/osoba. Kod cinomolgus majmuna slično povećanje eozinofila bilo je uočeno kod 100% životinja nakon ponovljenog tretmana sa visokom dozom Proleukina ili pojedinačnim 226 pmol/kg dozama DP47GS IgG-IL-2 (slika 44). Rezultati na slici 44 predstavljaju svaku ispitanu životinju (kolonije su uzete za životinje pre testiranja: n = 44 i n = 30) i za različite grupe za lečenje IL-2 (n = 5-9), bez obzira da li su brojevi eozinofila bili normalni ili povišen. Suprotno efektima Proleukina i DP47GS, IgG-IL-2 je bio virtualni nedostatak efekta na eozinofile sa DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 u in vivo dozama od 170 i 570 pmola/kg (30 i 100 μg/kg, respektivno). Ovaj nedostatak induciranja sistemske eozinofilije od strane DP47GS IgG-(IL-2N88D) 2 je upečatljiv u svjetlu stepena ekspanzije Trega indukovanog ovim različitim tretmanima (upoređeni na slici 43).
In vivo tretman sa DP47GS IgG-IL-2 potiskuje imune odgovore kod miševa
U preliminarnim studijama smo primetili da 4000 IU DP47GS IgG-IL-2 doza aktivira mišje FOXP3+regulatorne T ćelije in vivo ; Ova doza je zatim korišćena da bi se procenila njegova sposobnost za suzbijanje klasičnih T zavisnih imunih odgovora kod miševa, tj. hipersenzitivnost odloženog tipa (slika 45) i IgG anti-KLH odgovor (slika 46).
Miševi NOD i C57BL/6 miševi (n = 7) su imunizirani IV sa crvenim krvnim ćelijama ovaca (srbc) i izazvani 3 dana kasnije sa bolusom srbc u jednoj zadnjoj stopalici da indukuju odloženi tip hipersenzitivnosti (DTH). Jednog dana nakon izazivanja, miševi su bili eutanizovani sa CO 2, a šape su otsečene i izmerene. Veličina DTH odgovora je prikazana kao promena u težini šape u poređenju sa ne-imuniziranim mišem (Δ težina šape). DP47GS IgG-IL-2 je dato SC na 4000 IU po mišu 3 dana ranije i na dan srbc imunizacije, a vehikulum je bio sterilan PBS pH 7.2. Statistički značaj je izveden iz testa Mann Whitney u GraphPad Prism.
Doziranje DP47GS IgG-IL-2 tri dana ranije i na dan imunizacije crvenim krvnim ćelijama ovaca je potisnulo naknadni odgovor hipersenzitivnosti odloženog tipa na izazov izazvan krvnim ćelijama ovaca za 51% kod NOD miševa (slika 45A; p = 0,0023) i 38% kod C57BL/6 miševa (slika 45B, p = 0,002). Miš CTLA-4-Ig kao imunosupresiv pozitivne kontrole inhibirao je DTH odgovor na sličan nivo kao DP47GS IgG-IL-2.
DP47GS IgG-IL-2 je takođe mogao da potisne KLH specifične IgG odgovore na C57BL/6 (78% inhibicija, p = 0,0007, Slika 46A) i NOD (67% inhibicija, p = 0,004, Slika 46B) miševa. Za ovaj eksperiment, zdravi mladi C57BL/6 miševi (n = 7-10) i NOD miševi (n = 13-14) su imunizirani IP sa 100 μg humanog vakcinskog razreda KLH bez adjuvanta prema preporuci proizvođača (Stellar). Terapija DP47GS IgG-IL-2 se sastojala od 1 (NOD) ili 2 (C57BL/6) tretmana nedeljno sa 4000 IU po SC mišu započetim na dan imunizacije. Sedam dana (NOD) i 21 dana (C57BL/6) nakon imunizacije, sakupljena je krv, a serumski KLH-specifični IgG odgovori su mereni pomoću ELISA testa.
Sposobnost DP47GS IgG-IL-2 za suzbijanje imunoloških odgovora in vivo podržava hipotezu da regulatorna T ćelijska aktivacija indukovana malom dozom IL-2 proizvodi funkcionalne regulatorne T ćelije koje posreduju u smanjenju imunološkog odgovora.
Iako je gornji pronalazak opisan prilično detaljno putem ilustracije i pomoću primera koji bi olakšali razumevanje, opisi i primeri ne treba da se tumače kao ograničavajući za obim primene pronalaska.

Claims (37)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Fuzioni protein koji sadrži (i) molekul imunoglobulina koji nije sposoban za specifično vezivanje za antigen i (ii) dva mutantna molekula interleukina-2 (IL-2) koji sadrže mutaciju aminokiseline koja smanjuje afinitet mutiranog IL-2 molekula na IL-2 receptor intermedijarnog afiniteta, u poređenju sa IL-2 molekulom divljeg tipa, pri čemu pomenuti mutantni IL-2 molekuli sadrže sekvencu SEQ ID NO: 58.
2. Fuzioni protein iz zahteva 1, pri čemu je pomenuti molekul imunoglobulina molekul imunoglobulina IgG klase, posebno molekul imunoglobulina potklase IgG1.
3. Fuzioni protein prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je molekul imunoglobulina molekul humanog imunoglobulina.
4. Fuzioni protein prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu navedeni molekul imunoglobulina sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca zasnovanog na humanoj Vh3-23 germinativnoj sekvenci.
5. Fuzioni protein prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu navedeni molekul imunoglobulina sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 9.
6. Fuzioni protein prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu navedeni molekul imunoglobulina sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca zasnovanoj na humanoj germinativnoj sekvenci Vk3-20.
7. Fuzioni protein prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu navedeni molekul imunoglobulina sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 11.
8. Fuzioni protein prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu navedeni molekul imunoglobulina sadrži smanjeni modifikacioni afinitet vezivanja molekula imunoglobulina na Fc receptor u poređenju sa odgovarajućim molekulom imunoglobulina bez navedene modifikacije.
9. Fuzioni protein prema zahtevu 8, pri čemu je navedeni Fc receptor Fcγ receptor, naročito humani Fcγ receptor.
10. Fuzioni protein prema zahtevu 8 ili 9, pri čemu je navedeni Fc receptor aktivni Fc receptor.
11. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 8 do 10, pri čemu je navedeni Fc receptor odabran iz grupe FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) i FcαRI (CD89).
12. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 8 do 11, pri čemu je navedeni Fc receptor FcγRIIIa, naročito humani FcγRIIIa.
13. Fuzioni protein prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu molekul imunoglobulina sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 329 (EU numeracija) teških lanaca imunoglobulina.
14. Fuzioni protein prema zahtevu 13, pri čemu je supstitucija aminokiselina P329G.
15. Fuzioni protein prema bilo kom od prethodnih zahteva,pri čemu molekul imunoglobulina sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 234 i 235 (EU numeracija) teških lanaca imunoglobulina.
16. Fuzioni protein prema zahtevu 15, pri čemu su pomenute supstitucije aminokiselina L234A i L235A (LALA).
17. Fuzioni protein prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu navedeni molekul imunoglobulina sadrži aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329G (EU numeracija) u teškim lancima imunoglobulina.
18. Fuzioni protein prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu su pomenuti mutirani IL-2 molekuli spojeni preko N-terminalne aminokiseline sa C-terminalnom aminokiselinom jednog od teških lanaca pomenutog molekula imunoglobulina, opciono putem peptidnog linkera.
19. Fuzioni protein prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu su pomenuti mutantni IL-2 molekuli spojeni sa molekulom imunoglobulina preko peptidnog linkera.
20. Fuzioni protein prema zahtevu 19, pri čemu pomenuti peptidni linker sadrži najmanje 10, a u posebnom primeru, najmanje 15 aminokiselina.
21. Fuzioni protein prema zahtevu 19 ili 20, pri čemu pomenuti peptidni linker sadrži sekvencu aminokiselina (G4S)3 (SEQ ID NO: 66).
22. Fuzioni protein prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu fuzioni protein sadrži polipeptidne sekvence SEQ ID NO: 19 i SEQ ID NO: 50.
23. Fuzioni protein prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu navedeni fuzioni protein selektivno aktivira regulatorne T ćelije.
24. Polinukleotid koji kodira fuzioni protein prema bilo kom od prethodnih zahteva.
25. Vektor, posebno ekspresioni vektor, koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 24.
26. Ćelija domaćin koja sadrži polinukleotid iz zahteva 24 ili vektor iz zahteva 25.
27. Postupak za proizvodnju fuzionog proteina koji sadrži molekul imunoglobulina i dva mutantna IL-2 molekula koji sadrže mutaciju aminokiseline koja smanjuje afinitet mutiranog molekula IL-2 za IL-2 receptor intermedijarnog afiniteta u odnosu na IL- 2 molekul divljeg tipa, koji obuhvata korake (i) kultivacije ćelije domaćina prema zahtevu 26 pod uslovima pogodnim za ekspresiju fuzionog proteina, i (ii) obnavljanje fuzionog proteina.
28. Fuzijski protein proizveden postupkom u skladu sa zahtevom 27.
29. Farmaceutska kompozicija koja sadrži fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1 do 23 ili 28 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
30. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1 do 23 ili 28, ili farmaceutska kompozicija iz zahteva 29, koja se primenjuje kao lek.
31. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1 do 23 ili 28 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 29, za upotrebu u lečenju ili profilaksi autoimune bolesti.
32. Fuzioni protein ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 31, pri čemu je navedeno autoimuno oboljenje odabrano iz grupe dijabetesa tipa 1, sistemskog lupus eritematozusa, inflamatorne bolesti creva, Kronove bolesti, ulcerativnog kolitisa i multiple skleroze.
33. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1 do 23 ili 28 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 29, za upotrebu u lečenju ili profilaksi odbacivanja transplantata ili bolesti graft versus-host.
34. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1 do 23 ili 28 za upotrebu u selektivnoj aktivaciji regulatornih T ćelija in vitro.
35. Fuzioni protein prema zahtevu 34, pri čemu pomenuta aktivacija obuhvata indukciju proliferacije regulatornih T ćelija i/ili indukciju signalizacije IL-2 receptora u regulatornim T ćelijama.
36. Postupak selektivne aktivacije regulatornih T ćelija in vitro, koji obuhvata kontaktiranje navedenih regulatornih T ćelija sa fuzionim proteinom prema bilo kom od zahteva 1 do 23 ili 28.
37. Postupak prema zahtevu 36, pri čemu pomenuta aktivacija obuhvata indukciju proliferacije regulatornih T ćelija i/ili indukciju signalizacije IL-2 receptora u regulatornim T ćelijama.
RS20190003A 2014-02-06 2015-02-04 Fuzioni proteini interleukina-2 i njihova upotreba RS58149B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461936564P 2014-02-06 2014-02-06
EP15709419.4A EP3102595B1 (en) 2014-02-06 2015-02-04 Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
PCT/EP2015/052312 WO2015118016A1 (en) 2014-02-06 2015-02-04 Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58149B1 true RS58149B1 (sr) 2019-02-28

Family

ID=52669578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190003A RS58149B1 (sr) 2014-02-06 2015-02-04 Fuzioni proteini interleukina-2 i njihova upotreba

Country Status (32)

Country Link
US (1) US11098099B2 (sr)
EP (2) EP3508496A1 (sr)
JP (2) JP6306201B2 (sr)
KR (2) KR102042246B1 (sr)
CN (2) CN105980410B (sr)
AR (1) AR099289A1 (sr)
AU (2) AU2015215001B2 (sr)
BR (1) BR112016018288A2 (sr)
CA (1) CA2931114A1 (sr)
CL (1) CL2016001968A1 (sr)
CR (1) CR20160333A (sr)
DK (1) DK3102595T3 (sr)
EA (2) EA034350B1 (sr)
ES (1) ES2704731T3 (sr)
HR (1) HRP20190028T1 (sr)
HU (1) HUE041530T2 (sr)
IL (1) IL245484B (sr)
LT (1) LT3102595T (sr)
MA (1) MA39250B1 (sr)
MX (2) MX370283B (sr)
NZ (2) NZ760289A (sr)
PE (1) PE20161324A1 (sr)
PH (1) PH12016501406B1 (sr)
PL (1) PL3102595T3 (sr)
PT (1) PT3102595T (sr)
RS (1) RS58149B1 (sr)
SG (1) SG11201606369XA (sr)
SI (1) SI3102595T1 (sr)
TW (1) TWI671318B (sr)
UA (1) UA120847C2 (sr)
WO (1) WO2015118016A1 (sr)
ZA (1) ZA201603262B (sr)

Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
RS58149B1 (sr) 2014-02-06 2019-02-28 Hoffmann La Roche Fuzioni proteini interleukina-2 i njihova upotreba
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
ES2807260T3 (es) 2014-08-11 2021-02-22 Delinia Inc Variantes de IL-2 modificadas que activan selectivamente las células T reguladoras para el tratamiento de enfermedades autoinmunes
ES2883187T3 (es) 2014-12-05 2021-12-07 Aragon Pharmaceuticals Inc Composiciones anticancerosas
CA3006477A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Novartis Ag Antibody cytokine engrafted compositions and methods of use for immunoregulation
EP3402499B1 (en) 2016-01-14 2021-07-21 Intrexon Actobiotics NV Compositions and methods for the treatment of type 1 diabetes
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
KR102379464B1 (ko) 2016-06-20 2022-03-29 키맵 리미티드 항-pd-l1 항체
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
CN110087681A (zh) 2016-09-28 2019-08-02 佐马美国有限公司 结合白细胞介素-2的抗体和其用途
CN109952370B (zh) 2016-10-19 2023-09-08 豪夫迈·罗氏有限公司 用于产生免疫缀合物的方法
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
CN110167957A (zh) 2016-11-08 2019-08-23 德里尼亚公司 用于治疗自身免疫疾病的il-2变体
BR112019011799B1 (pt) * 2016-12-13 2021-12-21 Delinia, Inc Proteína de fusão, proteína dimérica e composição farmacêutica
BR112019018915A2 (pt) 2017-03-15 2020-04-14 Pandion Therapeutics Inc imunotolerância direcionada
JP7791642B2 (ja) 2017-05-24 2025-12-24 ノバルティス アーゲー 抗体－サイトカイングラフト化タンパク質及び癌の治療における使用方法
SG11201909949XA (en) 2017-05-24 2019-11-28 Pandion Therapeutics Inc Targeted immunotolerance
JOP20190271A1 (ar) 2017-05-24 2019-11-21 Novartis Ag بروتينات مطعّمة بسيتوكين- الجسم المضاد وطرق الاستخدام للاضطرابات المتعلقة بالمناعة
PH12020550661A1 (en) 2017-11-21 2021-04-19 Univ Leland Stanford Junior Partial agonists of interleukin-2
US10174092B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
WO2019113221A1 (en) * 2017-12-06 2019-06-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Engineered proteins to enhance sensitivity of a cell to il-2
USRE50550E1 (en) 2017-12-06 2025-08-26 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
IL275426B2 (en) 2017-12-19 2025-03-01 Xencor Inc Engineered il-2 fc fusion proteins
US12247060B2 (en) 2018-01-09 2025-03-11 Marengo Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered T cells for the treatment of diseases
WO2019158764A1 (en) 2018-02-16 2019-08-22 Iltoo Pharma Use of interleukin 2 for treating sjögren's syndrome
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
MX2020009975A (es) 2018-03-28 2020-10-12 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de fusion interleucina-2/receptor alfa de interleucina-2 y metodos de uso.
WO2019246404A1 (en) 2018-06-22 2019-12-26 Cugene Inc. Interleukin-2 variants and methods of uses thereof
WO2020007937A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Iltoo Pharma Use of interleukin-2 for treating systemic sclerosis
JP7554742B2 (ja) 2018-07-03 2024-09-20 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｔｃｒ抗体分子およびその使用
WO2020035482A1 (en) 2018-08-13 2020-02-20 Iltoo Pharma Combination of interleukin-2 with an interleukin 1 inhibitor, conjugates and therapeutic uses thereof
TWI791894B (zh) 2018-09-21 2023-02-11 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司 新型白介素２及其用途
TWI801664B (zh) 2018-09-21 2023-05-11 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司 新型白介素２及其用途
AR117770A1 (es) * 2019-01-07 2021-08-25 Inhibrx Inc Polipéptidos que comprenden polipéptidos con il-2 modificada y usos de los mismos
AU2020226893B2 (en) 2019-02-21 2025-02-27 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
GB2597851B (en) 2019-02-21 2024-05-29 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
BR112021019178A2 (pt) * 2019-03-29 2021-12-07 Centre Nat Rech Scient Variantes de interleucina-2 com atividade biológica modificada
CN111944036B (zh) * 2019-05-14 2024-09-06 上海盖浦生物科技有限公司 一种增殖免疫细胞的突变体蛋白
US11739146B2 (en) 2019-05-20 2023-08-29 Pandion Operations, Inc. MAdCAM targeted immunotolerance
CN114786708A (zh) * 2019-06-05 2022-07-22 亚设生物治疗公司 用于调节免疫细胞功能的突变体白介素-2多肽与抗原结合分子的融合物
CN114728040A (zh) * 2019-06-14 2022-07-08 科优基因公司 新型白介素-2变体及其双功能融合分子
JP7645859B2 (ja) * 2019-07-12 2025-03-14 プロヴィヴァ セラピューティクス （ホン コン） リミテッド Ｉｌ－２組成物およびその使用方法
AU2020323893A1 (en) 2019-07-26 2022-02-17 Visterra, Inc. Interleukin-2 agents and uses thereof
KR20220116513A (ko) * 2019-12-20 2022-08-23 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 신규 il2 작용제 및 이의 사용 방법
GB2609554B (en) 2020-01-03 2025-08-20 Marengo Therapeutics Inc Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
AU2021206449A1 (en) 2020-01-10 2022-07-21 Bright Peak Therapeutics Ag Modified IL-2 polypeptides and uses thereof
EP4090674A4 (en) 2020-01-14 2024-01-24 Synthekine, Inc. Biased il2 muteins methods and compositions
KR20220137672A (ko) 2020-02-13 2022-10-12 에프. 호프만-라 로슈 아게 핵 자기 공명 이완법으로 aav 입자의 부하 상태를 결정하는 방법
US11981715B2 (en) 2020-02-21 2024-05-14 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a CD39 effector
JP2023518443A (ja) * 2020-03-19 2023-05-01 イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド インターロイキン２変異体およびその使用
CN116323647A (zh) 2020-05-13 2023-06-23 博纳姆治疗公司 蛋白质复合物的组合物及其使用方法
CN113912735B (zh) * 2020-07-08 2025-03-28 南京师范大学 多肽二聚体及其用途
WO2022050401A2 (en) * 2020-09-01 2022-03-10 Takeda Pharmaceutical Company Limited Interleukin-2 muteins and uses thereof
WO2022087458A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 Asher Biotherapeutics, Inc. Fusions with cd8 antigen binding molecules for modulating immune cell function
CA3195260A1 (en) 2020-10-29 2022-05-05 Bristol-Myers Squibb Company Fusion proteins for the treatment of disease
CN112724259B (zh) * 2020-11-16 2022-12-20 天津林达生物科技有限公司 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
TW202237171A (zh) 2020-12-04 2022-10-01 美商威特拉公司 使用介白素-2藥劑之方法
JP2023551563A (ja) * 2020-12-04 2023-12-08 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ｐＨ依存性変異体インターロイキン－２ポリペプチド
CN116964068A (zh) 2021-02-24 2023-10-27 豪夫迈·罗氏有限公司 深度过滤器的再生和多次使用
CN115232215B (zh) * 2021-04-23 2026-03-27 湖州芈首生物技术有限公司 一种融合蛋白ABD/Fc/IL-2及其编码基因、制备方法和应用
EP4340866A4 (en) 2021-05-19 2025-05-21 Asher Biotherapeutics, Inc. Il-21 polypeptides and targeted constructs
CN113789346A (zh) * 2021-08-25 2021-12-14 北京伟德杰生物科技有限公司 长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用
US20240376172A1 (en) * 2021-10-06 2024-11-14 Iltoo Pharma Interleukin 2 chimeric constructs with targeting specificy to inflamed tissues
GB202115122D0 (en) * 2021-10-21 2021-12-08 Dualyx Nv Binding molecules targeting IL-2 receptor
AU2022477937A1 (en) 2022-09-12 2025-04-10 Assistance Publique - Hôpitaux De Paris Interleukin-2 for use in treating autism spectrum disorder
CN116041539B (zh) * 2022-10-31 2023-07-21 山东博安生物技术股份有限公司 Il-2突变体免疫缀合物
CN116554356B (zh) * 2023-05-16 2024-01-23 武汉大学 一种hyperIL-15与sCD4及Fc的融合蛋白及其应用

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL7802170A (nl) 1977-04-18 1978-10-20 Hitachi Metals Ltd Sierraad.
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
WO1985000817A1 (en) 1983-08-10 1985-02-28 Amgen Microbial expression of interleukin ii
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
HUP0100813A3 (en) 1998-02-25 2003-08-28 Lexigen Pharmaceuticals Corp L Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US6955807B1 (en) * 1998-05-15 2005-10-18 Bayer Pharmaceuticals Corporation IL-2 selective agonists and antagonists
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
NZ517906A (en) 1999-10-04 2003-01-31 Medicago Inc Cloning of genomic sequences encoding nitrite reductase (NiR) for use in regulated expression of foreign genes in host plants
US6962696B1 (en) 1999-10-04 2005-11-08 Vion Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
AU2002357784B2 (en) * 2001-12-04 2008-07-31 Merck Patent Gmbh Immunocytokines with modulated selectivity
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
US7569215B2 (en) 2003-07-18 2009-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptides
WO2005091956A2 (en) * 2004-03-05 2005-10-06 Chiron Corporation In vitro test system for predicting patient tolerability of therapeutic agents
NZ550217A (en) 2004-03-31 2009-11-27 Genentech Inc Humanized anti-TGF-beta antibodies
EP2357201B1 (en) 2004-04-13 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
WO2006058077A1 (en) 2004-11-24 2006-06-01 Schering Corporation Dap-10 and uses thereof
AU2007271398B2 (en) 2006-07-06 2013-06-20 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for enhancing the efficacy of IL-2 mediated immune responses
AU2008278803A1 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Astrazeneca Ab Targeted binging agents directed to KDR and uses thereof - 035
US8906356B2 (en) 2007-11-05 2014-12-09 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptides
JP2011507519A (ja) 2007-12-19 2011-03-10 セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド ｐＩＸ又はｐＶＩＩへの融合を介したヒトデノボｐＩＸファージディスプレイライブラリの設計及び作製、ベクター、抗体、及び方法
DE102008023820A1 (de) 2008-05-08 2009-11-12 Aicuris Gmbh & Co. Kg Mittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Autoimmunerkrankung und zur Bildung von Regulatorischen T-Zellen
MX2011007647A (es) 2009-01-21 2011-09-01 Amgen Inc Composiciones y metodos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes.
EA034742B1 (ru) 2010-08-13 2020-03-16 Роше Гликарт Аг Антитела к fap, полинуклеотид, вектор и клетка для их получения и их применения
CU23923B1 (es) 2010-11-12 2013-07-31 Ct De Inmunología Molecular Polipéptidos derivados de la il-2 con actividad agonista
LT3075745T (lt) 2011-02-10 2018-11-26 Roche Glycart Ag Mutavę interleukino-2 polipeptidai
PL2683395T3 (pl) 2011-03-11 2019-04-30 Assist Publique Hopitaux De Paris Zastosowanie małych dawek il-2 do leczenia cukrzycy typu 1
HUE041335T2 (hu) 2011-03-29 2019-05-28 Roche Glycart Ag Antitest FC-variánsok
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
EP2723380B1 (en) * 2011-06-24 2019-08-21 Stephen D. Gillies Light chain immunoglobulin fusion proteins and methods of use thereof
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
US9546203B2 (en) 2013-03-14 2017-01-17 Amgen Inc. Aglycosylated Fc-containing polypeptides with cysteine substitutions
RS58149B1 (sr) 2014-02-06 2019-02-28 Hoffmann La Roche Fuzioni proteini interleukina-2 i njihova upotreba
MA40094B1 (fr) 2014-08-06 2022-05-31 Univ Miami Protéines de fusion de l'interleukine-2/récepteur alpha de l'interleukine-2 et procédés d'utilisation

Also Published As

Publication number Publication date
MX2016009687A (es) 2017-03-10
EA201691576A1 (ru) 2016-12-30
US11098099B2 (en) 2021-08-24
MA39250A1 (fr) 2018-03-30
BR112016018288A2 (pt) 2017-10-10
MA39250B1 (fr) 2018-09-28
EP3508496A1 (en) 2019-07-10
CL2016001968A1 (es) 2017-02-24
PH12016501406B1 (en) 2022-04-22
TW201534625A (zh) 2015-09-16
CN105980410B (zh) 2020-02-28
AR099289A1 (es) 2016-07-13
ZA201603262B (en) 2019-10-30
PT3102595T (pt) 2019-01-11
AU2015215001A1 (en) 2016-05-19
UA120847C2 (uk) 2020-02-25
AU2019264579A1 (en) 2019-12-05
IL245484A0 (en) 2016-06-30
DK3102595T3 (en) 2019-02-04
NZ760289A (en) 2023-05-26
JP2017510551A (ja) 2017-04-13
HRP20190028T1 (hr) 2019-02-22
KR20160103134A (ko) 2016-08-31
JP2018102312A (ja) 2018-07-05
EP3102595B1 (en) 2018-11-07
EA034350B1 (ru) 2020-01-30
EP3102595A1 (en) 2016-12-14
ES2704731T3 (es) 2019-03-19
AU2015215001B2 (en) 2019-08-15
IL245484B (en) 2019-10-31
KR20190126205A (ko) 2019-11-08
PL3102595T3 (pl) 2019-04-30
CN105980410A (zh) 2016-09-28
JP6306201B2 (ja) 2018-04-04
KR102042246B1 (ko) 2019-11-28
MX370283B (es) 2019-12-09
TWI671318B (zh) 2019-09-11
SI3102595T1 (sl) 2019-02-28
HUE041530T2 (hu) 2019-05-28
MX2019014695A (es) 2020-02-07
US20150218260A1 (en) 2015-08-06
CR20160333A (es) 2016-09-05
CA2931114A1 (en) 2015-08-13
NZ719654A (en) 2020-06-26
PE20161324A1 (es) 2016-11-25
EA201992609A1 (ru) 2020-03-04
CN111423513A (zh) 2020-07-17
SG11201606369XA (en) 2016-09-29
WO2015118016A1 (en) 2015-08-13
PH12016501406A1 (en) 2016-08-31
LT3102595T (lt) 2019-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11365232B2 (en) Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
RS58149B1 (sr) Fuzioni proteini interleukina-2 i njihova upotreba
US20250368748A1 (en) Agonistic tumor necrosis factor receptor superfamily polypeptides
RS63591B1 (sr) Anti-lag3 antitela
TWI811703B (zh) 與ｃｄ３及ｃｄ１９結合之抗體
KR20230025665A (ko) Cd3에 결합하는 항체
KR20240119146A (ko) 세포 치료에 이용하기 위한 cd45의 식별 가능한 세포 표면 단백질 변이체
HK1228933B (zh) 白介素-2融合蛋白和其用途
HK1228933A1 (en) Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
HK40057663B (zh) 与cd3结合的抗体