PL213857B1

PL213857B1 - Sposób wykrywania obecności bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus z wykorzystaniem membran poliwęglanowych zawierających immobilizowane przeciwciała

Info

Publication number: PL213857B1
Application number: PL383364A
Authority: PL
Inventors: Wlodzimerz Przewodowski
Original assignee: Inst Hodowli I Aklimatyzacji Roslin
Priority date: 2007-09-16
Filing date: 2007-09-16
Publication date: 2013-05-31
Also published as: PL383364A1

Abstract

Sposób wykrywania obecności bakterii w analizowanej próbce, znamienny tym, że analizowaną próbkę zawiesza się w roztworze buforowym, uzyskany roztwór kontaktuje się z i odfiltrowuje się na filtrze pokrytym przeciwciałami specyficznymi wobec antygenu powierzchniowego pochodzącego z wykrywanej bakterii i ustala się obecność bakterii na filtrze, która świadczy o obecności bakterii w analizowanej próbce, przy czym do filtrowania wykorzystuje się aktywowane membrany poliwęglanowe modyfikowane aldehydem glutarowym zawierające immobilizowane przeciwciała.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania obecności bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus z wykorzystaniem membran poliwęglanowych zawierających immobilizowane przeciwciała mający zastosowanie w przemyśle spożywczym oraz rolnictwie.

Bakteria Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spickermann et Kotthoff) Davis et al. (Cms) - sprawca bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, jest jednym z najważniejszych patogenów ziemniaka (Lee i in. 1997, OEPP/EPPO 2006). Synonimy nazwy patogena to: Corynebacterium michiganensis subsp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Carlson et Vidaver, Corynebacterium michiganensis pv. sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Dye et Kemp oraz Corynebacterium sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Skaptason et Burkholder (OEPP/EPPO, 2006).

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus to gramdodatnie bakterie stanowiące formy pałeczkowate oraz kuliste (OEPP/EPPO, 2006), które wspólnie z rodzajem Rathayibacter tworzą grupę fitopatogenicznych corynebakterii o wspólnym pochodzeniu filogenetycznym (Lee i in. 1997). Kolonie większości szczepów hodowanych na pożywkach agarowych są mukoidalne, jakkolwiek zdarzają się również szczepy pośrednie i niemukolidalne (Bishop i in. 1988, Baer i Gudmestadt 1993).

Do poznanych dotychczas czynników wirulencji Cms należą:

a) Śluzy bakteryjne o kwaśnym charakterze i wielkości 1-10 MDa (Jahr i in. 1999) charakterystyczne są również dla innych podgatunków z gatunku C. michiganensis. Składają się one z kilku (I-III) komponentów cukrowych o podobnym składzie chemicznym, zróżnicowanych pod względem stopnia aglomeracji (Westra i Slack 1992). Występowanie IV komponentu składającego się głównie z mannozy jest charakterystyczne tylko dla bakterii Cms (Denny 1995). Śluzy bakteryjne z jednej strony zabezpieczają komórki bakteryjne przed utratą wilgoci, natomiast z drugiej poprzez fizyczną okluzję na ściankach wiązek przewodzących są przyczyną zahamowania transpiracji i więdnięcia roślin (Jahr i in. 1999).

Skład chemiczny śluzów bakteryjnych oraz ich obecność jest istotna w diagnostyce bakterii Cms opartej na testach serologicznych, w których składniki śluzu wykorzystuje się zazwyczaj jako antygeny. Prawidłowa ocena patogena na podstawie śluzów bakteryjnych jest zależna nie tylko od uwarunkowań genetycznych, lecz również od zmienności w chemicznym charakterze i ilości śluzów produkowanych przez poszczególne szczepy bakterii Cms (Bishop i Slack 1987, Baer i Gudmestadt 1993).

b) Celulaza wytwarzana przez większość przebadanych szczepów Cms (Baer i Gudmestad 1993) bierze udział w degradacji tkanek wiązki naczyniowej powodując rozwarstwianie się części zewnętrznej bulwy od rdzenia (Jahr i in. 1999, Nissinen i in. 2001). Laine i współpracownicy (2000) wykazali, że celulaza kodowana jest przez gen w natywnym plazmidzie pCS1 bakterii Cms (Laine i in. 2000).

c) Toksyczny glikoproteid wyizolowany przez Strobela (1970), poprzez wysokie powinowactwo w stosunku do fragmentów ścian i membran komórek gospodarza, prawdopodobnie powoduje zaburzenia w przepuszczalności tych drugich (Romanenko i in. 1997).

Dotychczas nie zdołano opracować skutecznej metody bezpośredniego chemicznego lub biologicznego zwalczania patogena. Dezynfekcja powierzchni bulw nie spełnia swego zadania wskutek przebywania bakterii w wiązkach naczyniowych, do których nie mają dostępu środki dezynfekujące.

Jednym z najbardziej skutecznych sposobów ograniczenia, czy też eliminacji sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, jest jego wczesne wykrycie. Detekcja potrzebna jest zarówno w procesie produkcji, obróbki, jak i dystrybucji materiału roślinnego. Stąd właściwe metody detekcji powinny być odpowiednio czułe i specyficzne, jak również proste, szybkie, wiarygodne i powtarzalne (Waleron i in. 2003).

Zgodnie z przyjętymi wymogami fitosanitarnymi, prawidłowa diagnostyka sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka wymaga stosowania przynajmniej dwóch testów laboratoryjnych opartych na różnych zasadach biologicznych łącznie z testem patogeniczności (OEPP/EPPO, 2006). W zależności od ekspresji objawów bakteriozy pierścieniowej ziemniaka stosuje się odpowiednie schematy postępowania zawierające testy fizjologiczne, biochemiczne, serologiczne, molekularne i inne (Dyrektywa Komisji WE 2006/56).

Testy fizjologiczne i biochemiczne stosowane do rutynowej kontroli, pozwalają określić właściwości fenotypowe Cms. Zgodnie z najnowszą Dyrektywą Komisji WE. testy te muszą być przeprowadzane przy użyciu izolatów bakterii uzyskanych w procesie pasażowania na agarze odżywczym z glukozą. Natomiast porównania morfologiczne muszą być przeprowadzane na kulturach uzyskanych po

PL 213 857 B1 wzroście na agarze odżywczym z glukozą w obecności znanej kontroli Cms (Dyrektywa Komisji WE 2006/56).

W przypadku roślin wykazujących wyraźne symptomy choroby stosuje się izolację bakterii na pożywkach półselektywnych NCP-88 (De la Cruz i in. 1992) oraz MTNA (Jansing i Rudolph 1998). natomiast do rutynowych hodowli czystych kultur bakterii Cms wykorzystuje się ogólne podłoża wzrostowe, jak agar odżywczy (NA), agar odżywczy z glukozą (NDA), agar drożdżowo-peptonowo-glukozowy (YPGA) oraz pożywkę mineralną z glukozą i wyciągiem drożdżowym (YGM) (De Boer i Copeman 1980, Dyrektywa Komisji WE 2006/56).

Jednym z głównych problemów związanych z detekcją i identyfikacją bakterii Cms jest wolne tempo wzrostu tego patogena. Przy bezpośrednim posiewie ekstraktów na pożywkę uniwersalną, obce bakterie saprofityczne, charakteryzujące się znacznie szybszym tempem wzrostu, porastają całą jej powierzchnię, często uniemożliwiając skuteczną izolację czystych szczepów Cms (OEPP/EPPO, 2006). Izolacja patogena na pożywkach półselektywnych zawierających w swym składzie antybiotyki takie jak: siarczan polimyksyny B, kwas nalidyksylowy i cykloheksymid (NCP-88) oraz trimetoprim, kwas nalidyksylowy i amfoterycynę B (MTNA), pozwala znacznie zmniejszyć ilość obcych bakterii. Najlepsze efekty izolacji na podłożu półselektywnym można uzyskać po uprzedniej inokulacji roślin oberżyny ekstraktem z komórkami patogena. Rośliny oberżyny są dobrym środowiskiem dla selektywnego namnażania sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka (OEPP/EPPO 2006).

Test patogeniczności na młodych siewkach oberżyny inokulowanej trzydniową kulturą testowanego izolatu, stosowany jest jako ostateczny test dla potwierdzenia infekcji latentnej oraz oceny wirulencji kultur zidentyfikowanych jako Cms. Test ten cechuje stosunkowo niska czułość (10⁶ CFU/ml) oraz duża czasochłonność - ok. 40 dni. Dla skrócenia czasu testu biologicznego jako roślinę indykatorową stosuje się również tytoń. Wadą tego testu jest niestety mniejsza czułość (10⁸-10⁹ CFU/ml) (OEPP/EPPO 2006).

Jako jedną z metod identyfikacji bakterii Cms przez długi czas stosowano barwienie Gramma wymazów z wydzieliny wiązek naczyniowych z łodygi i bulwy (Glick i in. 1944, Slack 1987). Jednakże jednoznaczna diagnoza tą metodą jest trudna ze względu na możliwość występowania innych gramdodatnich bakterii, jak Clostridium ssp. Bacillus ssp., a także saprofitycznych bakterii z rodzaju Corynebacterium (Crowley i De Boer 1982).

W niektórych pracowniach stosowano również aglutynacyjny test lateksowy pozwalający wykryć 10⁷ komórek w 1 ml (Slack i in. 1979). Test odwróconej pasywnej hemoaglutynacji (RPH) z krwinkami owcy opłaszczonymi przeciwciałami anty-Cms z surowicy królika lub żółtka jaja kury, pozwala na wykrywanie w czasie ok. 90 minut obecności Cms w stężeniu 6x10⁶ komórek w 1 ml (Kohm i Eggers-Schumacher 1995).

Wykrywanie sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka metodami serologicznymi nadal stwarza znaczne trudności ze względu na zróżnicowanie morfologiczne form patogena (Mills i Russell 2003). Powszechnie stosowanymi metodami serologicznymi w detekcji Cms są test pośredniej immunofluorescencji - IF (Slack i in. 1979. De Boer i Copeman 1980) oraz test immunoenzymatyczny ELISA (ang. Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (Drennan i in. 1993, De Boer i in. 1994, 2005). Jakkolwiek test ELISA niedopuszczony przez EPPO jako test przesiewowy, cieszy się znacznie większym powodzeniem w krajach Ameryki Północnej. Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych MAb 9A1 w teście IF zapewnia wysoką specyficzność (De Boer i Wieczorek 1984) i wykrywalność bakterii Cms w granicach 10⁴ komórek bakterii w 1 ml ekstraktu z tkanki ziemniaka (Baer i Gudmestad 1993). Często dla zwiększenia czułości metod serologicznych stosuje się również tańsze, ale mniej specyficzne przeciwciała poliklonalne. Niestety wadą takiego rozwiązania są występujące często fałszywie pozytywne wyniki wskutek reakcji krzyżowych z innymi bakteriami (Crowley i De Boer 1982) oraz niewykrywalnie niemukoidalnych szczepów bakterii Cms (Baer i Gudmestad 1993). Zasadniczym wykrywanym antygenem nie są komórki bakterii Cms, lecz rozpuszczalne egzopolisacharydy, których ilość w stosunku do liczby komórek może być zmienna (Lewosz 1997). Obie metody IF i ELISA pozwalają wykrywać bakterie Cms w bulwach i łodygach ziemniaka, przy czym metoda immunofluorescencyjna wykazuje większą czułość i specyficzność dla bulw, natomiast metoda ELISA pozwala z większą czułością wykrywać patogena w łodygach ziemniaka (De Boer i in. 1994). We współczesnej diagnostyce wykorzystuje się tradycyjne, posiadające wiele zalet, dobrze sprawdzone metody detekcji mikroorganizmów. Zwykle są one czasochłonne i wymagają stosowania specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego. Wyklucza to przeprowadzenie testu w warunkach polowych, gdzie wymagany jest niemal natychmiastowy wynik pomiaru, a próbka powinna być zanalizowana najlepiej w miejscu jej pobrania

PL 213 857 B1 (Łoś i Węgrzyn, 2005). Ponieważ jak dotąd najskuteczniejszym sposobem ograniczającym rozprzestrzenianie się patogenów bakteryjnych jest ich wczesne wykrycie, toteż warunki takie muszą być spełniane w coraz to większej liczbie procedur. Istnieje zatem rosnące zapotrzebowanie na szybkie, czułe i bezpośrednie metody detekcji, które będą jednocześnie specyficzne i niedrogie, a które umożliwią bieżącą kontrolę zarówno podczas wzrostu roślin, procesu produkcyjnego, przechowywania, jak i dystrybucji żywności (De Boer i Beumer 1999).

Obecnie stosowane testy detekcji bakterii Cms bazują na koncentracji bakterii przy wykorzystaniu siły odśrodkowej - poprzez zwirowywanie zawiesiny bakteryjnej, immunosorbcję na płytkach do testu ELISA (Baer i Gudmestadt, 1993), na mikrosferach aktywowanych magnetycznie mikrosferach krzemionkowych pokrytych odpowiednimi przeciwciałami (test LUMINEX) tudzież utrwalenie niewielkiej porcji zawiesiny na szkiełkach mikroskopowych - test IF (OEPP/EPPO 2006).

Znany jest sposób chemicznej polimeryzacji aniliny (Stejskal i in. 1999) oraz sposób jej modyfikacji przy pomocy aldehydu glutarowego (Fernandes i in. 2003) polegające na tym, że tworzenie polimeru aniliny zachodzi poprzez oksydatywną polimeryzację aniliny. W tym celu sporządzano 0,002 - 2 M roztwór aniliny w 0,01 - 5 N HCl, do którego dodawano 0,01 - 2 M (NH4)2S2O8 w stosunku objętościowym 10:1 (v/v) i po dokładnym wymieszaniu pozostawiano na 2 - 25 minut w temperaturze pokojowej. Następnie nanoszono 1-50 μΐ krople na powierzchnię membran poliwęglanowych i inkubowano 10 - 120 minut w temperaturze pokojowej. Po godzinie trzykrotnie przepłukiwano 2 x dest. H2O, dwukrotnie 0,1 N NaOH, dwukrotnie 0,1 N HCl i pięciokrotnie 2 x dest. H2O, następnie suszono ok. 30 mi-nut w temperaturze pokojowej.

Tak więc problemem jest odnalezienie szybkiego i prostego testu immunofiltracyjnego na wykrywanie bakterii Cms z tkanki roślinnej pozwalającego jednocześnie na koncentrację komórek in situ na małej powierzchni z dużej objętości zawiesiny, a przez to zwiększenie czułości detekcji.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania obecności bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, w analizowanej próbce, charakteryzujący się tym, że analizowaną próbkę zawiesza się w roztworze buforowym, uzyskany roztwór kontaktuje się z i odfiltrowuje się na filtrze pokrytym przeciwciałami wyznakowane złotem koloidalnym specyficznymi wobec antygenu powierzchniowego pochodzącego z wykrywanej bakterii uzyskanymi poprzez prowadzenie immunizacji z wykorzystaniem antygenu bakteryjnego otrzymanego z komórek bakterii poprzez przemywanie bakterii roztworem buforowym wybranym spośród roztworu buforowego glicyna - HCl lub roztworu buforowego glicyna NaOH i ustala się obecność bakterii na filtrze za pomocą przeciwciał, która świadczy o obecności bakterii w analizowanej próbce, przy czym do filtrowania wykorzystuje się aktywowane aniliną membrany poliwęglanowe modyfikowane aldehydem glutarowym zawierające immobilizowane przeciwciała. Równie korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że przeciwciała wyznakowane złotem koloidalnym wykrywa się poprzez redukcję jonów srebra na złocie koloidalnym. Korzystniej sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że wykorzystuje się przeciwciała wyznakowane barwnikiem fluorescencyjnym. W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku sposób charakteryzuje się tym, że wykorzystuje się barwniki fluorescencyjne takie jak karbocyjanina Cy3 lub wszystkie inne. W następnej korzystnej realizacji wynalazku sposób charakteryzuje się tym, że obecność bakterii immobilizowanych na filtrze ustala poprzez namnażanie komórek. Równie korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że namnażanie komórek bakterii następuje po umieszczeniu filtra na powierzchni podłoża zawierającego składniki pokarmowe dla immobilizowanych komórek bakteryjnych. Jeszcze korzystniej sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że podłożami mogą być pożywki selektywne, półselektywne lub mineralne. Najkorzystniej sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że aktywacja membran obejmuje: pokrywanie membran polimerem aniliny, chemiczną modyfikację polianiliny aldehydem glutarowym, powlekanie przeciwciałami, blokowanie i przemywanie roztworem buforowym.

Sposób pomimo swojej prostoty jest nowatorski, szybki, prosty i funkcjonalny. Możliwy jest również do zastosowania w przypadku innych bakterii. Dzięki niemu realna jest przyżyciowa, jak i optyczna ocena morfologii identyfikowanych komórek bakteryjnych.

P r z y k ł a d 1. Polimeryzacja aniliny

Polimeryzację aniliny prowadzano dobierając warunki pozwalające na powtarzalne i równomierne pokrycie polimerem aniliny aktywowanej powierzchni. Anilinę polimeryzowano zarówno na określonych obszarach w postaci plamek o średnicy ok. 5 mm lub na całej powierzchni aktywowanej membrany. Następnie chcąc uzyskać odpowiednie grupy funkcyjne zdolne do przyłączania przeciwciał, powierzchnię wytworzonego polimeru aniliny modyfikowano chemicznie aldehydem glutarowym.

PL 213 857 B1

W tym celu sporządzano 0,002 - 2 M roztwór aniliny w 0,01 - 5 N HCl, do którego dodawano 0,01 - 2 M (NH4)2S2O8 w stosunku objętościowym 10:1 (v/v) i po dokładnym wymieszaniu pozostawiano na

- 25 minut w temperaturze pokojowej. Następnie nanoszono 1 - 50 μΐ krople na powierzchnię membran poliwęglanowych i inkubowano 10 - 120 minut w temperaturze pokojowej. Po godzinie trzykrotnie przepłukiwano 2 x dest. H2O, dwukrotnie 0,1 N NaOH, dwukrotnie 0,1 N HCl i pięciokrotnie 2 x dest. H2O, następnie suszono ok. 30 minut w temperaturze pokojowej. Polianilinę równoważono 0,01 - 1,5 M buforem fosforanowym pH 5,0 - 9,0. Następnie inkubowano 15-120 minut z 2,5% roztworem aldehydu glutarowego w buforze równoważącym, płukano trzykrotnie buforem równoważącym bez aldehydu glutarowego suszono i przechowywano w 4°C.

P r z y k ł a d 2. Aktywacja membran do testów immunofiltracyjnych

Do testu wykorzystano membrany poliwęglanowe otrzymane i aktywowane chemicznie jak w przykładzie 1 a następnie aktywowano przeciwciałami skierowanymi na bakterie Cms. IgG unieruchamiano kowalencyjnie na powierzchni polianiliny w sposób zorientowany i przypadkowy. W pierwszym przypadku stosowano przeciwciała uprzednio poddane procesowi oksydacji oraz polianilinę niemodyfikowaną chemicznie, natomiast w drugim przeciwciała niemodyfikowane chemicznie oraz polianilinę aktywowaną aldehydem glutarowym.

2.1 Sposób zorientowany

Membrany poliwęglanowe aktywowano polianiliną analogicznie jak wcześniej w przykładzie 1, pokrywano 20 μl roztworu oksydowanych przeciwciał o stężeniu 0,001 - 1 mg/ml w buforze 1xPBS pH 7,4 z 20-60% glicerolem. Membrany inkubowano 15 - 120 minut w 37°C i trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4. Następnie nanoszono 20 μl 0,1-30% roztworu NaCNBH₄ w buforze 1xPBS pH 7,4, umieszczano na 15-120 minut pod dygestorium i trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4. Aktywowane powierzchnie inkubowano 15 - 120 minut w 37°C z buforem do blokowania (0,1-1,5% żelatyna w 1xPBS, pH 7,4), po czym trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4 z detergentem 0,05% Tween 20.

2.2 Sposób przypadkowy

Membrany poliwęglanowe aktywowano polianiliną i modyfikowano chemicznie aldehydem glutarowym. a następnie immobilizowano 1 - 50 μl roztworu przeciwciał o stężeniu 0,001-1 mg/ml w buforze 1xPBS pH 7,4 z 20-60% glicerolem. Dalej postępowano jak przy sposobie zorientowanym immobilizacji przeciwciał.

P r z y k ł a d 3. Test z bakteriami

Sporządzano zawiesinę bakterii Cms w mieszaninie soku ziemniaczanego z buforem 1xPBS pH 7,4 w rozcieńczeniach od 100 do 25000 CFU/ml. Membranę z immunoaktywowanymi plamkami polianiliny o rozstawie identycznym jak mikrostudzienki w blocie próżniowym, umieszczono pomiędzy przekładkami blotu próżniowego. Pobierano po 1 ml każdego z roztworów i filtrowano delikatnie przez membrany. Nadmiar niezwiązanych bakterii odpłukiwano trzykrotnie buforem - 1xPBS pH 7,4 z 0,05% Tween 20, natomiast immunopułapkowane bakterie Cms oceniano różnymi technikami:

- przyżyciowo umieszczając membranę stroną aktywną bezpośrednio na pożywce NCP-88 i inkubując 5-15 dni w temperaturze 15-30°C lub

- barwiąc bakterie metodą immunofluorescencyjną-IFAS lub

- barwiąc bakterie koniugatem złota koloidalnego i przeciwciał anty-Cms, a następnie amplifikując przy pomocy jonów srebra.

P r z y k ł a d 4. Oznaczanie bakterii CMS z bulw ziemniaka barwionych złotem koloidalnym

Sporządzano mieszaninę ekstraktu z bulw ziemniaka z buforem 1xPBS pH 7,4. Membranę z immunoaktywowanymi przeciwciałami skierowanymi na bakterie Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na plamkach polianiliny rozmieszczonych identycznie jak mikrostudzienki w blocie próżniowym, umieszczono pomiędzy przekładkami blotu próżniowego. Pobierano po 1 ml mieszaniny i filtrowano delikatnie przez membrany. Nadmiar niezwiązanych bakterii odpłukiwano trzykrotnie buforem - 1xPBS pH 7,4 z 0,05% Tween 20, natomiast immunopułapkowane bakterie Cms oceniano barwiąc bakterie koniugatem złota koloidalnego i przeciwciał anty-Cms, a następnie amplifikując przy pomocy jonów srebra.

P r z y k ł a d 5. Oznaczanie bakterii CMS z bulw ziemniaka barwionych metodą IFAS

Sporządzano mieszaninę ekstraktu z bulw ziemniaka z buforem 1xPBS pH 7,4. Membranę z immunoaktywowanymi przeciwciałami skierowanymi na bakterie Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na plamkach polianiliny rozmieszczonych identycznie jak mikrostudzienki w blocie próżniowym, umieszczono pomiędzy przekładkami blotu próżniowego. Pobierano po 1 ml mieszaniny

PL 213 857 B1 i filtrowano delikatnie przez membrany. Nadmiar niezwiązanych bakterii odpłukiwano trzykrotnie buforem - 1xPBS pH 7,4 z 0,05% Tween 20, natomiast immunopułapkowane bakterie Cms oceniano barwiąc bakterie metodą immunofluorescencyjną - IFAS i następnie prowadząc obserwację pod mikroskopem epifluorescencyjnym.

P r z y k ł a d 6. Posiew z immunofiltru

Sporządzano mieszaninę ekstraktu z bulw ziemniaka z buforem 1xPBS pH 7,4. Membranę z immunoaktywowanymi przeciwciałami skierowanymi na bakterie Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na plamkach polianiliny rozmieszczonych identycznie jak mikrostudzienki w blocie próżniowym, umieszczono pomiędzy przekładkami blotu próżniowego. Pobierano po 1 ml mieszaniny i filtrowano delikatnie przez membrany.

Nadmiar niezwiązanych bakterii odpłukiwano trzykrotnie buforem - 1xPBS pH 7,4 z 0,05% Tween 20, natomiast immunopułapkowane bakterie Cms oceniano przyżyciowo umieszczając membranę stroną aktywną bezpośrednio na pożywce NCP-88 i inkubując 10 dni w temperaturze 21 przyżyciowo umieszczając membranę stroną aktywną bezpośrednio na pożywce NCP-88 i inkubując 10 dni w temperaturze 21°C.

Claims

1. Sposób wykrywania obecności bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, w analizowanej próbce, znamienny tym, że analizowaną próbkę zawiesza się w roztworze buforowym, uzyskany roztwór kontaktuje się z i odfiltrowuje się na filtrze pokrytym przeciwciałami wyznakowane złotem koloidalnym specyficznymi wobec antygenu powierzchniowego pochodzącego z wykrywanej bakterii uzyskanymi poprzez prowadzenie immunizacji z wykorzystaniem antygenu bakteryjnego otrzymanego z komórek bakterii poprzez przemywanie bakterii roztworem buforowym wybranym spośród roztworu buforowego glicyna - HCl lub roztworu buforowego glicyna - NaOH i ustala się obecność bakterii na filtrze za pomocą przeciwciał, która świadczy o obecności bakterii w analizowanej próbce, przy czym do filtrowania wykorzystuje się aktywowane aniliną membrany poliwęglanowe modyfikowane aldehydem glutarowym zawierające immobilizowane przeciwciała.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciała wyznakowane złotem koloidalnym wykrywa się poprzez redukcję jonów srebra na złocie koloidalnym.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wykorzystuje się przeciwciała wyznakowane barwnikiem fluorescencyjnym.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wykorzystuje się barwniki fluorescencyjne takie jak karbocyjanina Cy3 lub wszystkie inne.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obecność bakterii immobilizowanych na filtrze ustala poprzez namnażanie komórek.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że namnażanie komórek bakterii następuje po umieszczeniu filtra na powierzchni podłoża zawierającego składniki pokarmowe dla immobilizowanych komórek bakteryjnych.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podłożami mogą być pożywki selektywne, półselektywne lub mineralne.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że aktywacja membran obejmuje: pokrywanie membran polimerem aniliny, chemiczną modyfikację polianiliny aldehydem glutarowym, powlekanie przeciwciałami, blokowanie i przemywanie roztworem buforowym.