PL210714B1 - Polipeptyd fuzyjny hormonu wzrostu, jego zastosowania medyczne, sposób wytwarzania, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna oraz cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor i transformowana lub transfekowana komórka - Google Patents
Polipeptyd fuzyjny hormonu wzrostu, jego zastosowania medyczne, sposób wytwarzania, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna oraz cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor i transformowana lub transfekowana komórkaInfo
- Publication number
- PL210714B1 PL210714B1 PL371313A PL37131302A PL210714B1 PL 210714 B1 PL210714 B1 PL 210714B1 PL 371313 A PL371313 A PL 371313A PL 37131302 A PL37131302 A PL 37131302A PL 210714 B1 PL210714 B1 PL 210714B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- polypeptide
- cell
- ghr
- growth hormone
- binding domain
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 55
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 52
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 52
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 96
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 96
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims abstract description 96
- 102100020948 Growth hormone receptor Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108010068542 Somatotropin Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 17
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 14
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 7
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 5
- 206010000599 Acromegaly Diseases 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 2
- 208000007342 Diabetic Nephropathies Diseases 0.000 claims description 2
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 2
- 241000224495 Dictyostelium Species 0.000 claims description 2
- 206010018265 Gigantism Diseases 0.000 claims description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 2
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 claims description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 2
- 208000033679 diabetic kidney disease Diseases 0.000 claims description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000002249 Diabetes Complications Diseases 0.000 claims 1
- 206010012655 Diabetic complications Diseases 0.000 claims 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 claims 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 102220080600 rs797046116 Human genes 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 101001075374 Homo sapiens Gamma-glutamyl hydrolase Proteins 0.000 description 4
- 101000664737 Homo sapiens Somatotropin Proteins 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 101150055782 gH gene Proteins 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 229940122853 Growth hormone antagonist Drugs 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000009025 developmental regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- -1 poly (oxy) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000026267 regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- 108010033419 somatotropin-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
- A61P5/08—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the anterior pituitary hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd fuzyjny zawierający zmodyfikowaną domenę wiążącą hormonu wzrostu (GH) i domenę wiążącą GH receptora hormonu wzrostu (GHR), jego zastosowania medyczne, sposób wytwarzania, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna oraz cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor i transformowana lub transfekowana komórka.
GH jest przedstawicielem dużej rodziny hormonów zaangażowanych w regulację wzrostu i rozwoju u ssaków. Ludzki GH jest 22 kDa polipeptydem, który jest zaangażowany w szereg procesów biologicznych, na przykład, wzrost komórek, laktację, aktywację makrofagów i regulację metabolizmu energetycznego. GH oddziaływuje kolejno z dwoma związanymi z błoną GHR przez dwa różne miejsca na GH opisywane, jako miejsce 1 i miejsce 2. Miejsce 1 jest miejscem wiązania o wysokim powinowactwie, a miejsce 2 o niskim powinowactwie. Pojedyncza cząsteczka GH wiąże jeden GHR przez miejsce 1. Drugi GHR zostaje wówczas związany przez miejsce 2 z wytworzeniem kompleksu GHR:GH:GHR. Kompleks następnie przedostaje się do wnętrza i aktywuje kaskadę przekazywania sygnału prowadząc do zmian w ekspresji genów.
Zewnątrzkomórkowa domena GHR istnieje, jako dwie połączone domeny, każda około 100 aminokwasów (SD-100), C-końcowa domena SD-100 (b) będąca najbliżej powierzchni komórki i N-końcowa domena SD-100 (a) będąca najbardziej oddalona. Przy wiązaniu hormonu z wytworzeniem kompleksu trimerycznego GHR:GH:GHR następuje zmiana konformacyjna w tych dwóch domenach.
Zmodyfikowane GH są ujawnione w US 5849535. Modyfikacja GH występuje zarówno w miejscu 1, jak i miejscu 2 miejsc wiążących. Modyfikacje miejsca 1 dają w rezultacie cząsteczkę GH, która ma wyższe powinowactwo do GHR w porównaniu do GH typu dzikiego. Te modyfikowane cząsteczki GH działają agonistycznie. Znajduje się tu również ujawnienie modyfikacji miejsca 2, które powodują wytworzenie antagonistów GH. Dalsze przykłady modyfikacji GH, które zmieniają powinowactwo wiązania GH dla miejsca 1 są ujawnione w opisach patentowych US 5854026; US 6004931; US 6022711; US 6057292; oraz US 6136563. Podsumowanie modyfikacji przeprowadzonych w miejscu 1 jest przedstawione w tabeli 1. Ujawnione są również modyfikacje miejsca 2, w szczególności reszty aminokwasowej G120, która kiedy jest podstawioną argininą, lizyną, tryptofanem, tyrozyną, fenyloalaniną lub kwasem glutaminowym, daje w rezultacie cząsteczkę GH o właściwościach antagonistycznych.
Ponadto, zmodyfikowany GH jest opłaszczany glikolem poli(oksy)etylenowym (PEG) w procesie znanym jako „pegylacja”, co ma szereg korzystnych skutków. Po pierwsze, opłaszczenie PEG zwiększa rzeczywistą masę cząsteczkową GH z 22 kD do około 40 kD. Skutkiem jest zmniejszenie filtracji kłębuszkowej GH, w ten sposób zwiesza się okres półtrwania in vivo GH, co zmniejsza dawkę podawaną w celu uzyskania pożądanego efektu. Ponadto, uważa się, że pegylacja obniża zarówno immunogeimość, jak i toksyczność białek, które są w ten sposób przygotowane, patrz Abuchowski i wsp. J. Biol. Chem., 252, 3578-3581, (1977).
Jednakże, konsekwencją pegylacji jest obniżenie powinowactwa cząsteczki zmodyfikowanego GH wobec GHR. Oznacza to, że jest konieczna zwiększona dawka do przezwyciężenia obniżonego powinowactwa. Jest to niepożądane, ponieważ przeciwdziała to korzystnemu skutkowi pegylacji w odniesieniu do zwiększenia okresu półtrwania modyfikowanego GH. Byłoby pożądane dostarczenie zmodyfikowanej cząsteczki GH, która nie wymaga pegylacji, ale ma wydłużony okres półtrwania i ma również dodatkowe korzyści obniżonej immunogenności oraz nie jest toksyczna.
Według pierwszego aspektu wynalazku, zostaje dostarczony polipeptyd fuzyjny obejmujący:
i) zmodyfikowaną domenę wiążącą hormonu wzrostu (GH), przy czym modyfikacja jest substytucją reszty aminokwasowej glicyny 120 na fig. 12 na argininę, lizynę, tryptofan, tyrozynę, fenyloalaninę lub kwas glutaminowy, korzystniej na argininę lub lizynę, a najkorzystniej na argininę; oraz ii) domenę wiążącą hormon wzrostu receptora hormonu wzrostu (GHR);
przy czym polipeptyd fuzyjny jest antagonistą receptora hormonu wzrostu (GHR).
Jak opisano uprzednio, są znane w dziedzinie mutacje miejsca 1, które zwiększają powinowactwo hormonu wzrostu do jego domeny wiążącej w receptorze hormonu wzrostu. Taki zmodyfikowany hormon wzrostu działa, jako agonista. Jeżeli modyfikacja miejsca 1 jest połączona z modyfikacją miejsca 2, przy czym ta ostatnia modyfikacja powoduje inaktywację łub częściową inaktywację miejsca 2 miejsca wiążącego, wówczas taka cząsteczka jest antagonistą. Modyfikacja tylko miejsca 2, która wykorzystuje miejsce 1 typu dzikiego, również daje w rezultacie antagonistę.
Zatem w jeszcze dalszym korzystnym wykonaniu wynalazku w celu zwiększenia powinowactwa miejsca 1 do jego wiążącej domeny w GHR, w polipeptydzie fuzyjnym według wynalazku zmodyfikowany
PL 210 714 B1 hormon wzrostu zawiera substytucję: histydyna 18 na kwas asparaginowy, histydyna 21 na asparaginę, glicyna 120 na argininę, arginina 167 na asparaginę, lizyna 168 na alaninę, kwas asparaginowy 171 na serynę, lizyna 172 na argininę, kwas glutaminowy 174 na serynę, oraz izoleucyna 179 na treoninę.
Zgodnie z wynalazkiem modyfikacja miejsca 2 dotyczy reszty aminokwasowej 120 sekwencji przedstawionej na fig. 12. Korzystnie, wspomniana modyfikacja miejsca 2 jest połączona z modyfikacjami miejsca 1, jak ujawniono niniejszym. Alternatywnie, GH jest zmodyfikowany tylko w reszcie aminokwasowej glicyny 120.
W dalszym korzystnym wykonaniu wynalazku, domena GHR wiążąca hormon wzrostu jest domeną zewnątrzkomórkową GHR. Korzystniej, domena wiążąca jest C-końcową domeną SD-100 GH.
Domena wiążąca w polipeptydzie fuzyjnym może być GHR pełnej długości.
W biał ku fuzyjnym wedł ug wynalazku zmodyfikowany GH moż e być fuzją translacyjną w tej samej ramce z GHR lub jego częścią. Korzystnie, polipeptyd fuzyjny obejmuje zmodyfikowany GH i C-końcową domenę SD-100 GHR.
W alternatywnym dalszym korzystnym wykonaniu wynalazku, w polipeptydzie wedł ug wynalazku zmodyfikowana domena wiążąca GH jest połączona przez łącznik z domeną wiążącą GH GHR. Łącznik może być elastyczny.
Łącznik może znajdować się przy każdej reszcie aminokwasowej w obrębie domeny zewnątrzkomórkowej receptora, która umożliwiłaby zmodyfikowanemu GH elastyczne wiązanie się z wolnym receptorem na powierzchni komórki. Korzystnie, połączenie jest wytworzone pomiędzy resztą bliską C-końca zmodyfikowanej cząsteczki GH i resztą bliską N-końca GHR. Bardziej korzystnie, połączenie jest wytworzone pomiędzy resztą bliską C-końca zmodyfikowanej cząsteczki GH i resztą bliską N-końca w N-końcu C-końcowej SD-100. Bardziej korzystnie, połączenie jest wytworzone przy dowolnej reszcie 126-128 z N-końca C-końcowej SD-100 GHR. W jednym wykonaniu wynalazku, połączenie jest wytworzone przy reszcie 127 N-końca C-końcowej SD-100. Korzystnie, łącznik jest peptydem.
Struktura krystalograficzna kompleksu GHR:GH:GHR pokazuje, że odległość pomiędzy C-końcem GH (reszta 191) i N-końcem C-końcowej SD-100 (reszty 126-128) wynosi 10A. Dostarcza to cennej informacji w odniesieniu do projektowania łącznika.
Korzystnie, łącznik jest polipeptydem, który obejmuje 5 do 30 reszt aminokwasowych. Bardziej korzystnie, łącznik obejmuje 10 do 20 reszt aminokwasowych. Jeszcze bardziej korzystnie, łącznik obejmuje przynajmniej jedną kopię peptydu: Gly Gly Gly Gly Ser (określany dalej jako „Gly4Ser”).
W jednym wykonaniu wynalazku, łącznik ma 10 aminokwasów długości i obejmuje dwie kopie łącznika Gly4Ser. W alternatywnym wykonaniu wynalazku, łącznik ma 15 aminokwasów długości i obejmuje trzy kopie łącznika Gly4Ser. W jeszcze innym alternatywnym wykonaniu, łącznik ma 20 aminokwasów długości i obejmuje cztery kopie łącznika Gly4Ser.
W korzystnym wykonaniu wynalazku, polipeptyd pochodzi z ludzkiego GH i ludzkiego GHR.
Według dalszego aspektu wynalazku, zostaje dostarczona cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd według wynalazku.
Cząsteczki kwasu nukleinowego, które kodują zmodyfikowany hormon wzrostu, mogą być typowo syntetyzowane technikami molekularnymi znanymi w dziedzinie obejmującymi metody rekombinacyjne, jak również syntezę cząsteczek kwasu nukleinowego z wykorzystaniem urządzeń do syntezy oligonukleotydów.
Według dalszego aspektu wynalazku, zostaje dostarczony wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku.
W korzystnym wykonaniu wynalazku, wspomniany wektor jest wektorem ekspresyjnym przystosowanym do ekspresji rekombinowanych genów.
Zazwyczaj, przystosowanie obejmuje, na przykład i nie ograniczająco, dostarczenie sekwencji kontrolujących transkrypcję (sekwencje promotorowe), które prowadzą ekspresję specyficzną komórkowo/tkankowo. Te sekwencje promotorowe mogą być specyficzne komórkowo/tkankowo, indukowalne lub konstytutywne.
Promotor to określenie obejmujące następujące własności, które zostają przytoczone wyłącznie jako przykład, a nie w sposób ograniczający. Elementy wzmacniające transkrypcję są to sekwencje kwasu nukleinowego działające w układzie cis często znajdowane w pozycji 5' do miejsca inicjacji transkrypcji genu (wzmacniacze transkrypcji mogą być również znajdowane w pozycji 3' do sekwencji genu lub nawet zlokalizowane w sekwencjach intronowych i zatem są niezależne od położenia). Wzmacniacze transkrypcji działają podnosząc wydajność transkrypcji genu, do którego są przyłączone. Aktywność wzmacniacza transkrypcji odpowiada na czynnik transkrypcyjny działający w układzie
PL 210 714 B1 trans, który, jak wykazano, wiąże się specyficznie z elementami wzmacniającymi transkrypcję. Wiązanie/aktywność czynników transkrypcyjnych (patrz Eukaryotic Transcription Factors, David S. Latchman, Academic Press Ltd., San Diego) zmienia się w odpowiedzi na liczne bodźce środowiskowe, które obejmują, na przykład, i nie w sposób ograniczający, pośrednie metabolity i/lub efektory środowiskowe.
Elementy promotorowe obejmują również tak zwane sekwencje TATA-box i sekwencje inicjacji selekcji polimerazy RNA (RIS, ang. RNA polylmerase initiation selection), które działają wybierając miejsce inicjacji transkrypcji. Te sekwencje wiążą również polipeptydy, które działają między innymi ułatwiając inicjację transkrypcji przez polimerazę RNA.
Możliwe jest również dostarczenie markerów selekcyjnych i sekwencji autonomicznej replikacji, z których każ dy uł atwia utrzymywanie wspomnianego wektora w komórce eukariotycznej lub gospodarzu prokariotycznym. Wektory utrzymywane autonomicznie, są określane jako wektory episomalne. Wektory episomalne są pożądane, ponieważ te cząsteczki mogą włączać duże fragmenty DNA (30-50 kb). Wektory episomalne tego rodzaju są opisane w WO 98/07876.
W celu uł atwienia ekspresji genów kodowanych w wektorze, dostarcza się sekwencji terminacji transkrypcji/poliadenylacji. Obejmuje to również dostarczenie wewnętrznych miejsc wiązania rybosomów (IRES, ang. internal ribosome entry sites), które działają maksymalizując ekspresję genów kodowanych w wektorze, zorganizowanych w dwu-cistronowych lub wielo-cistronowych kasetach ekspresyjnych.
Tego typu czynności są dobrze znane w dziedzinie. Istnieje znacząca ilość opublikowanej literatury odnoszącej się do konstrukcji wektorów ekspresyjnych i w ogólności technik rekombinacji DNA. Patrz, Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY i zawarte w nim odnośniki literaturowe; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach, tom III IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning: F M Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
Według dalszego aspektu wynalazku, zostaje niniejszym dostarczone zastosowanie polipeptydu fuzyjnego według wynalazku, jako leku oraz zastosowanie białka fuzyjnego według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia stanu wybranego z grupy składającej się z: gigantyzmu, akromegalii, nowotworu (np. guz Wilmsa, mięsak kościopochodny, sutka, okrężnicy, prostaty, tarczycy), retinopatii cukrzycowej, nefropatii cukrzycowej i innych powikłań cukrzycy i nadmiaru GH. W korzystnej postaci wykonania lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do leczenia akromegalii.
Polipeptydy i kompozycje według wynalazku mogą być podawane każdą tradycyjną drogą, włączając wstrzyknięcie lub przez stopniowy wlew na przestrzeni określonego czasu. Podawanie może, na przykład, odbywać się doustnie, dożylnie, dootrzewnowo, domięśniowo, do jamy ciała, doocznie, podskórnie lub przezskórnie. Przedmiot wynalazku stanowią również kompozycje farmaceutyczne zawierające polipeptyd fuzyjny według wynalazku. Kompozycje farmaceutyczne mogą dogodnie być prezentowane w jednostkowej postaci dawkowania i mogą być przygotowane wszystkimi sposobami dobrze znanymi w dziedzinie farmacji.
Kiedy podawany polipeptyd fuzyjny według wynalazku będzie zatem stosowany w dopuszczalnych farmaceutycznie ilościach i w dopuszczalnych farmaceutycznie kompozycjach. Określenie „dopuszczalny farmaceutycznie” oznacza nietoksyczną substancję, która nie zakłóca skuteczności aktywności biologicznej składników aktywnych. Takie kompozycje mogą rutynowo zawierać sole, czynniki buforujące, konserwanty, odpowiednie nośniki i ewentualnie inne czynniki terapeutyczne.
Składniki aktywne mogą być łączone, gdy jest to pożądane, z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem. Określenie „dopuszczalny farmaceutycznie nośnik” oznacza jeden lub więcej odpowiednich stałych lub ciekłych wypełniaczy, rozcieńczalników lub substancji do wytwarzania kapsułek, które są odpowiednie do podawania człowiekowi. Określenie „nośnik” oznacza organiczny lub nieorganiczny składnik, naturalny lub syntetyczny, z którym jest łączony aktywny składnik, aby ułatwić podawanie. Kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać stosowne czynniki buforujące, włączając kwas octowy z solą ; kwas cytrynowy z solą ; kwas borowy z solą ; oraz kwas fosforowy z solą . Kompozycje farmaceutyczne mogą również zawierać ewentualnie odpowiednie konserwanty, takie jak chlorek benzalkoniowy, chlorobutanol, parabeny i tiomersal.
Według jeszcze innego aspektu wynalazku, zostaje dostarczona komórka transformowana lub tranfekowana kwasem nukleinowym lub wektorem według wynalazku.
PL 210 714 B1
W korzystnym wykonaniu wynalazku, komórką jest komórka eukariotyczna. Korzystnie, wspomniana komórka jest wybrana w z grupy składającej się z: śluzowca (np. gatunek Dictyostelium) komórki drożdży (np. Saccharomyces cerevisae; gatunek Pichia); komórki ssaka (np. jajnika chomika chińskiego); komórki roślinnej; komórki owadziej (np. gatunku Spodoptera).
W alternatywnym korzystnym wykonaniu, komórką jest komórka prokariotyczna, korzystnie Escherchia coli lub z gatunku Bacillus.
Według dalszego aspektu wynalazku, zostaje niniejszym dostarczony sposób wytwarzania polipeptydu według wynalazku obejmujący:
i) dostarczanie komórki według wynalazku;
ii) inkubowanie komórki w warunkach sprzyjających wytwarzaniu polipeptydu według wynalazku; i ewentualnie iii) izolowanie polipeptydu z komórki lub podłoża hodowli komórkowej.
W korzystnym sposobie według wynalazku, polipeptyd jest dostarczany z sygnałem wydzielniczym w celu ułatwienia oczyszczania polipeptydu z komórki. Jeszcze bardziej korzystnie, wspomniany polipeptyd jest dostarczony ze znacznikiem powinowactwa w celu ułatwienia oczyszczania polipeptydu z komórki lub podłoża hodowli komórkowej.
Niniejszym opisano ponadto sposób leczenia ssaka, korzystnie człowieka, obejmujący podawanie temu ssakowi polipeptydu według wynalazku.
Ponadto w niniejszym opisie ujawniono polipeptyd obejmujący więcej niż dwie modyfikowane domeny wiążące hormonu wzrostu, przy czym modyfikacja to addycja, delecja lub podstawienie przynajmniej jednej reszty aminokwasowej.
Wykonanie wynalazku będzie teraz opisane jedynie na drodze przykładu i w odniesieniu do następującej tabeli i figur:
Tabela 1 przedstawia zestawienie podstawień aminokwasowych w miejscu 1 i miejscu 2 ludzkiego GH;
Fig. 1. Mapa plazmidu pHEAT.GH.G120R, który został wytworzony przez połączenie genu GH.G120R, zsyntetyzowanego w PCR, pomiędzy miejscami restrykcyjnymi BamHl i Notl. Markerem selekcyjnym na plazmidzie jest AmpR;
Fig. 2. Mapa plazmidu pTrcHis-TOPO. 1A7, który został wytworzony przez połączenie genu GH.G120R pomiędzy miejscami BamHI i Notl w pTrcHis 1A1. Łącznikiem jest (G4S)4 i markerem selekcyjnym na plazmidzie jest AmpR;
Fig. 3. Mapa plazmidu pTrcHis-TOPO. 1B2, który został wytworzony przez połączenie genu GH.G120R pomiędzy miejscami BamHl i Notl w pTrcHis 1B1. Łącznikiem jest (G4S)4 i markerem selekcyjnym na plazmidzie jest AmpR;
Fig. 4. Mapa plazmidu pTrcHis-TOPO. 1C3, który został wytworzony przez połączenie genu GH.G120R pomiędzy miejscami EcoRl i HinDlll w pTrcHis 1A7. Łącznikiem jest (G4S)4 i markerem selekcyjnym na plazmidzie jest AmpR;
Fig. 5. Sekwencja genu GH.G120R, przedstawiająca kodon startowy, znacznik 6xHis, istotne miejsca restrykcyjne, kodony stop i mutację G120R (CGC). Właściwy składnik GH.G120R jest pokazany WIELKIMI LITERAMI, sekwencjonowane regiony są pokazane tłustą czcionką;
Fig. 6. Sekwencja genu 1A7, pokazująca kodon startowy, znacznik 6xHis, istotne miejsca restrykcyjne, kodony stop i mutację G120R (CGC). Właściwy składnik GH. G120R-(G4S)4-GHR(b) jest pokazany WIELKIMI LITERAMI i sekwencjonowane regiony są pokazane tłustą czcionką;
Fig. 7. Sekwencja genu 1B2, pokazująca kodon startowy, znacznik 6xHis, istotne miejsca restrykcyjne, kodony stop i mutację G120R (CGC). Właściwy składnik GH.G120R-(G4S)4-GHR (flec) jest pokazany WIELKIMI LITERAMI i sekwencjonowane regiony są pokazane tłustą czcionką;
Fig. 8. Sekwencja genu 1C3, pokazująca kodon startowy, znacznik 6xHis, istotne miejsca restrykcyjne, kodony stop i mutację G120R (CGC). Właściwy składnik GH.G120R-(G4S)4-GH.G120R jest pokazany WIELKIMI LITERAMI i sekwencjonowane regiony są pokazane tłustą czcionką;
Fig. 9. Analiza Western blot ekspresji GHG120R, 1A7, 1B2 i 1C3 z zastosowaniem antyludzkiego GH jako przeciwciała pierwszorzędowego 15% żeli SDS-PAGE. Ekspresja odbywała się z wektora pTrcHis w komórkach E. coli XL1 Blue lub E. coli SURE; próbki był y pobierane w 4 godziny po indukcji 1 mM (stężenie końcowe) IPTG. Bioty pokazują, że GH.G120R i 1C3 wytwarzają pojedyncze prążki, podczas gdy próbki z 1A7 i 1B2 zawierają produkty trawienia;
Fig. 10. 15% Żele SDS-PAGE, barwione Coomassie [C], z oczyszczonym GH.G120R, 1A7 i 1C3. Analizy Western biot [W] tych próbek z uż yciem anty-ludzkiego GH jako przeciwciał a pierwszo6
PL 210 714 B1 rzędowego są również przedstawione. Żele wybarwione Coomassie pokazują, że oczyszczone próbki białek są > 95% czyste, jednakże, analizy Western błot pokazują, że tylko GH.G120R i 1C3 wytwarzają pojedyncze prążki, podczas gdy próbka 1A7 zawiera produkty trawienia;
Fig. 11. Wykresy pokazujące wyniki oznaczenia typu biologicznego GH dla GH.G120R, 1A7 i 1C3. Każ dy wykres pokazuje krzywą standardową, oznaczenie z samym konstruktem przy różnych stężeniach i oznaczenie z konstruktem przy różnych stężeniach z 25 ng/ml hGH. Pokazuje to, że żadne z białek nie ma własnej aktywności agonistycznej, ale wszystkie mają aktywność antagonistyczną z GH.G120R bę d ą cym najbardziej aktywnym i 1A7 najmniej;
Fig. 12 to sekwencja aminokwasowa niemodyfikowanego GH;
Fig. 13 to sekwencja kwasu nukleinowego niemodyfikowanego GH.
Materiały i metody
Metody wykorzystywane do wytworzenia GH modyfikowanego w miejscu 1 i/lub miejscu 2 są ujawnione w opiach patentowych US 5849535; US 5854026; US 6004931; US 6022711; US 6057292; i US 6136563.
Konstrukty DNA
Wytwarzanie antagonisty GH zmutowanego w miejscu 2 (GHa) cDNA dla ludzkiego GH (fig. 1) został namnożony w PCR z tkanki przysadki ludzkiej i sklonowany w wektorze pTrcHis-Topo (pTrc-TOPO-GHstop). Domena zewnątrzkomórkowa GHR została namnożona z cDNA wątroby ludzkiej z użyciem PCR.
Konstrukty antagonistów hormonu wzrostu (G120R)
Mutacja G120R hormonu wzrostu
Gen hormonu wzrostu (GH) został zmutowany z użyciem metody mutacji ssDNA fagemidu. Gen GH został najpierw sub-klonowany z pTrcHisGH do pT7T318 pomiędzy miejscami BamHl i Hindlll, z wytworzeniem pT7T318-GH. Plazmid ten został następnie transformowany do E. coli CJ236 i wytworzono jednoniciowe ssDNA.
ssDNA pT7T318-GH był następnie mutowany przez zmianę kodonu dla Gly 120 z GGC w CGC. Wykorzystywany był starter GH.(G120R) (Tabela 1).
dsDNA pT7T318-GH.G120R wytworzony po procesie mutacji był następnie używany do sub-klonowania GH.G120R do wektora pHEAT, z wytworzeniem pHEAT.GH.G120R (fig. 1).
Wytwarzanie konstruktów GH.G120R x1A7[GH.G120R-(G4S)4-GHR(b)]=GHa przyłączony do domeny b GHR.
Gen GH.G120R został wycięty z pHEAT.GH.G120R (fig. 1) z użyciem miejsc restrykcyjnych SamHl i Not\. Następnie gen został włączony w miejsce genu GH w pTrcHis%1A1 [GH-(G4S)4-GHR (b)] (fig. 2). Otrzymany plazmid został transformowany do Escherichia coli XL1 Blue i wysiany na stałe podłoże agarowe LB (0,3% glukozy, 50 μg/ml ampicyliny, 12,5 μg/ml tetracykliny).
x1B2[GH.G120R-(G4S)4-GHRflec]=GHa przyłączony do pełnej długości zewnątrzkomórkowej domeny GHR.
Strategia wykorzystana do wytworzenia genu χ1Α7 została powtórzona, jednakże wektorem przyjmującym był pTrcHisx1B1 [GH-(G4S)4-GHRflec] (fig. 3). Otrzymany plazmid został transformowany do E. coli XL1 Blue i wysiany na stałe podłoże agarowe LB (0,3% glukozy, 50 μg/ml ampicyliny, 12,5 μg/ml tetracykliny).
Tandem x1C3 [GH.G120R-(G4S)4-GH.G12QR1]=GHa.
Reakcja PGR została przeprowadzona na pTrcHisGH z użyciem starterów DiGHEcoFl i DiGHHinRl (tabela 1). Produkt PGR został następnie strawiony EcoRI i Hindilll, następnie włączony w miejsce domeny GHR(b) w pTrcHisx1A1[GH-(G4S)4-GHR(b)] (fig. 4). Otrzymany plazmid został transformowany do niezdolnych do rekombinacji E. coli SURE i wysiany na stałe podłoże agarowe LB (0,3% glukozy, 50 μg/ml ampicyliny, 12,5 μg/ml tetracykliny, 50 μg/ml kanamycyny).
Wyniki sekwencjonowania
Plazmidy zawierające konstrukty genowe zostały zsekwencjonowane. Sekwencje genów i obszary sekwencjonowane dla GH.G120R, χ1Α7, χ1Β2 i x1C3 są przedstawione na fig. 5-8, odpowiednio.
Badanie ekspresji
Pojedyncze kolonie były wykorzystywane do inokulacji 3 ml płynnego podłoża LB (0,3%) glukozy, 50 μg/ml ampicyliny, 12,5 μg/ml tetracykliny) dla komórek E. coli XLI Blue i płynnego podłoża LB (0,3%) glukozy, 50 μg/ml ampicyliny, 12,5 μg/ml tetracykliny, 50 μg/ml kanamycyny) dla komórek E. coli SURE. Były one hodowane z wytrząsaniem przez noc w 37°C.
PL 210 714 B1 ml podłoża 4YT, zawierającego odpowiednie antybiotyki, były następnie inokulowane 200 μΐ całonocnej hodowli w LB. Były one hodowane przez 3 godz., następnie były pobierane próbki 1 ml (próbki T0).
Hodowle 4YT były następnie indukowane IPTG do końcowego stężenia 1 mM i dalej inkubowane przez następne 4 godz. (próbki T4).
Próbki T0 i T4 były obrabiane natychmiast po tym, gdy zostały pobrane. Zostały najpierw odwirowane w celu zebrania komórek, nadsącz był następnie odrzucony i osad został przygotowany do rozdziału w żelu SDS PAGE. Białko zostało uwidocznione w tych żelach PAGE przez albo barwienie Coomassie lub przez analizę Western blot z zastosowaniem pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko GH w celu sprawdzenia konstruktu.
We wszystkich przypadkach, żele PAGE barwione Coomassie nie wykazywały nadekspresji konstruktu. Jednakże, konstrukty były obserwowane w analizach Western biot (fig. 9). Pokazuje to, że we wszystkich przypadkach jest wytwarzane białko o właściwej wielkości.
Oczyszczanie
Ogólnie, białko było oczyszczane z hodowli 4 x 250 ml prowadzonych w 4YT, zawierających odpowiednie antybiotyki i indukowanych przez 4-5 godzin IPTG do końcowego stężenia 1 mM. Komórki były zbierane przez odwirowanie i lizowane przez działanie lizozymem i dezoksycholanem sodu, a następnie sonikację.
Zlizowane komórki były odwirowywane w celu usunięcia fragmentów komórek i nadsącz był wstępnie oczyszczany z użyciem Invitrogen ProBond Resin (kolumna Ni). Białko było wymywane z użyciem 5 ml 0,5 M imidazolu.
Próbka białka była dalej oczyszczana przez 10-krotne rozcieńczenie produktu wymywania z kolumny Ni odpowiednim buforem i następnie przepuszczanie przez kolumnę jonowymienną MonoQ. Białko było wymywane z użyciem gradientu soli 0-1 M NaCl w 20 ml z prędkością 0,5 ml/min; były zbierane frakcje 0,5 ml. Frakcje były następnie analizowane na obecność konstruktu i frakcje zawierające konstrukt połączono.
Oczyszczone białko było analizowane przez SDS PAGE (barwienie Coomassie i analiza Western blot) (fig. 10) i oznaczane w celu pomiaru stężenia. Białko było następnie poddane analizie biologicznej.
W przypadku x1A1 i x1B2, które wykazywały produkty trawienia w analizie Western blot, konstrukty zostały zbadane w układzie Rapid Translation System (RTS) na transkrypcję in vitro. Poprzednio, badania na x1A7l i x1B2 wykazały, że trawienie było znacznie obniżone z użyciem układu RTS w połączeniu z inhibitorami proteaz i białek opiekuńczych przy ekspresji.
Test biologiczny
Oczyszczone konstrukty zostały poddane standardowej analizie biologicznej GH Asterion. Przygotowane 293 Hi, które trwale wyrażają receptor hormonu wzrostu, były stymulowane konstruktem z użyciem szeregu dawek. Druga duplikatowa płytka została również przygotowana, ale 25 ng/ml GH zostało dodane po 30 min. po dodaniu kontruktu w celu określenia antagonistycznej zdolności konstruktu.
Wszystkie konstrukty GH.G120R miały aktywności antagonistyczne (fig. 11).
Przeszukiwanie pod kątem aktywności antagonistycznej
Ustalony test biologiczny jest używany do poszukiwania aktywności antagonistycznej (9). Stała linia komórkowa wytwarzająca pełnej długości GHR jest przejściowo transfekowana lucyferazą, która wiąże aktywowany Stat5 (9). Dwadzieścia cztery godziny później, komórki są stymulowane GH przez 6 godzin razem z lub bez antagonisty. Komórki są następnie lizowane i jest mierzona aktywność lucyferazy (9).
Badanie wydajności klirensu metabolicznego in vivo
Szczury Sprague-Dawley są znieczulane i kanula zostaje wprowadzona do żyły udowej i szyjnej. Dwa dni później białko fuzyjne jest podawane przez wstrzyknięcie dożylne lub podskórne. Próbki krwi są zbierane przez kanulę udową i poziomy białka lub oligomerów mierzone przez oznaczenie radioimmunologiczne. Parametry farmakokinetyczne są oceniane z użyciem dostępnych programów komputerowych ustalających stężenia hormonu wobec czasu.
Tabela 1 przedstawia podsumowanie substytucji aminokwasowych wprowadzonych w miejsce 1 GH. Modyfikacje miejsca 2 obejmują podstawienie G120 dowolnym spośród argininy; alaniny; lizyny; tryptofanu; tyrozyny; fenyloalaniny; lub kwasu glutaminowego.
PL 210 714 B1
| H18 | H21 | Q22 | F25 | D26 | Q29 | E65 | R167 | K168 | D171 | KI 72 | El 74 | 1179 |
| D | N | N | A | S | R | S | T | |||||
| A | A | A | A | A | A | A | A | |||||
| A | A | A | A | A | A | A | ||||||
| D | A | A | A | A | A | A | S | |||||
| A | A | A | A | A | A | A | S | |||||
| D | A | A | A | A | A | A | A | |||||
| A | A | A | A | A | A | A | A | |||||
| D | N | N | A | S | R | S | T | |||||
| A | A | A | A | A | A | A | A |
Zastrzeżenia patentowe
Claims (23)
1. Polipeptyd fuzyjny obejmują cy:
i) zmodyfikowaną domenę wiążącą hormonu wzrostu (GH), przy czym modyfikacja jest substytucją reszty aminokwasowej glicyny 120 w sekwencji przedstawionej na fig. 12 na argininę, lizynę, tryptofan, tyrozynę, fenyloalaninę lub kwas glutaminowy; oraz ii) domenę wiążącą hormon wzrostu receptora hormonu wzrostu (GHR); przy czym polipeptyd fuzyjny jest antagonistą receptora hormonu wzrostu (GHR).
2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że substytucję stanowi substytucja glicyny
120 na argininę lub lizynę.
3. Polipeptyd według zastrz. 2, znamienny tym, że substytucję stanowi substytucja glicyny 120 na argininę.
4. Polipeptyd według jednego z zastrz. 1-3, znamienny tym, że domeną wiążącą hormon wzrostu receptora hormonu wzrostu (GHR) jest domena zewnątrzkomórkowa GHR.
5. Polipeptyd według zastrz. 4, znamienny tym, że domeną zewnątrzkomórkowa GHR jest C-końcowa domena SD-100 GHR.
6. Polipeptyd według jednego z zastrz. 1-5, znamienny tym, ż e zmodyfikowana domena wiążąca GH jest połączona łącznikiem z wiążącą GH domeną GHR.
7. Polipeptyd według zastrz. 6, znamienny tym, że łącznikiem jest łącznik polipeptydowy, który obejmuje 5 do 30 reszt aminokwasowych.
8. Polipeptyd według zastrz. 7, znamienny tym, że łącznik polipeptydowy obejmuje 10 do 20 reszt aminokwasowych.
9. Polipeptyd wedł ug zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, ż e łącznik obejmuje przynajmniej jedną kopię peptydu Gly Gly Gly Gly Ser.
10. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje:
i) zmodyfikowany hormon wzrostu, przy czym modyfikację stanowi substytucja: histydyna 18 na kwas asparaginowy, histydyna 21 na asparaginę, glicyna 120 na argininę, arginina 167 na asparaginę, lizyna 168 na alaninę, kwas asparaginowy 171 na serynę, lizyna 172 na argininę, kwas glutaminowy 174 na serynę, oraz izoleucyna 179 na treoninę; oraz ii) domenę wiążącą hormon wzrostu receptora hormonu wzrostu.
11. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd określony w jednym z zastrz. 1-10.
12. Wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 11.
13. Wektor według zastrz. 12, znamienny tym, że jest wektorem ekspresyjnym przystosowanym do ekspresji rekombinacyjnej.
14. Polipeptyd określony w jednym z zastrz. 1-10 do zastosowania jako lek.
15. Zastosowanie polipeptydu określonego w jednym z zastrz. 1-10 do wytwarzania leku do leczenia stanu wybranego z grupy składającej się z: gigantyzmu, akromegalii, nowotworu, guza Wilmsa, mięsaka kościopochodnego, raka sutka, raka okrężnicy, raka prostaty, raka tarczycy, retynopatii cukrzycowej, nefropatii cukrzycowej i powikłań cukrzycy oraz dowolnej choroby nadmiaru GH.
16. Zastosowanie według zastrz. 15 do leczenia akromegalii.
PL 210 714 B1
17. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera polipeptyd określony w jednym z zastrz. 1-10.
18. Komórka transformowana lub transfekowana kwasem nukleinowym lub wektorem określonym w jednym z zastrz. 11-13.
19. Komórka według zastrz. 18, znamienna tym, że jest komórką eukariotyczną, wybraną z grupy składającej się z: śluzowca, takiego jak gatunku Dictyostelium, komórki drożdży, takich jak Saccharomyces cerevisae i gatunku Pichia, komórki ssaka, takie jak jajnika chomika chińskiego, komórki roślinnej, komórki owadziej, takiej jak z gatunku Spodoptera.
20. Komórka według zastrz. 18, znamienna tym, że jest komórką prokariotyczną.
21. Sposób wytwarzania polipeptydu określonego w jednym z zastrz. 1-10, znamienny tym, że obejmuje:
i) dostarczenie komórki określonej w jednym z zastrz. 18-20;
ii) inkubację tej komórki w warunkach sprzyjających wytwarzaniu polipeptydu; i ewentualnie iii) izolowanie polipeptydu z komórki lub podłoża hodowli komórkowej.
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że polipeptyd jest dostarczony z sygnałem wydzielniczym w celu ułatwienia oczyszczania polipeptydu z komórki.
23. Sposób według zastrz. 21 albo 22, znamienny tym, że polipeptyd jest dostarczony ze znacznikiem powinowactwa w celu ułatwienia oczyszczania polipeptydu z komórki lub podłoża hodowli komórkowej.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0130052A GB2384001B (en) | 2001-12-14 | 2001-12-14 | Chimeric growth hormone-growth hormone receptor proteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL371313A1 PL371313A1 (pl) | 2005-06-13 |
| PL210714B1 true PL210714B1 (pl) | 2012-02-29 |
Family
ID=9927705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL371313A PL210714B1 (pl) | 2001-12-14 | 2002-12-06 | Polipeptyd fuzyjny hormonu wzrostu, jego zastosowania medyczne, sposób wytwarzania, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna oraz cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor i transformowana lub transfekowana komórka |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7524649B2 (pl) |
| EP (2) | EP1456385B1 (pl) |
| JP (2) | JP5248734B2 (pl) |
| KR (3) | KR20040083470A (pl) |
| CN (2) | CN100558899C (pl) |
| AT (1) | ATE541935T1 (pl) |
| AU (1) | AU2002366325B2 (pl) |
| CA (1) | CA2468439A1 (pl) |
| ES (1) | ES2378424T3 (pl) |
| GB (2) | GB2384001B (pl) |
| HU (1) | HUP0402496A3 (pl) |
| IL (3) | IL162433A0 (pl) |
| MX (1) | MXPA04005675A (pl) |
| NZ (1) | NZ533550A (pl) |
| PL (1) | PL210714B1 (pl) |
| RU (2) | RU2346047C2 (pl) |
| SG (1) | SG160205A1 (pl) |
| WO (1) | WO2003070765A2 (pl) |
| ZA (2) | ZA200404488B (pl) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1290170A2 (en) * | 2000-06-16 | 2003-03-12 | Asterion Limited | Binding agents: chimeric ligand/receptor proteins |
| GB2384001B (en) * | 2001-12-14 | 2004-02-04 | Asterion Ltd | Chimeric growth hormone-growth hormone receptor proteins |
| DE60332358D1 (de) * | 2002-09-09 | 2010-06-10 | Hanall Pharmaceutical Co Ltd | Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide |
| EP1771467A2 (en) * | 2004-07-26 | 2007-04-11 | Asterion Limited | Linkers |
| US7998930B2 (en) * | 2004-11-04 | 2011-08-16 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Modified growth hormones |
| GB0606946D0 (en) * | 2006-04-06 | 2006-05-17 | Asterion Ltd | Polypeptide antagonist |
| GB0618082D0 (en) * | 2006-09-14 | 2006-10-25 | Asterion Ltd | Growth factor |
| US20080260820A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-23 | Gilles Borrelly | Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides |
| GB0717985D0 (en) * | 2007-07-20 | 2007-10-24 | Asterion Ltd | Growth hormone fusion proteins |
| GB0719818D0 (en) | 2007-10-11 | 2007-11-21 | Asterion Ltd | Growth hormone fusion polypeptides |
| WO2009077731A2 (en) * | 2007-12-19 | 2009-06-25 | Asterion Limited | Prolactin fusion proteins |
| WO2011085070A2 (en) * | 2010-01-06 | 2011-07-14 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Methods and compositions to improve the health of plants, animals and microbes by manipulating protein entry into symbionts and their hosts |
| JP5412323B2 (ja) | 2010-02-26 | 2014-02-12 | 日東電工株式会社 | 貼付製剤 |
| GB201104285D0 (en) | 2011-03-15 | 2011-04-27 | Asterion Ltd | Modified receptor fusion proteins |
| EP2606908A1 (en) | 2011-12-19 | 2013-06-26 | Ipsen Pharma S.A.S. | Novel pharmaceutical composition for a long acting growth hormone fusion protein (LAGH) |
| DK2809400T3 (en) | 2012-02-03 | 2019-03-04 | Antisense Therapeutics Ltd | COMBINATION THERAPY INCLUDING A GROWTH HORMON VARIANT AND AN OIGONUCLEOTIDE BINDING TO THE GROWTH HORMON RECEPTOR |
| CN105229035A (zh) * | 2013-03-11 | 2016-01-06 | 诺和诺德保健股份有限公司 | 生长激素化合物 |
| ES2784603T3 (es) | 2015-06-02 | 2020-09-29 | Novo Nordisk As | Insulinas con extensiones recombinantes polares |
| EP3355931B1 (en) | 2015-10-01 | 2024-06-26 | Novo Nordisk A/S | Protein conjugates |
| JP2020513019A (ja) | 2017-04-05 | 2020-04-30 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | オリゴマー伸長インスリン−Ｆｃコンジュゲート |
| EP3820497A4 (en) * | 2018-07-11 | 2022-03-23 | Ohio University | Peptide-based inhibitors of growth hormone action and methods of use thereof |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5534617A (en) * | 1988-10-28 | 1996-07-09 | Genentech, Inc. | Human growth hormone variants having greater affinity for human growth hormone receptor at site 1 |
| US5958879A (en) * | 1989-10-12 | 1999-09-28 | Ohio University/Edison Biotechnology Institute | Growth hormone receptor antagonists and methods of reducing growth hormone activity in a mammal |
| NZ260103A (en) * | 1990-11-30 | 1996-10-28 | Bio Technology General Corp | Somatotropin with alterations in the alpha-helix-1 region |
| HUT69963A (en) * | 1990-12-13 | 1995-09-28 | Upjohn Co | Non-naturally-occuring fusion proteins and process for preparing them |
| JP3417558B2 (ja) * | 1991-05-10 | 2003-06-16 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | 配位子作用薬および拮抗薬の選択 |
| IT1251895B (it) * | 1991-09-27 | 1995-05-26 | Eniricerche Spa | Mutanti dell'ormone della crescita umano e loro impiego |
| US5686268A (en) * | 1992-06-19 | 1997-11-11 | Pfizer Inc. | Fused proteins |
| DK0851925T3 (da) * | 1995-09-21 | 2005-11-28 | Genentech Inc | Humane Væksthormonvarianter |
| GB9526733D0 (en) * | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
| ATE216723T1 (de) * | 1996-02-13 | 2002-05-15 | Japan Chem Res | Hormones de croissance humaines mutantes et leur utilisation |
| JP2000516472A (ja) | 1996-08-16 | 2000-12-12 | メディカル リサーチ カウンシル | 組織特異的遺伝子発現を与える自己複製型エピソーム性発現ベクター |
| IL122818A0 (en) * | 1997-07-10 | 1998-08-16 | Yeda Res & Dev | Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof |
| CA2359345A1 (en) * | 1999-01-14 | 2000-07-20 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
| EP1290170A2 (en) * | 2000-06-16 | 2003-03-12 | Asterion Limited | Binding agents: chimeric ligand/receptor proteins |
| GB2384001B (en) * | 2001-12-14 | 2004-02-04 | Asterion Ltd | Chimeric growth hormone-growth hormone receptor proteins |
-
2001
- 2001-12-14 GB GB0130052A patent/GB2384001B/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-12-14 GB GB0320479A patent/GB2389115B/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-12-06 KR KR10-2004-7009055A patent/KR20040083470A/ko not_active Ceased
- 2002-12-06 CN CNB028247817A patent/CN100558899C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-06 SG SG200705155-0A patent/SG160205A1/en unknown
- 2002-12-06 PL PL371313A patent/PL210714B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2002-12-06 AT AT02806858T patent/ATE541935T1/de active
- 2002-12-06 WO PCT/GB2002/005523 patent/WO2003070765A2/en not_active Ceased
- 2002-12-06 KR KR1020067016929A patent/KR100848802B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-06 AU AU2002366325A patent/AU2002366325B2/en not_active Ceased
- 2002-12-06 RU RU2004117777/13A patent/RU2346047C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-12-06 ES ES02806858T patent/ES2378424T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-06 CN CN200910164026A patent/CN101638437A/zh active Pending
- 2002-12-06 IL IL16243302A patent/IL162433A0/xx active IP Right Grant
- 2002-12-06 CA CA002468439A patent/CA2468439A1/en not_active Abandoned
- 2002-12-06 US US10/498,497 patent/US7524649B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-06 HU HU0402496A patent/HUP0402496A3/hu unknown
- 2002-12-06 KR KR1020077021636A patent/KR100879553B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-06 MX MXPA04005675A patent/MXPA04005675A/es active IP Right Grant
- 2002-12-06 EP EP02806858A patent/EP1456385B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-06 JP JP2003569672A patent/JP5248734B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-06 NZ NZ533550A patent/NZ533550A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-12-06 EP EP10009271A patent/EP2365085A1/en not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-06-07 ZA ZA200404488A patent/ZA200404488B/xx unknown
- 2004-06-10 IL IL162433A patent/IL162433A/en not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-01-06 ZA ZA200600149A patent/ZA200600149B/xx unknown
-
2008
- 2008-05-08 RU RU2008118104/13A patent/RU2008118104A/ru not_active Application Discontinuation
-
2009
- 2009-02-19 US US12/389,022 patent/US20090239801A1/en not_active Abandoned
- 2009-09-01 IL IL200659A patent/IL200659A0/en unknown
- 2009-09-28 JP JP2009223065A patent/JP2010043100A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20090239801A1 (en) | Modified Fusion Polypeptides | |
| US9879249B2 (en) | Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use | |
| EP2858662B1 (en) | Fibroblast growth factor 21 proteins | |
| US9168312B2 (en) | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same | |
| US20110172146A1 (en) | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same | |
| EP3278813A1 (en) | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same | |
| CN114591415B (zh) | Glp-1/gcg双受体激动剂多肽及其融合蛋白 | |
| US20170334971A1 (en) | Alpha-1-Antitrypsin (A1AT) Fusion Proteins and Uses Thereof | |
| RU2325400C2 (ru) | Мультимеры рецептор-связывающих лигандов | |
| BRPI0709793A2 (pt) | molÉcula de Ácido nucleico, polipeptÍdeo, vetor, cÉlula, mÉtodos para a fabricaÇço de um polipeptÍdeo, para o tratamente de um animal, para a modificaÇço da atividade antagonista de um polipeptÍdeo, e para a concepÇço racional de mutaÇÕes em um polipeptÍdeo, composiÇço farmacÊutica, uso do polipeptÍdeo, antagonista de polipeptÍdeo variante, e, homodÍmero | |
| HK1070669B (en) | Growth hormone fusion protein | |
| NZ543369A (en) | Polypeptide having a plurality of modified growth hormone receptor binding domains of growth hormone | |
| AU2008201889A1 (en) | Growth hormone fusion protein | |
| MXPA01004462A (en) | Opg fusion protein compositions and methods |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20121206 |