PL210395B1 - Test immunologiczny na obecność bakterii - Google Patents
Test immunologiczny na obecność bakteriiInfo
- Publication number
- PL210395B1 PL210395B1 PL383361A PL38336107A PL210395B1 PL 210395 B1 PL210395 B1 PL 210395B1 PL 383361 A PL383361 A PL 383361A PL 38336107 A PL38336107 A PL 38336107A PL 210395 B1 PL210395 B1 PL 210395B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- bacteria
- cms
- concentration
- bacterial
- glycine
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 33
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 31
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000007986 glycine-NaOH buffer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 241001136168 Clavibacter michiganensis Species 0.000 claims description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 10
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 10
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 8
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 4
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241001430228 Clavibacter sepedonicus Species 0.000 description 3
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 3
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 2
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920000715 Mucilage Polymers 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000212384 Bifora Species 0.000 description 1
- 101100028900 Caenorhabditis elegans pcs-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000448472 Gramma Species 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- SBKRTALNRRAOJP-BWSIXKJUSA-N N-[(2S)-4-amino-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-4-amino-1-oxo-1-[[(3S,6S,9S,12S,15R,18R,21S)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-15-benzyl-3-[(1R)-1-hydroxyethyl]-12-(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxobutan-2-yl]-6-methylheptanamide (6S)-N-[(2S)-4-amino-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-4-amino-1-oxo-1-[[(3S,6S,9S,12S,15R,18R,21S)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-15-benzyl-3-[(1R)-1-hydroxyethyl]-12-(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxobutan-2-yl]-6-methyloctanamide sulfuric acid Polymers OS(O)(=O)=O.CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@@H](CCN)NC1=O)[C@@H](C)O.CC[C@H](C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@@H](CCN)NC1=O)[C@@H](C)O SBKRTALNRRAOJP-BWSIXKJUSA-N 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 1
- 241001467567 Rathayibacter Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000032798 delamination Effects 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000013100 final test Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229960003548 polymyxin b sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005068 transpiration Effects 0.000 description 1
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest zastosowanie powierzchniowego antygenu bakteryjnego otrzymanego z komórek bakterii poprzez przemywanie bakterii roztworem buforowym wybranym spośród roztworu buforowego glicyna - HCl lub roztworu buforowego glicyna - NaOH do uzyskiwania przeciwciał do testów immunologicznych do wykrywania komórek bakterii.
Description
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie powierzchniowego antygenu bakteryjnego otrzymanego z komórek bakterii do uzyskiwania przeciwciał do wytwarzania testu immunologicznego do wykrywania komórek bakterii, zwłaszcza Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
Bakteria Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spickermann et Kotthoff) Davis et al.
(Cms) - sprawca bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, jest jednym z najważniejszych patogenów ziemniaka (Lee i in. 1997, OEPP/EPPO 2006). Synonimy nazwy patogena to: Corynebacterium michiganensis subsp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Carlson et Vidaver, Corynebacterium michiganensis pv. sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Dye et Kemp oraz Corynebacterium sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Skaptason et Burkholder (OEPP/EPPO, 2006).
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus to gramdodatnie bakterie stanowiące formy pałeczkowate oraz kuliste (OEPP/EPPO, 2006), które wspólnie z rodzajem Rathayibacter tworzą grupę fitopatogenicznych corynebakterii o wspólnym pochodzeniu filogenetycznym (Lee i in. 1997). Kolonie większości szczepów hodowanych na pożywkach agarowych są mukoidalne, jakkolwiek zdarzają się również szczepy pośrednie i niemukolidalne (Bishop i in. 1988, Baer i Gudmestadt 1993).
Do poznanych dotychczas czynników wirulencji Cms należą:
a) Śluzy bakteryjne o kwaśnym charakterze i wielkości 1-10 MDa (Jahr i in. 1999) charakterystyczne są również dla innych podgatunków z gatunku C. michiganensis. Składają się one z kilku (I-III) komponentów cukrowych o podobnym składzie chemicznym, zróżnicowanych pod względem stopnia aglomeracji (Westra i Slack 1992). Występowanie IV komponentu składającego się głównie z mannozy jest charakterystyczne tylko dla bakterii Cms (Denny 1995). Śluzy bakteryjne z jednej strony zabezpieczają komórki bakteryjne przed utratą wilgoci, natomiast z drugiej poprzez fizyczną okluzję na ściankach wiązek przewodzących są przyczyną zahamowania transpiracji i więdnięcia roślin (Jahr i in. 1999).
Skład chemiczny śluzów bakteryjnych oraz ich obecność jest istotna w diagnostyce bakterii Cms opartej na testach serologicznych, w których składniki śluzu wykorzystuje się zazwyczaj jako antygeny. Prawidłowa ocena patogena na podstawie śluzów bakteryjnych jest zależna nie tylko od uwarunkowań genetycznych, lecz również od zmienności w chemicznym charakterze i ilości śluzów produkowanych przez poszczególne szczepy bakterii Cms (Bishop i Slack 1987, Baer i Gudmestadt 1993).
b) Celulaza wytwarzana przez większość przebadanych szczepów Cms (Baer i Gudmestadt 1993) bierze udział w degradacji tkanek wiązki naczyniowej powodując rozwarstwianie się części zewnętrznej bulwy od rdzenia (Jahr i in. 1999, Nissinen i in. 2001). Laine i współpracownicy (2000) wykazali, że celulaza kodowana jest przez gen w natywnym plazmidzie pCSl bakterii Cms (Laine i in. 2000).
c) Toksyczny glikoproteid wyizolowany przez Strobela (1970), poprzez wysokie powinowactwo w stosunku do fragmentów ścian i membran komórek gospodarza, prawdopodobnie powoduje zaburzenia w przepuszczalności tych drugich (Romanenko i in. 1997).
Dotychczas nie zdołano opracować skutecznej metody bezpośredniego chemicznego lub biologicznego zwalczania patogena. Dezynfekcja powierzchni bulw nie spełnia swego zadania wskutek przebywania bakterii w wiązkach naczyniowych, do których nie mają dostępu środki dezynfekujące.
Jednym z najbardziej skutecznych sposobów ograniczenia, czy też eliminacji sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, jest jego wczesne wykrycie. Detekcja potrzebna jest zarówno w procesie produkcji, obróbki, jak i dystrybucji materiału roślinnego. Stąd właściwe metody detekcji powinny być odpowiednio czułe i specyficzne, jak również proste, szybkie, wiarygodne i powtarzalne (Waleron i in. 2003).
Zgodnie z przyjętymi wymogami fitosanitarnymi, prawidłowa diagnostyka sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka wymaga stosowania przynajmniej dwóch testów laboratoryjnych opartych na różnych zasadach biologicznych łącznie z testem patogeniczności (OEPP/EPPO, 2006). W zależności od ekspresji objawów bakteriozy pierścieniowej ziemniaka stosuje się odpowiednie schematy postępowania zawierające testy fizjologiczne, biochemiczne, serologiczne, molekularne i inne (Dyrektywa Komisji WE 2006/56).
Testy fizjologiczne i biochemiczne stosowane do rutynowej kontroli, pozwalają określić właściwości fenotypowe Cms. Zgodnie z najnowszą Dyrektywą Komisji WE, testy te muszą być przeprowadzane przy użyciu izolatów bakterii uzyskanych w procesie pasażowania na agarze odżywczym
PL 210 395 B1 z glukozą. Natomiast porównania morfologiczne muszą być przeprowadzane na kulturach uzyskanych po wzroście na agarze odżywczym z glukozą w obecności znanej kontroli Cms (Dyrektywa Komisji WE 2006/56).
W przypadku roś lin wykazujących wyraź ne symptomy choroby stosuje się izolację bakterii na pożywkach półselektywnych NCP-88 (De la Cruz i in. 1992) oraz MTNA (Jansing i Rudolph 1998), natomiast do rutynowych hodowli czystych kultur bakterii Cms wykorzystuje się ogólne podłoża wzrostowe, jak agar odżywczy (NA), agar odżywczy z glukozą (NDA), agar drożdżowo-peptonowo-glukozowy (YPGA) oraz pożywkę mineralną z glukozą i wyciągiem drożdżowym (YGM) (De Boer i Copeman 1980, Dyrektywa Komisji WE 2006/56).
Jednym z głównych problemów związanych z detekcją i identyfikacją bakterii Cms jest wolne tempo wzrostu tego patogena. Przy bezpośrednim posiewie ekstraktów na pożywkę uniwersalną, obce bakterie saprofityczne, charakteryzujące się znacznie szybszym tempem wzrostu, porastają całą jej powierzchnię, często uniemożliwiając skuteczną izolację czystych szczepów Cms (OEPP/EPPO, 2006). Izolacja patogena na pożywkach półselektywnych zawierających w swym składzie antybiotyki takie jak: siarczan polimyksyny B, kwas nalidyksylowy i cykloheksymid (NCP-88) oraz trimetoprim. kwas nalidyksylowy i amfoterycynę B (MTNA), pozwala znacznie zmniejszyć ilość obcych bakterii. Najlepsze efekty izolacji na podłożu półselektywnym można uzyskać po uprzedniej inokulacji roślin oberżyny ekstraktem z komórkami patogena. Rośliny oberżyny są dobrym środowiskiem dla selektywnego namnażania sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka (OEPP/EPPO 2006).
Test patogeniczności na młodych siewkach oberżyny inokulowanej trzydniową kulturą testowanego izolatu, stosowany jest jako ostateczny test dla potwierdzenia infekcji latentnej oraz oceny wirulencji kultur zidentyfikowanych jako Cms. Test ten cechuje stosunkowo niska czułość (106 CFU/ml) oraz duża czasochłonność - ok. 40 dni. Dla skrócenia czasu testu biologicznego jako roślinę indykatorową stosuje się również tytoń. Wadą tego testu jest niestety mniejsza czułość (108-109 CFU/ml) (OEPP/EPPO 2006).
Jako jedną z metod identyfikacji bakterii Cms przez długi czas stosowano barwienie Gramma wymazów z wydzieliny wiązek naczyniowych z łodygi i bulwy (Glick i in. 1944, Slack 1987). Jednakże jednoznaczna diagnoza tą metodą jest trudna ze względu na możliwość występowania innych gramdodatnich bakterii, jak Clostridium ssp., Bacillus ssp., a także saprofitycznych bakterii z rodzaju Corynebacterium (Crowley i De Boer 1982).
W niektórych pracowniach stosowano również aglutynacyjny test lateksowy pozwalający wykryć 107 komórek w 1 ml (Slack i in. 1979). Test odwróconej pasywnej hemoaglutynacji (RPH) z krwinkami owcy opłaszczonymi przeciwciałami anty-Cms z surowicy królika lub żółtka jaja kury. pozwala na wykrywanie w czasie ok. 90 minut obecności Cms w stężeniu 6x106 komórek w 1 ml (Kohm i Eggers-Schumacher 1995).
Wykrywanie sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka metodami serologicznymi nadal stwarza znaczne trudności ze względu na zróżnicowanie morfologiczne form patogena (Mills i Russell 2003). Powszechnie stosowanymi metodami serologicznymi w detekcji Cms są test pośredniej immunofluorescencji - IF (Slack i in. 1979, De Boer i Copeman 1980) oraz test immunoenzymatyczny - ELISA (ang. Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (Drennan i in. 1993, De Boer i in. 1994, 2005). Jakkolwiek test ELISA niedopuszczony przez EPPO jako test przesiewowy, cieszy się znacznie większym powodzeniem w krajach Ameryki Północnej. Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych MAb 9A1 w teście IF zapewnia wysoką specyficzność (De Boer i Wieczorek 1984) i wykrywalność bakterii Cms w granicach 104 komórek bakterii w 1 ml ekstraktu z tkanki ziemniaka (Baer i Gudmestad 1993). Często dla zwiększenia czułości metod serologicznych stosuje się również tańsze, ale mniej specyficzne przeciwciała poliklonalne. Niestety wadą takiego rozwiązania są występujące często fałszywie pozytywne wyniki wskutek reakcji krzyżowych z innymi bakteriami (Crowley i De Boer 1982) oraz niewykrywanie niemukoidalnych szczepów bakterii Cms (Baer i Gudmestad 1993). Zasadniczym wykrywanym antygenem nie są komórki bakterii Cms, lecz rozpuszczalne egzopolisacharydy, których ilość w stosunku do liczby komórek może być zmienna (Lewosz 1997). Obie metody IF i ELISA pozwalają wykrywać bakterie Cms w bulwach i łodygach ziemniaka, przy czym metoda immunofluorescencyjna wykazuje większą czułość i specyficzność dla bulw, natomiast metoda ELISA pozwala z większą czułością wykrywać patogena w łodygach ziemniaka (De Boer i in. 1994).
We współczesnej diagnostyce wykorzystuje się tradycyjne, posiadające wiele zalet, dobrze sprawdzone metody detekcji mikroorganizmów. Zwykle są one czasochłonne i wymagają stosowania specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego. Wyklucza to przeprowadzenie testu w warunkach polowych,
PL 210 395 B1 gdzie wymagany jest niemal natychmiastowy wynik pomiaru, a próbka powinna być zanalizowana najlepiej w miejscu jej pobrania (Łoś i Węgrzyn, 2005). Ponieważ jak dotąd najskuteczniejszym sposobem ograniczającym rozprzestrzenianie się patogenów bakteryjnych jest ich wczesne wykrycie, toteż warunki takie muszą być spełniane w coraz to większej liczbie procedur. Istnieje zatem rosnące zapotrzebowanie na szybkie, czułe i bezpośrednie metody detekcji, które będą jednocześnie specyficzne i niedrogie, a które umożliwią bieżącą kontrolę zarówno podczas wzrostu roś lin, procesu produkcyjnego, przechowywania, jak i dystrybucji żywności (De Boer i Beumer 1999).
Tak więc problemem jest znalezienie sposobu oceny ilościowej bakterii Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) metodami immunologicznymi przy wykorzystaniu ciał poliklonalnych anty-Cms.
Nieoczekiwanie powyższy problem został rozwiązany poprzez zastosowanie sposobu według prezentowanego wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie powierzchniowego antygenu bakteryjnego otrzymanego z komórek bakterii poprzez przemywanie bakterii roztworem buforowym glicyna - HCl o stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, oraz w pH 1,5 - 3,5, korzystnie w zakresie 2 - 3 i roztworem buforowym glicyna - NaOH o stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, o pH 9,5 - 12, korzystnie w zakresie 10 -11 do uzyskiwania przeciwciał do testów immunologicznych do wykrywania komórek bakterii. Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że antygen pochodzi z bakterii szczepu Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus. Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosuje się szczepy o różnym stopniu mukoidalności. Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że przeciwciało jest znakowane radioaktywnie lub fluorescencyjnie lub koloiloidalnie lub enzymatycznie. Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że przeciwciało koniugowane jest ze złotem koloidalnym.
W związku z powyższym, przedmiotem wynalazku jest także test immunologiczny typu ELISA, IFAS lub inny powszechnie znany charakteryzujący się tym, że antygen pochodzący z komórek bakterii, korzystnie bakterii mukoidalnych takie jak Cms, otrzymano według obejmującego etap przemywania bakterii roztworami buforowymi: glicyna - HCl lub roztwór glicyna - NaOH w celu otrzymania antygenu do otrzymywania przeciwciał.
Równie korzystnie przeciwciało użyte w teście immunologicznym jest znakowane radioaktywnie lub koloidalnie.
W kolejnej realizacji wynalazku przeciwciało pokrywane jest złotem koloidalnym.
P r z y k ł a d 1
Wykorzystanie komórek Cms pozbawionych śluzu do wytwarzania przeciwciał do testów immunologicznych
Sporządzono wodne zawiesiny komórek bakteryjnych posiadanych szczepów bakterii Cms BPR-527, PD 221 oraz PD 406. Zawiesiny trzykrotne przemywano sterylną 2 x dest. H2O i wirowano 15-25 min. 7000 x g na wirówce Beckman J-21. Supernatant odrzucano, a egzopolisacharydy pozostające na odwirowanych komórkach bakteryjnych odmywano 1 - 6 razy 0,001 - 1M buforem glicyna - HCl (pH 1,5 - 3,5), 1 - 6 razy 0,001 - 1M buforem glicyna - NaOH (pH 9,5 - 12), trzykrotnie sterylną H2O odwirowując bakterie za każdym razem jw. Bakterie liofilizowano i następnie sporządzono mieszaninę trzech liofilizatów w stosunku wagowym 1:1:1. Do immunizacji podskórnej królika stosowano 1% wodną zawiesinę liofilizatu z dodatkiem adiuwanta Gerbu 100 (1:1, v/v). Zawiesinę podawano sześciokrotnie w dwutygodniowych odstępach w 1 ml porcjach. Skrwawianie królika i izolację przeciwciał wykonywano wg Ball i inni (1993). Krew pobierano z żyły brzeżnej ucha królika bezpośrednio do probówek wirówkowych. Po zebraniu pozostawiano do skrzepnięcia 30 minut w temperaturze 37°C, a następnie przez noc w 4°C. Skrzep delikatnie oddzielano od ścianek i wirowano 15 minut 1000 x g w temp. 4°C w wirówce Beckman J-21. Surowicę zlewano delikatnie znad osadu, dodawano NaN3 do stężenia 0,02%, dziesięciokrotnie rozcieńczano 2 x dest. H2O i dodawano równoważną objętość nasyconego siarczanu amonu, delikatnie mieszano i pozostawiano na 60 min w temperaturze pokojowej w celu wytrącenia osadu. Mieszaninę zwirowywano 5 min 8000 x g na wirówce Sorvall RC-5B, usuwano supernatant, a osad rozpuszczano w buforze 0,5 x PBS pH 7,4 w objętości dwukrotnie większej niż początkowa objętość surowicy i dializowano przez noc wobec trzech zmian tego samego buforu z 0,02% NaN3. Dializowany roztwór nakładano na kolumnę wypełnioną DEAE - celulozą zrównoważoną buforem 0,5 x PBS z 0,02% NaN3, którym następnie przemywano złoże uzyskując elucję przeciwciał. Zbierano 3 ml frakcje, dla których stosunek absorbancji A280/A250 = 2,5 + 2,7. Frakcje łąPL 210 395 B1 czono i filtrowano następnie przez filtr antybakteryjny 0,2 μm i przechowywano w 4°C. Roztwory przeciwciał doprowadzano ww. buforem do stężenia 2 mg/ml, przyjmując, że absorbancja IgG w stężeniu 1 mg/ml przy λ = 280 nm wynosi 1,4. Przeciwciała reagują z komórkami Cms pokrytymi śluzem oraz reagują nieznacznie z komórkami częściowo pozbawionymi śluzu bakteryjnego (tabela 1).
T a b e l a 1
Porównanie miana przeciwciał anty-Cms względem średnio mukoidalnego szczepu bakterii Cms - PD 221 104 CFU/ml oceniane testem IF
| IgG | Zawiesina bakterii Cms | Miano | Ślepa bez IgG) | |||||
| 1:200 | 1:400 | 1:800 | 1:1600 | 1:3200 | 1:6400 | - | ||
| IgG skierowane na omponenty śluzu bakteryjnego | Bakterie w zawiesinie wodnej | + | + | +/- | -/+ | -/+ | -/+ | - |
| Bakterie przemyte 3-krotnie wodą podwójnie destylowaną | + | + | +/- | -/+ | - | - | - | |
| Bakterie przemyte buforem o odczynie kwaśnym | + | +/- | - | - | - | - | - | |
| Bakterie przemyte buforem o odczynie zasadowym | + | +/- | + | - | - | - | - | |
| IgG skierowane na komórki bakteryjne bez śluzu | Bakterie w zawiesinie wodnej | - | - | - | - | - | - | - |
| Bakterie przemyte 3-krotnie wodą podwójnie destylowaną | + | - | - | - | - | - | - | |
| Bakterie przemyte buforem o odczynie kwaśnym | +/- | -/+ | - | - | - | - | - | |
| Bakterie przemyte buforem o odczynie zasadowym | + | + | -/+ | - | - | - | - |
Legenda: + - silna fluorescencja, +/- - średnia fluorescencja, -/+ - słaba fluorescencja, - brak fluorescencji
P r z y k ł a d 2
Sposób znakowania przeciwciał poliklonalnych skierowanych na bakterie Clavibacter michiganensis subsp sepedonicus
W celu uzyskania fragmentów przeciwciał, przeprowadzano redukcję wiązań dwusiarczkowych S-S całych cząsteczek IgG inkubując je w roztworze EDTA - DTT w warunkach beztlenowych. Sporządzono sześć roztworów o różnych stężeniach przeciwciał w zakresie od 20 do 500 μg/ml w 0,2 ml końcowej objętości świeżo sporządzanego roztworu EDTA - DTT. Roztwory w 1,5 ml probówkach Eppendorf umieszczano i inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej pod próżnią 0,1 MPa. Po rozszczelnieniu układu, roztwory z uzyskanymi fragmentami IgG natychmiast łączono ze standardowym roztworem złota koloidalnego OD 4,0 sporządzając mieszaniny w proporcji 1:1 (v/v). Roztwory inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej łagodnie mieszając, po czym pobierano po 50 μl każdego z roztworów i mieszano z 50 μl 2 N NaCl. Po ustaleniu optymalnych proporcji, złoto koloidalne mieszano z odpowiednią ilością zredukowanych przeciwciał i inkubowano 5-60 minut w temp. pokojowej łagodnie mieszając. Dla uniknięcia niespecyficznej sorpcji, pozostałą powierzchnię złota koloidalnego blokowano 1-20% roztworem BSA, natomiast nadmiar niezwiązanych fragmentów przeciwciał usuwano z roztworu koniugatu poprzez trzykrotne płukanie roztworem TBS - BSA i zatężanie na wirówce Eppendorf 5415C (0,5-2 godzin przy 1000-4000 x g). Osad uzyskany przy ostatnim wirowaniu, doprowadzano buforem TBS - BSA do gęstości optycznej OD535 nm = 0,1-4,0 i przechowywano w 4°C (roztwór IgG-Au1).
P r z y k ł a d 3
Sposób znakowania przeciwciał poliklonalnych skierowanych na bakterie Clavibacter michiganensis subsp przypadkowy z całymi cząsteczkami IgG
Sporządzano roztwory przeciwciał o stężeniu 0,01-1 mg/ml, które dializowano przez noc w 4°C wobec trzech zmian 10 mM buforu boranowego pH 9,2 i doprowadzano do stężenia 0,1 mg/ml przyjmując, że A280 nm takich roztworów odpowiada wartości 0,140. Natomiast standardowy roztwór złota koloidalnego doprowadzano 10 mM buforem boranowym do pH 9,0. Wstępne miareczkowanie przeprowadzono sporządzając roztwory IgG o stężeniach od 5 do 50 Lil/ml, które łączono z dwukrotną
PL 210 395 B1 objętością standardowego roztworu złota koloidalnego OD 4,0, mieszano i inkubowano 10 minut w temp. pokojowej. Następnie pobierano po 50 μΐ każdego z roztworów i mieszano z 50 μΐ 2 N NaCl. Po ustaleniu optymalnych proporcji, złoto koloidalne mieszano z odpowiednią ilością zredukowanych przeciwciał i inkubowano 5-60 minut w temp. pokojowej łagodnie mieszając. Dalej postępowano podobnie jak w punkcie 1. Osad uzyskany przy ostatnim wirowaniu, doprowadzano buforem TBS - BSA do gęstości optycznej OD 535 nm = 0,1-4,0 i przechowywano w 4°C (roztwór IgG-Au2).
P r z y k ł a d 4
Opłaszczanie złota koloidalnego koniugatem IgG - alkaliczna fosfataza (AP)
Roztwór koniugatu IgG anty-Cms - AP dializowano przez noc w 4°C wobec trzech zmian 2 mM buforu boranowego pH 6,0-11,0 i doprowadzano do stężenia 0,1-1,0 mg/ml. Natomiast standardowy roztwór złota koloidalnego doprowadzano 2 mM buforem boranowym do pH 6,0-11,0. Sporządzono serię mieszanin złota koloidalnego z koniugatem IgG - AP w stężeniach 5-50 μg/ml, inkubowano 5-60 minut w temp. pokojowej, a następnie pobierano po 50 μl każdego z roztworów i mieszano z 50 μl 2 N NaCl. Po dobraniu odpowiedniego stężenia koniugatu, postępowano podobnie jak w punkcie 2, z tą różnicą, że stosowano bufor TBS - BSA z dodatkiem 0,01 - 100 mM MgC12 jako stabilizatora aktywności alkalicznej fosfatazy i przeciwciał. Uzyskany koniugat IgG-AP - złoto koloidalne doprowadzano buforem TBS - BSA z MgC12 do gęstości optycznej OD 524 nm = 0,1 - 4,0 i przechowywano w 4°C.
Claims (6)
1. Zastosowanie powierzchniowego antygenu bakteryjnego otrzymanego z komórek bakterii poprzez przemywanie bakterii roztworem buforowym glicyna - HCl o stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, oraz w pH 1,5 - 3,5, korzystnie w zakresie 2 - 3 i roztworem buforowym glicyna - NaOH o stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, o pH 9,5 - 12, korzystnie w zakresie 10 - 11 do uzyskiwania przeciwciał do testów immunologicznych do wykrywania komórek bakterii.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że antygen pochodzi z bakterii szczepu Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus.
3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że stosuje się szczepy o różnym stopniu mukoidalności.
4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest znakowane radioaktywnie lub fluorescencyjnie lub koloidalnie lub enzymatycznie.
5. Zastosowanie według zastrz.
6, znamienne tym, że przeciwciało koniugowane jest ze złotem koloidalnym.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL383361A PL210395B1 (pl) | 2007-09-16 | 2007-09-16 | Test immunologiczny na obecność bakterii |
| EP08830138.7A EP2205735B1 (en) | 2007-09-16 | 2008-09-16 | Immunological tests for the presence of bacteria which make use of antibodies obtained using a specific method |
| US12/676,671 US8642275B2 (en) | 2007-09-16 | 2008-09-16 | Immunological tests for the presence of bacteria which make use of antibodies obtained using a specific method |
| PCT/PL2008/050015 WO2009035357A2 (en) | 2007-09-16 | 2008-09-16 | Immunological tests for the presence of bacteria which make use of antibodies obtained using a specific method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL383361A PL210395B1 (pl) | 2007-09-16 | 2007-09-16 | Test immunologiczny na obecność bakterii |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL383361A1 PL383361A1 (pl) | 2009-03-30 |
| PL210395B1 true PL210395B1 (pl) | 2012-01-31 |
Family
ID=42984839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL383361A PL210395B1 (pl) | 2007-09-16 | 2007-09-16 | Test immunologiczny na obecność bakterii |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL210395B1 (pl) |
-
2007
- 2007-09-16 PL PL383361A patent/PL210395B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL383361A1 (pl) | 2009-03-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Freundt et al. | Chapter IX Identification of Mycoplasmas | |
| Oeding | Antigenic properties of Staphylococcus aureus | |
| Dieste-Pérez et al. | Diagnostic performance of serological tests for swine brucellosis in the presence of false positive serological reactions | |
| Rajeshwari et al. | Development of ELISA for the detection of Ralstonia solanacearum in tomato: its application in seed health testing | |
| WO1995014712A1 (en) | Streptococcus pneumoniae hemin/hemoglobin-binding antigens | |
| Hu et al. | Quantitative detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus by competitive polymerase chain reaction | |
| PL210395B1 (pl) | Test immunologiczny na obecność bakterii | |
| Barnes et al. | Comparison of enzyme immunoassay-based assays for environmental Alternaria alternata | |
| JAMAUX‐DESPRÉAUX et al. | Comparison of responses of ascospores and mycelium by ELISA with anti‐mycelium and anti‐ascospore antisera for the development of a method to detect Sclerotinia sclerotiorum on petals of oilseed rape | |
| Toloza-Moreno et al. | Immunodetection of Furcraea Necrotic Streak Virus-FNSV in fique plants (Furcraea macrophylla Baker) using a polyclonal antibody IgY produced in chicken egg yolk | |
| WO1997010351A1 (en) | Exopolysaccharides of burkholderia pseudomallei and burkholderia mallei | |
| PL213858B1 (pl) | Sposób wykrywania obecności bakterii Clavibacter michiganensis ssp sepedonicus, w analizowanej próbce | |
| US8642275B2 (en) | Immunological tests for the presence of bacteria which make use of antibodies obtained using a specific method | |
| LINFIELD et al. | A serological test for detecting Botrytis allii, the cause of neck rot of onion bulbs | |
| Bauer | Lectins as determinants of specificity in legume-Rhizobium symbiosis | |
| PL213857B1 (pl) | Sposób wykrywania obecności bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus z wykorzystaniem membran poliwęglanowych zawierających immobilizowane przeciwciała | |
| Masover et al. | Some effects of growth medium composition on the antigenicity of a T-strain mycoplasma | |
| US7090997B2 (en) | Diagnostic agent and test method for colon cancer using tannase as index | |
| PL210394B1 (pl) | Sposób usuwania śluzów bakteryjnych | |
| JP2002539819A (ja) | ウィップル病の診断 | |
| Manasa et al. | Immunodiagnosis of bacterial wilt pathogen using polyclonal antiserum to Ralstonia solanacearum. | |
| Kiseleva et al. | Methodological approach to the study of dynamics of specific concentration of cell wall antigens per cell of Bacillus species and examples of its application | |
| KR20200029943A (ko) | 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 야토균 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주 | |
| López-Ribot et al. | Common and form-specific cell wall antigens of Candida albicans as released by chemical and enzymatic treatments | |
| Mohammed et al. | Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for endotoxin in milk |