PL211175B1 - Koniugat polipeptydu czynnika VII, sposób wytwarzania takiego koniugatu, zawierający taki koniugat preparat farmaceutyczny oraz zastosowanie takiego koniugatu - Google Patents

Koniugat polipeptydu czynnika VII, sposób wytwarzania takiego koniugatu, zawierający taki koniugat preparat farmaceutyczny oraz zastosowanie takiego koniugatu

Info

Publication number
PL211175B1
PL211175B1 PL374318A PL37431803A PL211175B1 PL 211175 B1 PL211175 B1 PL 211175B1 PL 374318 A PL374318 A PL 374318A PL 37431803 A PL37431803 A PL 37431803A PL 211175 B1 PL211175 B1 PL 211175B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
fvii
factor vii
factor
conjugate
oligosaccharide chains
Prior art date
Application number
PL374318A
Other languages
English (en)
Other versions
PL374318A1 (pl
Inventor
Niels Kristian Klausen
Søren Bjørn
Carsten Behrens
Patrick William Garibay
Original Assignee
Novo Nordisk Healthcare Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44256861&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL211175(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novo Nordisk Healthcare Ag filed Critical Novo Nordisk Healthcare Ag
Publication of PL374318A1 publication Critical patent/PL374318A1/pl
Publication of PL211175B1 publication Critical patent/PL211175B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 374318 (22) Data zgłoszenia: 20.06.2003 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
20.06.2003, PCT/DK03/000420 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
31.12.2003, WO04/000366 (11) 211175 (13) B1 (51) Int.Cl.
A61K 38/36 (2006.01) A61K 47/48 (2006.01) C12N 9/64 (2006.01) C07K 14/475 (2006.01) A61P 7/02 (2006.01) A61P 7/04 (2006.01)
Koniugat polipeptydu czynnika VII, sposób wytwarzania takiego koniugatu, zawierający taki koniugat preparat farmaceutyczny oraz zastosowanie takiego koniugatu
(73) Uprawniony z patentu: NOVO NORDISK HEALTH CARE AG,
(30) Pierwszeństwo: Zurich, CH
21.06.2002, DK, PA 200200964 (72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono: NIELS KRISTIAN KLAUSEN, Gentofte, DK
17.10.2005 BUP 21/05 S0REN BJ0RN, Lyngby, DK CARSTEN BEHRENS, Kopenhaga, DK PATRICK WILLIAM GARIBAY, Holte, DK
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2012 WUP 04/12 (74) Pełnomocnik:
rzecz. pat. Marta Kawczyńska
PL 211 175 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest koniugat polipeptydu czynnika VII, sposób wytwarzania takiego koniugatu, zawierający taki koniugat preparat farmaceutyczny oraz zastosowania takiego koniugatu.
Dziedzina wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji zawierających koniugaty czynnika VII o ustalonych wzorcach glikozylacji.
Stan techniki
Czynnik VII (FVII) jest zależnym od witaminy K białkiem osocza, syntetyzowanym w wątrobie i wydzielanym do krwi w postaci jednoła ńcuchowej glikoproteiny o masie cząsteczkowej około 50 kDa. Zymogen FVII jest przekształcany do postaci aktywowanej (FVIIa) przez cięcie proteolityczne. FVIIa w kompleksie z czynnikiem tkankowym (TF) jest zdolny do przekształcania zarówno czynnika IX, jak i czynnika X do ich postaci aktywowanych; po tej aktywacji następują reakcje prowadzą ce do szybkiego wytworzenia trombiny i fibryny.
Białka biorące udział w kaskadzie krzepnięcia, w tym na przykład czynnik VII, czynnik VIII, czynnik IX, czynnik X i białko C, okazały się użytecznymi środkami terapeutycznymi w leczeniu wielu stanów patologicznych. Zgodnie z tym, coraz większa jest potrzeba opracowania preparatów zawierających te białka, farmaceutycznie dopuszczalnych i wykazujących jednolitą i z góry ustaloną skuteczność kliniczną.
Ze względu na wiele wad stosowania osocza ludzkiego, jako źródła produktów farmaceutycznych, zalecane jest wytwarzanie tych białek w układach rekombinowanych. Białka kaskady krzepnięcia podlegają jednak wielu modyfikacjom w trakcie translacji i po translacji, na przykład glikozylacji związanej z asparaginą (związanej z N), glikozylacji związanej z O i gamma-karboksylacji reszt Glu. Modyfikacje te mogą być jakościowo lub ilościowo różne, gdy jako gospodarzy do produkcji tych białek na dużą skalę stosuje się komórki heterologiczne. W szczególności wytwarzanie białek w komórkach heterologicznych powoduje często powstanie różnych rodzajów glikoform, które to glikoformy są identycznymi polipeptydami, ale różnią się kowalencyjnie związanymi strukturami oligosacharydowymi.
W róż nych ukł adach zmienność struktury oligosacharydowej biał ek terapeutycznych wiązał a się, między innymi, ze zmianami immunogenności i klirensu in vivo.
Oprócz klirensu in vivo istotny jest również czynnościowy czas półtrwania in vivo, ponieważ wpływa on na okres, w którym związek jest „terapeutycznie dostępny w organizmie.
Czas półtrwania rFVIIa w krążeniu wynosi około 2,3 godziny („Summary Basis for Approval for NovoSeven©, numer referencyjny FDA 96-0597).
Dostępne w handlu preparaty ludzkiego, rekombinowanego rFVIIa sprzedawane są pod nazwą NovoSeven®. NovoSeven® jest jedynym dostępnym na rynku rFVIIa, nadającym się do skutecznego i wiarygodnego leczenia epizodów krwawień . Do uzyskania i podtrzymania po żądanego dział ania terapeutycznego lub profilaktycznego niezbędne jest stosowanie względnie dużych dawek i częste podawanie. W wyniku tego trudna jest odpowiednia regulacja dawki, a konieczność częstego podawania dożylnego ogranicza tryb życia pacjenta.
Cząsteczka o dłuższym czasie półtrwania w krążeniu pozwoliłaby zmniejszyć częstotliwość podawania leku. Biorąc pod uwagę to, że obecnie dostępny produkt FVIIa wymaga częstych wstrzyknięć, istnieje ewidentnie potrzeba opracowania ulepszonych cząsteczek FVII.
Jednym ze sposobów ulepszenia krążenia jest zapewnienie zmniejszenia prędkości klirensu środka z organizmu. Jak to wspomniano, zmienność struktury oligosacharydowej białek terapeutycznych wiąże się, między innymi, z klirensem in vivo. Ponadto przyłączenie do polipeptydów cząsteczki chemicznej może powodować zmniejszenie klirensu nerkowego polipeptydu.
Opisywano nieaktywne postacie FVII. Postać inaktywowana zdolna jest do kompetycji z FVII lub FVIIa typu dzikiego o wiązanie się z czynnikiem tkankowym i do hamowania aktywności krzepnięcia. Sugeruje się stosowanie inaktywowanej postaci FVIIa w leczeniu pacjentów w stanach nadmiernej krzepliwości, na przykład u pacjentów z posocznicą, u osób narażonych na ryzyko zawału mięśnia serca lub udaru mózgu w mechanizmie zakrzepowym.
W zgłoszeniu WO 98/32466 sugerowano pegylowanie FVII, oprócz wielu innych białek, lecz zgłoszenie to nie zawiera żadnych więcej informacji na ten temat.
W zgł oszeniu WO 01/58935 zastrze ż ono koniugaty ugrupowań niepolipeptydowych (na przykład PEG) z polipeptydem, przy czym sekwencja aminokwasowa różni się od sekwencji FVII typu
PL 211 175 B1 dzikiego tym, że wprowadzono do niej, albo z niej usunięto, co najmniej jedną resztę aminokwasową zawierającą co najmniej jedną grupę przyłączającą dla ugrupowania niepeptydowego.
W patencie Stanów Zjednoczonych 4847325 sugerowano możliwość przyłączenia do PEG czynnika stymulującego wzrost kolonii 1 (CSF-1) przez poddanie pochodnych PEG reakcji z utlenionym CSF-1.
Tak więc ze stanu techniki wynika potrzeba opracowania kompozycji i sposobów, zapewniających preparaty białek krzepnięcia, zwłaszcza preparaty obejmujące ulepszony, rekombinowany ludzki czynnik VII, zmodyfikowany czynnik VII lub polipeptyd pokrewny czynnikowi VII.
Krótki opis wynalazku
Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że preparaty polipeptydów czynnika VII o wzorcu glikoform zawierającym co najmniej jedną grupę oligosacharydową, kowalencyjnie związaną z co najmniej jedną grupą polimerową, wykazują ulepszone właściwości czynnościowe. Zgodnie z tym niniejszy wynalazek dotyczy sposobów i kompozycji zapewniających te preparaty koniugatów białkowych.
Przedmiotem wynalazku jest koniugat polipeptydu czynnika VII, charakteryzujący się tym, że zawiera polipeptyd czynnika VII zawierający połączone z asparaginą i/lub połączone z seryną łańcuchy oligosacharydowe zawierające ugrupowanie kwasu sialowego albo galaktozy, przy czym co najmniej jeden z łańcuchów oligosacharydowych jest kowalencyjnie połączony z co najmniej jedną grupą polimerową, którą stanowi glikol polietylenowy o masie cząsteczkowej w zakresie 300-100,000 Da.
Korzystnie grupa polimerowa jest połączona z ugrupowaniem kwasu sialowego.
Korzystnie pomiędzy 94-100% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedno ugrupowanie kwasu sialowego.
Korzystniej pomiędzy 94-100% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedno ugrupowanie kwasu sialowego, przy czym mniej niż 25% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną antenę niezakończoną czapeczką.
Jeszcze korzystniej mniej niż 10% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną antenę niezakończoną czapeczką.
Najkorzystniej mniej niż 5%, w szczególności mniej niż 2%, łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną antenę niezakończoną czapeczką.
Korzystniej pomiędzy 96-100% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedno ugrupowanie kwasu sialowego.
Jeszcze korzystniej pomiędzy 98-100% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedno ugrupowanie kwasu sialowego.
Korzystnie łańcuchy oligosacharydowe połączone z asparaginą znajdują się w pozycjach odpowiadających resztom aminokwasowym Asn-145 i Asn-322 ludzkiego czynnika VIIa (FVIIa) typu dzikiego.
Korzystnie łańcuchy oligosacharydowe połączone z seryną znajdują się w pozycjach odpowiadających resztom aminokwasowym Ser-52 i Ser-60 ludzkiego FVIIa typu dzikiego.
Korzystnie polipeptyd ma sekwencję aminokwasową ludzkiego czynnika VII typu dzikiego.
Korzystnie polipeptyd stanowi pochodzący z osocza ludzki czynnik Vlla.
Korzystnie polipeptydy czynnika VII wybrane są z grupy składającej się z czynnika VII-S52A, czynnika VII-S60A, czynnika VII poddanego cięciu proteolitycznemu między resztami 290 a 291, czynnika VII poddanego cięciu proteolitycznemu między resztami 315 a 316, utlenionego czynnika VII, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, S336G-FVII, wariantów sekwencji czynnika VII, w których zastąpiono resztę aminokwasową w pozycjach 290 i/lub 291, korzystnie 290, i wariantów sekwencji czynnika VII, w których zastąpiono resztę aminokwasową w pozycjach 315 i/lub 316, korzystnie 315.
Korzystnie polipeptydy czynnika VII wybrane są z grupy składającej się z: L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K3 37A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V15 8D/E296V-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,
PL 211 175 B1
L305V/K337A/E296V-FVII,
L305V/V158D/M298Q-FVII,
L3O5V/V158T/M298Q-FVII,
L305V/E296V/M298Q-FVII,
L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,
L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,
L305V/K337A/V158D-FVII,
L305V/V158D/E296V-FVII,
L305V/V158T/E296V-FVII,
L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,
L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII,
L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,
L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/Vl58D/E296V/M298Q/K337AFVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII,
S314E/K316Q-FVII,
S314E/V158D-FVII,
S314E/V158T-FVII,
K316H/V158D-FVII,
K316H/V158T-FVII,
K316Q/V158D-FVII,
S314E/L305V-FVII,
S314E/E296V-FVII,
K316H/L305V-FVII,
K316H/E296V-FVII,
K316Q/L305V-FVII,
S314E/K337A-FVII,
S314E/M298Q-FVII,
K316H/K337A-FVII,
K316H/M298Q-FVII,
K316Q/K337A-FVII,
K316Q/M298Q-FVII,
K316Q/E296V-FVII,
K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158DFVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII,
S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII,
S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII,
S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII,
S314E/L305V/K337A/V158D-FVII,
S314E/L305V/V158D/E296V-FVII,
S314E/L305V/V158T/E296V-FVII,
S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/Vl58D/E296V/M298Q/K337A-FVII,
S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337AFVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII,
K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII,
PL 211 175 B1
K316H/L3O5V/K337A/V158T-FVII,
K316H/L305V/K337A/E296V-FVII,
K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII,
K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII,
K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII,
K316H/L305V/K337A/V158D-FVII,
K316H/L305V/V158D/E296V-FVII,
K316H/L305V/V158T/E296V-FVII,
K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298QFVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,
K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII,
K316H/L3O5V/V158T/E296V/K337A-FVII,
K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,
K316H/L3O5V/V158D/E296V/K337A-FVII,
K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,
K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337AFVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII,
K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/Vl58T-FVII,
K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII,
K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII,
K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII,
K316Q/L305V/V158D/E296V/M298QFVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L3O5V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,
F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII,
F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII,
F374Y/L305V/K337A-FVII,
F374Y/L305V/E296V-FVII,
F374Y/K337A-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/L305V-FVII,
F374Y/L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII,
F374Y/L3O5V/V158T-FVII,
F374Y/L305V/S314E-FVII,
PL 211 175 B1
F374Y/K337A/S314E-FVII,
F374Y/K337A/M298Q-FVII,
F374Y/K337A/V158D-FVII,
F374Y/V158D/M298Q-FVII,
F374Y/V158T/S314E-FVII,
F374Y/V158T/E296V-FVII,
F374Y/S314E/M298Q-FVII,
F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII,
F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII,
F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII,
F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII,
F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII,
F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII,
F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII,
F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII,
F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII,
F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII,
F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII,
F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII,
F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII,
F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314EF374Y/L305V/E296V/K337A/S314EF374Y/E296V/M298Q/K337A/S314EF374Y/L305V/E296V/M298Q/K337AF374Y/L305V/E296V/M298Q/S314EF374Y/V158D/E296V/M298Q/K337AF374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E
F374Y/L3O5V/V158D/K337A/S314EF374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E·
F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII,
F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII,
FVII,
FVII,
FVII,
FVII,
FVII,
FVII,
FVII,
FVII,
FVII,
PL 211 175 B1
F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,
F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,
F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII,
F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,
F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII,
F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII,
F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,
F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII,
F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,
F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/L3O5V/V158T/E296V/S314E-FVII,
F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,
F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII,
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII,
F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII,
F374Y/L305V/M298Q/K337A/Vl58T/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/Vl58D/M298Q/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, czynnika VIIS52A, czynnika VII-S60A; oraz P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; FVII
PL 211 175 B1 zawierającego substytucje, addycje lub delecje w sekwencji aminokwasowej od 233Thr do 240Asn, FVII zawierającego substytucje, delecje lub addycje w sekwencji aminokwasowej od 304Arg do 329Cys, i FVII zawierającego substytucje, delecje lub addycje w sekwencji aminokwasowej Ile153-Arg223.
Korzystnie polipeptydy czynnika VII wybrane są z grupy składającej się z czynnika VII-R152E, czynnika VII-S344A, czynnika VII-FFR i czynnika VIIa pozbawionego domeny Gla.
Korzystnie preparat wykazuje biodostępność odpowiadającą co najmniej 110% biodostępności preparatu referencyjnego, na przykład przynajmniej 120%, lub co najmniej 130%, lub co najmniej 140% biodostępności preparatu referencyjnego.
Korzystnie czas półtrwania w surowicy tego preparatu wynosi co najmniej 125% czasu półtrwania preparatu referencyjnego, na przykład 150%, lub 200%, lub co najmniej 250% czasu półtrwania preparatu referencyjnego.
Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania koniugatu polipeptydu czynnika VII jak określono powyżej, polegający na tym, że kontaktuje się koniugat polipeptydu czynnika VII zawierający połączone z asparaginą i/lub połączone z seryną łańcuchy oligosacharydowe zawierające ugrupowanie kwasu sialowego albo galaktozy, i przy czym co najmniej jedną grupę oligosacharydową kowalencyjnie łączy się z co najmniej jedną grupą polimerową wybraną spośród glikolu polietylenowego o masie czą steczkowej w zakresie 300-100,000 Da.
Przedmiotem wynalazku jest także preparat farmaceutyczny, charakteryzujący się tym, że zawiera koniugat określony powyżej oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub adiuwant.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie preparatu jak określono powyżej do wytwarzania leku do zmniejszenia krwawienia i/lub zwiększania krzepnięcia krwi w leczeniu zespołu odpowiadającego na czynnik VII.
Korzystnie zespół wybrany jest z grupy składającej się z hemofilii (krwawiączki) A, hemofilii B, niedoboru czynnika XI, niedoboru czynnika VII, małopłytkowości (trombocytopenii), choroby von Willebranda, obecności inhibitora czynnika krzepnięcia, zabiegu operacyjnego, urazu, leczenia środkami przeciwkrzepliwymi, włączając w to koagulopatię z rozcieńczenia, krwawienia śródczaszkowego, przeszczepienia komórek macierzystych, krwawienia z górnego odcinka przewodu pokarmowego i choroby wątroby.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie preparatu zawierającego polipeptydy czynnika VII jak określono powyżej do wytwarzania leku do leczenia zespołu odpowiadającego na czynnik VII.
Zgodnie z tym opisano preparat zawierający wiele polipeptydów czynnika VII lub polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII, przy czym polipeptydy zawierają połączone z asparaginą i/lub połączone z seryną ł a ńcuchy oligosacharydowe, a co najmniej jedna grupa oligosacharydowa jest kowalencyjnie połączona z co najmniej jedną grupą polimerową.
W jednym z wykonań wynalazku grupa polimerowa jest kowalencyjnie połączona z ugrupowaniem kwasu sialowego. W innym wykonaniu wynalazku grupa polimerowa jest kowalencyjnie połączona z ugrupowaniem galaktozy. W jednym z wykonań wynalazku około 94-100% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedno ugrupowanie kwasu sialowego.
W jednym z wykonań wynalazku około 94-100% łań cuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedno ugrupowanie kwasu sialowego, a poniżej około 25% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną antenę niezakończoną czapeczką.
W jednym z wykonań wynalazku poniżej około 10% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną antenę niezakończoną czapeczką.
W jednym z wykonań poniż ej około 5%, korzystnie poniżej około 2% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną antenę niezakończoną czapeczką.
W jednym z wykonań około 96-100% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedno ugrupowanie kwasu sialowego.
W jednym z wykonań około 98-100% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedno ugrupowanie kwasu sialowego.
W jednym z wykonań łańcuchy oligosacharydowe, związane z asparaginą, znajdują się w pozycjach odpowiadającym resztom aminokwasowym Asn-145 i Asn-322 ludzkiego FVIIa typu dzikiego (Fig. 1).
W jednym z wykonań ł a ń cuchy oligosacharydowe zwią zane z seryną znajdują się w pozycjach odpowiadającym resztom aminokwasowym Ser-52 i Ser-60 ludzkiego FVIIa typu dzikiego (Fig. 1).
Opisano, że polimery mogą być wybrane z grupy obejmującej: tlenek polialkilenowy (PAO), w tym glikol polialkilenowy (PAG), taki jak glikol polietylenowy (PEG) i glikol polipropylenowy (PPG), rozgałęzione PEG, alkohol poliwinylowy (PVA), polikarboksylan, poliwinylopirolidon, bezwodnik kwasu
PL 211 175 B1 polietylenokomaleinowego, bezwodnik kwasu polistyrenokomaleinowego i dekstran, w tym karboksymetylodekstran, poliuretaner, poliester i poliamider.
W jednym z wykonań polimerem jest glikol polietylenowy (PEG). W jednym z wykonań glikolem polietylenowym jest PEG o masie cząsteczkowej 300-100000 Da, na przykład około 500-20000 Da, lub około 500-15000 Da, lub 2-15 kDa, lub 3-15 kDa, lub 3-12 kDa, lub około 10 kDa.
W jednym z wykonań polipeptyd ma sekwencję aminokwasową czynnika VII typu dzikiego (Fig. 1). W jednym z wykonań polipeptydy stanowią polipeptydy czynnika VIIa typu dzikiego. W jednym z wykonań polipeptydy czynnika VII wybiera się z grupy obejmującej: czynnik VII-S52A, czynnik VII-S60A, czynnik VII poddany cięciu proteolitycznemu między resztami 290 a 291, czynnik VII poddany cięciu proteolitycznemu między resztami 315 a 316, utleniony czynnik VII, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, S336G-FVII, czynnik VII - warianty sekwencji, w których zastąpiono resztę aminokwasową w pozycjach 290 i/lub 291, korzystnie 290, i czynnik VII - warianty sekwencji, w których zastąpiono resztę aminokwasowa w pozycjach 315 i/lub 316, korzystnie 315. W innym wykonaniu polipeptydy czynnika VII wybiera się z grupy składającej się z: wariantów czynnika VII o zwiększonej aktywności biologicznej w porównaniu z FVIIA typu dzikiego, opisanych w WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/77218, WO
PL 211 175 B1
03/27147 i WO 03/37932; L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII,
L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L3O5V/V158T-FVII,
L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII,
L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII,
L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII,
L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII,
L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,
L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/Vl58T/K337A/M298Q-FVII,
L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,
L3O5V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-
FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII,
K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII,
S314E/L305V/V158DFVII, S314E/L305V/E296V-FVII,
S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L3O5V/V158T-FVII,
S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII,
S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII,
S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII,
S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII,
S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-
FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,
S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,
PL 211 175 B1
S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,
S314E/L305V/Vl58T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337AFVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII,
K316H/L305V/M298Q-FVII,
K316H/L305V/K337A/V158T-FVII,
K316H/L305V/K337A/E296V-FVII,
K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII,
K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII,
K316H/L305V/V158T-FVII,
K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII,
K316H/L305V/K337A/V158DFVII,
K316H/L305V/V158D/E296V-FVII,
K316H/L305V/V158T/E296V-FVII,
K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298QFVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,
K316H/L3O5V/V158T/K337A/M298Q-FVII,
K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,
K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,
K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,
K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,
K316H/L305V/Vl58T/E296V/M298Q/K337A-FVII K316Q/L305V/K337AFVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII,
K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/Vl58T-FVII,
K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII,
K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII,
K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII,
K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII,
K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298QFVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,
K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,
K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,
K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII,
PL 211 175 B1
F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L3O5V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305 V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII,
F374Y/K337A/V158T-FVII,
F374Y/K337A/E296V-FVII,
F374Y/V158D/S314E-FVII,
F374Y/V158D/E296V-FVII,
F374Y/V158T/M298Q-FVII,
F374Y/E296V/S314E-FVII,
F374Y/F296V/M298Q-FVII,
F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII,
F374Y/L3O5V/K337A/V158T-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII,
F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII,
F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII,
F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII,
F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII,
F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII,
F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII,
F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII,
F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII,
F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII,
F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII,
F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII,
F374Y/K337A/M298Q-FVII,
F374Y/K337A/V158D-FVII,
F374Y/V158D/M298Q-FVII,
F374Y/V158T/S314E-FVII,
F374Y/V158T/E296V-FVII,
F374Y/S314E/M298Q-FVII,
F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII,
F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314EFVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII,
PL 211 175 B1
F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,
F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII,
F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,
F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,
F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,
F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII,
F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,
F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII,
F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII,
F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,
F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII,
F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,
F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII,
F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII
F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII
F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/Vl58T-FVII
F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII
F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII
F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII
PL 211 175 B1
F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/Vl58D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, czynnik VII552A, czynnik VII-S60A i P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; FVII z substytucjami, addycjami lub delecjami w sekwencji aminokwasowej od 233Thr do 240Asn, FVII z substytucjami, delecjami lub addycjami w sekwencji aminokwasowej od 304Arg do 329Cys, oraz FVII z substytucjami, delecjami lub addycjami w sekwencji aminokwasowej Ile153-Arg223.
Polipeptydy pokrewne czynnikowi VII wybiera się z grupy obejmującej czynnik VII-R152E, czynnik VII-S344A, czynnik VII-FFR i czynnik VIIa pozbawiony domeny Gla.
Polipeptyd pokrewny czynnikowi VII wykazuje co najmniej 25%, dogodnie co najmniej około 50%, dogodniej co najmniej około 75% i najdogodniej co najmniej około 90% swoistej aktywności czynnika VIIa typu dzikiego, wytwarzanego w tym samym typie komórek, w badaniu w jednym lub więcej niż w jednym teście krzepnięcia, teście proteolizy lub teście wiązania TF, opisanych w niniejszym zgłoszeniu.
Polipeptyd pokrewny czynnikowi VII wykazuje poniżej 25%, dogodnie poniżej około 10%, dogodniej poniżej około 5% i najdogodniej poniżej około 1% swoistej aktywności czynnika VIIa typu dzikiego, wytwarzanego w tym samym typie komórek, w badaniu w jednym lub więcej niż w jednym teście krzepnięcia, teście proteolizy lub teście wiązania TF, opisanych w niniejszym zgłoszeniu.
W różnych wykonaniach koniugat polipeptydu wykazuje biodostępność odpowiadającą co najmniej około 110% biodostępności preparatu referencyjnego, na przykład około 120%, lub co najmniej około 130%, lub co najmniej około 140% biodostępności preparatu referencyjnego.
W jednym z wykonań czas półtrwania w surowicy koniugatu polipeptydu wynosi co najmniej około 125% czasu półtrwania preparatu referencyjnego, na przykład co najmniej około 150%, lub co najmniej około 200%, lub co najmniej około 250% czasu półtrwania preparatu referencyjnego.
W jednym z wykonań koniugat polipeptydu wytwarza się przez modyfikację enzymatyczną cząstek kwasu sialowego lub galaktozy w polipeptydzie.
W kolejnym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania preparatu opisanego powyżej, przy czym sposób ten obejmuje etap kontaktowania polipeptydu zawierającego oligosacharyd z cząsteczką polimeru w warunkach, w których co najmniej jedna cząsteczka polimeru kowalencyjnie łączy z co najmniej jednym z łańcuchów oligosacharydowych polipeptydów.
W innym aspekcie opisano kompozycję farmaceutyczną, zawierającą preparat opisany powyżej, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub adiuwant.
W innym aspekcie opisano tu zastosowanie preparatu zawierającego wiele polipeptydów czynnika VII lub polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII, przy czym polipeptydy te zawierają łańcuchy oligosacharydowe połączone z asparaginą i/lub połączone z seryną, a co najmniej jedna grupa oligosacharydowa jest kowalencyjnie połączona z co najmniej jedną grupą polimerową, do wytwarzania leku do leczenia zespołu odpowiadającego na czynnik VII.
Opisano też sposób leczenia zespołu odpowiadającego na czynnik VII, obejmujący podawanie kompozycji farmaceutycznej zawierającej preparat opisany powyżej, pacjentowi wymagającemu takiego leczenia, w warunkach, w których uzyskuje się zmniejszenie krwawienia i/lub zwiększenie krzepnięcia krwi.
Zespół odpowiadający na czynnik VII korzystnie wybrany jest z grupy składającej się z hemofilii (krwawiączkę) A, hemofilii B, niedoboru czynnika XI, niedoboru czynnika VII, małopłytkowości (trombocytopenii), choroby von Willebranda, obecności inhibitora czynnika krzepnięcia, zabiegu operacyjnego, urazu, leczenia środkami przeciwkrzepliwymi, włączając w to koagulopatię z rozcieńczenia, krwawienia śródczaszkowego, przeszczepienia komórek macierzystych, krwawienia z górnego odcinka przewodu pokarmowego i choroby wątroby.
Opisano tu także sposób zapobiegania niepożądanemu krwawieniu obejmujący podawanie kompozycji farmaceutycznej zawierającej preparat opisany powyżej pacjentowi wymagającemu takiePL 211 175 B1 go postępowania, w warunkach, w których uzyskuje się zmniejszenie krwawienia i/lub zwiększenie krzepnięcia krwi.
Opisano tu także sposób zapobiegania niepożądanemu krzepnięciu krwi obejmujący podawanie kompozycji farmaceutycznej zawierającej preparat opisany powyżej, pacjentowi wymagającemu takiego postępowania, w warunkach skutecznych w zakresie hamowania krzepnięcia.
W jednym z wykonań niepożądane krzepnię cie krwi zwią zane jest z chorobą lub stanem, wybranymi z grupy składającej się z: angioplastyki, zakrzepicy żył głębokich, zatorowości płucnej, udaru mózgu, rozsianego krzepnięcia wewnątrznaczyniowego (DIC), złogów fibryny w płucach i nerkach w przebiegu endotoksemii bakteriami Gram-ujemnymi i zawału mi ęśnia serca.
Opisano tu również sposób zapobiegania reakcjom, których mediatorem jest czynnik tkankowy, obejmujący podawanie kompozycji farmaceutycznej obejmującej preparat opisany powyżej pacjentowi wymagającemu takiego postępowania, w warunkach skutecznych w zakresie hamowania krzepnięcia.
W jednym z wykonań wynalazku reakcje, których mediatorem jest czynnik tkankowy, są zwią zane ze stanem wybranym z grupy składającej się z: zapalenia, nowotworu, wzrostu guza, przerzutów, angiogenezy, SIRS, ALI, ARDS, MOF, HUS i TTP.
Opis wynalazku
Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że preparaty białek krzepnięcia o wzorcach glikoform, w których co najmniej jedna grupa oligosacharydowa jest kowalencyjnie zwią zana z co najmniej jedną grupą polimerową, taką jak na przykład PEG, wykazują ulepszone właściwości czynnościowe. Zgodnie z tym niniejszy wynalazek dotyczy sposobów i kompozycji zapewniających te preparaty koniugatów białkowych. W szczególności niniejszy wynalazek dotyczy preparatów obejmujących polipeptydy czynnika VII lub ewentualnie polipeptydy pokrewne czynnikowi VII, o wzorcach oligosacharydów połączonych z asparaginą (związane z N) i połączonych z seryną (związane z O), kowalencyjnie przyłączonych do co najmniej jednej grupy polimerowej.
Opisane tu preparaty wykazują zmienione właściwości, w tym, bez ograniczenia, ulepszone właściwości farmakokinetyczne i ulepszoną skuteczność kliniczną. Zgodnie z wynalazkiem opisano też kompozycje farmaceutyczne obejmujące opisane tu preparaty, jak również sposoby terapeutyczne, w których wykorzystuje się te preparaty.
W rozumieniu niniejszego opisu termin „przyłączenie kowalencyjne ma oznaczać, że ugrupowanie oligosacharydowe i cząsteczka polimerowa są bezpośrednio kowalencyjnie połączone ze sobą lub że jedna jest pośrednio kowalencyjnie połączona z drugą przez pośrednie ugrupowanie lub ugrupowania, takie jak mostek, grupa rozdzielająca lub ugrupowanie lub ugrupowania wiążące.
Terminy „sprzężony, „koniugat lub „koniugat polipeptydu mają oznaczać cząsteczkę heterogenną (w sensie cząsteczki złożonej lub chimerowej), utworzoną przez kowalencyjne połączenie jednego lub więcej niż jednego polipeptydu z jedną lub więcej niż jedną cząsteczką polimerową.
Termin „cząsteczka polimerowa lub „grupa polimerowa, „ugrupowanie polimerowe lub „cząsteczka polimeru oznacza cząsteczkę zdolną do sprzęgania (tworzenia koniugatu) z grupą łączącą polipeptydu. Przy stosowaniu w kontekście koniugatu według wynalazku należy rozumieć, że cząsteczka (lub ugrupowanie) polimeru związana jest z częścią polipeptydową koniugatu przez grupę łączącą łańcucha oligosacharydowego glikoproteiny; dogodnie cząsteczka polimerowa połączona jest z ugrupowaniem kwasu sialowego nakrywają c ą oligosacharyd („ugrupowanie kwasu sialowego tworzące czapeczkę) lub z ugrupowaniem galaktozy.
Cząsteczka polimerowa jest to cząsteczka utworzona przez kowalencyjne połączenie dwóch lub więcej monomerów, przy czym żaden z monomerów nie jest resztą aminokwasową. Zalecanymi monomerami są cząsteczki polimerowe wybrane z grupy składającej się z tlenku polialkilenowego (PAO), w tym glikolu polialkilenowego (PAG), takiego jak glikol polietylenowy (PEG) i glikol polipropylenowy (PPG), rozgałęzione PEG, alkoholu poliwinylowego (PVA), polikarboksylanu, poliwinylopirolidonu, kopolimeru etylen/bezwodnik kwasu maleinowego, kopolimeru styren/bezwodnik kwasu maleinowego i dekstranu, w tym karboksymetylodekstranu, w szczególności PEG.
Termin „grupa łącząca ma oznaczać grupę funkcyjną ugrupowania oligosacharydowego zdolną do przyłączania cząsteczki polimeru. Do zalecanych grup łączących należą, na przykład, grupa aminowa, hydroksylowa, karboksylowa, aldehydowa, ketonowa, sulfhydrylowa, sukcynimidylowa, maleimidowa, winylosulfonowa lub chlorowcooctowa.
Grupę łączącą na cząstce oligosacharydu można aktywować przed reakcją z polimerem. Ewentualnie grupę obecną na polimerze można aktywować przed reakcją z ugrupowaniem oligosachary16
PL 211 175 B1 dowym. Aktywowana grupa obecna na ugrupowaniu oligosacharydowym lub obecna na cząsteczce polimeru może mieć postać aktywowanej grupy opuszczającej.
Termin „aktywowana grupa opuszczająca obejmuje ugrupowania łatwo ulegające przemieszczeniu w reakcjach substytucji regulowanych organicznie lub enzymatycznie. Aktywowane grupy opuszczające znane są ze stanu techniki, patrz na przykład Vocadlo i wsp., w Carbohydrate Chemistry and Biology, t. 2, Wiley-VCH Verlag, Niemcy (2000); Kodama i wsp., Tetrahedron Letters 34:6419 (1993); Lougheed i wsp., J. Biol. Chem. 274:37717 (1999).
Sposoby i chemia aktywacji polimerów są opisane w literaturze. Do powszechnie stosowanych sposobów aktywacji polimerów należą aktywacja grup funkcyjnych bromcyjanem tlenu, nadjodanem, aldehydem glutarowym, biepoksydami, epichlorohydryną, diwinylosulfonem, karbodiimidem, halogenkami sulfonylowymi, trichlorotriazyną itp. (zob. na przykład, Taylor (1991), Protein Immobilization, Fundamentals and Applications, Marcel Dekker, N. Y.; Wong (1992), Chemistry of protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton; Hermanson i wsp., (1993), Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, N. Y., Dunn i wsp. (red), Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium. Series Vol. 469, American Chemical Society, 1991).
Grupami reaktywnymi i klasami reakcji zalecanymi do zastosowania w niniejszym wynalazku są ogólnie te grupy i klasy, które nadają się do wykorzystania we względnie łagodnych warunkach. Należą do nich, lecz bez ograniczenia, substytucje nukleofilowe (na przykład reakcja amin i alkoholi z halogenkami acylowymi, aktywnymi estrami), substytucje elektrofilowe (na przykład reakcje enaminowe) i reakcje addycji do wiązań węgiel-węgiel i węgiel-heteroatom (na przykład reakcja Michaela, reakcja Dielsa-Aldera). Te i inne użyteczne reakcje opisał, na przykład March w trzecim wydaniu Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, N. Y., 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; Feeney i wsp., Modifications of Proteins, Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, 1982.
Reaktywne grupy funkcyjne można dobierać tak, żeby nie uczestniczyły w reakcjach niezbędnych do połączenia oligosacharydu i cząsteczki polimeru, lub żeby nie zakłócały tych reakcji. Ewentualnie reaktywną grupę funkcyjną można zabezpieczać przed udziałem w reakcji przez obecność grupy zabezpieczającej. Przykłady użytecznych grup zabezpieczających można znaleźć, na przykład, w Greene i wsp., Protective groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, N. Y., 1991.
Ogólne sposoby wiązania węglowodanów z innymi cząsteczkami są znane z piśmiennictwa (zob. na przykład Lee i wsp., Biochemistry 28:1856 (1989); Bhatia i wsp., Anal. Biochem. 178:408 (1989); Janda i wsp., J. Am. Chem. Soc. 112:8886 (1990); i Bednarski i wsp., WO 92/18135.
Termin „naturalnie występujące miejsce glikozylacji ma oznaczać miejsca glikozylacji w pozycjach Asn-145 (N145), Asn-322 (N322), Ser-52 (S52) i Ser-60 (S60). Podobnie termin „naturalnie występujące in vivo miejsce O-glikozylacji oznacza pozycje S52 i S60, natomiast termin „naturalnie występujące in vivo miejsce N- glikozylacji oznacza pozycje N145 i N322.
Termin „czynnościowy czas półtrwania in vivo stosuje się w jego normalnym znaczeniu, to znaczy jest to czas, w którym w organizmie/narządzie docelowym nadal obecne jest 50% aktywności biologicznej polipeptydu lub koniugatu, czyli czas, w którym aktywność polipeptydu lub koniugatu wynosi 50% wartości początkowej. Zamiast oznaczania czynnościowego czasu półtrwania in vivo można oznaczać „czas półtrwania w surowicy, to znaczy czas, w którym w osoczu lub krwiobiegu krąży 50% cząsteczek polipeptydu lub koniugatu, przed ich eliminacją z organizmu. Oznaczanie czasu półtrwania w surowicy jest czę sto prostsze niż oznaczanie czynnościowego czasu pół trwania, a rzą d wielkoś ci czasu półtrwania w surowicy zwykle dość dobrze koreluje z rzędem wielkości czynnościowego czasu półtrwania in vivo.
Terminami stosowanymi zamiennie z terminem „czas półtrwania w surowicy są czas półtrwania w osoczu, czas pół trwania w krążeniu, klirens w surowicy, klirens w osoczu i czas poł owiczego klirensu.
Polipeptyd lub koniugat jest eliminowany na skutek działania jednego lub więcej niż jednego z następujących układów i narządów: układ siateczkowo-śródbłonkowy, nerka, śledziona, wą troba, pod wpływem działania czynnika tkankowego, receptora SEC lub za pośrednictwem innego receptora albo na drodze proteolizy swoistej lub nieswoistej. W normalnych warunkach klirens zależy od rozmiarów (w stosunku do wartości odcięcia dla filtracji kłębuszkowej), ładunku, dołączonych łańcuchów węglowodanowych i obecności receptorów komórkowych dla białka. Funkcjonalność, która ma być zachowana normalnie dobierana jest spośród aktywności: sprzyjającej krzepnięciu, proteolitycznej, aktywności wiązania kofaktora lub aktywności wiązania z receptorem. Czynnościowy czas półtrwania in vivo i czas półtrwania w surowicy można oznaczać dowolnym odpowiednim sposobem, znanym ze
PL 211 175 B1 stanu techniki, jak to bardziej szczegółowo omówiono poniżej (zob. rozdział „Właściwości czynnościowe preparatów czynnika VII).
Termin „zwiększenie lub „wydłużenie stosowany w odniesieniu do czynnościowego czasu półtrwania in vivo lub czasu półtrwania w osoczu stosowany jest do wskazania, że odpowiedni czas trwania polipeptydu lub koniugatu jest zwiększony (wydłużony) w sposób statystycznie istotny w stosunku do tego samego czasu dla cząsteczki referencyjnej, takiej jak nietworzący koniugatu czynnik VIIa (na przykład FVIIa typu dzikiego) przy oznaczaniu w porównywalnych warunkach. Przykładowo, odpowiedni czas półtrwania może być wydłużony o co najmniej około 25%, na przykład co najmniej około 50%, na przykład co najmniej około 100%, 150%, 200%, 250% lub 500%.
„Immunogenność preparatu odnosi się do zdolności preparatu, po podaniu go człowiekowi, do wywoływania niszczącej reakcji immunologicznej, humoralnej, komórkowej lub obu tych rodzajów reakcji. O ile wiadomo polipeptydy czynnika Vlla i polipeptydy pokrewne czynnikowi Vlla nie wywołują wykrywalnej reakcji immunologicznej u ludzi. Mimo to w każdej subpopulacji ludzkiej mogą zdarzyć się osoby wykazujące wrażliwość na podawane białka danego typu.
Immunogenność można mierzyć przez ilościowe oznaczanie obecności przeciwciał przeciwko czynnikowi VII i/lub limfocytów T reagujących na czynnik VII u osoby wrażliwej, stosując konwencjonalne sposoby, znane ze stanu techniki. W niektórych wykonaniach preparaty według niniejszego wynalazku wykazują zmniejszenie immunogenności u osoby wrażliwej o co najmniej 10%, dogodnie co najmniej około 25%, jeszcze dogodniej co najmniej około 40% i najdogodniej co najmniej około 50% w stosunku do immunogenności preparatu referencyjnego u tej samej osoby.
Termin „reszty aminokwasowe odpowiadające resztom aminokwasowym S52, S60, N145, N322 z Fig. 1 (FVII typu dzikiego) ma oznaczać reszty aminokwasowe Asn i Ser odpowiadające sekwencji czynnika VII typu dzikiego (Fig. 1), przy przyrównaniu (porównaniu) sekwencji.
Homologię/identyczność sekwencji aminokwasowej dogodnie ustala się na podstawie przyrównanych sekwencji, stosując odpowiedni program komputerowy do przyrównywania sekwencji, taki jak na przykład program ClustalW, wersja 1.8, 1999 (Thompson i wsp., 1994, Nucleic Acid Research, 22: 4673-4680).
Polipeptydy czynnika VII i polipeptydy pokrewne czynnikowi VII
Niniejszy wynalazek obejmuje ludzkie polipeptydy, czynnika VII, takie jak na przykład polipeptydy o sekwencji aminokwasowej opisanej w patencie Stanów Zjednoczonych numer 4,784,950 (czynnik VII typu dzikiego). W rozumieniu niniejszego opisu pojęcie „czynnik VII lub „polipeptyd czynnika VII obejmuje czynnik VII typu dzikiego, jak również odmiany czynnika VII, wykazujące w zasadzie taką samą lub ulepszoną aktywność biologiczną w stosunku do czynnika VII typu dzikiego.
Termin „czynnik VII ma obejmować polipeptydy czynnika VII w ich postaci nie przeciętej (zymogen), jak również polipeptydy poddane obróbce proteolitycznej dla uzyskania odpowiednich postaci bioaktywnych, które można oznaczać jako czynnik VIIa. Typowo czynnik VII ulega cięciu między resztami 152 a 153, w wyniku czego powstaje czynnik VIIa.
W rozumieniu niniejszego opisu „polipeptydy pokrewne czynnikowi VII obejmują polipeptydy, w tym ich odmiany, w których doszło do istotnej modyfikacji lub zmniejszenia aktywno ś ci biologicznej czynnika VIIa w stosunku do aktywności czynnika VIIa typu dzikiego. Do tych polipeptydów należą, bez ograniczenia, czynnik VII lub czynnik VIIa po modyfikacji chemicznej oraz odmiany czynnika VII, do których wprowadzono specyficzne zmiany sekwencji aminokwasowej, modyfikujące lub zaburzające aktywność biologiczną polipeptydu.
Aktywność biologiczna czynnika VIIa w zakresie krzepnięcia krwi polega na jego zdolności do (i) wiązania się z czynnikiem tkankowym (TF) i (ii) katalizowania cięcia proteolitycznego czynnika IX lub czynnika X, w wyniku czego powstaje aktywowany czynnik IX lub X (odpowiednio czynnik IXa lub Xa). Dla celów niniejszego wynalazku aktywność biologiczną czynnika VIIa można oznaczać ilościowo mierząc zdolność preparatu do sprzyjania krzepnięciu krwi, za pomocą osocza pozbawionego czynnika VII i tromboplastyny, jak to opisano na przykład w patencie Stanów Zjednoczonych numer 5,997,864.
W teś cie tym aktywność biologiczną wyraż a się jako skrócenie czasu krzepnię cia w porównaniu z próbką kontrolną i przekształca się ją na „jednostki czynnika VII przez porównanie z pulą wzorca surowicy ludzkiej, zawierającą jedną jednostkę aktywności czynnika VII na mililitr. Ewentualnie aktywność biologiczną czynnika VIIa można oznaczać ilościowo przez (i) zmierzenie zdolności czynnika VIIa do wytwarzania czynnika Xa w układzie zawierającym TF zatopiony w błonie lipidowej i czynnik X (Person i wsp., J. Biol. Chem. 272:19919-19924,1997); (ii) mierzenie hydrolizy czynnika X w układzie wodnym (patrz, na przykład, poniższy przykład 5); (iii) mierzenie fizycznego wiązania z TF za pomocą
PL 211 175 B1 narzędzia wykorzystującego powierzchniowy rezonans plazmonowy (Person, FEBS Letts. 413:359363, 1997); (iv) mierzenie hydrolizy substratu syntetycznego (patrz poniższy przykład 4) i (v) mierzenie wytwarzania trombiny w niezależnym od TF układzie in vitro.
Do odmian czynnika VII o aktywności biologicznej w zasadzie takiej samej lub ulepszonej w stosunku do czynnika VIIa typu dzikiego należą odmiany wykazujące co najmniej około 25%, dogodnie co najmniej około 50%, dogodniej co najmniej około 75% i najdogodniej co najmniej około 90% swoistej aktywności czynnika VIIa typu dzikiego, wytworzonego w tym samym typie komórek, przy badaniu w jednym lub więcej niż jednym teście krzepnięcia, teście proteolitycznym lub teście wiązania TF, jak to opisano powyżej.
Odmianami czynnika VII wykazującymi w zasadzie zmniejszoną aktywność biologiczną w stosunku do czynnika VIIa typu dzikiego są odmiany wykazujące poniżej około 25%, dogodnie poniżej około 10%, dogodniej poniżej około 5% i najdogodniej poniżej około 1% swoistej aktywności czynnika VIIa typu dzikiego, wytworzonego w tym samym typie komórek, przy badaniu w jednym lub więcej niż jednym teście krzepnięcia, teście proteolitycznym lub teście wiązania TF, jak to opisano powyżej. Do odmian czynnika VII o aktywności biologicznej istotnie zmodyfikowanej w stosunku do czynnika VII typu dzikiego należą, bez ograniczenia, odmiany czynnika VII, wykazujące aktywność proteolityczną czynnika X, niezależną od TF i odmiany wiążące się z TF, lecz które nie tną czynnika X.
Do odmian czynnika VII, wykazujących w zasadzie taką samą lub lepszą aktywność biologiczną niż czynnik VII typu dzikiego lub ewentualnie wykazujących w zasadzie zmodyfikowaną lub zmniejszoną aktywność biologiczną w stosunku do czynnika VII typu dzikiego należą, bez ograniczenia, polipeptydy o sekwencji aminokwasowej różniącej się od sekwencji czynnika VII typu dzikiego insercją, delecją lub substytucją jednego lub więcej niż jednego aminokwasu.
Do nieograniczających przykładów polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII o aktywności biologicznej w zasadzie takiej samej lub ulepszonej w stosunku do czynnika VII typu dzikiego należą S52A-FVII, S60A-FVII (lino i wsp., Arch. Blochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); L305VFVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V//M298Q//L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII i S336G-FVV; odmiany FVIIa wykazujące zwiększoną stabilność proteolityczną, opisane w patencie Stanów Zjednoczonych numer 5,580,560; czynnik VIIa przecięty proteolitycznie między resztami 290 a 291 albo między resztami 315 a 316 (Mollerup i wsp., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); utlenione postacie czynnika VIIa (Kornfelt i wsp., Arch. Biochem. Biophys. 363:4354, 1999), odmiany sekwencji czynnika VII, w których zastąpiono reszty aminokwasowe w pozycjach 290 i/lub 291 (z Fig. 1) i odmiany sekwencji czynnika VII, w których zastąpiono resztę aminokwasową w pozycjach 315 i/lub 316 (z Fig. 1), korzystnie 315.
Do nieograniczających przykładów polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII o aktywności biologicznej w zasadzie takiej samej lub ulepszonej w porównaniu z czynnikiem VII typu dzikiego należą: odmiany FVII o zwiększonej aktywności biologicznej w porównaniu z FVIIa typu dzikiego opisane w zgł oszeniach WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02177218, WO 03/27147 i WO 03/37932, w tym, bez ograniczenia, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII,
PL 211 175 B1
V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298QFVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305VFVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, and S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296VFVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158TFVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII,
L305V/K337A/V158D-FVII, L3O5V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,
L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305VN158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,
L305V/V158D/M298Q-FVII,
L305V/V158T/M298Q-FVII,
L305V/E296V/M298Q-FVII,
L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,
L305VN158T/E296V/K337A-FVII,
L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,
S314E/K316Q-FVII,
S314E/V158D-FVII,
S314E/V158T-FVII,
K316HN158D-FVII,
K316H/V158T-FVII,
K316Q/V158D-FVII,
S314E/L305V-FVII,
S314E/E296V-FVII,
K316H/L305V-FVII,
K316H/E296V-FVII,
K316Q/L305V-FVII,
S314E/K316H-FVII,
S314E/K337AFVII,
S314E/M298Q-FVII,
K316H/K337A-FVII,
K316H/M298Q-FVII,
K316Q/K337A-FVII,
K316Q/M298Q-FVII,
K316Q/E296V-FVII,
K316QN158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158DFVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII,
S314E/L3O5V/V158TFVII,
S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII,
S314E/L305V/K337A/V158D-FVII,
S314E/L305V/V158D/E296V-FVII,
S314E/L305V/V158T/E296V-FVII,
S314E/L305V/K337A/V158T-FVII,
S314E/L305V/K337A/E296V-FVII,
S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII,
S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII,
S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII,
S314E/L3O5V/V158D/E296V/M298Q-FVII,
PL 211 175 B1
S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,
S314E/L305VN158T/K337A/M298Q-FVII,
S314E/L305VN158T/E296V/K337A-FVII,
S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,
S314E/L305V/V158D/E296V/K337AFVII,
S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,
S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337AFVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296VFVII,K316H/L305V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T-FVII,
K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII,
K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/Vl58D-FVII,
K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII,
K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII,
K316H/L305V/V158D/E296V-FVII,
K316H/L305V/V158T/E296V-FVII,
K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298QFVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,
K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII,
K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,
K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,
K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,
K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,
K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337AFVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII,
K316Q/L305V/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII,
K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII,
K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/E296V/M298QFVII,
K316Q/L3O5V/V158T-FVII,
K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII,
K316Q/L3O5V/V158D/E296V-FVII,
K316Q/L3O5V/V158T/E296V-FVII,
K316Q/L305V/V158D/E296V/M298QFVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII,
PL 211 175 B1
K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L3O5V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII,
F374Y/V158TFVII, F374Y/S314E-FVII,
F374Y/L305V/K337A-FVII,
F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII,
F374Y/K337A/S314EFVII, F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/
F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/
F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII,
F374Y/K337A-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/L305V-FVII,
F374Y/L305V/V158D-FVII,
F374Y/L305V/M298Q-FVII,
F374Y/L305V/S314E-FVII,
F374Y/K337A/V158T-FVI1,
F374Y/K337A/E296V-FVII,
F374Y/V158D/S314E-FVII,
F374Y/V158D/E296V-FVII,
V158T/M298Q-FVII,
F374Y/E296V/S314E-FVII,
E296V/M298Q-FVII,
F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/ M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII,
F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII,
F374Y/L305VN158D/S314E-FVII,
F374Y/L305V/E296V/M298QFVII, F374Y/ L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158TFVII,F374Y/L305V/ M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314EFVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/ M298QFVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314EN158DFVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296VFVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158DFVII, F374Y/K337A/E296VN158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII,
PL 211 175 B1
F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII,
F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII,
F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314EFVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII,
F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337AFVII,
F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,
F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII,
F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,
F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,
F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337AFVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,
F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII,
F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,
F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII,
F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII,
F374Y/V158T/E296V/K337A/S314EFVII, F374Y/
L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337AFVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,
F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII,
F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,
F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII,
PL 211 175 B1
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII,
F374Y/L305V/E296V/K337AN158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337ANl58T/S314EFVII, F374Y/L305V/Vl58D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/Vl58D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, czynnik VIIS52A, czynnik VII-S60A; i P11Q/K33E-FVII, czynnik VII-T1O6N, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII, FVII z substytucjami, addycjami lub delecjami w sekwencji aminokwasowej od 233Thr do 240Asn, FVII z substytucjami, addycjami lub delecjami w sekwencji aminokwasowej od 304Arg do 329Cys i FVII obejmujące substytucje, addycje lub delecje w sekwencji aminokwasowej Ile 153-Arg 223.
Do nieograniczających przykładów polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII o aktywności biologicznej istotnie zmniejszonej lub zmodyfikowanej w stosunku do czynnika VII typu dzikiego należą 152E-FVIIa (Wildgoose i wsp., Biochem 29:3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama i wsp., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Holst i wsp., Eur. J. Vasco Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998), czynnik VIIa pozbawiony domeny Gla, (Nicolaisen i wsp., FEBS Letts. 317:245-249, 1993) i czynnik VII, w którym resztę Lys341 zastąpiono resztą Ala. Nieograniczające przykłady zmodyfikowanych chemicznie polipeptydów czynnika VII i odmian sekwencji opisano na przykład w patencie Stanów Zjednoczonych nr 5,997,864.
Glikozylacja
W rozumieniu niniejszego opisu „wzorzec glikozylacji lub „wzorzec glikoformy, „dystrybucja lub „spektrum oznaczają reprezentację danych struktur oligosacharydowych w danej populacji polipeptydów czynnika VII lub polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII. Do nieograniczających przykładów takich wzorców należą względny odsetek łańcuchów oligosacharydowych (i) zawierających co najmniej jedną resztę kwasu sialowego, (ii) nie zawierających żadnych reszt kwasu sialowego (to znaczy o ładunku obojętnym, (iii) zawierających co najmniej jedną końcową resztę galaktozy, (iv) zawierających co najmniej jedną końcową resztę N-acetylogalaktozaminy, (v) zawierających co najmniej jedną antenę pozbawioną czapeczki, zawierających co najmniej jedną końcową resztę galaktozy lub
N-acetylogalaktozaminy, albo (vi) zawierających co najmniej jedną fukozę związaną o1 >3 do antenowej reszty N-acetyloglukozaminy.
W rozumieniu niniejszego opisu „łańcuch oligosacharydowy oznacza całą strukturę oligosacharydową kowalencyjnie związaną z pojedynczą resztą aminokwasową. Czynnik VII jest normalnie glikozylowany w pozycjach Asn-145 i Asn-322 (N-glikozylacja) oraz Ser-52 i Ser-60 (O-glikozylacja). N-związany łańcuch oligosacharydowy obecny na czynniku VII, produkowany w organizmie człowieka in situ może być bi-,tri-, lub tetra- antenowy, przy czym każda antena ma strukturę Neu5Ac(o2 >3 lub o2 >6) Gal (β1- >4)GlcNAc związaną (β1 >2,4 lub 6) z resztą Man związaną (od- >3 lub 6) z Man (β1 >4)GlcNAc (β1 >4) GlcNAc - Asn (Neu5Ac oznacza kwas N-acetyloneuraminowy (kwas sialowy), Gal oznacza galaktozę, GlcNAc oznacza N-acetyloglukozaminę, a Man oznacza mannozę). Łańcuchy oligosacharydowe mogą także zawierać reszty fukozy, które mogą być związane o1>6 z GlcNAc.
Łańcuch oligosacharydowy związany z O, obecny na czynniku VII, produkowany w organizmie człowieka in situ, jest monoantenowy, przy czym antena Ser-52 ma strukturę Xyl-Xyl-Glc-Ser lub Glc24
PL 211 175 B1
Ser a antena Ser-60 ma strukturę Neu5Ac(a2 >3 lub α2 >6) Gal (β1 >4) GlcNAc-Fuc-Ser lub Fuc-Ser (Fuc oznacza fukozę, Gic oznacza glukozę, a Xyl oznacza ksylozę).
Gdy czynnik VII wytwarzany jest w organizmie człowieka in situ, niektóre ze związanych z N łańcuchów oligosacharydowych nie zawierają rdzeniowych reszt fukozy; wszystkie łańcuchy są pozbawione antenowych reszt fukozy i oba N-związane łańcuchy są niemal całkowicie sialilowane, to znaczy cukrem końcowym każdej anteny jest kwas N-acetyloneuraminowy związany z galaktozą za pośrednictwem wiązania α2>3 lub α2>6.
Przy wytwarzaniu w innych okolicznościach, czynnik VII może jednak zawierać łańcuchy oligosacharydowe o innej strukturze końcowej na jednej lub więcej niż jednej ze swych anten, na przykład może nie zawierać reszt kwasu sialowego; może zawierać reszty kwasu N-glikoliloneuraminowego (Neu5Gc); może zawierać końcową resztę N-acetylogalaktozaminy (GalNAc) zamiast galaktozy i tym podobne. Przy wytwarzaniu na przykład w komórkach BHK hodowanych w obecności surowicy cielęcej preparaty czynnika VII wykazują następujące wzorce oligosacharydowe: 87-93% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną resztę kwasu sialowego; 7-13% stanowią łańcuchy obojętne (bez kwasu sialowego); 9-16% łańcuchów zawiera co najmniej jedną końcową resztę galaktozy; 19-29% zawiera co najmniej jedną końcową resztę N-acetylogalaktozaminy; a 30-39% zawiera co najmniej jedną antenę bez czapeczki, to znaczy zawiera co najmniej jedną końcową resztę galaktozy lub N- acetylogalaktozaminy.
Przy wytwarzaniu w innych typach komórek lub w innych warunkach hodowli (w podłożu pozbawionym surowicy, w pełni chemicznym) preparat czynnika VII może wykazywać następujące wzorce oligosacharydowe (jak to ujawniono w zgłoszeniu WO 02/29025):
(i) Pomiędzy około 94-100% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną resztę kwasu sialowego, na przykład pomiędzy około 94-99%, pomiędzy około 95-98% lub pomiędzy około 96-97%. W różnych wykonaniach co najmniej około 94%, 95%, 96% lub 97% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną resztę kwasu sialowego;
(ii) 6% lub mniej łańcuchów oligosacharydowych stanowią łańcuchy obojętne, to znaczy obojętnych jest około pomiędzy 1,5-6% lub pomiędzy około 2-4% łańcuchów;
(iii) Poniżej około 16%, dogodnie około 10% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną końcową galaktozę, na przykład około pomiędzy 6-10% lub pomiędzy około 8-9%;
(iv) Poniżej około 25%, dogodnie poniżej około 10% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną końcową resztę GalNAc, na przykład pomiędzy około 6-9% lub pomiędzy około 7-8%;
(v) Poniżej około 30%, dogodnie poniżej około 25% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną antenę niezakończoną czapeczką, na przykład pomiędzy około 11-23% lub pomiędzy około 12-18%;
(vi) co najmniej około 2%, dogodnie co najmniej około 5%, dogodniej co najmniej około 10% lub 20% i najdogodniej co najmniej około 40% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną fukozę, związaną α1 >3 z antenową resztą N-acetyloglukozaminy (to znaczy resztę N-acetyloglukozaminy, która jest związana β1>2,4 lub 6 z resztą Man).
Stopień sialilacji można ponadto ulepszać (to znaczy liczbę reszt kwasu sialowego przyłączonych do każdego łańcucha oligosacharydowego) przez poddawanie preparatu wytwarzanego na drodze ekspresji polipeptydu czynnika VII lub polipeptydu pokrewnego czynnikowi VII obróbce enzymatycznej in vitro za pomocą sialilotransferazy i cząsteczki będącej donorem kwasu sialowego, na przykład jak to opisano w patencie Stanów Zjednoczonych nr 6,399,336. W ten sposób można sialilować w zasadzie wszystkie anteny na łańcuchach oligosacharydowych (to znaczy można je osłaniać czapeczką w postaci reszty kwasu sialowego). W niektórych przypadkach N-glukany na FVII lub polipeptydzie pokrewnym FVII są również nie w pełni galaktozylowane i etap galaktozylacji, obejmujący zastosowanie transferazy galaktozylowej i substratu będącego donorem UDP-galaktozy przed etapem sialilacji, pozwoli ulepszyć zawartość kwasu sialowego w produkcie.
Twórcy niniejszego wynalazku wytworzyli preparaty czynnika VII, obejmujące wzorce glikozylacji zawierające co najmniej jedną grupę polimerową kowalencyjnie przyłączoną do co najmniej jednej grupy oligosacharydowej. W jednym z wykonań wynalazku preparaty zawierają polipeptydy czynnika VII lub ewentualnie polipeptydy pokrewne czynnikowi VII, wykazujące jeden lub więcej niż jeden z następujących wzorców glikoform:
(i) pomiędzy około 94-100% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną resztę kwasu sialowego, na przykład pomiędzy około 94-99%, pomiędzy około 95-98% lub pomiędzy około
PL 211 175 B1
96-97%. W innych wykonaniach co najmniej około 94%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną resztę kwasu sialowego;
(ii) 6% lub mniej łańcuchów oligosacharydowych stanowią łańcuchy obojętne, to znaczy obojętnych jest około pomiędzy 0,5-6%, lub pomiędzy około 1,5-6%, lub pomiędzy około 2-4%, lub pomiędzy około 0,5-4%, lub pomiędzy około 0,5-2% łańcuchów;
(iii) poniżej około 16%, dogodnie poniżej około 10% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną końcową galaktozę, na przykład pomiędzy około 6-10% lub pomiędzy około 8-9%;
(iv) poniżej około 25%, dogodnie poniżej około 10% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną końcową resztę GalNAc, na przykład pomiędzy około 6-9% lub pomiędzy około 7-8%;
(v) poniżej około 30%, dogodnie poniżej około 25% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną antenę niezakończoną czapeczką, na przykład pomiędzy około 11-23% lub pomiędzy około 12-18%;
(vi) co najmniej około 2%, dogodnie co najmniej około 5%, dogodniej co najmniej około 10% lub 20% i najdogodniej co najmniej około 40% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną fukozę, związaną α1>3 z antenową resztą N-acetyloglukozaminy (to znaczy z resztą N-acetyloglukozaminy, która jest związana β1>2,4 lub 6 z resztą Man).
Należy rozumieć, że każdy z (i)-(vi) może mieć odrębny wzorzec glikoformy objęty wykonaniami niniejszego wynalazku, to znaczy wzorzec glikoformy preparatu według niniejszego wynalazku, w którym co najmniej jedna grupa polimerowa jest kowalencyjnie połączona z co najmniej jednym oligosacharydem, może być opisany tylko przez jeden z opisów zawartych w punktach (i)-(vi). Ewentualnie wzorzec glikoformy preparatu według niniejszego wynalazku może być opisywany więcej niż jednym z opisów z punktów (i)-(vi).
Ponadto preparat według niniejszego wynalazku można opisać jednym lub więcej niż jednym opisem z punktów (i)-(vi), w połączeniu z jedną lub więcej niż jedną cechą strukturalną. Na przykład wynalazek obejmuje preparaty obejmujące polipeptydy czynnika VII lub polipeptydy pokrewne czynnikowi VII, w których reszty kwasu sialowego (Neu5Ac lub Neu5Gc) są związane z galaktozą wyłącznie w konfiguracji α2>3. Wynalazek obejmuje preparaty zawierające polipeptydy czynnika VII, lub polipeptydy pokrewne czynnikowi VII, obejmujące fukozę związaną α1 >6 z rdzeniową N-acetyloglukozaminą i/lub fukozę związaną α1>3 z antenową N-acetyloglukozaminą. W jednej z serii wykonań preparaty według wynalazku zawierają czynnik VII lub polipeptydy pokrewne czynnikowi VII, w których ponad 99% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną resztę kwasu sialowego i (a) reszty kwasu sialowego są związane wyłącznie w konfiguracji α2>3 i/lub (b) obecne są reszty fukozy związane z rdzeniowymi N-acetyloglukozaminami i/lub (c) wykrywalna liczba anten kończy się N-acetylogalaktozaminą. W jednym z wykonań wynalazek obejmuje preparaty obejmujące czynnik VIIa typu dzikiego, w którym ponad 99% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną resztę kwasu sialowego i reszty kwasu sialowego są związane z galaktozą wyłącznie w konfiguracji α2>3. W innym wykonaniu wynalazek obejmuje preparaty obejmujące czynnik VIIa typu dzikiego, w którym ponad 99% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną resztę kwasu sialowego i co najmniej część łańcuchów oligosacharydowych zawiera N-acetylogalaktozaminę.
Wzorzec oligosacharydów związanych z N i/lub związanych z O można oznaczyć dowolnym sposobem znanym ze stanu techniki, włączając w to, bez ograniczenia: wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC); elektroforezę kapilarną (CE); magnetyczny rezonans jądrowy (NMR); spektometrię masową (MS) z zastosowaniem technik jonizacji, takich jak bombardowanie szybkimi atomami, elektrosprej lub desorpcja laserowa wspomagana matrycą (MALDI); chromatografia gazowa (GC) i obróbka egzoglikozydazami w połączeniu z HPLC anionowymienną (AIE), sączenie molekularne (SEC), spektroskopia masowa (MS), elektroforeza żelowa (SDS-PAGE, CE-PAGE), żele do ogniskowania izoelektrycznego lub elektroforeza kapilarna z ogniskowaniem izoelektrycznym (CE-IEF). Patrz, na przykład. Weber i wsp., Anal. Biochem. 225:135 (1995); Klausen i wsp., J. Chromatog. 718:195 (1995); Morris i wsp., w: Mass Spectrometry of Biological Materials, McEwen i wsp., (red.), Marcel Dekker, (1990), str. 137-167; Conboy i wsp., Biol. Mass Spectrom. 21:397, 1992; Hellerqvist, Meth. Enzymol. 193:554 (1990); Sutton i wsp., Anal. Biochem. 318:34 (1994); Harvey i wsp.. Organic Mass Spectrometry 29:752 (1994).
Po rozdzieleniu łańcuchów oligosacharydowych pochodzących z czynnika VII, z zastosowaniem dowolnej z powyższych metod (lub dowolnej innej metody, pozwalającej na rozdzielenie łańcuchów oligosacharydowych o różnych strukturach), rozdzielone rodzaje przypisuje się na przykład do jednej
PL 211 175 B1 z grup (i)-(vi). Wzglę dną zawartość każdego z (i)-(vi) oblicza się jako sumę oligosacharydów przypisanych do tej grupy w stosunku do całkowitej zawartości łańcuchów oligosacharydowych w próbce.
Przy użyciu AIE-HPLC można na przykład rozdzielić 13 lub więcej pików oligosacharydów związanych z N, z preparatu rekombinowanego czynnika VII, wytworzonego w komórkach BHK (patrz na przykład Klausen i wsp. Mol. Biotechnol. 9:195, 1998). Pięć pików (oznaczonych w publikacji Klausena i wsp., jako 1-5) nie zawiera kwasu sialowego, natomiast osiem pików (oznaczonych jako 6, 7 i 10-15) zawiera kwas sialowy.
Należy rozumieć, że w danej analizie liczba i dystrybucja łańcuchów zawierających kwas sialowy i łańcuchów nie zawierających kwasu sialowego może zależeć (a) od ulegającego ekspresji polipeptydu, (b) od typu komórki i warunków hodowli, (c) od wszelkich modyfikacji wzorca glikoformy na drodze obróbki chemicznej i/lub enzymatycznej po ekspresji i (d) od zastosowanego sposobu analizy, i w zależności od tego wzorce mogą się różnić .
W każ dym przypadku po rozróżnieniu oligosacharydów zawierających kwas sialowy od oligosacharydów nie zawierających kwasu sialowego stosuje się konwencjonalne programy do analizy danych w celu obliczenia pola pod każdym pikiem; całkowitego pola powierzchni pików i odsetka pola powierzchni piku, który stanowi dany pik. W ten sposób dla danego preparatu suma pól powierzchni pików zawierających kwas sialowy/całkowitego pola powierzchni pików razy 100 daje procent wartości sialilacji dla preparatu według niniejszego wynalazku (to znaczy proporcję łańcuchów oligosacharydowych zawierających co najmniej jedną resztę kwasu sialowego). Podobnie można obliczyć procent łańcuchów nie zawierających kwasu sialowego lub zawierających co najmniej jedną galaktozę lub N-acetyloglukozaminę.
Polimery
Cząsteczką polimeru, która ma być łączona z polipeptydem (tworzyć z nim koniugat), może być dowolna odpowiednia cząsteczka, na przykład naturalny lub syntetyczny homopolimer lub heteropolimer, typowo o masie cząsteczkowej w zakresie około 300-100000 Da, na przykład około 500-20000 Da, lub około 500-15000 Da, lub 2-15 kDa, lub 3-15 kDa, lub 3-12 kDa, lub około 10 kDa. Gdy w niniejszym opisie stosowany jest termin „około w odniesieniu do pewnej masy cząsteczkowej, słowo „około oznacza przybliżoną, średnią dystrybucję masy cząsteczkowej w danym preparacie polimeru.
Przykładami homopolimerów są polialkohole (na przykład poli-OH), poliaminy (poli-NH2) i kwasy polikarboksylowe (to znaczy poli-COOH). Heteropolimer jest to polimer zawierający różne grupy sprzęgające, takie jak grupa hydroksylowa i grupa aminowa.
Do przykładów odpowiednich cząsteczek polimerowych należą cząsteczki polimerowe wybrane z grupy obejmującej tlenek polialkilenu (PAO), w tym glikol polialkilenowy (PAG), taki jak glikol polialkilenowy (PEG) i glikol polipropylenowy (PPG), rozgałęzione PEG, alkohol poliwinylowy (PVA), polikarboksylan, poliwinylopirolidon, kopolimer etylen/bezwodnik kwasu maleinowego, kopolimer styren/bezwodnik kwasu maleinowego, dekstran, w tym karboksymetylodekstran, poliuretaner, poliester i poliamider lub dowolny inny polimer odpowiedni do zmniejszenia immunogennoś ci i/lub wydł u ż ania czynnościowego czasu półtrwania in vivo i/lub czasu półtrwania w surowicy. Ogólnie polimery stanowiące pochodne glikoli polialkilenowych wykazują zgodność biologiczną, są nietoksyczne, nieantygenowe i nieimmunogenne, mają różne właściwości rozpuszczalności w wodzie i łatwo ulegają wydzieleniu z organizmów żywych.
Zalecaną cząsteczką polimerową jest PEG, ponieważ zawiera jedynie kilka grup reaktywnych, zdolnych do usieciowania, w porównaniu na przykład z polisacharydami, takimi jak dekstran. Zalecane są w szczególności PEG obejmujące jedną grupę funkcyjną, na przykład glikol metoksypolietylenowy (mPEG), ponieważ chemia sprzęgania jest w jego przypadku względnie prosta (do tworzenia koniugatów z grupami łączącymi na oligosacharydzie dostępna jest tylko jedna grupa reaktywna). W wyniku tego wyeliminowane jest ryzyko powstania usieciowania, powstałe koniugaty polipeptydów są bardziej homogenne, a reakcja cząsteczek polimeru z polipeptydem jest łatwiejsza do kontrolowania.
Żeby uzyskać kowalencyjne przyłączenie cząsteczki lub cząsteczek polimeru do polipeptydu, należy dostarczyć hydroksylowe grupy końcowe cząsteczki polimerowej w postaci aktywowanej, to znaczy z reaktywnymi grupami funkcyjnymi (przykładami takich grup są pierwszorzędowe grupy aminowe, hydrazyd (HZ), tiol, bursztynian (SUC), sukcynimidylobursztynian (SS), sukcynimidylosukcynamid (SSA), sukcynimidylopropionian (SPA), sukcynimidylokarboksymetylan (SCM), węglan benzytriazolu (BTC), N-hydroksysukcynimid (NHS), aldehyd, nitrofenylowęglan (NPC) i trezylan (TRES)).
Odpowiednie aktywowane cząsteczki polimerowe są dostępne w handlu, na przykład w Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL., Stany Zjednoczone, lub w PolyMASC Pharmaceuticals plc. Wielka
PL 211 175 B1
Brytania. Ewentualnie, cząsteczki polimerowe można aktywować konwencjonalnymi sposobami znanymi ze stanu techniki, na przykład w sposób opisany w zgłoszeniu WO 90/13540. Szczegółowe przykłady aktywowanych cząsteczek polimerów o łańcuchach prostych lub rozgałęzionych, do zastosowania w niniejszym wynalazku, opisano w katalogach na rok 1997 i 2000 Shearwater Polymers, Inc. (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives).
Do swoistnych przykładów aktywowanych polimerów PEG należą następujące liniowe PEG: NHS-PEG (na przykład SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG i SCM-PEG) oraz NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, lODO-PEG i MAL-PEG, jak również PEG o rozgałęzionym łańcuchu, taki jak PEG2-NHS i PEG opisane w patentach Stanów Zjednoczonych 5,932,462 i 5,643,575. Ponadto w poniż szych publikacjach opisano uż yteczne czą steczki polimeru i/lub chemi ę pegylacji: patent Stanów Zjednoczonych 5,824,778, patent Stanów Zjednoczonych 5,476,653, publikacja WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, patent Stanów Zjednoczonych 4,902,502, patent Stanów Zjednoczonych 5,281,698, patent Stanów Zjednoczonych 5,122,614, patent Stanów Zjednoczonych 5,219,564, publikacja WO 92/16555, publikacja WO 94/04193, publikacja WO 94/14758, publikacja WO 94/17039, publikacja WO 94/18247, publikacja WO 94/28024, publikacja WO 95/00162, publikacja WO 95/11924, WO 95/13090, publikacja WO 95/33490, publikacja WO 96/00080, publikacja WO 97/18832, publikacja WO 98/41562, publikacja WO 98/48837, publikacja WO 99/32134, publikacja WO 99/32139, publikacja WO 99/32140, publikacja WO 96/40791, publikacja WO 98/32466, publikacja WO 95/06058, EP 439,508, publikacja WO 97/03106, publikacja WO 96/21469, publikacja WO 95/13312, EP 921,131, patent Stanów Zjednoczonych 5,736,625, publikacja WO 98/05363, EP 809,996, patent Stanów Zjednoczonych 5,629,384, publikacja WO 96/41813, publikacja WO 96/07670, patent Stanów Zjednoczonych 5,473,034, patent Stanów Zjednoczonych 5,516,673, EP 605,963, patent Stanów Zjednoczonych 30 5,382,657, EP 510,356, EP 400472, EP 183 503 i EP 154316.
Tworzenie koniugatów łańcuchów oligosacharydowych polipeptydu i aktywowanych cząsteczek polimeru prowadzi się, stosując dowolny konwencjonalny sposób. Sposoby konwencjonalne są znane specjalistom.
Specjalista będzie zdawał sobie sprawę, że zastosowany sposób aktywacji i/lub chemia sprzęgania będzie zależeć od grupy łączącej (lub grup łączących) oligosacharydu (lub oligosacharydów), jak również od grup funkcyjnych cząsteczki polimeru (którymi mogą być na przykład grupy aminowa, hydroksylowa, karboksylowa, aldehydowa, ketonowa, sulfhydrylowa, sukcynimidylowa, maleimidowa, winylosulfonowa lub chlorowcooctowa).
Należy rozumieć, że sprzęganie polimeru prowadzi się w taki sposób, aby uzyskać cząsteczkę optymalną w odniesieniu do liczby przyłączonych cząsteczek polimeru, wielkości i postaci takich cząsteczek (to znaczy w zależności od tego, czy są one liniowe czy rozgałęzione) i od miejsca (lub miejsc) przyłączenia w łańcuchu (lub łańcuchach) oligosacharydowych. Masę cząsteczkową stosowanego polimeru można wybrać na przykład na podstawie pożądanego efektu, który ma być uzyskany. Na przykład jeżeli podstawowym celem sprzęgania jest uzyskanie koniugatu o dużej masie cząsteczkowej (na przykład po to, aby zmniejszyć klirens nerkowy), dogodne jest zwykle sprzęganie możliwie jak najmniejszej liczby cząsteczek polimeru o dużej masie cząsteczkowej w celu uzyskania pożądanej masy cząsteczkowej.
W niniejszym wynalazku bierze się również pod uwagę sprzęganie cząsteczek polimeru z polipeptydem przez łącznik. Odpowiednie łączniki są znane specjalistom. Zalecanym przykładem jest chlorek cyjanurowy (Abuchowski i wsp., (1977), J. Biol. Chem., 252,3578-3581; patent Stanów Zjednoczonych nr 4,179,337; Shafer i wsp., (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24,375-378). Po sprzęganiu resztę aktywowanych cząsteczek polimeru blokuje się sposobami znanymi ze stanu techniki, na przykład przez dodanie do mieszaniny reakcyjnej aminy pierwszorzędowej, a powstałe inaktywowane cząsteczki polimeru usuwa się odpowiednim sposobem. Takie sposoby są dobrze znane specjalistom, patrz na przykład March, Advanced Organic Chemistry, wyd. 3, John Wiley and Sons, NY, 1985; Greene i wsp., Protective groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, NY, 1991; Taylor (1991), Protein Immobilization, Fundamentals and Applications, Marcel Dekker, NY; Wong (1992), Chemistry of protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton; Hermanson i wsp., (1993), Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, NY.; Dunn i wsp. (red.), Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, 1991).
PL 211 175 B1
Należy rozumieć, że w zależności od okoliczności, na przykład od sekwencji aminokwasowej polipeptydu, rodzaju stosowanego aktywowanego związku PEG i specyficznych warunków pegylacji, w tym stosunku molowego PEG do polipeptydu, można uzyska ć róż ne stopnie pegylacji, przy czym wyższy stopień pegylacji ogólnie uzyskuje się przy wyższym stosunku PEG do polipeptydu. Pegylowane polipeptydy, uzyskane w dowolnym procesie pegylacji, będą jednak w normalnych warunkach zawierać stochastyczną dystrybucję koniugatów polipeptydów o nieco różniącym się stopniu pegylacji.
W interesującym wykonaniu wynalazku koniugat polipeptydu według niniejszego wynalazku zawiera cząsteczkę polimeru, kowalencyjnie przyłączoną do jednej z grup kwasu sialowego, znajdujących się na końcowym zakończeniu grupy oligosacharydowej polipeptydu czynnika VII, przy czym ta cząsteczka polimerowa jest jedyną cząsteczką polimerową połączoną z polipeptydem. W innym wykonaniu dwie cząsteczki polimeru są kowalencyjnie związane z jedną lub więcej niż jedną grupą oligosacharydową polipeptydu czynnika VII; w innym wykonaniu do polipeptydu czynnika VII kowalencyjnie przyłączonych jest 3, 4, 5, 6 lub 7 cząsteczek polimeru.
W jednym z wykonań , polipeptyd czynnika VII jest polipeptydem FVII lub FVIIa typu dzikiego, przedstawionym na Fig. 1; w innym wykonaniu polipeptyd czynnika VII jest polipeptydem pokrewnym czynnikowi VII; w jednym z wykonań polipeptyd pokrewnym czynnikowi VII jest odmianą sekwencji aminokwasowej czynnika VII.
Takie koniugaty polipeptydowe dogodnie zawierają jedną cząsteczkę PEG. W szczególności może to być liniowa lub rozgałęziona cząsteczka PEG, o masie cząsteczkowej wynoszącej co najmniej około 5 kDa, dogodnie około 10-25 kDa, na przykład około 15-25 kDa, na przykład około 20 kDa lub około 10 kDa.
W koniugacie wedł ug wynalazku liczbę i masę cząsteczkową czą steczek polimerowych dogodnie wybiera się tak, aby całkowita masa cząsteczkowa dodana przez cząsteczkę polimerową pozostawała w zakresie 5-25 kDa, tak jak na przykład w zakresie 10-25 kDa, około 5 kDa, około 10 kDa, około 15 kDa lub około 20 kDa.
Sposoby wytwarzania preparatów czynnika VII połączonych z polimerem o z góry ustalonym wzorcu oligosacharydów.
Sposoby wytwarzania preparatów czynnika VII
Czynnik VII, odmiany czynnika VII lub polipeptydy pokrewne czynnikowi VII można wytwarzać, stosując dowolne odpowiednie komórki gospodarza, wykazujące ekspresję glikolizowanego czynnika VII lub polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII (to znaczy komórki gospodarza zdolne do przyłączania grup oligosacharydowych w miejscach glikozylacji polipeptydu). Czynnik VII można także izolować z osocza pochodzącego od ludzi lub od osobników innych gatunków.
W niektórych wykonaniach komórkami gospodarza są komórki ludzkie, wykazują ce ekspresję endogennego genu czynnika VII. W tych komórkach gen endogenny może być nienaruszony lub może być zmodyfikowany in situ lub sekwencja poza genem czynnika VII może być zmodyfikowana in situ tak, aby zmienić ekspresję endogennego genu czynnika VII. Można stosować dowolną komórkę ludzką, zdolną do ekspresji genu endogennego czynnika VII.
W innych wykonaniach programuje się heterologiczne komórki gospodarza tak, aby wykazywał y ekspresję ludzkiego czynnika VII z genu rekombinowanego. Komórki gospodarza mogą pochodzić z krę gowców, owadów lub grzybów. Zalecane komórki to komórki ssaków, zdolne do peł nego spektrum charakterystycznej dla ssaków N-glikozylacji, O-glikozylacji i γ-karboksylacji. Patrz na przykład patent Stanów Zjednoczonych nr 4,784,950. Do zalecanych linii komórek ssaków należy linia CHO (ATCC CCI. 61), COS-1 (ATCC CRL 1650) i linia komórek nerek noworodków chomików (BHK) i HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham i wsp., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Zalecaną linią komórek BHK jest linia komórek tk- ts13 BHK (Waechter i Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982), zwana w dalszej części niniejszego opisu komórkami BHK-570. Linia komórek BHK 570 jest dostępna w Amerykańskim Zbiorze Hodowli Typowych (American Type Culture Collection), 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, pod nr ATCC CRL 10314. Linia komórek tk- ts13 BHK jest także dostępna w ATCC pod nr CRL 1632. Można również stosować wiele innych linii komórkowych, w tym szczurze komórki Rat Hep I (wątrobiak szczura; ATCC CRl 1600), Rat Hep II (wątrobiak szczura; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), ludzkie komórki płuca (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) i komórki DUKX (linia komórkowa CHO) (Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980). (Komórki DUKX bywają także nazywane komórkami CXB11). Można też stosować komórki DG44 m (linia komórek CHO) (Cell, 33:405, 1983, i Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555, 1986). Użyteczne są także komórki 3T3, komórki Namalwa, szpiczaki i fuzje szpiczaków
PL 211 175 B1 z innymi komórkami. W szczególnie zalecanym wykonaniu komórkami gospodarza są komórki BHK 21, zaadaptowane do wzrostu w nieobecności surowicy i zaprogramowane do ekspresji czynnika VII. W niektórych wykonaniach komórki mogą być komórkami zmutowanymi lub rekombinowanymi, wykazującymi ekspresję, jakościowo lub ilościowo, innego spektrum enzymów glikozylacji (takich jak na przykład transferazy glikozylowe i/lub glikozydazy) niż typ komórek, z którego pochodzą. Komórki można również zaprogramować do ekspresji innych heterologicznych peptydów lub białek, włączając w to, na przykł ad, skrócone postacie czynnika VII. W jednym z wykonań komórki gospodarza stanowią komórki CHO zaprogramowane do jednoczesnej ekspresji polipeptydu czynnika VII (na przykład czynnika VII lub polipeptydu pokrewnego czynnikowi VII) i innego heterologicznego peptydu lub polipeptydu, takiego jak na przykład enzym modyfikujący lub fragment czynnika VII.
Sposoby wytwarzania preparatu czynnika VII, obejmującego dowolny z wzorców glikozylacji opisanych powyżej w punktach (i)-(vi) i sposoby optymalizacji dystrybucji glikoform czynnika VII i polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII można przeprowadzić w następujących etapach:
(a) hodowla komórki wykazującej ekspresję czynnika VII lub polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII w pierwszym zestawie z góry ustalonych warunków hodowli;
(b) odzyskiwanie z hodowli czynnika VII lub polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII, w celu wytworzenia preparatu obejmującego polipeptydy i (c) analiza struktury oligosacharydów związanych z peptydami w celu ustalenia wzorca glikozylacji.
Sposoby mogą ponadto obejmować:
(d1) zmianę warunków hodowli z etapu (a) w celu uzyskania drugiego zestawu z góry ustalonych warunków hodowli;
(e1) powtórzenie etapów (b)-(d1) aż do osiągnięcia pożądanego wzorca glikoformy;
(f1) kontaktowanie czynnika VII lub polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII z cząsteczką polimeru, w warunkach, w których cząsteczka polimeru jest kowalencyjnie łączona z grupą oligosacharydową polipeptydu.
Ewentualnie sposoby mogą ponadto obejmować:
(d2) chemiczną i/lub enzymatyczną obróbkę preparatów w celu zmiany struktury oligosacharydowej i (e2) powtarzanie etapów (b)-(d2) aż do uzyskania pożądanego wzorca glikoformy.
Sposoby te mogą ponadto obejmować etap poddawania preparatów, o z góry ustalonych wzorcach glikoform, co najmniej jednemu testowi aktywności biologicznej (włączając w to na przykład test krzepnięcia, proteolizy czynnika X lub wiązania z TF) lub innej funkcjonalności (takiej, jak na przykład profil farmakokinetyczny lub stabilność) i korelowanie danych wzorców glikoform z poszczególnymi profilami aktywności biologicznej lub funkcjonalności, w celu identyfikacji pożądanego wzorca glikoformy.
Do zmiennych warunków hodowli, które można zmieniać w etapie (d1) należą, bez ograniczenia, komórka pierwotna, taka jak na przykład komórka pochodząca z gatunku innego niż używany pierwotnie, lub komórka zmutowana lub rekombinowana, obejmująca zmiany jednej lub więcej niż jednej glikozylotransferazy lub glikozydazy, lub innych składowych aparatu glikozylacji (patrz na przykład Grabenhorst i wsp., Glycoconjugate J. 16:81, 1999; Bragonzi i wsp., Biochem. Biophys. Acta 1474:273, 2000; Weikert, Nature Biotechnol. 17:1116,1999); poziom ekspresji polipeptydu, warunki metaboliczne, takie jak, na przykład stężenie glukozy lub glutaminy, nieobecność lub obecność surowicy, stężenie witaminy K, hydrolizatów białek, hormonów, metali śladowych, soli, jak również parametrów procesu, takich jak temperatura, poziom rozpuszczalnego tlenu i pH.
Do sposobów obróbki enzymatycznej, które można stosować w etapie (d2) w celu modyfikacji wzorca oligosacharydowego preparatu należą, bez ograniczenia, obróbka jednym lub więcej niż jednym z następujących enzymów: sialidaza (neuraminidaza), galaktozydaza, fukozydaza, galaktozylotransferaza, fukozylotransferaza i/lub sialilotransferaza, w takiej sekwencji i w takich warunkach, aby uzyskać pożądaną modyfikację dystrybucji łańcuchów oligosacharydowych o danych strukturach końcowych. Glikozylotransferazy są dostępne w handlu w Calbiochem (La Jolla, CA, Stany Zjednoczone) a glikozydazy są dostępne w handlu w Glyko, Inc., (Novato, CA, Stany Zjednoczone).
W jednej z serii wykonań komórki gospodarza wykazują ce ekspresję czynnika VII lub polipeptydu pokrewnego poddaje się swoistym warunkom hodowli, w których wydzielają one glikozylowane polipeptydy czynnika VII o pożądanym wzorcu struktur oligosacharydowych, opisanym powyżej w dowolnym z punktów (i)-(vi). Do takich warunków hodowli należą, bez ograniczenia, zmniejszenie zawartości lub całkowita nieobecność surowicy. Dogodnie komórki gospodarza adaptuje się tak, aby rosły w nieobecności surowicy i hoduje się je w nieobecności surowicy, zarówno w fazie wzrostu, jak i w fazie wytwarzania. Takie procedury adaptacji opisano na przykład w Scharfenberg i wsp., Animal
PL 211 175 B1
Cell Technology Developments towards the 21st Century, E. C. Beuvery i wsp., (red), Kluwer Academic Publishers, str. 619-623, 1995 (komórki BHK i CHO); Cruz, Biotechnol. Tech. 11:117-120,1997 (komórki owadów); Keen, Cytotechnol. 17:203-211, 1995 (komórki szpiczaka); Berg i wsp., Biotechniques 14:972-978, 1993 (komórki 293 nerki ludzkiej). W zalecanym wykonaniu pożywka wzrostowa dodawana do komórek nie zawiera białek ani innych składników izolowanych z hodowli tkanki zwierzęcej lub z komórek zwierzęcych. Patrz na przykład poniższy przykład 1. Typowo, oprócz konwencjonalnych składników, pożywka odpowiednia do wytwarzania czynnika VII zawiera witaminę K w stężeniu pomię dzy 0,1-50 mg/l, ponieważ witamina ta jest niezbę dna do γ -karboksylacji reszt glutaminowych w czynniku VII.
W innej serii wykonań glikoformy wytwarza się przez poddawanie preparatu czynnika VII lub polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII modyfikacji enzymatycznej i/lub chemicznej oligosacharydów związanych z N i/lub związanych z O, które się w nich znajdują, na przykład poprzez poddawanie preparatu modyfikacji sialilotransferazą lub galaktozylotransferazą, jak to opisano na przykład w patencie Stanów Zjednoczonych 6,399,336. Dogodnie modyfikuje się oligosacharydy związane z N. Sialilotransferaza jest w stanie sialilować duży odsetek grup akceptorowych na glikoproteinie (na przykład końcową galaktozę). Pożądany wynik uzyskuje się zwykle stosując około 50 mU sialilotransferazy na mg glikoproteiny lub mniej. Typowo, łańcuchy oligosacharydowe na glikoproteinie, których wzorzec glikoformy zmienia się tym sposobem będą w wyniku tego zawierać większy odsetek sialilowanych końcowych reszt galaktozowych, w porównaniu z polipeptydem niezmienionym. Stosując te metody można w zasadzie poddać sialilacji 100% końcowych reszt galaktozowych. Za pomocą tych sposobów można zwykle osiągnąć pożądany poziom sialilacji w ciągu około 48 godzin lub w krótszym czasie. Dogodnie, w przypadku glikozylacji związanych z N węglowodanów glikoprotein, sialilotransferaza będzie zdolna przenieść kwas sialowy na sekwencję Gal (β1 >4) GlcNAc-, która jest najczęstszą, przedostatnią sekwencją przed końcowym kwasem sialowym na w pełni sializowanych strukturach węglowodanowych. Przykładami sialilotransferaz wykorzystujących Gal (β1 >4)GlcNAc- jako grupę akceptorową są ST3Gal III, ST3Gal IV i ST3Gal V (dołączenie NeuAc za pomocą wiązania α2>3) oraz ST6Gal I i ST6Gal II (z dołączeniem NeuAc za pomocą wiązania α2>6) (zob. patent Stanów Zjednoczonych 6,399,336) (nomenklaturę sialilotransferaz opisano w publikacji Tsuji i wsp., Glycobiology 6:v-xiv (1996)).
Tak więc mieszanina dwóch enzymów może być odpowiednia, jeżeli zalecana jest obecność obu wiązań w produkcie końcowym. Pokrótce, sialilację glikoproteiny uzyskuje się stosując, na przykład, cykl sialilotransferazy, w którym bierze udział syntetaza kwasu CMP- sialowego. System regeneracji CMP w tym cyklu obejmuje monofosforan cytydyny (CMP), trójfosforan nukleozydu, donor fosforanów, kinazę zdolną do przenoszenia fosforanu z donoru fosforanów do difosforanów nukleozydów i kinazę monofosforanów nukleozydów, zdolną do przenoszenia końcowego fosforanu z trójfosforanu nukleozydu na CMP. System regeneracji wykorzystuje również syntetazę CMP-kwasu sialowego, przenoszącą kwas sialowy na CMP. W cyklu sialilacji CMP ulega przekształceniu do CDP, pod działaniem kinazy monofosforanów nukleozydów, w obecności dodanego ATP. ATP jest regenerowany katalitycznie ze swego produktu ubocznego ADP przez kinazę pirogronianu (PK) w obecności dodanego fosfoenolopirogronianu (PEP). CDP ulega dalszemu przekształceniu do CTP; przekształcanie to jest katalizowane przez PK, w obecności PEP. CTP reaguje z kwasem sialowym, tworząc nieorganiczny pirofosforan (PPi) i CMP-kwas sialowy, przy czym ta ostatnia reakcja jest katalizowana przez syntetazę CMP-kwasu sialowego. Po sialilacji galaktozyloglukozydu uwolniony CMP ponownie wchodzi do systemu regeneracji, tworząc CDP, CTP i CMP-kwas sialowy. Wytworzony PPi jest wymiatany i tworzy nieorganiczny fosforan jako produkt uboczny. Pirogronian jest także produktem ubocznym. Ze względu na niezależność i cykliczny charakter tego sposobu, gdy obecne są wszystkie odczynniki i enzymy, reakcja trwa do momentu zużycia pierwszych substratów (na przykład wolnego NeuAc i PEP lub akceptora). Cykl sialilotransferazy opisano na przykład w patentach Stanów Zjednoczonych 5,374,541 i 6,399,336.
W glikoproteinie do modyfikacji będą obecne akceptory sialilotransferazy.
Do odpowiednich akceptorów należą na przykład: Gal(e1 >4)GlcNAc-, Gal(e1 >4)GalNAc-, Gal(e1 >3)GalNAc-, Gal(e1 >3)GlcNAc-, Gal(e1 >6)GlcNAc-, Gal(e1 >4)Glc- oraz inne akceptory znane specjalistom (zob. na przykład Paulson i wsp., (1978) J. Biol. Chem. 253:5617-5624). Typowo, receptory te wchodzą w skład łańcuchów oligosacharydowych, przyłączonych do reszt asparaginowej, serynowej lub treoninowej, obecnych w polipeptydzie.
PL 211 175 B1
Glikoproteinę można „obciąć, w całości lub w części, w celu ekspozycji akceptora na działanie sialilotransferazy lub ekspozycji ugrupowania, do którego można dodać jedną lub więcej odpowiednią resztę w celu wytworzenia odpowiedniego akceptora. Do reakcji przyłączania i „obcinania użyteczne są enzymy, takie jak glikozylotransferazy i endoglikozydazy. Na przykład glikoproteinę można „obciąć, traktując ją sialidazą, w celu wytworzenia końcowych grup galaktozy, przed poddaniem białka cyklowi sialilotransferazy lub jeszcze dalej do poziomu N-acetyloglukozaminy przez dalszą obróbkę galaktozydazami. Patrz na przykład patent Stanów Zjednoczonych 5,272,066, w którym opisano sposoby wytwarzania polipeptydów zawierających akceptory, odpowiednie do sialilacji.
Sposoby kowalencyjnego przyłączania cząsteczek polimeru do polipeptydu czynnika VII
Do oligosacharydów na polipeptydzie czynnika VII można przyłączać różne cząsteczki chemiczne, takie jak cząsteczki polimerów, stosowane w niniejszym wynalazku, przez syntezę chemiczną lub obróbkę enzymatyczną polipeptydu, na przykład zmodyfikowanym kwasem sialowym. Cząsteczkę polimeru można także sprzęgać z oligosacharydem za pośrednictwem łącznika. Odpowiednie łączniki są znane specjalistom. Przykładami są, jednak bez ograniczenia, N-(4-acetylofenylo)malimid, oraz pochodne malimidowe, aktywowane estrem sukcymidylowym, takie jak dostępne w handlu sukcymidylo-4-malimidobutanoesan, 1,6-bismalimidoheksany.
Do kwasu sialowego można kowalencyjnie przyłączać różne cząsteczki chemiczne, takie jak cząsteczki polimerów, stosowane w niniejszym wynalazku, i w ten sposób zmodyfikowany (lub sprzężony) kwas sialowy można następnie włączać do cyklu sialilotransferazy, w wyniku czego uzyskuje się kowalencyjne przyłączenie cząsteczki polimeru do glikoproteiny. Sprzężony kwas sialowy można wytwarzać konwencjonalnymi sposobami, znanymi specjalistom. Cząsteczkę polimeru można także sprzęgać z kwasem sialowym przez łącznik.
Wytwarzanie pochodnych i analogów FVII metodami chemoenzymatycznymi
Zmodyfikowane nukleotydy cukrowo-fosforowe, użyteczne do zastosowania w niniejszym wynalazku można podstawiać zgodnie ze wzorami ogólnymi I i II:
-X są członami wybranymi niezależnie od siebie spośród atomu siarki, tlenu, grupy NH lub wiązania kowalencyjnego;
-R1, R2, R3, R4 i R5 są członami wybranymi niezależnie od siebie spośród atomu wodoru, polimeru i cząsteczki łącznika kowalencyjnie połączonej z polimerem, grupy acylowej (w tym acetylowej i hydroksyacetylowej) i alkilowej;
-M+ jest kationem wybranym spośród monofosforanów nukleozydów Na+, K+, Li+, kationu tetrabutyloamoniowego lub podobnego kationu.
W zalecanym wykonaniu R1 i R2 stanowią niezależ nie od siebie polimer oparty na PEG o masie wynoszą cej 1-40000 kDa.
W jeszcze bardziej zalecanym wykonaniu R1 stanowi niezależ nie polimer oparty na PEG o masie 1-40000 kDa.
W przykł adowym wykonaniu, przedstawionym w schemacie 1, kwas neuraminowy zabezpieczony grupą aminową, 2-hydroksylową i karboksylową początkowo przekształca się do jego pochodnej 9- aminowej, sposobem opisanym przez Isecke, R., Brossmer, R. Tetrahedron 1994, 50 (25), 7445-7460, i następnie z tego związku wytwarza się pochodną za pomocą PEG-COOH, stosując standardowe warunki sprzęgania. Produkt pochodny PEG pozbawia się następnie grup zabezpieczających w łagodnych warunkach kwasowych i enzymatycznie przekształca się do odpowiedniego cukru nukleotydowego.
PL 211 175 B1
W innym przykładowym wykonaniu, przedstawionym w schemacie 2, kwas acetyloneuraminowy traktuje się tiokwasami, z których wytworzono pochodne za pomocą PEG, w warunkach Mitsunobu, w celu wytworzenia pochodnej PEG kwasu N-acetyloneuraminowego, która następnie przekształca się do nukleotydu cukrowego.
W przykładowym wykonaniu, przedstawionym w schemacie 3, tiol zmodyfikowanej galaktozy reaguje z PEG zawierającym ugrupowanie maleimidowe. Związek PEG - galaktoza, można następnie przekształcać do odpowiedniego cukru nukleotydowego metodami enzymatycznymi lub chemicznymi.
PL 211 175 B1
Schemat 3
W innym przykładowym wykonaniu, przedstawionym w schemacie 4,6-aminogalaktoza (Fernandez, J. i wsp., J. Org. Chem. 1993, 58 (19), 5192-5199) reaguje z PEG zawierającym zabezpieczone ugrupowanie aminokwasu. Ester metylowy poddaje się zmydlaniu. Związek PEG-galaktoza można następnie przekształcać do odpowiedniego cukru nukleotydowego metodami enzymatycznymi lub chemicznymi.
Schemat 4
W innym przykł adowym wykonaniu, przedstawionym w schemacie 5, zabezpieczona 6-bromogalaktoza (Hodosi, G., Podanyi, B. i Kuszmann, J., Carbohydr. Res., 1992, 230(2), 327-342) reaguje z PEG zawierającym ugrupowanie tiolowe. Grupy izopropylidenowe usuwa się w warunkach kwasowych. Związek PEG-galaktoza można następnie przekształcać do odpowiedniego cukru nukleotydowego metodami enzymatycznymi lub chemicznymi.
PL 211 175 B1
Schemat 5
W innym przykładowym wykonaniu, przedstawionym w schemacie 6, zabezpieczony kwas galakturonowy (Godage, Y.S. i Fairbanks, A.J., Tetrahedron Lett., 2000, 41(39),7589-7594) reaguje z PEG zawierającym ugrupowanie aminowe. Grupy izopropylidenowe usuwa się w warunkach kwasowych. Związek PEG-galaktoza można następnie przekształcać do odpowiedniego cukru nukleotydowego metodami enzymatycznymi lub chemicznymi.
Schemat 6
EDAC, HOBt
TFA
TMS-CI, pirydyna, równ. TMS-I, sól UDP-tetrabutyloamoniowa, fluorek tetrabutyloamoniowy, fosfataza zasadowa lub kinaza galaktozy, ATP,
UDP-galaktozopirofosforylaza,
UTP
Ogólnie cukry nukleotydowe, takie jak opisane powyżej, można enzymatycznie przenosić na odpowiednie glikoproteiny, takie jak FVII lub polipeptyd pokrewny FVII, stosując naturalne lub zmutowane glikozylotransferazy. Dla przykładu można podać następujące, nieograniczające przykłady takich glikozylotransferaz: a2,3-sialilotransferazy, a2,6-sialilotransferazy i ei,4-galaktozylotransferazy. W zależności od doboru cukru nukleotydowego - pochodnej PEG (CMP-SA-PEG lub UDP-Gal-PEG) zalecane może być poddanie polipeptydu pokrewnego FVII obróbce sialidazą, galaktozydazą lub oboma tymi enzymami, przed reakcją z glikozylotransferazami i cukrami nukleotydowymi - pochodnymi PEG.
PL 211 175 B1
Tak więc w jednym z zalecanych wykonań analog FVII traktuje się sialidazą w celu wytworzenia analogu asialowego FVII, który następnie poddaje się obróbce sialilotransferazą i analogu CMP-SAPEG, według wzoru ogólnego 1, w celu wytworzenia analogu FVII - pochodnej PEG.
W innym wykonaniu polipeptyd pokrewny FVII traktuje się najpierw sialidazą i następnie galaktozydazą w celu wytworzenia asialo-agalakto-polipeptydu pokrewnego FVII. Analog ten następnie traktuje się galaktozylotransferazą i analogiem UDP-Gal-PEG, według ogólnego wzoru II, uzyskując analog FVII - pochodną PEG.
W serii wykonań stosuje się zmodyfikowane związki galaktozowe, kowalencyjnie związane z polimerem, bezpośrednio lub za pośrednictwem cząsteczki łącznikowej. Można stosować czynnik FVII lub polipeptydy pokrewne czynnikowi VII bezpośrednio w celu uzyskania niższego poziomu polimerów na polipeptyd lub można najpierw traktować czynnik VII lub polipeptydy pokrewne czynnikowi VII sialidazą w celu usunięcia końcowych grup kwasu sialowego, aby uzyskać wyższy poziom polimeru na peptyd. Przy traktowaniu polipeptydu galaktozydazą uzyskuje się dostęp do punktów przyłączenia dla zmodyfikowanych związków galaktozowych. Można wytworzyć wiązanie między zmodyfikowanymi związkami galaktozowymi a poddawanym obróbce polipeptydem, stosując aktywowaną UDP postać zmodyfikowanych związków galaktozowych i galaktozylotransferazę. Przykładowe wykonanie tego typu przedstawiono na schemacie 7, na którym czarne koła oznaczają czynnik VII lub polipeptydy pokrewne czynnikowi VII, i przedstawiono końcowe części kilku węglowodanów.
Schemat 7
Chemiczne wytwarzanie pochodnych i analogów FVII
Alternatywnym sposobem wytwarzania koniugatów FVII-PEG jest chemiczne utlenienie reszt węglowodanowych z zastosowaniem nadjodanu sodowego. W wyniku utlenienia chemicznego węglowodanu ogólnie wytwarza się wiele reaktywnych grup aldehydowych, z których każda jest zdolna do reakcji z PEG-nukleofilami, takimi jak PEG-hydrazyd, PEG-O-hydroksyloamina i PEG-amina.
Za pomocą odpowiednio PEG-hydrazydu i PEG-O-hydroksyloaminy można wytworzyć stabilne koniugaty FVII-PEG-acylohydrazon i FVII-PEG-oksym. Za pomocą PEG-amin wytwarza się mniej stabilne koniugaty zasady Shiffa. Ten koniugat można jednak poddać dalszej stabilizacji poprzez redukcję cyjanoborowodorkiem sodowym, w wyniku czego tworzy się drugorzędowe wiązanie aminowe. Koniugaty FVII-PEG-acylohydrazonu można także poddawać redukcji cyjanoborowodorkiem sodowym, w wyniku czego tworzą się koniugaty hydrazynowe związane N,N'.
PL 211 175 B1
Oczyszczanie preparatów glikokoniugatów czynnika VII
W rozumieniu niniejszego opisu „preparat czynnika VII oznacza wiele polipeptydów czynnika
VII, polipeptydów czynnika VIIa lub polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII, włączając w to odmiany i postacie chemicznie zmodyfikowane, które zostały oddzielone od komórki lub pożywki reakcyjnej, w której zostały wytworzone.
Oczyszczanie preparatów i koniugatów czynnika VII
Rekombinacyjnie wytworzone polipeptydy można oddzielić od komórek, z których pochodzą dowolnym sposobem znanym ze stanu techniki, włączając w to, bez ograniczenia, usuwanie pożywki do hodowli komórkowej zawierającej pożądany produkt z przylegającej do niej hodowli komórkowej, odwirowanie lub filtrację w celu usunięcia komórek, które nie uległy przywarciu i tym podobnych.
Polipeptydy czynnika VII mogą ewentualnie być dalej oczyszczane. Oczyszczanie można prowadzić dowolnym sposobem, znanym ze stanu techniki, włączając w to, bez ograniczenia, chromatografię powinowactwa, taką jak na przykład chromatografię na kolumnie z przeciwciałem skierowanym przeciwko czynnikowi VII (zob. na przykład Wakabayashi i wsp., J. Bio. Chem. 261:11097, 1986; i Thim i wsp., Biochem. 27:7785, 1988); chromatografię interakcji hydrofobowych, chromatografię jonowymienną, sączenie molekularne, procedury elektroforezy (na przykład preparatywne ogniskowanie izoelektryczne lEF, rozpuszczalność różnicową (na przykład strącanie siarczanem amonu), lub ekstrakcję i tym podobne, Zob. na przykład Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; i Protein Purification, J.-C. Janson i Lars Ryden, (red), VCH Publishers, New York, 1989. Po oczyszczeniu preparat dogodnie zawiera poniżej około 10% wagowo, dogodniej poniżej około 5% wagowo i najdogodniej poniżej około 1% białek pochodzących z komórki gospodarza innych niż czynnik VII.
Czynnik VII i polipeptydy pokrewne czynnikowi VII można aktywować przez cięcie proteolityczne, stosując czynnik XIIa lub inne proteazy o swoistości trypsynopodobnej, takie jak na przykład czynnik IXa, kalikreina, czynnik Xa i trombina. Zob. na przykład Osterud i wsp., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, patent Stanów Zjednoczonych nr 4,456,591; i Hedner i wsp., J. Clin. Invest. 71:1836 (1983). Ewentualnie czynnik VII można aktywować przez przepuszczanie go przez kolumnę do chromatografii jonowymiennej, taką jak MonoQ® (Pharmacia) lub tym podobne. Z uzyskanego w ten sposób aktywowanego czynnika VII można następnie wytwarzać preparaty i podawać je w sposób opisany poniżej.
Właściwości czynnościowe preparatów czynnika VII
Preparaty polipeptydów czynnika VII i polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII według niniejszego wynalazku, o z góry określonych wzorcach oligosacharydowych, z kowalencyjnie przyłączonymi cząsteczkami polimerów wykazują ulepszone właściwości czynnościowe w stosunku do preparatów referencyjnych. Ulepszenie właściwości czynnościowych może obejmować, bez ograniczenia, a) właściwości fizyczne, takie jak na przykład stabilność w czasie przechowywania, b) właściwości farmakokinetyczne, takie jak na przykład biodostępność i czas półtrwania oraz c) immunogenność u człowieka.
Pojęcie preparatu referencyjnego odnosi się do preparatu zawierającego polipeptyd o sekwencji aminokwasowej identycznej z sekwencją preparatu według wynalazku, z którym się go porównuje (na przykład nietworzące koniugatu postacie czynnika VII typu dzikiego lub konkretna odmiana lub postać chemicznie zmodyfikowana), lecz nietworzące koniugatu z żadną cząsteczką polimerową, taka jakie wchodzą w skład preparatu według wynalazku. Na przykład preparaty referencyjne typowo zawierają nietworzący koniugatu czynnik VII typu dzikiego lub nietworzące koniugatu polipeptydy pokrewne czynnikowi VII.
Stabilność preparatu czynnika VII w czasie przechowywania można oceniać mierząc (a) czas niezbędny do utraty 20% aktywności biologicznej preparatu, przy przechowywaniu w postaci suchego proszku, w temperaturze 25°C i/lub (b) czas niezbędny do podwojenia odsetka agregatów czynnika VIIa w preparacie.
W niektórych wykonaniach preparaty według wynalazku wykazują wydłużenie o co najmniej około 30%, korzystnie co najmniej około 60% i korzystniej co najmniej około 100% czasu wymaganego do utraty 20% aktywności biologicznej, w porównaniu z czasem, którego wymaga to samo zjawisko w preparacie referencyjnym, przy przechowywaniu obu preparatów w postaci suchych proszków, w temperaturze 25°C. Pomiarów aktywności biologicznej można dokonać stosując dowolny test krzepnięcia, test proteolizy, test wiązania TF lub niezależny od TF test wytwarzania trombiny.
W niektórych wykonaniach preparaty według wynalazku wykazują wydłużenie co najmniej o około 30%, korzystnie co najmniej około 60%, korzystniej co najmniej o około 100% czasu niezbędnego do podwojenia liczby agregatów w stosunku do preparatu referencyjnego, przy przechowywaniu obu preparatów w postaci suchych proszków, w temperaturze 25°C. Zawartość agregatów oznacza
PL 211 175 B1 się z zastosowaniem permeacji żelowej HPLC na kolumnie Protein Pak 300SW (7,5 x 300mm) (Waters, 80013) w następujący sposób. Kolumnę równoważy się eluentem A (0,2 M siarczanu amoniowego, 5% izopropanolu, pH skorygowane do wartości 2,5 z użyciem kwasu fosforowego i następnie pH skorygowane do wartości 7,0 trietyloaminą), po czym na kolumnę nakłada się 25 μg próbki. Elucję prowadzi się stosując eluent A, przy prędkości przepływu 0,5 ml/min przez 30 minut, a detekcję osiąga się mierząc absorbancję przy 215 nm. Zawartość agregatów oblicza się jako pole pod pikiem dla agregatów czynnika VII/całkowite pole powierzchni pod pikami dla czynnika VII (monomer i agregaty).
„Biodostępność odnosi się do odsetka podanej dawki preparatu czynnika VII lub polipeptydu pokrewnego czynnikowi VII, który można wykryć w osoczu w określonych momentach po podaniu. Typowo, biodostępność mierzy się u zwierząt doświadczalnych podając dawkę preparatu wynoszącą około 25-250 μg/kg, następnie pobiera się próbki osocza w ustalonych momentach po podaniu i określa się w tych próbkach zawartość czynnika VII lub polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII, stosując jeden lub więcej niż jeden test krzepnięcia (lub dowolny inny test biologiczny), test immunologiczny lub ich równoważnik. Dane typowo przedstawia się graficznie w postaci zależności [czynnika VII] od czasu, a biodostępność wyraża się jako pole pod krzywą (AUC). Pojęcie względnej biodostępności preparatu badanego odnosi się do stosunku między AUC preparatu badanego i AUC preparatu referencyjnego.
W niektórych wykonaniach preparaty według niniejszego wynalazku wykazują biodostępność względną wynoszącą co najmniej około 110%, korzystniej co najmniej około 120%, korzystniej co najmniej około 130%, najkorzystniej około 140% biodostępności preparatu referencyjnego. Biodostępność można mierzyć u dowolnego gatunku ssaków, dogodnie u psów, a określone punkty czasowe stosowane do obliczenia AUC mogą obejmować różne odstępy czasu od 10 minut do 8 godzin po podaniu dawki.
„Czas półtrwania odnosi się do czasu niezbędnego do zmniejszenia stężenia polipeptydów czynnika VII lub polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII w osoczu z określonej wartości do połowy tej wartości. Czas półtrwania można oznaczać, stosując te same procedury co w przypadku biodostępności. W niektórych wykonaniach preparaty według niniejszego wynalazku wykazują wydłużenie czasu półtrwania o co najmniej około 0,25 godz., dogodnie co najmniej około 0,5 godz., dogodniej co najmniej około 1 godz., najdogodniej co najmniej około 2 godz. w stosunku do czasu półtrwania preparatu referencyjnego.
„Immunogenność preparatu odnosi się do zdolności preparatu, po podaniu go człowiekowi, do wywołania szkodliwej reakcji immunologicznej, humoralnej, komórkowej lub obu tych rodzajów reakcji. O ile wiadomo, polipeptydy czynnika VIIa i polipeptydy pokrewne czynnikowi VIIa nie wywołują wykrywalnych reakcji immunologicznych u człowieka. Jednakże w każdej subpopulacji ludzkiej mogą zdarzyć się osoby wykazujące wrażliwość na konkretne podawane białka. Immunogenność można mierzyć oznaczając ilościowo obecność przeciwciał skierowanych przeciwko czynnikowi VII i/lub liczbę limfocytów T reagujących na czynnik VII u osoby wrażliwej, konwencjonalnymi sposobami znanymi ze stanu techniki. W niektórych wykonaniach preparaty według wynalazku wykazują zmniejszenie immunogenności u osób wrażliwych, o co najmniej około 10%, dogodnie co najmniej około 25%, dogodniej co najmniej około 40% i najdogodniej co najmniej około 50%, w porównaniu z immunogennością preparatu referencyjnego u tej osoby.
Kompozycje farmaceutyczne
Opisane tu preparaty według niniejszego wynalazku można stosować do leczenia dowolnego zespołu odpowiadającego na czynnik VII, takiego jak na przykład zaburzenia krzepnięcia, włączając w to, bez ograniczenia, zaburzenia spowodowane niedoborami czynników krzepnięcia (na przykład hemofilia A i B lub niedobór czynników krzepnięcia XI lub VII); przez małopłytkowość lub chorobę von Willebranda, lub przez obecność inhibitorów czynników krzepnięcia lub nadmierne krwawienie spowodowane dowolną przyczyną. Preparaty można także podawać pacjentom w związku z zabiegiem chirurgicznym lub innego typu urazem lub pacjentom otrzymującym leki przeciwkrzepliwe.
Preparaty obejmujące opisane tu polipeptydy pokrewne czynnikowi VII o istotnie obniżonej aktywności biologicznej w stosunku do czynnika VII typu dzikiego można stosować jako środki przeciwkrzepliwe, na przykład u pacjentów poddawanych angioplastyce lub innym procedurom chirurgicznym, które mogą zwiększać ryzyko zakrzepicy lub zamknięcia naczyń krwionośnych, do czego dochodzi na przykład w przypadku restenozy. Do innych wskazań, w których stosuje się środki przeciwkrzepliwe należą, bez ograniczenia, zakrzepica żył głębokich, zatorowość płucna, udar mózgu, rozsiane krzepnięcie wewnątrznaczyniowe (DIC), złogi fibryny w płucach i nerkach w przebiegu
PL 211 175 B1 endotoksemii Gram-ujemnej, zawał mięśnia serca, zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), zespół ogólnoustrojowej reakcji zapalnej (SIRS), zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS), MOF i TTP.
Opisane tu kompozycje farmaceutyczne zawierające preparaty czynnika VII i polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII, według niniejszego wynalazku są przeznaczone przede wszystkim do podawania pozajelitowego w postępowaniu profilaktycznym i/lub terapeutycznym. Zalecane kompozycje farmaceutyczne podaje się pozajelitowo, to znaczy dożylnie, podskórnie lub domięśniowo. Można je podawać we wlewie ciągłym lub pulsacyjnym.
Kompozycje lub preparaty farmaceutyczne zawierają opisany tu preparat w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, dogodnie rozpuszczone w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, dogodnie w nośniku lub rozcieńczalniku wodnym. Można stosować rozmaite nośniki wodne, takie jak woda, zbuforowana woda, 0,4% sól fizjologiczna, 0,3% glicyna i tym podobne. Z preparatu według niniejszego wynalazku można także wytwarzać preparaty liposomowe do podawania do miejsc urazu lub ukierunkowywania na miejsce urazu. Preparaty liposomowe opisano ogólnie, na przykład w patentach Stanów Zjednoczonych o numerach 4,837,028, 4,501,728 i 4,975,282. Kompozycje można wyjaławiać konwencjonalnymi znanymi sposobami wyjaławiania. Uzyskane roztwory wodne można pakować do zastosowania lub filtrować w warunkach aseptycznych i następnie liofilizować, przy czym preparat liofilizowany łączy się z jałowym roztworem wodnym przed podaniem.
Kompozycje mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze lub adiuwanty, włączając w to, bez ograniczenia, środki korygujące pH i buforujące oraz środki korygujące toniczność, takie jak na przykład octan sodowy, mleczan sodowy, chlorek sodowy, chlorek potasowy, chlorek wapniowy itd.
Stężenie czynnika VII lub polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII w tych preparatach może być bardzo różne, na przykład może wynosić od poniżej około 0,5% wagowo, zwykle wynosi około 1% lub co najmniej około 1% wagowo, lecz może wynosić aż do 15 lub 20% wagowo; stężenie będzie dobierać się przede wszystkim na podstawie objętości cieczy, lepkości itd., zgodnie z wybranym sposobem podawania.
Tak więc typową kompozycję farmaceutyczną do wlewu dożylnego będzie się wytwarzać tak, aby zawierała 250 ml jałowego roztworu Ringera i 10 mg preparatu. Sposoby wytwarzania kompozycji nadającej się do podawania pozajelitowego będą znane lub oczywiste dla specjalisty i opisano je bardziej szczegółowo, na przykład w Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 18, Mack Publishing Company, Easton, PA, Stany Zjednoczone (1990).
Kompozycje obejmujące preparaty według wynalazku można podawać w postępowaniu profilaktycznym i/lub terapeutycznym. W zastosowaniach terapeutycznych kompozycje podaje się pacjentowi, który już cierpi na chorobę opisaną powyżej, w ilości niezbędnej do wyleczenia, złagodzenia lub częściowego zahamowania choroby i jej powikłań. Ilość odpowiednią do uzyskania tych celów definiuje się jako „ilość terapeutycznie skuteczną. Ilość skuteczna dla każdego celu będzie zależała od nasilenia choroby lub urazu, jak również od masy ciała i ogólnego stanu pacjenta. Ogólnie jednak ilość skuteczna będzie wynosić od około 0,05 mg do około 500 mg preparatu dziennie, dla pacjenta o masie ciała 70 kg, przy czym częściej stosować się będzie dawki wynoszące od około 1,0 mg do około 200 mg preparatu dziennie. Należy rozumieć, że odpowiednie dawkowanie można ustalić stosując rutynowe doświadczenia, konstruując macierz wartości i testując różne punkty macierzy.
Preparat według niniejszego wynalazku można, na przykład, podawać miejscowo, na przykład miejscowo zewnętrznie, stosując na przykład aerozol, perfuzję, cewniki z podwójnymi balonikami, stenty, włączanie preparatów w skład przeszczepów lub stentów naczyniowych, hydrożele stosowane do powlekania cewników balonikowych lub innymi znanymi sposobami. W każdym razie kompozycje farmaceutyczne powinny dostarczać preparat w ilości niezbędnej do skutecznego leczenia pacjenta.
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą ponadto zawierać inne czynniki biologicznie czynne, takie jak na przykład niepokrewne czynnikowi VII środki sprzyjające krzepnięciu lub przeciwkrzepliwe.
Preparaty o przedłużonym uwalnianiu
Przykładami preparatów o przedłużonym uwalnianiu są półprzepuszczalne matryce ze stałych polimerów hydrofobowych, zawierające polipeptyd lub koniugat, przy czym macierze te mają odpowiednią formę, na przykład warstwy lub mikrokapsułek. Przykładami macierzy o przedłużonym uwalnianiu są poliestry, hydrożele (na przykład poli(2-hydroksyetylometakrylan) lub poli(winyloalkohol)), polilaktydy, kopolimery kwasu L-glutaminowego i L-glutaminianu etylu, nie ulegający rozpadowi octan etylenowinylowy, ulegające rozpadowi kopolimery kwasu mlekowego i kwasu glikolowego, takie jak
PL 211 175 B1
Prolease® lub Lupron Depot® (mikrosfery do wstrzyknięć, utworzone z kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego i octanu leuprolidu) oraz kwas poli-D-(-)-3-hydroksymasłowy. Podczas gdy polimery, takie jak octan etylenowinylowy i kwas mlekowy-kwas glikolowy, umożliwiają długotrwałe uwalnianie cząsteczek, na przykład do ponad 100 dni, niektóre hydrożele uwalniają białka przez krótszy czas. Po zamknięciu do kapsułek polipeptydy pozostają w organizmie przez długi czas; mogą one ulegać denaturacji lub agregacji w wyniku narażenia na działanie wilgoci w temperaturze 37°C, co prowadzi do zmiany aktywności biologicznej i możliwych zmian immunogenności. Należy opracować racjonalne strategie stabilizacji w zależności od konkretnego mechanizmu. Na przykład jeżeli stwierdza się, że mechanizm agregacji polega na tworzeniu wiązań S-S między cząsteczkami przez wymianę tiodisiarczkową, to stabilizację można uzyskać przez modyfikację reszt sulfhydrylowych, liofilizację z roztworów kwasowych, kontrolowanie zawartoś ci wilgoci za pomocą odpowiednich środków dodatkowych i opracowanie specyficznych kompozycji macierzy polimerowych.
Poniższe nieograniczające przykłady ilustrują pewne aspekty wynalazku.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1
Glikopegylacja produktu o dużej zawartości kwasu sialowego
Glikol polietylenowy-CMP-kwas sialowy (PEG-CMPSA) wytwarza się poprzez kowalencyjne połączenie PEG o masie cząsteczkowej 10000Da z kwasem sialowym.
Czynnik VIIa o zawartości kwasu sialowego wynoszącej 87-99% poddaje się obróbce sialidazą, na przykład w sposób opisany w patencie Stanów Zjednoczonych numer 5,272,066, i ponownie poddaje się sialilacji sialilotransferazą, stosując jako cząsteczkę donorową PEG-CMPSA (na przykład sposób opisany w patencie Stanów Zjednoczonych numer 6,399,336). Kiedy reakcja pegylacji osiągnie maksymalne włączanie, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się CMPSA w celu przyłączenia czapeczki na każdej eksponowanej końcowej reszcie galaktozy.
Włączanie pegylowanego kwasu sialowego analizuje się za pomocą SDS-PAGE, CE-PAGE, żeli do ogniskowania izoelektrycznego i CE-IEF.
Włączeniu ulega 94-100% kwasu sialowego, średnio włączanych jest 1-4 grup PEG.
P r z y k ł a d 2
Glikopegylacja produktu o średniej zawartości kwasu sialowego
Glikol polietylenowy-CMP-kwas sialowy (PEG-CMPSA) wytwarza się poprzez kowalencyjne połączenie PEG o masie cząsteczkowej 10000Da z kwasem sialowym.
Czynnik VIIa o zawartości kwasu sialowego wynoszącej 87-93% poddaje się obróbce sialilotransferazą, stosując jako PEG-CMPSA jako cząsteczkę donorową (na przykład w sposób opisany w patencie Stanów Zjednoczonych numer 6,399,336). Kiedy reakcja pegylacji osią gnie maksymalne włączanie, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się CMPSA w celu przyłączenia czapeczki na każdej eksponowanej końcowej reszcie galaktozy.
Włączanie pegylowanego kwasu sialowego analizuje się za pomocą SDS-PAGE, CE-PAGE, żeli do ogniskowania izoelektrycznego i CE-IEF.
Włączeniu ulega 87-100% kwasu sialowego, średnio włączanych jest 0,1-0,5 grup PEG.
P r z y k ł a d 3
Pegylowaną cytydyno-5'-monofosforową pochodną kwasu sialowego (CMP-SA-PEG): ester metylowy kwasu N-acetylo-O2-metylo-9-amino-9-deoksyneuraminowego (10 mg, 0,031 mmola, wytworzony zgodnie z metodą opisaną przez Isecke, R., Brossmer, R., Tetrahedron 1994, 50(25), 74457460) rozpuszcza się w wodzie (2 ml) i dodaje się mPEG-SBA (170 mg, 0,03 mmola, 5 kDa, Shearwater 2M450H01)). Mieszaninę miesza się w temperaturze otoczenia aż do zakończenia według TLC. Rozpuszczalnik usuwa się przez liofilizację, a pozostałość ponownie rozpuszcza się w mieszaninie metanolu i roztworu 0,1 M NaOH w stosunku 1:1 (5 ml). Mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej przez 1h i następnie przepuszcza przez kolumnę z żywicą Dowex 50W-X8 (H+) w temperaturze 4°C i liofilizuje. Pozostałość następnie ponownie rozpuszcza się w wodzie (5 ml), dodaje się żywicę Dowex 50W-X8 (H+) i mieszaninę miesza się do zakończenia przez TLC.
Analogi cytydyno-5'monofosforanowe pochodnych kwasu sialowego o ogólnym wzorze I sporządza się ogólnie sposobem opisanym przez E.S. Simon, M.D. Bednarski i G.M. Whitesides, J. Am. Chem. Soc, 1998, 110, 7159,7163 w następujący sposób: syntetazę kwasu cytydyno-5'-monofosfoneuraminowego rozpuszcza się w roztworze 9-pegylowanego kwasu N-acetylo-9-amino-9-deoksyneuraminowego (wytworzonego w sposób opisany powyżej) i dodaje do roztworu CTP. pH mieszaniny doprowadza się do wartości 8,5 i dodaje się MgCl2 • 6H2O. Reakcję miesza się w temperaturze poko40
PL 211 175 B1 jowej i dodaje się 1N NaOH pompą perystaltyczną w celu utrzymania pH w pobliżu wartości 8,5. Gdy 1H-NMR próbki wykazuje zakończenie reakcji produkt izoluje się z użyciem standardowej chromatografii jonowymiennej.
P r z y k ł a d 4
FVIIa (1 mg) rozpuszczony w 1 ml 0,01 M octanu sodowego, pH 5,5, utlenia się na poziomie jego glikanów w temperaturze pokojowej przez 30 minut z dodatkiem 10 mM nadjodanu sodowego. Następnie roztwór poddaje się dializie wobec 100 mM octanu sodowego, pH 5,5. Po dializie z utlenionym FVIIa miesza się PEG-C(O)-NHNH2 (wytworzony przez hydrazynolizę mPEG-SBA (2 mg, 5 kDa, Shearwater 2M450H01)) i pozostawia się całość do reakcji przez noc w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Tak wytworzony roztwór koniugatu FVIIa-PEG poddaje się dializie (błony dializacyjne o odcięciu 10 kDa) wobec 100 mM buforu Tris-HCl, pH 7,5 i przechowuje w temperaturze 4°C.
Metody farmakologiczne
Poniższe testy są użyteczne do ustalenia aktywności biologicznej, czasu półtrwania i biodostępności czynnika VII i polipeptydów pokrewnych czynnikowi VII.
Test (I)
Test hydrolizy in vitro
Poniższy sposób można stosować do badania aktywności biologicznej czynnika Vlla. Test prowadzi się na płytce do mikromiareczkowania (MaxiSorp, Nunc, Dania). Do czynnika Vlla (ostateczne stężenie 100 mM) w 50 mM Hepes, pH 7,4, zawierającego 0,1 M NaCl, 5 mM CaCl2 i 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, dodaje się substrat chromogenny D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilid (S-2288, Chromogenix, Szwecja), w ostatecznym stężeniu 1 mM. Absorbancję mierzy się w sposób ciągły przy 405 nm na czytniku płytek SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, Stany Zjednoczone). Absorbancję rozwiniętą w czasie 20 minut inkubacji po odjęciu absorbancji pustej studzienki nie zawierającej enzymu, wykorzystuje się do obliczenia stosunku aktywności badanego czynnika VIIa do referencyjnego czynnika VIIa.
Test (II)
Test proteolizy in vitro
Poniższy sposób można wykorzystać do badania aktywności biologicznej czynnika VIIa. Test ten prowadzi się na płytce do mikromiareczkowania (MaxiSorp, Nunc, Dania). Czynnik VIIa (10 nM) i czynnik X (0,8 microM) w 100 μl 50 mM Hepes, pH 7,4, zawierającym 0,1 M NaCl, 5 mM CaCl2 i 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej inkubuje się przez 15 minut. Następnie hamuje się cięcie czynnika X przez dodanie 50 μl 50 mM Hepes, pH 7,4, zawierającego 0,1 M NaCl, 20 mM EDTA i 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej. Ilość wytworzonego czynnika Xa mierzy się dodając substrat chromogenny Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilid (S-2765, Chromogenix, Szwecja), stężenie końcowe 0,5 mM. Absorbancję przy 405 nm mierzy się w sposób ciągły w czytniku płytek SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, Stany Zjednoczone). Absorbancję rozwiniętą w ciągu 10 minut po odjęciu absorbancji pustej studzienki nie zawierającej FVIIa stosuje się do obliczenia stosunku aktywności proteolitycznej badanego czynnika VIIa i referencyjnego czynnika VIIa.
Test (III)
Oznaczenie czynnościowego czasu półtrwania in vivo
Oznaczenia biologicznego czasu półtrwania in vivo można dokonać na wiele sposobów, opisanych w piśmiennictwie. Przykład testu pozwalającego zmierzyć czas półtrwania in vivo rFVIIa i jego odmian opisano w publikacji FDA o numerze referencyjnym 96-0597. Pokrótce, aktywność sprzyjającą krzepnięciu FVIIa mierzy się w osoczu pobranym przed oraz podczas 24-godzinnego okresu po podaniu koniugatu, polipeptydu lub kompozycji. Mierzy się medianę pozornej objętości dystrybucji w stanie równowagi dynamicznej i ustala się medianę klirensu.
Test (IV)
Biodostępność polipeptydów czynnika VII
Biodostępność można, na przykład, mierzyć w modelu psim w sposób następujący. Doświadczenia przeprowadzono jako badanie z czterema grupami, z zamianą grup, na 12 psach rasy Beagle. Wszystkie zwierzęta otrzymywały preparat badany A i preparat referencyjny B w dawce około 90 μg/kg w buforze glicyloglicynowym (pH 5,5), zawierającym chlorek sodu (2,92 mg/ml), dwuwodzian chlorku wapnia (1,47 mg/ml), mannitol (30 mg/ml) i polisorbat 80. Próbki krwi pobierano po 10, 30 i 60 minutach oraz po 2, 3, 4, 6 i 8 godzinach od pierwszego podania. Z próbek uzyskiwano osocze i oznaczano ilościowo czynnik VII metodą ELISA.
PL 211 175 B1
Biodostępność poszczególnych próbek wyrażano jako skorygowane ze względu na dawkę pole pod krzywą stężenia dla czynnika VII (AUC/dawka). Biodostępność względną wyrażano jako stosunek między średnim AUC/dawkę preparatu badanego i preparatu referencyjnego x 100 i obliczano 90% granice ufności dla biodostępności względnej.

Claims (14)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Koniugat polipeptydu czynnika VII, znamienny tym, ż e zawiera polipeptyd czynnika VII zawierający połączone z asparaginą i/lub połączone z seryną łańcuchy oligosacharydowe zawierające ugrupowanie kwasu sialowego albo galaktozy, przy czym co najmniej jeden z łańcuchów oligosacharydowych jest kowalencyjnie połączony z co najmniej jedną grupą polimerową, którą stanowi glikol polietylenowy o masie cząsteczkowej w zakresie 300-100,000 Da.
  2. 2. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że grupa polimerowa jest połączona z ugrupowaniem kwasu sialowego.
  3. 3. Koniugat wedł ug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ż e pomię dzy 94-100% ł a ń cuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedno ugrupowanie kwasu sialowego.
  4. 4. Koniugat według zastrz. 3, znamienny tym, że pomiędzy 94-100% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedno ugrupowanie kwasu sialowego, przy czym mniej niż 25% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną antenę niezakończoną czapeczką.
  5. 5. Koniugat według zastrz. 4, znamienny tym, ż e mniej niż 10% ł a ń cuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną antenę niezakończoną czapeczką.
  6. 6. Koniugat według zastrz. 5, znamienny tym, ż e mniej niż 5%, korzystnie mniej niż 2% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedną antenę niezakończoną czapeczką.
  7. 7. Koniugat według jednego z zastrz. 4-6, znamienny tym, ż e pomię dzy 96-100% ł a ń cuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedno ugrupowanie kwasu sialowego.
  8. 8. Koniugat według zastrz. 7, znamienny tym, że pomiędzy 98-100% łańcuchów oligosacharydowych zawiera co najmniej jedno ugrupowanie kwasu sialowego.
  9. 9. Koniugat według jednego z zastrz. 1-8, znamienny tym, że łań cuchy oligosacharydowe połączone z asparaginą znajdują się w pozycjach odpowiadających resztom aminokwasowym Asn-145 i Asn-322 ludzkiego czynnika VIIa (FVIIa) typu dzikiego.
  10. 10. Koniugat według jednego z zastrz. 1-9, znamienny tym, że łańcuchy oligosacharydowe połączone z seryną znajdują się w pozycjach odpowiadających resztom aminokwasowym Ser-52 i Ser-60 ludzkiego FVIIa typu dzikiego.
  11. 11. Koniugat według jednego z zastrz. 1-10, znamienny tym, że polipeptyd ma sekwencję aminokwasową ludzkiego czynnika VII typu dzikiego.
  12. 12. Koniugat według jednego z zastrz. 1-11, znamienny tym, że polipeptyd stanowi pochodzący z osocza ludzki czynnik VIIa.
  13. 13. Koniugat według jednego z zastrz. 1-12, znamienny tym, że polipeptydy czynnika VII wybrane są z grupy składającej się z czynnika VII-S52A, czynnika VII-S60A, czynnika VII poddanego cięciu proteolitycznemu między resztami 290 a 291, czynnika VII poddanego cięciu proteolitycznemu między resztami 315 a 316, utlenionego czynnika VII, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, VI58D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, S336G-FVII, wariantów sekwencji czynnika VII, w których zastąpiono resztę aminokwasową w pozycjach 290 i/lub 291, korzystnie 290, i wariantów sekwencji czynnika VII, w których zastąpiono resztę aminokwasową w pozycjach 315 i/lub 316, korzystnie 315.
  14. 14. Koniugat według jednego z zastrz. 1-13, znamienny tym, że polipeptydy czynnika VII wybrane są z grupy składającej się z:
PL374318A 2002-06-21 2003-06-20 Koniugat polipeptydu czynnika VII, sposób wytwarzania takiego koniugatu, zawierający taki koniugat preparat farmaceutyczny oraz zastosowanie takiego koniugatu PL211175B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200200964 2002-06-21
US39477802P 2002-07-01 2002-07-01

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL374318A1 PL374318A1 (pl) 2005-10-17
PL211175B1 true PL211175B1 (pl) 2012-04-30

Family

ID=44256861

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL374318A PL211175B1 (pl) 2002-06-21 2003-06-20 Koniugat polipeptydu czynnika VII, sposób wytwarzania takiego koniugatu, zawierający taki koniugat preparat farmaceutyczny oraz zastosowanie takiego koniugatu

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP1517710B1 (pl)
JP (1) JP4634145B2 (pl)
KR (1) KR101186140B1 (pl)
CN (2) CN1671420A (pl)
AT (1) ATE503498T1 (pl)
AU (1) AU2003240439B2 (pl)
BR (1) BR0311978A (pl)
CA (1) CA2490360A1 (pl)
DK (1) DK1517710T3 (pl)
ES (1) ES2363205T3 (pl)
PL (1) PL211175B1 (pl)
PT (1) PT1517710E (pl)
RU (1) RU2362807C2 (pl)
UA (1) UA86744C2 (pl)
WO (1) WO2004000366A1 (pl)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7786070B2 (en) 1997-09-10 2010-08-31 Novo Nordisk Healthcare A/G Subcutaneous administration of coagulation factor VII
ES2411007T3 (es) * 2001-10-10 2013-07-04 Novo Nordisk A/S Remodelación y glicoconjugación de péptidos
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
NZ542094A (en) 2003-03-14 2008-12-24 Neose Technologies Inc Branched polymer conjugates comprising a peptide and water-soluble polymer chains
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
PL1615945T3 (pl) 2003-04-09 2012-03-30 Ratiopharm Gmbh Sposoby glikopegylacji i białka/peptydy wytwarzane tymi sposobami
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
NZ548123A (en) 2004-01-08 2010-05-28 Novo Nordisk As O-linked glycosylation of peptides
ES2642214T3 (es) * 2004-01-21 2017-11-15 Novo Nordisk Health Care Ag Conjugación de péptidos mediante transglutaminasa
KR20070008645A (ko) 2004-05-04 2007-01-17 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 폴리펩티드의 ｏ-연결된 단백당형 및 그들의 제조 방법
EP1761630A2 (en) * 2004-06-21 2007-03-14 Novo Nordisk Health Care AG Glycosylation-disrupted factor vii variants
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
WO2006031811A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
EP1797192A1 (en) * 2004-09-29 2007-06-20 Novo Nordisk Health Care AG Modified proteins
WO2006050247A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
JP2008526864A (ja) * 2005-01-06 2008-07-24 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 糖断片を用いる糖結合
US9029331B2 (en) 2005-01-10 2015-05-12 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
WO2006121569A2 (en) 2005-04-08 2006-11-16 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
EP2975135A1 (en) 2005-05-25 2016-01-20 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US8293708B2 (en) 2005-08-30 2012-10-23 Novo Nordisk Health Care A/G Liquid formulations N-terminal serine of pegylated growth hormone
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
JP5280001B2 (ja) * 2005-12-08 2013-09-04 株式会社カネカ 外来性遺伝子由来のタンパク質がＧｌａ残基を含むトランスジェニック鳥類及びその作製法
WO2007066775A1 (ja) * 2005-12-08 2007-06-14 Kaneka Corporation 外来性遺伝子由来のタンパク質がＧｌａ残基を含むトランスジェニック鳥類及びその作製法
MX2008014520A (es) * 2006-05-22 2008-11-27 Elan Pharm Inc Preparacion de conjugados polimericos de compuestos terapeuticos, agricolas, y de aditivos para alimentos.
BRPI0713963A2 (pt) 2006-07-07 2012-11-27 Novo Nordisk Healthcare Ag conjugados de proteìna e métodos para sua preparação
EP2049144B8 (en) 2006-07-21 2015-02-18 ratiopharm GmbH Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
FR2904558B1 (fr) * 2006-08-01 2008-10-17 Lab Francais Du Fractionnement "composition de facteur vii recombinant ou transgenique, presentant majoritairement des formes glycanniques biantennees, bisialylees et non fucosylees"
CN101535339B (zh) * 2006-09-01 2014-11-12 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 改性糖蛋白
WO2008025856A2 (en) * 2006-09-01 2008-03-06 Novo Nordisk Health Care Ag Modified glycoproteins
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As PROCESS FOR CLEANING POLYPEPTIDE CONJUGATES
ES2655734T3 (es) * 2006-10-04 2018-02-21 Novo Nordisk A/S Glicopéptidos y azúcares pegilados unidos a glicerol
PT2101821E (pt) * 2006-12-15 2014-10-03 Baxter Int Fator conjugado viia-ácido (poli)siálico com prolongamento do tempo de meia vida in vivo
US20100143326A1 (en) * 2007-01-03 2010-06-10 Novo Nordisk Healthcare A/G SUBCUTANEOUS ADMINISTRATION OF COAGULATION FACTOR VIIa-RELATED POLYPEPTIDES
HRP20130382T1 (hr) 2007-04-03 2013-05-31 Biogenerix Ag Postupci lijeäśenja pomoä†u glikopegiliranog g-csf
CN104887620A (zh) 2007-05-02 2015-09-09 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 包括芳香族防腐剂和抗氧化剂的高浓度因子vii多肽制剂
CA2690611C (en) 2007-06-12 2015-12-08 Novo Nordisk A/S Improved process for the production of nucleotide sugars
EP2014299A1 (en) * 2007-07-11 2009-01-14 Novo Nordisk A/S Subcutaneous administration of coagulation factor VII
US8207112B2 (en) 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
US11197916B2 (en) 2007-12-28 2021-12-14 Takeda Pharmaceutical Company Limited Lyophilized recombinant VWF formulations
SG187410A1 (en) 2007-12-28 2013-02-28 Baxter Int Recombinant vwf formulations
PL2257311T3 (pl) 2008-02-27 2014-09-30 Novo Nordisk As Koniugaty cząsteczek czynnika VIII
TWI465247B (zh) 2008-04-11 2014-12-21 Catalyst Biosciences Inc 經修飾的因子ｖｉｉ多肽和其用途
WO2009141418A1 (en) * 2008-05-23 2009-11-26 Novo Nordisk A/S Formulations of peg-functionalised serine proteases with high concentrations of an aromatic preservative
US20100099616A1 (en) * 2008-10-17 2010-04-22 Baxter International Inc. Modified blood factors comprising a low degree of water soluble polymer
EP2349314B1 (en) 2008-10-21 2013-02-27 Baxter International Inc. Lyophilized recombinant vwf formulations
US9241896B2 (en) 2008-12-19 2016-01-26 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Methods and formulations for treating sialic acid deficiencies
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
EP3093029A1 (en) 2009-07-27 2016-11-16 Baxalta GmbH Blood coagulation protein conjugates
ES2597954T3 (es) 2009-07-27 2017-01-24 Baxalta GmbH Conjugados de proteína de la coagulación sanguínea
JP5909755B2 (ja) 2009-07-27 2016-04-27 リポクセン テクノロジーズ リミテッド 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化
CN102812039B (zh) 2010-02-16 2016-01-20 诺沃—诺迪斯克有限公司 缀合蛋白质
GB201007356D0 (en) * 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
KR20140003380A (ko) * 2010-07-13 2014-01-09 울트라제닉스 파마수티컬 인코포레이티드 시알산 결함 치료용 방법들 및 제형들
EP2957628A1 (en) 2010-10-05 2015-12-23 Novo Nordisk Health Care AG Process for protein production
BR112013015898A2 (pt) 2010-12-22 2018-06-26 Baxter International Inc. derivado de ácido graxo solúvel em água, e, métodos para preparar um derivado de ácido graxo e uma proteína terapêutica conjugada.
HK1201067A1 (en) 2011-10-24 2015-08-21 罕见病药物研发公司 Sialic acid analogs
MY190257A (en) 2012-04-16 2022-04-11 Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd Optimised subcutaneous therapeutic agents
US10385085B2 (en) 2015-09-14 2019-08-20 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Crystal forms of sialic acid or salt or solvate thereof
EP3833381B1 (en) 2019-08-15 2022-08-03 Catalyst Biosciences, Inc. Modified factor vii polypeptides for subcutaneous administration

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4456591A (en) 1981-06-25 1984-06-26 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Therapeutic method for activating factor VII
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8430252D0 (en) 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
JP2524586B2 (ja) 1985-06-26 1996-08-14 シタス コーポレイション ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
US4975282A (en) 1985-06-26 1990-12-04 The Liposome Company, Inc. Multilamellar liposomes having improved trapping efficiencies
US5272066A (en) 1986-03-07 1993-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic method for enhancing glycoprotein stability
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
WO1990006952A1 (fr) 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Facteur de stimulation de colonies de granulocytes modifies chimiquement
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
ES2136595T5 (es) 1989-04-19 2004-04-01 Enzon, Inc. Carbonatos activos de oxidos de polialquileno para la modificacion de polipeptidos.
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
DK0400472T3 (da) 1989-05-27 1996-05-13 Sumitomo Pharma Fremgangsmåde til fremstilling af polyethylenglycolderivater og modificeret protein
US5580560A (en) 1989-11-13 1996-12-03 Novo Nordisk A/S Modified factor VII/VIIa
US5219564A (en) 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
EP0513332A4 (en) 1990-11-14 1993-03-17 Cargill, Incorporated Conjugates of poly(vinylsaccharide) with proteins for the stabilization of proteins
US5997864A (en) 1995-06-07 1999-12-07 Novo Nordisk A/S Modified factor VII
JPH06506217A (ja) 1991-03-18 1994-07-14 エンゾン，インコーポレーテッド ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5212075A (en) 1991-04-15 1993-05-18 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for introducing effectors to pathogens and cells
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
AU5006993A (en) 1992-08-21 1994-03-15 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5298643A (en) 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
US5349001A (en) 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
IL104734A0 (en) 1993-02-15 1993-06-10 Univ Bar Ilan Bioactive conjugates of cellulose with amino compounds
US5374541A (en) 1993-05-04 1994-12-20 The Scripps Research Institute Combined use of β-galactosidase and sialyltransferase coupled with in situ regeneration of CMP-sialic acid for one pot synthesis of oligosaccharides
WO1994028024A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
AU7113594A (en) 1993-06-21 1995-01-17 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
ATE214940T1 (de) 1993-11-10 2002-04-15 Enzon Inc Verbesserte interferon-polymerkonjugate
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5473034A (en) 1994-03-18 1995-12-05 Hyogo Prefectural Government Method for producing protein-synthetic polymer conjugate and said conjugate produced thereby
US5629384A (en) 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
AU2826495A (en) 1994-06-02 1996-01-04 Enzon, Inc. Method of solubilizing substantially water insoluble materials
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
CA2204726A1 (en) 1994-11-09 1996-12-27 Robin E. Offord Functionalized polymers for site-specific attachment
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
WO1996040791A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
EP0964702B1 (en) 1996-08-02 2006-10-04 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Polypeptides having a single covalently bound n-terminal water-soluble polymer
JP2001507215A (ja) 1997-01-16 2001-06-05 サイテル コーポレイション 組換え糖タンパク質のインビトロでの実用的なシアリル化
WO1998032466A1 (en) 1997-01-29 1998-07-30 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylation process
EP0979102A4 (en) 1997-04-30 2005-11-23 Enzon Inc DETAILED POLYPEPTIDE MODIFIED BY POLYALKYLENE OXIDE
JP4011124B2 (ja) 1997-06-06 2007-11-21 協和醗酵工業株式会社 化学修飾ポリペプチド
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
CA2739933A1 (en) * 2000-02-11 2001-08-16 Bayer Healthcare Llc Factor vii or viia-like molecules
JP4455802B2 (ja) 2000-05-03 2010-04-21 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト ヒト第ｖｉｉ凝固因子変異型
US6423826B1 (en) * 2000-06-30 2002-07-23 Regents Of The University Of Minnesota High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides
WO2002022776A2 (en) 2000-09-13 2002-03-21 Novo Nordisk A/S Human coagulation factor vii variants
BR0114373A (pt) * 2000-10-02 2004-02-17 Novo Nordisk As Célula hospedeira eucariótica, métodos para a produção de fvii e de fviia ou de suas variantes, de uma proteìna dependente de vitamina k e de uma célula hospedeira eucariótica produtora de fvii ou de seu análogo, vetor recombinante, fvii e fviia recombinante ou suas variantes, e, proteìna dependente de vitamina k recombinante
CZ20032454A3 (en) 2001-03-22 2004-03-17 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor vii derivative
CZ2004427A3 (cs) 2001-09-27 2004-08-18 Novoánordiskáhealthácareáag Polypeptidy lidského koagulačního faktoru VII
JP2005512524A (ja) 2001-11-02 2005-05-12 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト ヒト凝固第ｖｉｉ因子ポリペプチド

Also Published As

Publication number Publication date
CA2490360A1 (en) 2003-12-31
JP4634145B2 (ja) 2011-02-16
AU2003240439A1 (en) 2004-01-06
BR0311978A (pt) 2005-03-22
EP1517710B1 (en) 2011-03-30
AU2003240439B2 (en) 2009-05-21
CN101301475A (zh) 2008-11-12
KR101186140B1 (ko) 2012-09-27
CN1671420A (zh) 2005-09-21
ES2363205T3 (es) 2011-07-26
RU2362807C2 (ru) 2009-07-27
PL374318A1 (pl) 2005-10-17
WO2004000366A1 (en) 2003-12-31
PT1517710E (pt) 2011-07-08
DK1517710T3 (da) 2011-07-18
CN101301475B (zh) 2012-12-19
JP2006513142A (ja) 2006-04-20
RU2005101348A (ru) 2005-08-27
KR20050016612A (ko) 2005-02-21
EP1517710A1 (en) 2005-03-30
UA86744C2 (en) 2009-05-25
ATE503498T1 (de) 2011-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1517710B1 (en) Pegylated factor vii glycoforms
US8053410B2 (en) Pegylated factor VII glycoforms
US9023992B2 (en) Hydrophobic interaction chromatography purification of factor VII polypeptides
KR100861470B1 (ko) 인자 ⅶ 글리코형
US20100028939A1 (en) Use of Galactose Oxidase for Selective Chemical Conjugation of Protractor Molecules to Proteins of Therapeutic Interest
US20070037966A1 (en) Hydrophobic interaction chromatography purification of factor VII polypeptides
ES2338425T3 (es) Variantes de dominio de gla del factor vii o viia.
US20080108557A1 (en) Modified Proteins
JP5836910B2 (ja) 陰イオン交換物質からの分画溶出によるｖｉｉ因子ポリペプチドのバルクの精製
US10179905B2 (en) Factor VII conjugates
US20150225711A1 (en) Factor VII Conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20130620