PL210394B1 - Sposób usuwania śluzów bakteryjnych - Google Patents
Sposób usuwania śluzów bakteryjnychInfo
- Publication number
- PL210394B1 PL210394B1 PL383362A PL38336207A PL210394B1 PL 210394 B1 PL210394 B1 PL 210394B1 PL 383362 A PL383362 A PL 383362A PL 38336207 A PL38336207 A PL 38336207A PL 210394 B1 PL210394 B1 PL 210394B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- bacteria
- cms
- glycine
- bacterial
- mucus
- Prior art date
Links
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 79
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 title claims abstract description 50
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 63
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 15
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 241001430228 Clavibacter sepedonicus Species 0.000 claims abstract description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 claims description 10
- 239000007986 glycine-NaOH buffer Substances 0.000 claims description 10
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 7
- CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].NCC([O-])=O CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 10
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 abstract description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 19
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 11
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 9
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 8
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 229920000715 Mucilage Polymers 0.000 description 5
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 5
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 4
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 3
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 2
- 241001136168 Clavibacter michiganensis Species 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000212384 Bifora Species 0.000 description 1
- 101100028900 Caenorhabditis elegans pcs-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000448472 Gramma Species 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- SBKRTALNRRAOJP-BWSIXKJUSA-N N-[(2S)-4-amino-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-4-amino-1-oxo-1-[[(3S,6S,9S,12S,15R,18R,21S)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-15-benzyl-3-[(1R)-1-hydroxyethyl]-12-(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxobutan-2-yl]-6-methylheptanamide (6S)-N-[(2S)-4-amino-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-4-amino-1-oxo-1-[[(3S,6S,9S,12S,15R,18R,21S)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-15-benzyl-3-[(1R)-1-hydroxyethyl]-12-(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxobutan-2-yl]-6-methyloctanamide sulfuric acid Polymers OS(O)(=O)=O.CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@@H](CCN)NC1=O)[C@@H](C)O.CC[C@H](C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@@H](CCN)NC1=O)[C@@H](C)O SBKRTALNRRAOJP-BWSIXKJUSA-N 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 1
- 241001467567 Rathayibacter Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000032798 delamination Effects 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 238000013100 final test Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000003843 mucus production Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229960003548 polymyxin b sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005068 transpiration Effects 0.000 description 1
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Sposób usuwania śluzów bakteryjnych, szczególnie szczepów Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, charakteryzuje się tym, że obejmuje przemywanie bakterii roztworami buforowymi: glicyna - HCl lub glicyna - NaOH.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób usuwania śluzów bakteryjnych, szczególnie bakterii mukoidalnych takich jak Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
Bakteria Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spickermann et Kotthof) Davis et al. (Cms) - sprawca bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, jest jednym z najważniejszych patogenów ziemniaka (Lee i in. 1997, OEPP/EPPO 2006). Synonimy nazwy patogena to: Corynebacterium michiganensis subsp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Carlson et Vidaver, Corynebacterium michiganensis pv. sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Dye et Kemp oraz Corynebacterium sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Skaptason et Burkholder (OEPP/EPPO, 2006).
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus to gramdodatnie bakterie stanowiące formy pałeczkowate oraz kuliste (OEPP/EPPO, 2006), które wspólnie z rodzajem Rathayibacter tworzą grupę fitopatogenicznych corynebakterii o wspólnym pochodzeniu filogenetycznym (Lee i in. 1997). Kolonie większości szczepów hodowanych na pożywkach agarowych są mukoidalne, jakkolwiek zdarzają się również szczepy pośrednie i niemukoidalne (Bishop i in. 1988, Baer i Gudmestadt 1993).
Do poznanych dotychczas czynników wirulencji Cms należą:
a) Śluzy bakteryjne o kwaśnym charakterze i wielkości 1-10 MDa (Jahr i in. 1999) charakterystyczne są również dla innych podgatunków z gatunku C. michiganensis. Składają się one z kilku (I-III) komponentów cukrowych o podobnym składzie chemicznym, zróżnicowanych pod względem stopnia aglomeracji (Westra i Slack 1992). Występowanie IV komponentu składającego się głównie z mannozy jest charakterystyczne tylko dla bakterii Cms (Denny 1995). Śluzy bakteryjne z jednej strony zabezpieczają komórki bakteryjne przed utratą wilgoci, natomiast z drugiej poprzez fizyczną okluzję na ściankach wiązek przewodzących są przyczyną zahamowania transpiracji i więdnięcia roślin (Jahr i in. 1999).
Skład chemiczny śluzów bakteryjnych oraz ich obecność jest istotna w diagnostyce bakterii Cms opartej na testach serologicznych, w których składniki śluzu wykorzystuje się zazwyczaj jako antygeny. Prawidłowa ocena patogena na podstawie śluzów bakteryjnych jest zależna nie tylko od uwarunkowań genetycznych, lecz również od zmienności w chemicznym charakterze i ilości śluzów produkowanych przez poszczególne szczepy bakterii Cms (Bishop i Slack 1987, Baer i Gudmestad 1993).
b) Celulaza wytwarzana przez większość przebadanych szczepów Cms (Baer i Gudmestad 1993) bierze udział w degradacji tkanek wiązki naczyniowej powodując rozwarstwianie się części zewnętrznej bulwy od rdzenia (Jahr i in. 1999, Nissinen i in. 2001). Laine i współpracownicy (2000) wykazali, że celulaza kodowana jest przez gen w natywnym plazmidzie pCS1 bakterii Cms (Laine i in. 2000).
c) Toksyczny glikoproteid wyizolowany przez Strobela (1970), poprzez wysokie powinowactwo w stosunku do fragmentów ś cian i membran komórek gospodarza, prawdopodobnie powoduje zaburzenia w przepuszczalności tych drugich (Romanenko i in. 1997).
Dotychczas nie zdołano opracować skutecznej metody bezpośredniego chemicznego lub biologicznego zwalczania patogena. Dezynfekcja powierzchni bulw nie spełnia swego zadania wskutek przebywania bakterii w wiązkach naczyniowych, do których nie mają dostępu środki dezynfekujące.
Jednym z najbardziej skutecznych sposobów ograniczenia, czy też eliminacji sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, jest jego wczesne wykrycie. Detekcja potrzebna jest zarówno w procesie produkcji, obróbki, jak i dystrybucji materiału roślinnego. Stąd właściwe metody detekcji powinny być odpowiednio czułe i specyficzne, jak również proste, szybkie, wiarygodne i powtarzalne (Waleron i in. 2003).
Zgodnie z przyjętymi wymogami fitosanitarnymi, prawidłowa diagnostyka sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka wymaga stosowania przynajmniej dwóch testów laboratoryjnych opartych na różnych zasadach biologicznych łącznie z testem patogeniczności (OEPP/EPPO, 2006). W zależności od ekspresji objawów bakteriozy pierścieniowej ziemniaka stosuje się odpowiednie schematy postępowania zawierające testy fizjologiczne, biochemiczne, serologiczne, molekularne i inne (Dyrektywa Komisji WE 2006/56).
Testy fizjologiczne i biochemiczne stosowane do rutynowej kontroli, pozwalają określić właściwości fenotypowe Cms. Zgodnie z najnowszą Dyrektywą Komisji WE, testy te muszą być przeprowadzane przy użyciu izolatów bakterii uzyskanych w procesie pasażowania na agarze odżywczym z glukozą. Natomiast porównania morfologiczne muszą być przeprowadzane na kulturach uzyskanych
PL 210 394 B1 po wzroście na agarze odżywczym z glukozą w obecności znanej kontroli Cms (Dyrektywa Komisji WE 2006/56).
W przypadku roś lin wykazujących wyraź ne symptomy choroby stosuje się izolację bakterii na pożywkach półselektywnych NCP-88 (De la Cruz i in. 1992) oraz MTNA (Jansing i Rudolph 1998), natomiast do rutynowych hodowli czystych kultur bakterii Cms wykorzystuje się ogólne podłoża wzrostowe, jak agar odżywczy (NA), agar odżywczy z glukozą (NDA), agar drożdżowo-peptonowo-glukozowy (YPGA) oraz pożywkę mineralną z glukozą i wyciągiem drożdżowym (YGM) (De Boer i Copeman 1980, Dyrektywa Komisji WE 2006/56).
Jednym z głównych problemów związanych z detekcją i identyfikacją bakterii Cms jest wolne tempo wzrostu tego patogena. Przy bezpośrednim posiewie ekstraktów na pożywkę uniwersalną, obce bakterie saprofityczne, charakteryzujące się znacznie szybszym tempem wzrostu, porastają całą jej powierzchnię, często uniemożliwiając skuteczną izolację czystych szczepów Cms (OEPP/EPPO, 2006). Izolacja patogena na pożywkach półselektywnych zawierających w swym składzie antybiotyki takie jak: siarczan polimyksyny B, kwas nalidyksylowy i cykloheksymid (NCP-88) oraz trimetoprim, kwas nalidyksylowy i amfoterycynę B (MTNA), pozwala znacznie zmniejszyć ilość obcych bakterii. Najlepsze efekty izolacji na podłożu półselektywnym można uzyskać po uprzedniej inokulacji roślin oberżyny ekstraktem z komórkami patogena. Rośliny oberżyny są dobrym środowiskiem dla selektywnego namnażania sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka (OEPP/EPPO 2006).
Test patogeniczności na młodych siewkach oberżyny inokulowanej trzydniową kulturą testowanego izolatu, stosowany jest jako ostateczny test dla potwierdzenia infekcji latentnej oraz oceny wirulencji kultur zidentyfikowanych jako Cms. Test ten cechuje stosunkowo niska czułość (106 CFU/ml) oraz duża czasochłonność - około 40 dni. Dla skrócenia czasu testu biologicznego jako roślinę indykatorową stosuje się również tytoń. Wadą tego testu jest niestety mniejsza czułość (108-109 CFU/ml) (OEPP/EPPO 2006).
Jako jedną z metod identyfikacji bakterii Cms przez długi czas stosowano barwienie Gramma wymazów z wydzieliny wiązek naczyniowych z łodygi i bulwy (Glick i in. 1944, Slack 1987). Jednakże jednoznaczna diagnoza tą metodą jest trudna ze względu na możliwość występowania innych gramdodatnich bakterii, jak Clostridium ssp. Bacillus ssp., a także saprofitycznych bakterii z rodzaju Corynebacterium (Crowley i De Boer 1982).
W niektórych pracowniach stosowano również aglutynacyjny test lateksowy pozwalający wykryć 107 komórek w 1 ml (Slack i in. 1979). Test odwróconej pasywnej hemoaglutynacji (RPH) z krwinkami owcy opłaszczonymi przeciwciałami anty-Cms z surowicy królika lub żółtka jaja kury, pozwala na wykrywanie w czasie ok. 90 minut obecności Cms w stężeniu 6x106 komórek w 1 ml (Kohm i Eggers-Schumacher 1995).
Wykrywanie sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka metodami serologicznymi nadal stwarza znaczne trudności ze względu na zróżnicowanie morfologiczne form patogena (Mills i Russell 2003). Powszechnie stosowanymi metodami serologicznymi w detekcji Cms są test pośredniej immunofluorescencji - IF (Slack i in. 1979, De Boer i Copeman 1980) oraz test immunoenzymatyczny ELISA (ang. Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (Drennan i in. 1993, De Boer i in. 1994, 2005). Jakkolwiek test ELISA niedopuszczony przez EPPO jako test przesiewowy, cieszy się znacznie większym powodzeniem w krajach Ameryki Północnej. Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych MAb 9A1 w teście IF zapewnia wysoką specyficzność (De Boer i Wieczorek 1984) i wykrywalność bakterii Cms w granicach 104 komórek bakterii w 1 ml ekstraktu z tkanki ziemniaka (Baer i Gudmestad 1993). Często dla zwiększenia czułości metod serologicznych stosuje się również tańsze, ale mniej specyficzne przeciwciała poliklonalne. Niestety wadą takiego rozwiązania są występujące często fałszywie pozytywne wyniki wskutek reakcji krzyżowych z innymi bakteriami (Crowley i De Boer 1982) oraz niewykrywalnie niemukoidalnych szczepów bakterii Cms (Baer i Gudmestad 1993). Zasadniczym wykrywanym antygenem nie są komórki bakterii Cms, lecz rozpuszczalne egzopolisacharydy, których ilość w stosunku do liczby komórek moż e być zmienna (Lewosz 1997). Obie metody IF i ELISA pozwalają wykrywać bakterie Cms w bulwach i łodygach ziemniaka, przy czym metoda immunofluorescencyjna wykazuje większą czułość i specyficzność dla bulw, natomiast metoda ELISA pozwala z większą czułością wykrywać patogena w łodygach ziemniaka (De Boer i in. 1994).
We współczesnej diagnostyce wykorzystuje się tradycyjne, posiadające wiele zalet, dobrze sprawdzone metody detekcji mikroorganizmów. Zwykle są one czasochłonne i wymagają stosowania specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego. Wyklucza to przeprowadzenie testu w warunkach polowych, gdzie wymagany jest niemal natychmiastowy wynik pomiaru, a próbka powinna być zanalizo4
PL 210 394 B1 wana najlepiej w miejscu jej pobrania (Łoś i Węgrzyn, 2005). Ponieważ jak dotąd najskuteczniejszym sposobem ograniczającym rozprzestrzenianie się patogenów bakteryjnych jest ich wczesne wykrycie, toteż warunki takie muszą być spełniane w coraz to większej liczbie procedur. Istnieje zatem rosnące zapotrzebowanie na szybkie, czułe i bezpośrednie metody detekcji, które będą jednocześnie specyficzne i niedrogie, a które umożliwią bieżącą kontrolę zarówno podczas wzrostu roślin, procesu produkcyjnego, przechowywania, jak i dystrybucji żywności (De Boer i Beumer 1999).
Tak więc problemem jest znalezienie usuwania śluzu bakterii, szczególnie mukoidalnych takich jak np. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms).
Nieoczekiwanie powyższy problem został rozwiązany poprzez zastosowanie sposobu według prezentowanego wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób usuwania śluzów bakteryjnych, zwłaszcza bakterii szczepów Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (w skrócie Cms), charakteryzujący się tym, że obejmuje przemywanie bakterii roztworem buforowym glicyna - HCl o stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stęże ń 0,05 - 0,5 M, oraz w pH 1,5 - 3,5, korzystnie w zakresie 2 - 3 i roztworem buforowym glicyna - NaOH o stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, o pH 9,5 - 12, korzystnie w zakresie 10 - 11. Równie korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że roztwór glicyna - HCl powoduje utratę żywotności komórek bakteryjnych. Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że roztwór glicyna - NaOH nie powoduje znacznej utraty żywotności bakterii Cms. W kolejnej korzystnej realizacji sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że roztwór glicyna - HCl powoduje dysocjację kompleksu antygen - przeciwciało. Równie korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że roztwór glicyna - NaOH powoduje dysocjację kompleksu antygen - przeciwciało. Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że uwolnienie bakterii Cms immunopułapkowanych następuje na podłożu, na którym zostały uprzednio wyłapane za pomocą przeciwciał. Równie korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że przemywanie bakterii roztworami buforowymi glicyna - HCl lub glicyna - NaOH wzmacnia korelację ilości bakterii z uzyskanym sygnałem metodą ELISA. Bakterie Cms poddane działaniu roztworu o pH alkalicznym są zdolne tworzyć nowe kolonie po godzinnej inkubacji w tym roztworze. W sposobie według wynalazku uwolnienie bakterii Cms immunopułapkowanych następuje na podłożu, na którym zostały uprzednio wyłapane za pomocą przeciwciał.
Równie korzystnie sposób według wynalazku stanowi wstępny etap przygotowania bakterii Cms do wykrywania znanymi metodami immunologicznymi typu ELISA, IFAS.
Zastosowanie przeciwciał anty-Cms zdolnych do bezpośredniego oddziaływania z powierzchnią komórek bakterii Cms pozwala zapobiec utracie tych komórek z podłoża na którym zostały immunopułapkowane. Wymywanie immunopułakowanych bakterii Cms ma miejsce w przypadku stosowania przeciwciał anty-Cms skierowanych na komponenty śluzów bakteryjnych otaczających bakterie. Ze względu na rozpuszczalność tych komponentów, istnieje ryzyko utraty komórek bakteryjnych z powierzchni, na której zostały immunopułapkowane za pośrednictwem otaczających je komponentów śluzów bakteryjnych. Według wynalazku nowo wytworzone przeciwciała anty-Cms skierowane na bakterie pozbawione śluzu dają możliwość detekcji szczepów bakterii Cms o różnym stopniu mukoidalności. Sposób znamienny tym, iż bakterie przed analizą powinny być pozbawione komponentów śluzów przez przemycie buforem o odczynie kwaśnym lub alkalicznym. Baer i Gudmestad (1993) stosując sześć rodzajów przeciwciał anty-Cms nie byli w stanie wykryć niemukoidalnych szczepów bakterii Cms metodą ELISA. Autorzy nie zanotowali natomiast problemów z detekcją szczepów bakterii Cms wytwarzających średnie i duże ilości śluzów bakteryjnych (Baer i Gudmestad 1993).
Sposobem według wynalazku uzyskuje się bakterie Cms, których komórki pozbawione są śluzów bakteryjnych. Skuteczność usuwania śluzów bakteryjnych z powierzchni komórek bakteryjnych oceniano metodą antronową mierząc ilość pozostających śluzów w supernatancie po żwirowaniu bakterii oraz metodą DAS-ELISA przy wykorzystaniu przeciwciał poliklonalnych z firmy Loewe mierząc wykrywalność bakterii po usunięciu śluzów wskutek przemywania bakterii roztworami buforowymi o odczynie kwaś nym i/lub alkalicznym.
Sposób przemywania bakterii Cms według wynalazku, którego wynikiem są komórki bakteryjne pozbawione śluzów bakteryjnych, może posłużyć jako:
sposób przygotowania antygenu do wytwarzania przeciwciał skierowanych na same komórki bakteryjne, nie wykrywających jednocześnie komponentów śluzów bakteryjnych,
PL 210 394 B1 wstę pny etap przygotowania bakterii Cms do wykrywania metodami immunologicznymi typu ELISA, IFAS, itd., pozwalający na uniknięcie zafałszowań detekcji tej bakterii metodami immunologicznymi wynikających z różnej mukoidalności szczepów bakterii Cms, sposób oceny ilościowej bakterii Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) metodami immunologicznymi przy wykorzystaniu przeciwciał poliklonalnych anty-Cms, sposób uwalniania bakterii Cms immunopuł apkowanych na podł o ż u, na którym został y uprzednio wyłapane za pomocą przeciwciał, pozwalający na zachowanie żywotności tych komórek. Fakt ten ma niebagatelne znaczenie w przypadku testów diagnostycznych pozwalających przyżyciowo stwierdzić zjadliwość wyizolowanych komórek bakteryjnych.
Zaletą wynalazku jest możliwość odzyskiwania żywych komórek bakterii Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus pułapkowanych przy pomocy przeciwciał na podłożach immunosorpcyjnych i następnie wysianie tych komórek na pożywkę. Ma to istotne znaczenie dla pełnego przeprowadzenia analizy fitopatologicznej wyizolowanego z zainfekowanej tkanki roślinnej szczepu bakterii Cms w celu przeprowadzenia testu przyżyciowego na roś linie indykatorowej. Test taki jest konieczny dla stwierdzenia wirulentności wyizolowanego szczepu sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka.
P r z y k ł a d 1: Oznaczanie śluzów bakteryjnych metodą antronową; usuwanie śluzu bakteryjnego
Użyto trzy szczepy bakterii Cms: BPR 527, PD 221 oraz PD 406, różniących się ilością wytwarzanego śluzu. Na podstawie wyglądu kolonii bakteryjnych i ilości śluzu pozostającego w supernatancie oznaczanych metodą antronową, stwierdzono, że najbardziej mukoidalnym szczepem był szczep PD 406, średnio PD 221, natomiast najmniej śluzu wytwarzał szczep BPR 527 (Tabela 1).
T a b e l a 1. Ilość śluzów bakteryjnych w supernatantach oznaczana metodą antronową po żwirowaniu komórek bakterii Cms. Średnią i odchylenie standardowe (SD) obliczono dla trzech powtórzeń
| Bakterie Cms 5^106 CFU/ml | Ilość śluzu w supernatancie w przeliczeniu na glukozę | |
| ^g] | SD | |
| Szczep BPR 527 | 16 | ± 1,6 |
| Szczep PD 221 | 34 | ± 2,7 |
| Szczep PD 406 | 44 | ± 2,3 |
Bakterie stopniowo odmywano ze śluzu bakteryjnego i testowano metodą DAS-ELISA stosując przeciwciała poliklonalne z firmy Loewe.
Śluz usuwano poprzez kilkukrotne, krótkotrwałe przemywanie komórek bakteryjnych w różnych mediach, tj.: w buforze glicyna - HCl o odczynie kwaśnym lub w buforze glicyna - NaOH o odczynie alkalicznym lub w wodzie podwójnie destylowanej, każdorazowo zatężając bakterie poprzez wirowanie. Znane jest użycie buforów kwaśnego i alkalicznego w chromatografii powinowactwa, gdzie powodują one dysocjację kompleksu antygen - przeciwciało (Hermanson i in. 1992). Nowością według sposobu jest zastosowanie tych roztworów do efektywnego usuwania składników śluzów bakteryjnych z powierzchni komórek bakterii Cms.
Wyniki w tabeli 2 wskazują, że głównym antygenem, z którym reagują IgG anty-Cms są kompleksy śluzu bakteryjnego. Pomimo użycia jednakowych ilości komórek badanych szczepów Cms, najwyższe wartości testu ELISA otrzymano dla mukoidalnego szczepu PD 406 i odpowiednio niższe dla szczepów PD 221 i BPR 527 wytwarzających mniejsze ilości śluzu.
Po usunięciu śluzów wyniki testu ELISA znacznie lepiej korelowały z ilością komórek bakteryjnych w zawiesinie. Usunięcie śluzu według wynalazku buforem kwaśnym i/lub alkalicznym pozwoliło ujednolicić wyniki testu ELISA przy wykorzystaniu przeciwciał poliklonalnych. Wynika z tego, że czułość testu ELISA zależy przede wszystkim od ilości śluzów wytwarzanych przez poszczególne szczepy bakterii Cms, a nie od rzeczywistej ilości komórek w zawiesinie.
W obecności śluzu stosowane przeciwciała poliklonalne wykrywały bakterie Cms z różną intensywnością. Natomiast po usunięciu śluzu według wynalazku, niezależnie od badanego szczepu, wynik testu ELISA znacznie lepiej korelował z ilością komórek bakteryjnych w zawiesinie.
Wprowadzenie dodatkowego etapu według wynalazku polegającego na usunięciu komponentów śluzów bakteryjnych pozwoliło w teście ELISA na uzyskanie odpowiedzi ilościowej przy wykorzystaniu przeciwciał poliklonalnych.
PL 210 394 B1
T a b e l a 2. Wynik testu DAS-ELISA z różnymi szczepami bakterii Cms pozbawianymi śluzu bakteryjnego względem przeciwciał z Loewe. Średnią i odchylenie standardowe (SD) obliczono dla trzech powtórzeń
| Zawiesina bakterii Cms (5000 CFU/ml) | Szczep BPR 527 | Szczep PD 221 | Szczep PD 406 | |||
| A405 | SD | A405 | SD | A405 | SD | |
| Bakterie w zawiesinie wodnej | 0,530 | ±0,025 | 0,950 | ±0,012 | 1,150 | ±0,031 |
| Bakterie przemyte 3-krotnie wodą podwójnie destylowaną | 0,372 | ±0,021 | 0,389 | ±0,041 | 0,428 | ±0,008 |
| Bakterie przemyte buforem o odczynie kwaśnym | 0,270 | ±0,005 | 0,277 | ±0,009 | 0,268 | ±0,006 |
| Bakterie przemyte buforem o odczynie zasadowym | 0,285 | ±0,008 | 0,280 | ±0,003 | 0,289 | ±0,005 |
Według wynalazku sposób odmywania śluzu bakteryjnego z komórek bakterii Cms pozwala na zachowanie żywotności tych bakterii. Bakterie Cms poddane działaniu roztworu o pH alkalicznym są zdolne tworzyć nowe kolonie nawet po godzinnej inkubacji w tym roztworze (Tabela 3). Zaobserwowano jedynie nieznaczny spadek przeżywalności badanych szczepów wraz z upływem czasu inkubacji, przy czym większą odpornością charakteryzował się szczep wytwarzający najwięcej śluzu. Większość bakterii pozostała żywa jeszcze po 10 minutowym traktowaniu buforem o odczynie alkalicznym (Tabela 3). Oznacza to, że komórki bakteryjne, z których usunięto śluz w alkalicznym pH zachowują zdolność namnażania się (Tabela 4).
T a b e l a 3. Przeżywalność [%] bakterii Cms inkubowanych w buforze o odczynie alkalicznym w czasie 0 - 60 min po posiewie na podłożu YGM
| Zawiesina Cms (szczep PD 406) | Czas inkubacji [min] | ||||||||
| 0 | 5 | 10 | 15 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | |
| Przeżywalność [%] | 100 | 98,6 | 74,2 | 52,1 | 40,3 | 27,7 | 21,1 | 20,6 | 18,6 |
T a b e l a 4. Określenie żywotności bakterii Cms przy stopniowym usuwaniu śluzu. Za wartość 100% przyjęto liczbę kolonii po inkubacji w podwójnie destylowanej, sterylnej wodzie. Wynik po 5 minutach inkubacji. Średnią i odchylenie standardowe (SD) obliczono dla trzech powtórzeń
| Zawiesina bakterii Cms | Liczba kolonii na pożywce YGM po 5-cio minutowej inkubacji | |||||
| BPR 527 | PD 221 | PD 406 | ||||
| [%] | SD | [%] | SD | [%] | SD | |
| Bakterie w zawiesinie wodnej | 100 | ±1,1 | 100 | ±2,6 | 100 | ±1,9 |
| Bakterie przemyte 3-krotnie wodą podwójnie destylowaną | 91,3 | ±2,6 | 69,9 | ±1,4 | 84,6 | ±3,8 |
| Bakterie przemyte buforem o odczynie alkalicznym | 51,5 | ±2,7 | 60,0 | ±4,0 | 98,2 | ±7,1 |
Proces usuwania śluzów bakteryjnych prowadzono z udziałem świeżo sporządzonych zawiesin szczepów bakterii Cms zróżnicowanych pod względem mukoidalności (zdolności wytwarzania śluzów). W celu zapewnienia odpowiednich warunków dla procesu usuwania śluzów bakteryjnych, proces przemywania komórek baterii Cms prowadzi się poprzez kilkukrotne przemywanie w roztworach buforowych o pH kwaśnym i/lub alkalicznym oraz w wodzie destylowanej.
Najkorzystniejsze rezultaty w wyniku realizacji sposobu według wynalazku osiąga się wówczas, gdy proces przemywania prowadzi się przy zastosowaniu roztworu glicyna - HCl o stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, o pH 1,5 - 3,5, korzystnie w zakresie 2 - 3 i/lub roztworu glicyna - NaOH o stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, o pH 9,5 - 12, korzystnie w zakresie 10 - 11 oraz wody destylowanej, korzystnie dwukrotnie destylowanej. Sposobem według wynalazku uzyskuje się bakterie Cms, których komórki pozbawione są śluzów bakteryjnych. Skuteczność usuwania śluzów bakteryjnych z powierzchni komórek bakteryjnych oceniano metodą antronową mierząc ilość pozostających śluzów w supernatancie po żwirowaniu bakterii oraz metodą
PL 210 394 B1
DAS-ELISA przy wykorzystaniu przeciwciał poliklonalnych z firmy Loewe mierząc wykrywalność bakterii po usunięciu śluzów wskutek przemywania bakterii roztworami buforowymi o odczynie kwaśnym i/lub alkalicznym.
P r z y k ł a d 2: Sporządzenie wodnych zawiesin bakteryjnych z wykorzystaniem buforu glicyna - HCl
Sporządzono wodne zawiesiny komórek bakteryjnych różnych szczepów bakterii Cms BPR-527, PD
221 oraz PD 406. Zawiesiny trzykrotne przemywano sterylną 2 x dest. H2O i wirowano 15 min. 7000 x g na wirówce Beckman J-21. Supernatant odrzucano, natomiast zewnątrzkomórkowe polisacharydy pozostające na odwirowanych komórkach bakteryjnych odmywano trzykrotnie 0,2 M buforem glicyna HCl (pH 2,0) oraz trzykrotnie podwójnie destylowaną wodą odwirowując bakterie za każdym razem jw. Tak przygotowane bakterie rozcieńczano w 10 mM buforze fosforanowym i przechowywano w 4°C do czasu wykorzystania.
P r z y k ł a d 3: Sporządzenie wodnych zawiesin bakteryjnych z wykorzystaniem buforu glicyna
- NaOH
Sporządzono wodne zawiesiny komórek bakteryjnych różnych szczepów bakterii Cms BPR-527, PD 221 oraz PD 406. Zawiesiny trzykrotne przemywano sterylną 2 x dest. H2O i wirowano 15 min. 7000 x g na wirówce Beckman J-21. Supernatant odrzucano, natomiast zewnątrzkomórkowe polisacharydy pozostające na odwirowanych komórkach bakteryjnych odmywano trzykrotnie 0,2 M buforem glicyna NaOH (pH 11) oraz trzykrotnie podwójnie destylowaną wodą odwirowując bakterie za każdym razem jw. Tak przygotowane bakterie rozcieńczano w 10 mM buforze fosforanowym i przechowywano w 4°C do czasu wykorzystania.
P r z y k ł a d 4: Sporządzenie wodnych zawiesin bakteryjnych z wielokrotnym wykorzystaniem buforu glicyna - NaOH
Sporządzono wodne zawiesiny komórek bakteryjnych różnych szczepów bakterii Cms BPR-527, PD 221 oraz PD 406. Zawiesiny trzykrotne przemywano sterylną 2 x dest. H2O i wirowano 15 min. 7000 x g na wirówce Beckman J-21. Supernatant odrzucano, natomiast zewnątrzkomórkowe polisacharydy pozostające na odwirowanych komórkach bakteryjnych odmywano trzykrotnie 0,2 M buforem glicyna HCl (pH 2,5), trzykrotnie 0,2 M buforem glicyna - NaOH (pH 10,5) oraz trzykrotnie podwójnie destylowaną wodą odwirowując bakterie za każdym razem jw. Tak przygotowane bakterie rozcieńczano w 10 mM buforze fosforanowym i przechowywano w 4°C do czasu wykorzystania.
P r z y k ł a d 5: Sporządzenie wodnych zawiesin bakteryjnych z wielokrotnym wykorzystaniem buforu glicyna - NaOH, glicyna - HCl oraz wody destylowanej
Sporządzono wodne zawiesiny komórek bakteryjnych różnych szczepów bakterii Cms BPR-527, PD 221 oraz PD 406. Zawiesiny trzykrotne przemywano sterylną 2 x dest. H2O i wirowano 15 min. 7000 x g na wirówce Beckman J-21. Supernatant odrzucano, natomiast zewnątrzkomórkowe polisacharydy pozostające na odwirowanych komórkach bakteryjnych odmywano czterokrotnie 0,1 M buforem glicyna - HCl (pH 3,0), czterokrotnie 0,1 M buforem glicyna - NaOH (pH 10) oraz trzykrotnie podwójnie destylowaną wodą odwirowując bakterie za każdym razem jw. Tak przygotowane bakterie liofilizowano i przechowywano w 4°C do czasu wykorzystania.
P r z y k ł a d 6: Sporządzenie wodnych zawiesin bakteryjnych z wykorzystaniem buforu glicyna
- NaOH, glicyna - HCl oraz wody destylowanej
Sporządzono wodne zawiesiny komórek bakteryjnych różnych szczepów bakterii Cms BPR-527, PD 221 oraz PD 406. Zawiesiny trzykrotne przemywano sterylną 2 x dest. H2O i wirowano 15 min. 7000 x g na wirówce Beckman J-21. Supernatant odrzucano, natomiast zewnątrzkomórkowe polisacharydy pozostające na odwirowanych komórkach bakteryjnych odmywano 0,1 M buforem glicyna - HCl (pH 2,5), 0,1 M buforem glicyna - NaOH (pH 10,5) oraz trzykrotnie podwójnie destylowaną wodą odwirowując bakterie za każdym razem jw. Tak przygotowane bakterie liofilizowano i przechowywano w 4°C do czasu wykorzystania. Ustalenie warunków odmywania śluzu z bakterii pozwoliło na wytworzenie przeciwciał poliklonalnych mty-Cms względem nowego rodzaju antygenu - komórek bakteryjnych bez śluzu. Znany jest sposób uzyskiwania przeciwciał poprzez immunizację królików (Ball i inni 1993). Znamiona nowości zawiera natomiast antygen - bakterie Cms pozbawione śluzu oraz wytworzone przy jego udziale przeciwciała poliklonalne anty-Cms. Nowe przeciwciała mają istotne znaczenie dla diagnostyki, ponieważ posiadają epitopy obecne na powierzchni komórek bakteryjnych pozbawionych zewnątrzkomórkowych komponentów śluzów bakteryjnych. Przeciwciała te nie reagują z komórkami Cms pokrytymi śluzem oraz reagują nieznacznie z komórkami częściowo pozbawionymi śluzu bakteryjnego.
Claims (7)
1. Sposób usuwania śluzów bakteryjnych, zwłaszcza bakterii szczepów Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (w skrócie Cms), znamienny tym, że obejmuje przemywanie bakterii roztworem buforowym glicyna - HCl w stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, oraz w pH 1,5 - 3,5, korzystnie w zakresie 2 - 3 i roztworem buforowym glicyna - NaOH w stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, o pH 9,5 - 12, korzystnie w zakresie 10 - 11.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór glicyna - HCl powoduje utratę żywotności komórek bakteryjnych.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór glicyna - NaOH nie powoduje znacznej utraty żywotności bakterii Cms.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór glicyna - HCl powoduje dysocjację kompleksu antygen - przeciwciało.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór glicyna - NaOH powoduje dysocjację kompleksu antygen - przeciwciało.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uwolnienie bakterii Cms immunopułapkowanych następuje na podłożu, na którym zostały uprzednio wyłapane za pomocą przeciwciał.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przemywanie bakterii roztworami buforowymi glicyna - HCl lub glicyna - NaOH wzmacnia korelację ilości bakterii z uzyskanym sygnałem metodą
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL383362A PL210394B1 (pl) | 2007-09-16 | 2007-09-16 | Sposób usuwania śluzów bakteryjnych |
| EP08830138.7A EP2205735B1 (en) | 2007-09-16 | 2008-09-16 | Immunological tests for the presence of bacteria which make use of antibodies obtained using a specific method |
| US12/676,671 US8642275B2 (en) | 2007-09-16 | 2008-09-16 | Immunological tests for the presence of bacteria which make use of antibodies obtained using a specific method |
| PCT/PL2008/050015 WO2009035357A2 (en) | 2007-09-16 | 2008-09-16 | Immunological tests for the presence of bacteria which make use of antibodies obtained using a specific method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL383362A PL210394B1 (pl) | 2007-09-16 | 2007-09-16 | Sposób usuwania śluzów bakteryjnych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL383362A1 PL383362A1 (pl) | 2009-03-30 |
| PL210394B1 true PL210394B1 (pl) | 2012-01-31 |
Family
ID=42984840
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL383362A PL210394B1 (pl) | 2007-09-16 | 2007-09-16 | Sposób usuwania śluzów bakteryjnych |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL210394B1 (pl) |
-
2007
- 2007-09-16 PL PL383362A patent/PL210394B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL383362A1 (pl) | 2009-03-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Freundt et al. | Chapter IX Identification of Mycoplasmas | |
| CA2500464C (fr) | Procede de detection et de comptage de microorganismes dans un echantillon | |
| Harada et al. | Phosphorylcholine and SpaA, a choline-binding protein, are involved in the adherence of Erysipelothrix rhusiopathiae to porcine endothelial cells, but this adherence is not mediated by the PAF receptor | |
| Van Vuurde et al. | Comparison of immunofluorescence colony-staining in media, selective isolation on pectate medium, ELISA and immunofluorescence cell staining for detection of Erwinia carotovora subsp. atroseptica and E. chrysanthemi in cattle manure slurry | |
| Rajeshwari et al. | Development of ELISA for the detection of Ralstonia solanacearum in tomato: its application in seed health testing | |
| US20120034637A1 (en) | Detection of trichomonas and candida | |
| Hu et al. | Quantitative detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus by competitive polymerase chain reaction | |
| DK161860B (da) | Fremgangsmaade til paavisning af det vigtigste ydre membranprotein af chlamydia trachomatis | |
| Delfosse et al. | Serological methods for detection of Polymyxa graminis, an obligate root parasite and vector of plant viruses | |
| PL210394B1 (pl) | Sposób usuwania śluzów bakteryjnych | |
| Selçuk et al. | Determination of diagnostic value of cELISA for the diagnosis of anaplasmosis in clinically suspected ruminants | |
| Chun | Identification and detection of Corynebacterium michiganese in tomato seed using the indirect enzyme-linked immunosorbent assay | |
| Toloza-Moreno et al. | Immunodetection of Furcraea Necrotic Streak Virus-FNSV in fique plants (Furcraea macrophylla Baker) using a polyclonal antibody IgY produced in chicken egg yolk | |
| CN102207503A (zh) | 快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片及其制备方法 | |
| US8642275B2 (en) | Immunological tests for the presence of bacteria which make use of antibodies obtained using a specific method | |
| JAMAUX‐DESPRÉAUX et al. | Comparison of responses of ascospores and mycelium by ELISA with anti‐mycelium and anti‐ascospore antisera for the development of a method to detect Sclerotinia sclerotiorum on petals of oilseed rape | |
| PL210395B1 (pl) | Test immunologiczny na obecność bakterii | |
| PL213857B1 (pl) | Sposób wykrywania obecności bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus z wykorzystaniem membran poliwęglanowych zawierających immobilizowane przeciwciała | |
| PL213858B1 (pl) | Sposób wykrywania obecności bakterii Clavibacter michiganensis ssp sepedonicus, w analizowanej próbce | |
| JP2004258024A (ja) | 皮膚糸状菌の検出方法、検出用試薬および抗原性賦活化方法 | |
| ITMI980197A1 (it) | Metodo per la determinazione di infezioni da protesi | |
| Tănase et al. | Using the galactomannan antigen assay in the diagnosis of invasive aspergillosis after hematopoietic stem cell transplantation | |
| Manasa et al. | Immunodiagnosis of bacterial wilt pathogen using polyclonal antiserum to Ralstonia solanacearum. | |
| Verdier et al. | Methods for detecting the cassava bacterial blight pathogen: a practical approach for managing the disease | |
| De Jonckheere et al. | Determination of acid phosphatase and leucine amino peptidase activity as an identification method for pathogenic Naegleria fowleri |