PL213066B1 - Nowy szczep bakterii Salmonella enterica s. Typhimurium, jego zastosowanie i sposób otrzymywania terapeutycznego wektora szczepionkowego - Google Patents
Nowy szczep bakterii Salmonella enterica s. Typhimurium, jego zastosowanie i sposób otrzymywania terapeutycznego wektora szczepionkowegoInfo
- Publication number
- PL213066B1 PL213066B1 PL387319A PL38731909A PL213066B1 PL 213066 B1 PL213066 B1 PL 213066B1 PL 387319 A PL387319 A PL 387319A PL 38731909 A PL38731909 A PL 38731909A PL 213066 B1 PL213066 B1 PL 213066B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sipb
- strain
- psifb
- vnp20009
- gene
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title description 42
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 title description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 22
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims abstract description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims abstract description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 101150050853 sipB gene Proteins 0.000 claims description 47
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 24
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 11
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 37
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 48
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 101150047507 ushA gene Proteins 0.000 description 27
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 241000405383 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2 Species 0.000 description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 7
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 7
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 7
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 7
- 101150031645 sifB gene Proteins 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 6
- 241000607149 Salmonella sp. Species 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 102100022019 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Human genes 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 101150007310 htrA gene Proteins 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 2
- 101100216993 Bacillus subtilis (strain 168) aroD gene Proteins 0.000 description 2
- 235000018793 Cymbopogon martinii Nutrition 0.000 description 2
- 244000166652 Cymbopogon martinii Species 0.000 description 2
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 2
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101710190786 PI protein Proteins 0.000 description 2
- 101150038013 PIR gene Proteins 0.000 description 2
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 2
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 2
- 101100533514 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) sifB gene Proteins 0.000 description 2
- 101710142113 Serine protease inhibitor A3K Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150042732 aroC gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 101150018266 degP gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 2
- 101150002054 galE gene Proteins 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 101150076849 rpoS gene Proteins 0.000 description 2
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 101150101623 surA gene Proteins 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 101150045267 CEA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100135641 Caenorhabditis elegans par-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004099 Chlortetracycline Substances 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 101100439026 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) cdh gene Proteins 0.000 description 1
- 101100155814 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) ushA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 101100021843 Shigella flexneri lpxM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100021844 Shigella flexneri lpxM2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 108010028173 UDPglucose hydrolase Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150102858 aroD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150040872 aroE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150108612 aroQ gene Proteins 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008952 bacterial invasion Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N chlorotetracycline Natural products C1=CC(Cl)=C2C(O)(C)C3CC4C(N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)C4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004475 chlortetracycline Drugs 0.000 description 1
- CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N chlortetracycline Chemical compound C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N 0.000 description 1
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000007440 host cell apoptosis Effects 0.000 description 1
- 101150043028 ilvD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150105723 ilvD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 101150060640 lpxM gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101150093826 par1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical compound OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0275—Salmonella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Oncology (AREA)
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy dziedziny farmacji, szczególnie przygotowywania szczepionek, zwłaszcza przeciwrakowych bakteryjnych szczepionek terapeutycznych.
Bakterie należące do rodzaju Salmonella są Gram-ujemnymi bakteriami z rodziny Enterobacteriaceae, wywołując choroby ludzi i zwierząt stanowią one poważny problem medyczny i weterynaryjny.
Szczepienia przy użyciu żywych, osłabionych szczepów Salmonella są skutecznym sposobem zapobiegania zakażeniom. Poprzez wprowadzenie określonych nieodwracalnych mutacji do specyficznych genów w chromosomie Salmonella, takich jak: aroA (1), aroC (2), surA (3), htrA (4), rpoS (5), czy galE (6) uzyskano osłabione szczepy Salmonella.
Obecnie stosowane metody atenuacji szczepów Salmonella w kierunku uzyskania materiału szczepionkowego polegają na uzyskaniu genetycznie stabilnych deIecji, które obniżają lub eliminują wirulencję bakterii, a jednocześnie nie zmieniają lub potęgują ich immunogenność.
Poprzez atenuację dzikiego szczepu Salmonella typhi stworzony został szczep Ty21a stosowany w szczepieniu przeciwko durowa brzusznemu. Atenuacja tego szczepu została osiągnięta poprzez liczne mutacje indukowane mutagenami chemicznymi. Doprowadziło to do powstania szczepu, który jest wrażliwy na galaktozę (mutacja w genie galE), auksotroficzny w stosunku do izoleucyny i waliny (mutacje w genach ilvD), ma zmniejszoną oporność na stres (mutacja w rpoS), jest także niezdolny do produkcji polisacharydu Vi. Wielość mutacji sprawia, że jest to szczep stabilny genetycznie oraz bezpieczny - mutacje powrotne w obrębie genów wirulencji nie zostały zaobserwowane ani in vitro ani in vivo (7, 8).
Szczep CVD908 posiada ściśle zdefiniowane mutacje w genach aroC i aroD, jednak wywołuje gorączkę i inne niepożądane reakcje u ochotników szczepionych wysokimi dawkami. Dalsza atenuacja tego szczepu poprzez delecję genu htrA, który koduje proteazę serynową, niezbędną dla przetrwania bakterii w makrofagach, doprowadziła do powstania szczepu CVD908-htrA, który jest dobrze tolerowany nawet w wysokich dawkach, a także wykazuje wysoką immunogenność (9).
Mutanty Salmonella enterica serotyp Typhimurium, które nie posiadają regulatora transkrypcyjnego RfaH, gdy użyte do szczepień, skutecznie zapobiegają salmonellozie u myszy. Brak RfaH wpływa na ekspresję genów zaangażowanych w syntezę rdzenia lipopolisacharydu i O-antygenu. Takie mutanty nie różnią się w zdolności do namnażania, lecz wykazują zwiększoną podatność na peptydy antybakteryjne (10).
Ze względu na specyfikę szczepionek prewencyjnych, polegającą na uzyskaniu pamięci immunologicznej po podaniu szczepionki prewencyjnej, ich działanie może być oparte o zdolność atenuowanych bakterii do stymulacji odpowiedzi humoralnej (produkcji przeciwciał neutralizujących). Generacja efektywnej odpowiedzi humoralnej nie wymaga zdolności do inwazji komórek gospodarza przez szczepionkową Samonella sp. Oznacza to, że nawet relatywnie obszerne delecje w obrębie chromosomu Salmonella sp. mogą być tolerowane w materiale szczepionkowym przygotowanym na użytek szczepionki prewencyjnej. Relatywna łatwość atenuacji jednak nie zawsze łączy się z zachowaniem oryginalnej (efektywnej) immunogenności.
Terapeutyczny wektor szczepionkowy powinien być wysoce atenuowany i możliwie słabo immunogenny zapewniając efektywność przy wielokrotnym podaniu do organizmu. W przypadku zastosowania skoniugowanych antygenów (epitopów) heterogennych (allo- lub ksenogenicznych), wektor powinien wykazywać zdolności adjuwancyjne (przy zachowaniu słabej immunogenności własnej). Wektor terapeutyczny powinien mieć zdolność ukierunkowanej stymulacji odpowiedzi immunologicznej, tzn. w zależności od potrzeb, indukować odpowiedź humoralną (Th2) lub komórkową (Th1).
Szczep VNP20009 został opisany w publikacji Xiang Luo et al.: „Antitumor effect of VNP20009, an attenuated Salmonella, in murine tumor models”, Onclology Research 2001, vol. 12, no. 11-12, 2001, strony 501-508. W publikacji „Construction of VNP20009 A Novel, Genetically Stable Antibiotic-Sensitive Strain of Tumor-Targeting Salmonella for Parenteral Administration in Humans” Kenneth Brooks Low, Martina Ittensohn, Xiang Luo, Li-Mou Zheng, Ivan King, John M. Pawelek i David Bermudes, SUICIDE GENE THERAPY, Methods in Molecular Medicine, 2004, Volume 90, strony 47-59, opisano prosty sposób otrzymania szczepu VNP20009 ze szczepu dzikiego Salmonella enterica s. Typhimurium publicznie dostępnego w kolekcji ATCC jako ATCC 14028.
PL 213 066 B1
Szczep VNP20009 został opracowany na potrzeby wektora szczepionkowego, którego zadaniem miało być dostarczanie nietoksycznych prekursorów leków cytostatycznych (proleków) do tkanki nowotworowej (9, 10). Delecje w obrębie genów purl i msbB zapewniają auksotrofizm szczepu przy obniżonej zdolności do stymulacji TNF w zakażonym organizmie. Wstępne badania wykazały zdolność preferencyjnej akumulacji VNP20009 w guzach nowotworowych u myszy (11). Stwierdzono również hamujący wpływ VNP20009 na rozwój guzów nowotworowych. Badania kliniczne I fazy nie potwierdziły efektów obserwowanych u małych ssaków. Nie przeprowadzono badań nad immunogennością VNP20009 ani u myszy ani i człowieka (12).
Poprzez powierzchniową ekspresję części zmiennej przeciwciała specyficznego dla CEA (T84.66) poprawiono zdolność selektywnej akumulacji bakterii w guzach nowotworowych (13). Jednak stres powodowany przez nadekspresję fuzyjnego białka OmpA-scFv(CEA-specyficzne) w znacznym stopniu (100-krotnie) obniża inwazyjność transformowanych VNP20009 (oznaczone jako VNP/scFv). Pomimo obniżonej inwazyjności, zaobserwowano zwiększone efekty terapeutyczne VNP/scFv w stosunku do VNP20009 w odniesieniu do mysich nowotworów transplantacyjnych stabilnie transfekowanych ludzkim genem CEA (gruczolakoraki MC38CEA i CT26CEA).
Kolejnym powodem ograniczonej efektywności VNP/scFv jest prawdopodobnie niestabilność genetyczna szczepu polegająca na utracie plazmidu, czyli utracie zdolności ekspresji OmpA-scFv, przy braku antybiotykowej presji selekcyjnej. Powrót do dzikiej formy VNP20009 w organizmie może nie sprzyjać wędrówce bakterii ukierunkowanej na miejsca bogate w CEA (tkanka nowotworowa).
W przypadku wektora Salmonella sp. istotne jest zachowanie zdolności inwazyjnych bakterii, które wiążą się z jakością mechanizmów odpornościowych stymulowanych przez te bakterie.
Istnieje nadal duże zapotrzebowanie na rozwój wiedzy w zakresie szczepionek terapeutycznych. Dużym problemem pozostaje określenie wpływu atenuacji na wielkość i rodzaj odpowiedzi immunologicznej w zależności od rodzaju drobnoustroju ze szczególnym uwzględnieniem bakteryjnych szczepionek protekcyjnych.
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie skutecznego wektora szczepionkowego, szczególnie skutecznego w przypadku leczenia nowotworów.
Celem wynalazku jest zatem uzyskanie odpowiedniego szczepu Salmonella sp., realizującego zapotrzebowanie w dziedzinie szczepionek terapeutycznych jako wektor służący do dostarczania materiału terapeutycznego do komórek celowych, zwłaszcza nowotworowych, zakażonych wirusem itp; o immunogenności wynikającej z fizjologicznie wewnątrzkomórkowej lokalizacji bakterii.
Przedmiotem wynalazku jest szczep Samonella enterica serotyp Typhimurium uzyskany ze znanego szczepu VNP20009 zawierający zintegrowaną z chromosomem bakteryjnym kasetę ekspresyjną PsifB-sipB przedstawioną jako SEQ ID 1.
Korzystnie do otrzymywania szczepionki, zwłaszcza szczepionki przeciwnowotworowej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania terapeutycznego wektora szczepionkowego ze szczepu VNP20009 bakterii Samonella enterica serotyp Typhimurium, charakteryzujący się tym, że w bakteryjnym szczepie wektorowym VNP20009 bakterii Samonella enterica serotyp Typhimurium, specyficznym wobec komórek nowotworowych, wprowadza się modyfikację genetyczną umożliwiającą opóźnioną nadekspresję genu kodującego białko odpowiedzialne za zdolności inwazyjne wspomnianego szczepu, przy czym otrzymuje się kasetę ekspresyjną zawierającą sekwencję przedstawioną jako SEQ ID 1 obejmującą gen sipB kodujący białko pod kontrolą promotor PsifB kontrolującego jego opóźnioną nadekspresję, a następnie integruje się wspomnianą kasetę ekspresyjną z chromosomem bakteryjnym.
Korzystnie, kasetą ekspresyjną integrowaną z chromosomem bakteryjnym jest kaseta PsifB-sipB wg SEQ ID 1 albo kaseta ushA-5'-PsifB-sipB-ushA-3' wg SEQ ID 2.
W korzystnej realizacji wynalazku, sposób zawiera dodatkowy końcowy etap usunięcia genu antybiotykooporności z genomu bakteryjnego.
Przedmiot wynalazku w przykładzie realizacji jest uwidoczniony na rysunku, na którym:
Na Figurze 1A przedstawiono rozdział elektroforetyczny produktu PCR w 1% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny dla sekwencji genu sipB (1782bp) uzyskanej z genomowego DNA referencyjnego szczepu S. typhimurium SL5319;
Na Fig. 1B przedstawiono wyniki uzyskane w technice Western blot potwierdzające funkcjonalność sklonowanego genu sipB:
Na Figurze 2 przedstawiono wyniki uzyskane w wyniku izolacji promotora genu sifB oraz wyniki testów funkcjonalności konstruktu PsifB-GFP:
PL 213 066 B1
Na Figurze 2A przedstawiono obraz uzyskany w wyniku rozdziału elektroforetycznego produktu PCR w 1,2% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny;
Na Figurze 2B przedstawiono obraz mikroskopowy makrofagów linii RAW264.7 zakażonych VNP20009 transformowanymi plazmidem pBR322-PsifB-gfp.
Na Figurze 2C przedstawiono wyniki analizy cytofluorymetrycznej hodowli bakteryjnych. VNP20009/PsifB-sipB-gfp: indukcja ekspresji białka fuzyjnego SipB-GFP (prawy panel); bakterie GFP-negatywne (lewy panel);
Na Figurze 3 przedstawiono schemat integracji plazmidu do genomu i wymiany fragmentu DNA, stymulowanej przecięciem obu nici DNA;
Na Figurze 4 przedstawiono względne położenie sekwencji genu sipB, promotora Psifli i miejsca insercji kasety Psifli-sipB (gen ushA) w genomie Salmonella typhimurium LT2;
Na Figurze 5 przedstawiono schemat plazmidu pSG76C z wklonowaną kasetą ushA-5'-PsifBsipB-ushA-3';
Na Figurze 6 przedstawiono schemat sekwencji genomowej uzyskanej w wyniku rekombinacji z udziałem genu ushA i plazmidowego regionu homologii 5'-ushA. Zaznaczono startery użyte do analizy klonów opornych na chloramfenikol;
Na Figurze 7 przedstawiono rozdział elektroforetyczny produktów RT-PCR w 1% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny: amplifikowano DNA zmutowanego klonu ze starterami: 1 - A i B (2350 pz); 2 - A i G (3755 pz); 3 - A i F (4560 pz); 4 - A i D; 5 - C i D (2411 pz). M - standard masowy;
Na Figurze 8 przedstawiono rozdział elektroforetyczny produktów RT-PCR w 1% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny:
Na Figurze 8A przedstawiono obraz elektroforetyczny dla produktu amplifikacji ze starterami specyficznymi dla Psif-BsipB (1222 pz), 1 - VNP20009; 2 - zmodyfikowany VNP20009; M - standard masowy;
Na Figurze 8B przedstawiono obraz elektroforetyczny dla produktu amplifikacji cDNA ze starterami specyficznymi dla sipB (389 pz), 1 - VNP20009, 2 - zmodyfikowany VNP20009 (Panel górny); produkt amplifikacji cDNA 16S rRNA (350 pz); M - standard masowy (Panel dolny);
Na Figurze 9 przedstawiono obraz rozdziału elektroforetycznego produktu reakcji PCR ze starterami komplementarnymi do sekwencji flankujących gen ushA, na DNA genomowym klonu uzyskanego w wyniku procedury integracji PsifB-sipB do chromosomu VNP20009; 1 - produkt amplifikacji ze starterami E i D (1526 pz); 2 - produkt amplifikacji ze starterami A i D (4709 pz); M - standard masowy;
Na Figurze 10 przedstawiono wykres obrazujący wyniki inwazji komórek RAW264 przez VNP20009 i VNP/sipB;
Na Figurze 11 przedstawiono doświadczenia wykonanego na modelu płucnym CT26CEA u myszy Balb/c. Górny rząd przedstawia płuca pobrane od myszy kontrolnych w 15 dniu po dożylnym 5 podaniu 5 x 105 komórek CT26CEA. Białe punkty widoczne na ciemnym tle są niewielkimi guzkami nowotworowymi. Dolny rząd przedstawia płuca pobrane od myszy, którym 48 godzin po podaniu nowotworu podano donosowo bakterie Salmonella typhimurium VNP/sipB w ilości 2 x 107 CFU/mysz;
Na Figurze 12 przedstawiono wynik doświadczenia wykonanego na modelu płucnym CT26CEA u myszy Balb/c. Górny rząd przedstawia płuca pobrane od myszy kontrolnych w 15 dniu po dożylnym 5 podaniu 5 x 105 komórek CT26CEA. Białe punkty widoczne na ciemnym tle są niewielkimi guzkami nowotworowymi. Dolny rząd przedstawia płuca pobrane od myszy, którym 96 godzin po podaniu nowotworu podano donosowo bakterie Salmonella typhimurium VNP/sipB w ilości 2x107 CFU/mysz;
Na Figurze 13 przedstawiono wynik doświadczenia wykonanego na modelu płucnym B16F10 u myszy C57B1/6. Górny rząd przedstawia płuca pobrane od myszy kontrolnych w 28 dniu po dożylnym 5 podaniu 5 x 105 komórek B16F10. Guzy nowotworowe są widoczne w postaci ciemnych punktów. Rząd środkowy i dolny przedstawia płuca pobrane od myszy, którym 96 godzin po podaniu nowotworu podano donosowo bakterie VNP (rząd środkowy) lub VNP/sipB (rząd dolny) w ilości 2 x 107 CFU/mysz;
Na Figurze 14 przedstawiono wyniki uzyskane dla wybiórczej stymulacji odpowiedzi typu Th1 przez VNP/sipB poprzez szczepienie myszy Swiss (outbred) szczepami VNP20009: myszy szczepione „dzikim” VNP20009 (Panel górny); myszy szczepione VNP/sipB (Panel dolny);
Na Figurze 15 przedstawiono wynik sekwencjonowania rekombinowanego fragmentu genomowego DNA zmodyfikowanego szczepu Salmonella enterica s. typhimurium VNP20009:
Na Figurze 15A przedstawiono sekwencję DNA obejmującą sekwencje flankujące gen ushA oraz kompletną sekwencję zintegrowanego konstruktu PsifB-sipB, który w bakterii VNP/sipB zlokalizowany jest wewnątrz genu ushA.
PL 213 066 B1
Na Figurze 15B przedstawiono wyniki potwierdzające zgodność sekwencji z VNP/sipB względem matrycowego DNA z modelowego szczepu Salmonella typhimurium LT2. Dolna nić: matryca (dolna nić DNA); zaznaczono pozycje określające położenie poszczególnych elementów konstruktu (promotor sifB, ORF sipB, miejsce integracji ushA) zgodnie z numeracją szczepu LT2 zdeponowanego w GenBank (NCBI). Górna nić: oznaczona jako „Query”; przedstawiono sekwencję uzyskaną z VNP/sipB.
Na Fig. 16 przedstawiono sekwencje starterów użytych do sekwencjonowania genomowego DNA. Schematyczne położenie starterów zaznaczono na Fig. 15 w obrębie sekwencji flankujących i zintegrowanego konstruktu.
W niniejszym wynalazku uzyskano wektor VNP/sipB, który w pełni zachowuje zdolności inwazyjne (Fig. 10).
W przygotowanym wektorze szczepionkowym wykorzystano naturalną zdolność Salmonella sp. do zakażania komórek gospodarza. Inwazyjność Salmonella sp. jest procesem wieloczynnikowym, w którym zaangażowane są zarówno komponenty komórki bakteryjnej, jak i komórki gospodarza (14). Adhezja bakterii do komórki gospodarza powoduje aktywację genów systemu wydzielniczego typu III (TTSS) zgrupowanych w „wyspie patogenności-1” (Salmonella pathogenicity island-1 - SPI-1). Produkty tych genów, a wśród nich białko SipB, umożliwiają wniknięcie bakterii do wnętrza komórki (15). Wewnątrz komórki gospodarza następuje aktywacja ekspresji kolejnego zestawu genów zlokalizowanych w obrębie SPI-2, których produkty odpowiadają za umożliwienie bakterii namnożenia się w obrębie cytoplazmy. Czynniki wewnątrzplazmatyczne poprzez interakcję z promotorami genów SPI-2 regulująich ekspresję. Jednym z takich promotorów jest promotor genu sifB (16).
Namnożenie się bakterii w cytoplazmie prowadzi do apoptozy komórki gospodarza co umożliwia wydostanie się bakterii i zakażenie dalszych komórek. Jednym z czynników indukujących apoptozę jest wspomniane już białko SipB (14).
Założono, że opóźniona (użycie promotora genu sifB) nadekspresja SipB (PsifB-sipB) spowoduje wewnątrzkomórkową eliminację zakażających bakterii z jednoczesną apoptozą/nekrozą zakażonych komórek. Przejściowa infekcja będzie silnym sygnałem dla imigracji leukocytów do miejsca zakażenia, natomiast nie będzie skutkowała zainfekowaniem populacji nowoimigrujących komórek układu odpornościowego.
Skutkiem działania tak przygotowanego wektora szczepionkowego będzie eliminacja guzów nowotworowych poprzez skoordynowane działanie bakterii i układu odpornościowego.
Niniejszy wynalazek zobrazowano za pomocą poniższych przykładów wykonania.
P r z y k ł a d 1: Klonowanie genu sipB
Sekwencja genu sipB (1782bp) (Fig. 1A) została uzyskana z genomowego DNA referencyjnego szczepu S. typhimurium SL5319 za pomocą techniki PCR, przy użyciu następujących starterów:
5' AACTGCAGAACCAATGCATTGGTTTCTCCCTTTATTTTGGCA
3' CGGGATCCCGAAGTAGCATTAGCCGTAGCG, które zawierają odpowiednio miejsce restrykcyjne Pstl I BamHl.
cDNA dla sipB został wklonowany do kasety ekspresyjnej plazmidu pQE30 dla uzyskania sekwencji kodującej białko fuzyjne RGS-6His-SipB. Poprawność uzyskanej sekwencji sipB potwierdzono poprzez zsekwencjonowanie obu nici cDNA sipB.
Funkcjonalność sklonowanego genu sipB potwierdzono standardową techniką Western blot (Fig. 1B) na lizatach bakterii E. coli M15 inkubowanych w obecności IPTG (1 mM 0,5 mM), przy użyciu przeciwciał anty-His-tag.
Wyniki analizy Western blot wykazały, że ekspresja SipB z indukowalnego promotora Plac była toksyczna dla bakterii, dlatego indukowano ją w szczepie E. coli M15 (zawiera plazmid pREP-4 z genem IacI kodującym białko represorowe). Ekspresję białka indukowano 0,5 mM IPTG w E. coli M15, hodowanych w medium TB w 25°C, przy gęstości optycznej OD600-1.0. Lizat bakteryjny przygotowany po 2,5 godz. indukcji ze 120 ml hodowli oczyszczono na złożu kobaltowym TALON BD. Zebrane frakcje rozdzielono w 10% żelu SDSPAGE, blot wywołano używając przeciwciał a-RGS-6His (Qiagen).
Otrzymano produkt o masie cząsteczkowej odpowiadającej masie SipB (62kDa).
P r z y k ł a d 2: Izolacja promotora genu sifB i umieszczenie genu sipB pod kontrolą PsifB
Sekwencja kodująca regionu promotorowego genu sifB została otrzymana w reakcji PCR z DNA genomowego Salmonella typhimurium VNP20009, ze starterami: „zgodnym” („forward”) CCCAAGCTTGGGCCTTAGCCATTCTGACTG z miejscem HindIII i „odwrotnym” („reverse”) GAAGATCTTCACTTCATTACTGGAATAGGTGGT z miejscem Bglll. Równolegle, z plazmidu
PL 213 066 B1 pGFPuv (Clontech) w reakcji PCR otrzymano sekwencję kodującą białko GFP, z primerami „zgodnym” („forward”) GAA^ATCTTCTCACACAGGAAACAGCTATGAC z miejscem Bglll i „odwrotnym” („reverse”) GAAGATCTTCGCGCTCAGTTGGAATTCA, także z miejscem Bglll.
Produkty PCR wklonowano do plazmidu pGEM-TEasy (Promega) i namnożono w bakteriach Escherichia coli DH5a. Po potwierdzeniu zgodności otrzymanej sekwencji z sekwencją uzyskaną z bazy GenBank, w miejsce Bglll plazmidu pGEM-TEasy-PsifB wklonowano gen gfp, uzyskany z plazmidu pGEM-TEasy-gfp. Indukcja wewnątrzkomórkowa promotora PsifB została sprawdzona in vitro przez zakażenie makrofagów \inii RAW264.7 bakteriami VNP20009 zawierającymi p\azmid pGEM-TEasy -PsifB-gfp, z sekwencją gfp wklonowaną zgodnie \ub przeciwnie do orientacji promotora. Z plazmidu pQE-sipB została otrzymana sekwencja kodująca sipB wraz z sekwencjami RBS i 6His w reakcji PCR z primerami:
„zgodnym” GGAAGATCTTCCAGAGGAGAAATTAACTATGAGA, „odwrotnym” GAAGATCTTCGGAGTCCAAGCTCAGCTA (oba primery z miejscem Bglll).
Produkt PCR wklonowano do plazmidu pGEM-TEasy -PsifB w miejsce Bglll. Kasetę PsifB-sipB wycięto z p\azmidu pGEM-Easy -Psift-sipB enzymem Notl i po wypełnieniu \epkich końców, wk\onowano do plazmidu niskokopijnego pBR322 w miejsca EcoRV-Nrul, oraz do plazmidu pMoPac2-lpp-ompA-scFv.
Na Fig. 2 przedstawiono wyniki izolacji promotora genu sifB oraz rezultaty testów funkcjonalności konstruktu PsifB-GFP.
Na Fig. 2A uwidoczniono obraz rozdziału elektroforetycznego produktu PCR w 1,2% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny. Sekwencję kodującą regionu promotorowego genu sifB (603 bp) otrzymano w reakcji PCR z DNA genomowego Salmonella typhimurium. Potwierdzono zgodność otrzymanej sekwencji z sekwencją uzyskaną z bazy GenBank (Salmonella typhimurium LT2, 1 691 572 - 1 692 152 bp). Aby potwierdzić funkcjonalność uzyskanej sekwencji promotorowej, otrzymano fuzję transkrypcyjną PsifB-GFP (sekwencję gfp zamplifikowano z plazmidu pGFPuv (Clontech) w reakcji PCR). Równolegle otrzymano sekwencję RBS-RGS-6His-sipB w reakcji PCR z plazmidu pQE30-sipB.
Na Fig. 2B przedstawiono obraz mikroskopowy uzyskany dla makrofagów linii RAW264.7, zakażanych VNP20009 transformowanymi plazmidem pBR322-PsifB-gfp. Indukcję promotora PsifB w bakteriach wewnątrzkomórkowych oceniano mikroskopowo. VNP20009 transformowane plazmidem nisko-(pBR322) jak i wysokokopijnym (pGEM-TEasy) z kasetą PsifB-gfp, hodowane w medium TB nie wykazywały obserwowalnej mikroskopowo ekspresji GFP.
Na Fig. 2C przedstawiono wyniki analizy cytofluorymetrycznej hodowli bakteryjnych. VNP20009/PsifB-sipB-gfp (ale nie E. coli DH5a/PsifB-sipB-gfp), hodowane 12 godz. w 30°C z wytrząsaniem (180 rpm) w medium do hodowli komórek eukariotycznych OPTIMEM (Invitrogen) wykazywały indukcję ekspresji białka fuzyjnego SipB-GFP (prawy panel). Te same bakterie hodowane w TB były GFP-negatywne (lewy panel).
Wykorzystanie konstruktów plazmidowych jest ograniczone w badaniach in vivo ze względu na łatwość gubienia plazmidów przez bakterie przy braku presji selekcyjnej (antybiotyków). Tymczasem stabilność genetyczna jest jedną z podstawowych cech umożliwiających użycie bakterii jako materiału szczepionkowego. Integracja kaset funkcjonalnych (promotor-gen) do chromosomu bakteryjnego jest metodą uzyskiwania stabilnych genetycznie szczepów bakteryjnych.
P r z y k ł a d 3: Integracja kasety ekspresyjnej PsifB-sipB do chromosomu VNP20009
W celu uzyskania genetycznie stabilnego, atenuowanego szczepu Salmonella typhimurium, z indukowaną w zakażonej komórce nadekspresją endogennego białka SipB, kasetę ekspresyjną PsifB-sipB zintegrowano do genomu VNP20009. Integrację wykonano metodą homologicznej rekombinacji, opartą o naturalny system naprawczo-rekombinacyjny bakterii (aktywność białka Rec-A) i wykorzystującą warunkowo replikujący plazmid jako wektor dostarczający zmutowany allel do DNA genomowego (17). W temperaturze niepermisywnej dla namnażania plazmidu, w obecności antybiotyku zachodzi selekcja klonów, które wbudowały plazmid, uzyskując chromosomową oporność na antybiotyk, w wyniku rekombinacji z udziałem dzikiej i zmutowanej kopii genu. Na tym etapie regiony homologiczne modyfikowanego genu są zduplikowane w genomie. W następnym etapie zachodzi wymiana pomiędzy zduplikowanymi sekwencjami, stymulowana przecięciem nici DNA w obrębie sekwencji plazmidowej obecnej w genomie. W efekcie następuje powrót do formy dzikiej allelu lub jego wymiana na formę zmutowaną, z równoczesnym wycięciem genu oporności na antybiotyk. Schemat wymiany genu na drodze stymulowanej przecięciem nici DNA rekombinacji odcinków homologicznych przedstawiono na Fig. 3.
PL 213 066 B1
Jako miejsce docelowe integracji wybrano rejon genu ushA (STM0494), który ma wysoką homologię z ushA Escherichia coli, ale bardzo niską ekspresję oraz niską aktywność kodowanego enzymu w Salmonella typhimurium (hydrolaza UDP-glukozy z mutacją punktową; „cichy gen”). Gen ushA w szczepach S. typhimurium uległ inaktywacji, a jego funkcjonalnym aktywnym homologiem jest ushB; sekwencje DNA tych genów nie wykazują znaczącej homologii (18, 19). Znaczna odległość lokalizacji sekwencji ushA od PsifB i sipB w genomie S. typhimurium (Fig. 4) powinna ograniczyć niestabilność genomową zmodyfikowanego szczepu, związaną z wprowadzeniem dodatkowych kopii tych sekwencji, które mogą być substratem dla rekombinacji homologicznej.
Do integracji wykorzystano warunkowo replikujący plazmid pSG76-C, z wklonowaną sekwencją PsifB-sipB, oflankowaną regionami homologii, tj. odcinkami sekwencji identycznej z sekwencją wybranego miejsca integracji na chromosomie bakteryjnym (5'-ushA i 3'-ushA); genem oporności na chloramfenikol, umożliwiającym selekcję klonów, w których zaszło crossing-over; ori R6Ky oraz wyjątkowo rzadkim miejscem restrykcyjnym dla endonukleazy I-SceI (Fig. 4). Plazmid pSG76-C do replikacji wymaga białka Π, dostarczanego z plazmidu pomocniczego pPIR-A (z temperaturo-wrażliwym ori pSC101). Plazmid pSG76C-ushA-PsifB-sipB może zostać wbudowany do genomu na drodze pojedynczego crossing-over z udziałem jednego z regionów homologii oraz odpowiadającego mu regionu chromosomowego. W temperaturze uniemożliwiającej replikację plazmidu pPIR-A (37-42°C), a więc zarazem plazmidu pSG76C, w obecności antybiotyku zachodzi selekcja klonów z sekwencją plazmidową wbudowaną do genomu. Na tym etapie flankujące regiony homologii są zduplikowane w genomie. Następnie, z plazmidu pomocniczego pSTKST zostaje indukowana ekspresja meganukleazy I-SceI. Przecięcie obu nici łańcucha DNA w obrębie zintegrowanej sekwencji plazmidowej stymuluje zależną od białka Rec-A wewnątrzcząsteczkową rekombinację (double strand break-stimulated gene replacement) - zachodzi naprawa powstałego pęknięcia z wykorzystaniem sąsiadujących z nim flankujących regionów homologii. Pojedyncze crossing-over może zajść z udziałem regionów 5'-ushA lub 3'-ushA. W pierwszym przypadku nastąpi powrót do formy dzikiej (odtworzenie integralności sekwencji genu ushA) lub - w drugim przypadku - produktywna rearanżacja, z równoczesnym usunięciem genu oporności na antybiotyk.
Uzyskany jest zmodyfikowany szczep bakteryjny pozbawiony markera selekcyjnego w postaci genu oporności na antybiotyk oraz innych egzogennych sekwencji.
P r z y k ł a d 4: Klonowanie kasety ushA-5'-PsifB-sipB-ushA-3' do plazmidu pSG76-C
Komplementarny DNA dla ushA uzyskano z DNA genomowego VNP20009 w reakcji PCR ze starterami: forward FushA GGGGTACCCCGCGATGTTGGAGATAGTAGG oraz reverse RushA GGGGTACCCCTACAGCCAGCTCACCTCA, oba z miejscem restrykcyjnym dla enzymu KpnI. Produkt PCR (1825 pz) wklonowano do plazmidu pGEM-TEasy (Promega) i namnożono w bakteriach Escherichia coli DH5a. Po potwierdzeniu zgodności otrzymanej sekwencji z sekwencją uzyskaną z bazy GenBank, w miejsce restrykcyjne Hpal, zlokalizowane we wnętrzu ushA, wklonowano PsifB-sipB (uzyskano z pGEM-TEasy -PsifB-sipB), w orientacji przeciwnej do orientacji sekwencji genu ushA.
W otrzymanym w ten sposób konstrukcie, sekwencja PsifB-sipB jest oflankowana 1091 pz odcinkiem ushA na 5'- końcu i 732 pz na 3'- końcu. Następnie, kasetę ushA-5'-PsifB-sipB-ushA-3' wycięto enzymem Kpnl i wklonowano do pSG76-C w miejsce Kpnl, otrzymując pSG76C-USS (Fig. 5).
P r z y k ł a d 5: Integracja plazmidu pSG76C-USS do chromosomu VNP20009
Plazmid namnożono w bakteriach Escherichia coli DH5a.pir (z genomową kopią genu pir, kodującego białko Π) i transformowano do VNP20009 (elektroporacja), transformowanych uprzednio plazmidem pPIR-A. Transformowane bakterie wysiano na podłoże stałe z ampicyliną i chloramfenikolem i hodowano w temperaturze 30°C przez 40 godz., następnie wysiano na podłoże stałe z chloramfenikolem i hodowano w temperaturze kolejno 30°C (5 godz.), 42°C (17 godz.) i 37°C (7 godz.) w celu selekcji klonów, które uzyskały oporność chromosomową. Spośród transformantów opornych na chloramfenikol wybrano duże kolonie bakteryjne, przesiano na podłoże stałe z chloramfenikolem i hodowano 20 godz. w 37°C. Następnie sprawdzono, czy w wybranych klonach zaszła integracja plazmidu do chromosomu, to jest czy doszło do wbudowania plazmidu w miejsce genu ushA. Przeprowadzono reakcję PCR z parami starterów hybrydyzujących do sekwencji flankujących miejsce insercji oraz do sekwencji plazmidowej i PsifB-sipB (Fig. 5, Tabela 1), w warunkach 94°C 1 min 30 s; 94°C 45 s 58°C 30 s, 72°C 2 min 30 s, 28 cykli.
Zgodnie z powyższym, na Fig. 6 zobrazowano schemat sekwencji genomowej uzyskanej w wyniku rekombinacji z udziałem genu ushA i plazmidowego regionu homologii 5'-ushA. Zaznaczono startery użyte do analizy klonów opornych na chloramfenikol.
PL 213 066 B1
W doświadczeniu zastosowano startery według Tabeli 1:
T a b e l a 1
Startery użyte do analizy rekombinowanych klonów i masy produktów PCR potwierdzających integrację plazmidu do genomu w miejscu sekwencji genu ushA
| STARTER SEKWENCJA (5’ - 3’) | PRODUKT TYP DZIKI | - PRODUKT PO |
| INTEGRACJI | ||
| FushA | 8366 pz | |
| GGGGTACCCCGCGATGTTGGAGATAGTAGG | 4366 pz (po | |
| 1825 pz | ||
| RushA | wycięciu genu | |
| GGGGTACCCCTACAGCCAGCTCACCTCA | oporności) | |
| A GCGACTGGATCATATCGT | ||
| — | 2350 pz | |
| B CGCCTCACTATGCTCATG | ||
| 2411 pz | ||
| C CTGAACGGTCTGGTTATAGG | ||
| — | — (po wycięciu | |
| D CTGGATATTGAACTGGCG | ||
| A GCGACTGGATCATATCGT | genu oporności) 8709 pz 4709 pz (po | |
| D CTGGATATTGAACTGGCG | 2168 pz | wycięciu genu |
| E CCCAAGCTTGGGCCTTAGCCATTCTGACTG | oporności) 5140 pz 1526 pz (po | |
| D CTGGATATTGAACTGGCG | wycięciu genu | |
| A GCGACTGGATCATATCGT | oporności) 4560 pz | |
| — | — (po wycięciu | |
| F GCAGGTCGACTCTAGAGGAT | ||
| genu oporności) | ||
| A GCGACTGGATCATATCGT | ||
| 3755 pz | ||
| G CCCAAGCTTGGGCCTTAGCCATTCTGACTG |
W przypadku integracji plazmidu w miejsce ushA w reakcji ze starterami A i B otrzymano produkt 2350 pz, a ze starterami C i D - 2411 pz, natomiast w standardowej reakcji PCR ze starterami A i D nie otrzymano produktu (Fig. 7).
Na Fig. 7 przedstawiono obraz rozdziału elektroforetycznego produktów PCR w 1% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny. Amplifikowano DNA zmutowanego klonu ze starterami: 1 - A i B (2350 pz); 2 - A i G (3755 pz); 3 - A i F (4560 pz); 4 - A i D; 5 - C i D (2411 pz).
Całkowity RNA izolowano z bakterii VNP20009 typu dzikiego oraz klonu, w którym stwierdzono integrację, hodowanych w warunkach indukujących aktywność promotora PsifB. W reakcji RT-PCR ze
PL 213 066 B1 starterem specyficznym dla nowo wprowadzonej do genomu kopii genu sipB (komplementarnym do sekwencji obejmującej syntetyczną sekwencję RBS) na matrycy uzyskanej ze zmutowanego klonu otrzymano produkt odpowiadający masie 1222 pz (Fig. 8).
Na Fig. 8 przedstawiono obraz rozdziału elektroforetycznego produktów RT-PCR w 1% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny. RNA izolowano z bakterii hodowanych w warunkach indukujących aktywność promotora PsifB. (A) Produkt amplifikacji ze starterami specyficznymi dla PsifB-sipB (1222 pz), 1 - VNP20009 2 - zmodyfikowany VNP20009; (B) produkt amplifikacji cDNA ze starterami specyficznymi dla sipB (389 pz), 1 - VNP20009, 2 - zmodyfikowany VNP20009 oraz produkt amplifikacji cDNA 16S rRNA (350 pz).
P r z y k ł a d 6: Usunięcie genu antybiotykooporności z genomu VNP20009
Dotychczasowe manipulacje wymagały obecności genu oporności na antybiotyk, którego obecność w materiale szczepionkowym jest niepożądana. Dlatego, w kolejnym etapie gen ten został usunięty. Przecięcie DNA genomowego w miejscu restrykcyjnym dla enzymu I-SceI, wprowadzonym do genomu wraz z sekwencją plazmidową, stymuluje rekombinację z udziałem sąsiadujących regionów homologii oraz selekcję klonów, w których pęknięcie zostało naprawione. Klony z potwierdzoną integracją plazmidu pSG76C-USS transformowano plazmidem pSTKST (posiadającym temperaturowrażliwe ori pSC101), zawierającym gen meganukleazy I-SceI pod kontrolą promotora tetracyklinowego i hodowano na podłożu stałym z kanamycyną w temperaturze 30°C. Następnie, pojedyncze kolonie hodowano 24 godz. w 30°C w pożywce płynnej LB z kanamycyną (20 μg/ml) i autoklawowaną chlorotetracykliną (cTc, 30 μg/ml; indukuje ekspresję I-SceI poprzez inaktywację represora tetracyklinowego). Hodowlę rozcieńczono 1:106 i wysiano na podłoże stałe z kanamycyną i cTc i hodowano w temperaturze 30°C 20 godz. Następnie, w reakcji PCR z parą starterów E i D sprawdzono, czy w wybranych klonach doszło do wycięcia genu oporności i planowanej rekombinacji - w tym przypadku uzyskano produkt o masie 1526 pz (Fig. 9, ścieżka 1). W reakcji PCR ze starterami A i D, w warunkach 94°C 2 min; 94°C 30 s, 58°C 30 s, 70°C 4 min, 10 cykli; 94°C 30 s, 58°C 30 s, 70°C 4 min + 10 s/cykl, 20 cykli; uzyskano produkt o masie powyżej 4500 pz., odpowiadający masie sekwencji ushA ze zintegrowaną kasetą PsifB-sipB (Fig. 9, ścieżka 2).
Na Fig. 9 przedstawiono obraz rozdziału elektroforetycznego produktu reakcji PCR ze starterami komplementarnymi do sekwencji flankujących gen ushA, na DNA genomowym klonu uzyskanego w wyniku procedury integracji PsifB-sipB do chromosomu VNP20009. Uzyskano produkt amplifikacji ze starterami E i D (1526 pz) oraz produkt amplifikacji ze starterami A i D (4709 pz).
Integracja funkcjonalnej kasety PsifB-sipB do chromosomu VNP20009 jest na tyle znaczącą modyfikacją gentyczną bakterii, że jej skutkiem jest uzyskanie nowego szczepu bakteryjnego.
P r z y k ł a d 7: Badanie funkcjonalności VNP/sipB (INT)
P r z y k ł a d 7A: Porównanie zdolności inwazyjnych bakterii VNP20009 i VNP/sipB
Badano poziom inwazji komórek RAW264.7 przez VNP20009 i VNP/sipB. Stwierdzono brak statystycznie istotnych różnic w inwazyjności „dzikiego” i rekombinowanego szczepu VNP.
Komórki linii makrofagowej RAW264.7 hodowano na 48-studzienkowych płytkach, w gęstości 2.5x104, w medium DMEM z 10% surowicą przez 24 godz. Komórki zakażano VNP20009 i VNP20009/sipB w 100 μΐ medium OPTIMEM (Invitrogen) bez surowicy przy MOI 5, wyznaczonym na podstawie pomiaru gęstości optycznej (OD, 600 nm). Po 1 godz. koinkubacji komórek z bakteriami (37°C, 5% CO2) dodawano 100 μl OPTIMEM z surowicą i gentamycyną (2% surowicy, 100 μg/ml gentamycyny) i inkubowano 3 godz. (37°C, 5% CO2) w celu eliminacji bakterii pozakomórkowych. Następnie, komórki zbierano i wysiewano na płytki LB/agar. Liczbę żywych wewnątrzkomórkowych bakterii oceniano na podstawie liczby kolonii bakteryjnych po 24 godzinach wzrostu i odnoszono do liczby komórek w studzience.
Równolegle wyznaczono liczbę CFU przypadającą na studzienkę na starcie infekcji, na podstawie liczby kolonii bakteryjnych po 24 godzinach wzrostu na płytkach LB/agar, uzyskanych z odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny bakterii użytej do infekcji. Inwazyjność bakterii wyznaczono jako frak5 cję komórek zakażonych przypadającą na 105 CFU (Fig. 10).
P r z y k ł a d 7B: Efekty terapeutyczne VNP/sipB w mysim modelu nowotworowym
Doświadczenie wykonano na modelu płucnym CT26CEA u myszy Balb/c. Płuca były barwione czernią indyjską. Na Fig. 11 górny rząd przedstawia płuca pobrane od myszy kontrolnych w 15 dniu 5 po dożylnym podaniu 5 x 105 komórek CT26CEA. Białe punkty widoczne na ciemnym tle są niewielkimi guzkami nowotworowymi, których liczba (> 300 w płucu) oraz arbitralnie oceniana wielkość obrazują efektywność przerzutowania nowotworu. Dolny rząd przedstawia płuca pobrane od myszy, któ10
PL 213 066 B1 rym 48 godzin po podaniu nowotworu podano donosowo bakterie Salmonella typhimurium VNP/sipB w ilości 2 x 107 CFU/mysz. W tych płucach znaleziono średnio < 20 guzów/płuco.
W grupach myszy, które poddano szczepieniu VNP/sipB, w 50% badanych płuc nie stwierdzono obecności guza.
P r z y k ł a d 7C: Porównanie efektów terapeutycznych różnych modyfikacji VNP20009 w mysim modelu nowotworowym
Doświadczenie wykonano na modelu płucnym CT26CEA u myszy Balb/c. Płuca były barwione czernią indyjską. Na Fig. 12A górny rząd przedstawia płuca pobrane od myszy kontrolnych w 15 dniu 5 po dożylnym podaniu 5 x 105 komórek CT26CEA. Białe punkty widoczne na ciemnym tle są niewielkimi guzkami nowotworowymi, których liczba (> 300 w płucu) oraz arbitralnie oceniana wielkość obrazują efektywność przerzutowania nowotworu (Fig. 12B). Dolny rząd przedstawia płuca pobrane od myszy, którym 96 godzin po podaniu nowotworu podano donosowo bakterie Salmonella typhimurium VNP/sipB w ilości 2 x 107 CFU/mysz. W tych płucach znaleziono średnio < 20 guzów/płuco.
W grupach myszy, które poddano szczepieniu VNP/sipB, w 50% badanych płuc nie stwierdzono obecności guzów.
P r z y k ł a d 7D: Porównanie efektów terapeutycznych VNP20009 i VNP/sipB w mysim modelu nowotworowym czerniaka B16F10
Doświadczenie wykonano na modelu płucnym B16F10 u myszy C57B1/6 (Fig.13). Płuca były barwione kwasem pikrynowym. Na Fig. 13 górny rząd odpowiada płucom pobranym od myszy kontro5 lnych w 28 dniu po dożylnym podaniu 5 x 105 komórek B16F10. Guzy nowotworowe są widoczne w postaci ciemnych punktów, których liczba oraz arbitralnie oceniana wielkość obrazują efektywność przerzutowania nowotworu. Rząd środkowy i dolny przedstawia płuca pobrane od myszy, którym 96 godzin po podaniu nowotworu podano donosowo bakterie VNP (rząd środkowy) lub VNP/sipB (rząd dolny) w ilości 2 x 107 CFU/mysz. W tych płucach znaleziono średnio < 2 guzy/płuco.
W grupie myszy, które poddano szczepieniu VNP/sipB, w 75% badanych płuc nie stwierdzono obecności guzów.
P r z y k ł a d 7E: Wybiórcza stymulacja odpowiedzi typu Th1 przez VNP/sipB
Efektem szczepienia myszy Swiss (outbred) zmodyfikowanymi szczepami VNP20009 jest ukierunkowanie (skewing) odpowiedzi immunologicznej na odpowiedź typu Th1 u połowy szczepionych myszy (Fig. 14). O ile skutkiem podania „dzikiego” VNP20009 (górny panel) było pojawienie się wszystkich analizowanych izotypów przeciwciał (IgGl, IgG2a i 1gM), to w surowicy myszy szczepionych VNP/sipB (dolny panel) stwierdzono wysoki poziom IgG2a przy niemal braku IgG1.
Jest bardzo prawdopodobne, że obserwowany Ig switch jest jednym z ogniw w łańcuchu reakcji odpornościowych stymulowanych przez VNP/sipB, których efektem jest między innymi zahamowanie wzrostu (lub eliminacja) nowotworów w organizmie szczepionych myszy.
P r z y k ł a d 8: Sekwencjonowanie rekombinowanego fragmentu genomowego DNA zmodyfikowanego szczepu Salmonella enterica s. Typhimurium VNP20009
Analizowano sekwencję DNA obejmującą sekwencje flankujące genu ushA, oraz kompletną sekwencję zintegrowanego konstruktu PsifB-sipB (Fig. 15), który w bakterii VNP/sipB zlokalizowany jest wewnątrz genu ushA. Zgodność sekwencji uzyskanych z VNP/sipB potwierdzono względem matrycowego DNA z modelowego szczepu Salmonella typhimurium LT2 przy użyciu programu BLAST (NCBI). Na Fig. 15B zaznaczono na matrycy (dolna nić DNA) pozycje określające położenie poszczególnych elementów konstruktu (promotor sifB, ORF sipB, miejsce integracji ushA) zgodnie z numeracją szczepu LT2 zdeponowanego w GenBank (NCBI). Górną nić oznaczono jako „Query” i przedstawiono sekwencję uzyskaną z VNP/sipB.
Sekwencja PsifB w genomie Salmonella typhimurium LT2 położona jest w pozycji par 1 691 578-1 692 147.
Sekwencja sipB w genomie Salmonella typhimurium LT2 położona jest w pozycji par 3 029 114-3 030 895.
Sekwencja ushA w genomie Salmonella typhimurium LT2 położona jest w pozycji par 553 634-555 286.
Sekwencje starterów użytych do sekwencjonowania genomowego DNA przedstawiono na Fig. 16. Schematyczne położenie starterów zaznaczono na Fig. 15 w obrębie sekwencji flankujących i zintegrowanego konstruktu.
PL 213 066 B1
Dzięki uzyskaniu odpowiednio zmodyfikowanego szczepu Salmonella enterica S. Typhimurium uzyskano korzystny terapeutycznie wektor szczepionkowy, nadający się szczególnie do zastosowania jako przeciwrakowy, bakteryjny wektor szczepionkowy.
Lista sekwencji <110> Uniwersytet. Jagielloński Bereta, Michał <120 Nowy szczep bakterii Salmonella enterica s. typhiftLurium, jego zastosowanie i sposób otrzymywania terapeutycznego wektora szczepionkowego <130 PK/0643/AG <160 2 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 2414 <212> DNA <213> artificial seguence <220 <223> Sekwencja kodująca kasety PsifB-sipB <400> 1
| ccttagccat | tctgactgca | aaatgcccca | ggatgctgtc | ttttcgtgaa | tttcaccatc | 60 |
| tgat ttcttc | attttgagcc | tcctcgcagg | tttttataat | tttatcgccc | aactggaaac | 120 |
| aaacccgtca | gctaatcgtt | acaacaaata | taattaagac | aaaaactaaa | gagtaagata | 180 |
| tttatatcat | aagcactatc | agtatf.ggcc | ttctgcccta | ccgctaaaca | tctcattgtt | 240 |
| gttagcctaa | taatactttt | agtttaactt | cttataagac | aatttctaca | cggttgagca | 300 |
| actatttact | ttctctaaaa | ataatatagt | gcgtaattaa | tcattactca | tagtacatga | 360 |
| tgatgtgaga | attaagaaaa | ccgttttact | ttcattcgtt | ttatctgaca | tatt tcatgg | 420 |
| ccaggaggcg | tgggcatgac | taaagctacg | ggtcgatttg | aacaattgaa | caataatgtt | 480 |
| gacggttcag | gacaaagcaa | aaatca ggtg | tttcaccgat | aggcaaaccg | atgggcaaca | 540 |
| tgggataata | tttcgaatac | cacctattcc | agtaatgaag | Igaagatctt | ccagaggaga | 600 |
| aattaactat | gagaggatcg | catcaccatc | accatcacgg | atcccgaagt | agcattagcc | 660 |
| gtagcggata | tacccaaaat | ccgcgcctcg | ctgaggcggc | ttttgaaggc | gttcgtaaga | 720 |
| acacggactt | tttaaaagcg | gcggataaag | cttttaaaga | tgtggtggca | acgaaagcgg | 7 80 |
| gcgaccttaa | agccggaaca | aagtccggcg | agagcgctat | taatacggtg | ggtctaaagc | 840 |
| cgcctacgga | cgccgcccgg | gaaaaactct | ccagcgaagg | gcaattgaca | Ltactgcttg | 900 |
| gcaagttaat | gaccctactg | ggcgatgttt | cgctgtctca | actggagtct | cgtctggcgg | 960 |
| tatggcaggc | gatgattgag | tcacaaaaag | agatggggat | tcaggtatcg | a ci a a a t.. c c. | 1020 |
| agacggctct | gggagaggct | caggaggcga | cggatctcta | tgaagccagt | atcaaaaaga | 1080 |
| cggataccgc | caagagtgtt | tatgacgctg | cgaccaaaaa | actgacgcag | gcgcaaaata | 1140 |
| aattgcaatc | gctggacccg | gctgaccccg | gctatgcaca | agctgaagcc | gcggtagaac | 1200 |
| aggccggaaa | agaagcgaca | gaggcgaaag | aggccttaga | taaggccacg | gatgcgacgg | 1260 |
| ttaaagcagg | cacagacgcc | aaagcgaaag | ccgagaaagc | ggataacatt | ctgaccaaat | 1320 |
| tccagggaac | ggctaatgcc | gcct ctcaga | atcaggtttc | ccagggtgag | caggataatc | 1380 |
PL 213 066 B1
| tgtcaaatgt | cgcccgcctc | actatgctca | tggccatgtt | tattgagatt | gtgggcaaaa | 1440 |
| atacggaaga | aagcctgcaa | aacgatcttg | cgcttttcaa | cgccttgcag | gaagggcgtc | 1500 |
| aggcggagat | ggaaaagaaa | tcggctgaat | tccaggaaga | gacgcgcaaa | gccgaggaaa | 1560 |
| cgaaccgcat | tatgggatgt | atcgggaaag | tcctcggcgc | gctgctaacc | attgtcagcg | 162 0 |
| ttgtggccgc | tgtttttacc | ggtggggcga | gtctggcgct | ggctgcggtg | ggacttgcgg | 1680 |
| taatggtggc | cgatgaaatt | gtgaaggcgg | cgacgggagt | gtcgtttatt | cagcaggcgc | 1740 |
| taaacccgat | tatggagcat | gtgctgaagc | cgttaatgga | gctgattgge | aaggcgatta | 1800 |
| ccaaagcgct | ggaaggatta | ggcgtcgata | agaaaacggc | agagatggcc | ggcagcattg | 1860 |
| ttggtgcgat | tgtcgccgct | attgccatgg | tggcggtcat | tgtggtggtc | gcagttgtcg | 1920 |
| ggaaaggcgc | ggcggcgaaa | ctgggtaacg | egctgagcaa | aatgatgggc | gaaacgatta | 1980 |
| agaagttggt | gcctaacgtg | ctgaaacagt | tggcgcaaaa | cggcagcaaa | ctctttaccc | 2040 |
| aggggatgca | acgtattact | agcggtctgg | gtaatgtggg | tagcaagatg | ggcctgcaaa | 2100 |
| cgaatgcctt | aagtaaagag | ctggtaggta | ataccctaaa | taaagtggcg | ttgggcatgg | 2160 |
| aagtcacgaa | taccgcagcc | cagtcagccg | ctggtgttgc | cgagggcgta | tttattaaaa | 2220 |
| atgccagcga | ągcgcttgct | gattttatgc | tcgcccgttt | tgccatggat | cagattcagc | 2280 |
| agtggcttaa | aeaatccgta | gaaatatttg | gtgaaaacca | gaaggtaacg | gcggaactgc | 2340 |
| aaaaagccat | gtcttctgcg | gtacagcaaa | atgcggatgc | ttcgcgtttt | attctgcgcc | 2400 |
| agagtcgcgc | ataa | z 414 |
<210> 2 <211> 4352
| <212> DNA | ||||||
| <213> artificial seguence | ||||||
| <220> | ||||||
| <223> Sekwencja kons' | truktu ushA- | -5' -PsifB“SipB--ushA-3' | ||||
| <400> 2 | ||||||
| gcgatgttgg | agatagtagg | atgtgtaatt | attacttgcc | taacatacct | gtgaaatgtg | 60 |
| tttgaaggaa | gt ctcaattc | tgaaaacata | tttgtctatt | attgcaagga | aaggtaattt | 120 |
| ctgcggttga | tattgagtca | gggagagaaa | gatgaaattt | ttgaaacggg | gtgtggcgct | 180 |
| ggcgttactg | gcggcgttcg | cgctgacgac | tcsgcctgca | caggcttacg | aaaaagataa | 240 |
| aacctataaa | attactatcc | tgcataccaa | cgatcaccac | ggtcacttct | ggcgcagcga | 300 |
| atatggcgaa | tatggtctgg | cggcgcaaaa | aacgctggtg | gacagtatcc | gtaaagaggt | 360 |
| ggcgcaagag | gggggaagcg | tcctgttgtt | atccggcggc | gacartaata | ccggggtgcc | 420 |
| ggaatccgat | ctccaggatg | cggagcccga | tttccgcggg | atgaatctga | ttggctacga | 480 |
| cgctatggcc | gtcggtaatc | atgaatttga | taatccgctc | accgtattgc | gccagcagga | 540 |
| aaagtgggcg | aagtttccct | ttctttacgc | caatatttat | caaaaaagta | ccggcgagcg | 600 |
| tctgtttaag | c-cgtgggcta | tttttacacg | ccaggatata | aaaatcgcgg | taatcggctt | 660 |
| aaccaccgat | gacacggcga | aaataggcaa | cccggaatat | ttcaccgata | ttgagtttcg | 720 |
| taaacctgct | ęj<3.«3.ęe3.ćigcćA<3 | aggtggtgat | tcaggaactt | aatatgaatg | aaaaaccgga | 780 |
| cgtgattatc | gcgaccacgc | atatgggaca | ttatgacaac | ggcgatcacg | gttcgaacgc | 840 |
| gccgggcgac | gttgagatgg | cgcgtagcct | gcctgccggt | tcgttggcga | tgattgtggg | 900 |
PL 213 066 B1
| cggtcactca | caagacccgg | tatgcatggc | gtcggaaaat | clsSSleieiiiCeięję | tgaattacgt | 960 |
| accgggaacg | ccctgcgcgc | cggataagca | aaatggcatc | tggatcgtgc | aggcgcatga | 1020 |
| gtggggtaaa | tatgtgggcc | gtgcggattt | cgaattccgt | aacggcgaga | tgaaaatggt | 1080 |
| tggccgcggg | aattcgatga | agatettegg | agtccaagct | cagctaatta | agcttggctg | 1140 |
| cagaaccaat | gcattggttt | ctccctttat | tttggcagtt | tttatgcgcg | actctggcgc | 1200 |
| agaataaaac | gcgaagcatc | cgcattttgc | tgtaccgcag | aagacatggc | tttttgcagt | 1260 |
| tccgccgtta | ccttctggtt | ttcaccaaat | atttctacgg | attgtttaag | ccactgctga | 1320 |
| atctgatcca | tggcaaaacg | ggegageata | aaatcagcaa | gcgcctcgct | ggcattttta | 1380 |
| ataaatacgc | cctcggcaac | accaccggct | gactgggctg | cggtattcgt | gacttccatg | 1440 |
| cccaacgcca | ctttatttag | ggtattacct | accagctctt | tact Laaggc | attcgtttgc | 1500 |
| aggeceatct | tgctacccac | attacccaga | ccgctagtaa | tacgttgcat | cccctgggta | 1560 |
| aagagtttgc | tgccgttttg | cgccaactgt | ttcagcacgt | taggcaccaa | cttcttaatc | 1620 |
| gtttcgccca | tcattttgct | cagcgcgtta | cccagtttcg | ccgccgcgcc | tttcccgaca | 1680 |
| actgcgacca | ccacaatgac | cgccaccatg | gcaatagcgg | cgacaatcgc | accaacaatg | 1740 |
| ctgccggcca | tctctgccgt | tttettateg | acgcctaatc | cttccagcgc | tttggtaatc | 1800 |
| gccttgccaa | tcagctccat | taacggcttc | agcacatgct | ccataatcgg | gtttagcgcc | 18 60 |
| tgctgaataa | acgacactcc | egtcgccgcc | ttcacaattt | catcggccac | cattaccgca | 1920 |
| agtcccaccg | cagccagcgc | cagactcgcc | ccaccggtaa | aaacagcggc | cacaacgctg | 1980 |
| acaatggtta | gcagcgcgcc | gaggactttc | ccgatacatc | ccataatgcg | gttcgtttcc | 204 0 |
| tcggctttgc | gcgtctcttc | etggaattca | geegatttet | tttccatctc | cgcctgacgc | 2100 |
| ccttcctgca | aggcgttgaa | aagcgcaaga | tcgttttgca | ggctttcttc. | cgtatttttg | 2160 |
| cccacaatct | caataaacat | ggccatgagc | atagtgaggc | gggcgacatt | tgacagatta | 2220 |
| tcctgctcac | cctgggaaac | ctgattctga | gaqgcggeat | tagccgttcc | ctggaatttg | 2280 |
| gtcagaatgt | tatccgcttt | ctcggctttc | gctttggcgt | ctgtgcctgc | tttaaccgtc | 2340 |
| gcatccgtgg | ccttatctaa | ggcctctttc | gcctctgtcg | cttcttttcc | ggcctgttct | 2400 |
| accgcggctt | cagettgtge | atagccgggg | tcagccgggt | ccagcgattg | caatttattt | 2460 |
| tgcgcctgcg | tcagtttttt | ggtcgcagcg | tcataaacac | tcttggcggt | atccgtcttt | 2520 |
| t1 tf tL t t.1- yj gj' | etteatagag | atccgtcgcc | tcctgagcct | ctcccagagc | cgtctgaaat | 2580 |
| tctttcgata | cctgaatccc | catctctttt | tgtgactcaa | tcatcgcctg | ccataccgcc | 2640 |
| agacgagact | ccagttgaga | cagcgaaaca | tcgcccagta | gggtcattaa | cttgccaagc | 2700 |
| agtaatgtca | attgcccttc | gctggagagt | ttttcccggg | cggcgtccgt | aggcggcttt | 27 60 |
| agacccaccg | tattaatage | gctctcgccg | gactttgttc | eggctttaag | gtcgcccgct | 2820 |
| ttcgttgcca | ccacatcttt | aaaagcttta | tccgccgctt | ttaaaaagtc | cgtgttctta | 2880 |
| cgaacgcctt | caaaagccgc | eteagegagg | cgcggatttt | gggtatatcc | getaeggeta | 2940 |
| atcctacttc | gggatccgtg | atggtgatgg' | tgatgegate | eteteatagt | taa t ttctcc | 3000 |
| tctggaagat | cttcacttca | ttactggaat | aggtggtatt | cgaaaratta | tcccatgttg | 3060 |
| cccatcggtt | tgcctatcgg | tgaaacacct | gatttttgct | ttgtcctgaa | ccgtcaacat | 3120 |
| tat tgttcaa | ttgttcaaat | cgacccgtag | ctttagtcat | gcccacgcct | cctggccatg | 3180 |
| aaatatgtca | gataaaacga | atgaaagtaa | aacggttttc | ttaattctca | catcatcatg | 3240 |
| taetatgagt | aatgattaat | tacgcactat | attattttta | gagaaagtaa | atagttgctc | 3300 |
| aaccgtgtag | aaattgtctt | ataagaagtt | aaactaaaag | tattattagg | ctaacaacaa | 3360 |
PL 213 066 B1
| tgagatgttt | agcggtaggg | eag<aaggcca | atactgatag | tgcttatgat | ataaatatct | 3420 |
| tactctttag | tttttgtctt | aattatattt | gttgtaacga | ttagctgacg | gctttgtttc | 3480 |
| cagttgggcg | ataaaattat | CS. Cl O. CS Ct L. t-Λ | gaggaggctc | aaaatgaaga | aatcagatgg | 3540 |
| tgaaat tcac | gaaaagacag | catcctgggg | cattttgcag | tcagaatggc | taaggcccaa | 3600 |
| gcttgggaat | cactagtgaa | ttcgcggcca | actaccagct | tattccggta | aatctcaaga | 3660 |
| aaaaagtgac | ctgggataac | gggaaaagcg | agcgtgtact | ttacacgccg | gaaatcgcag | 3720 |
| aaaatccgca | aatgctctcg | ttattaacgc | cgttccagaa | t aaaggtaaa | gcgcaactgg | 3780 |
| aggtgaaaat | tggtagcgtg | aatggccttc | ttgaaggcga | tcgcagtaag | gtcagatttg | 3840 |
| tccagaccaa | tatgggacgg | gtgattctgg | ctgcgcagat | cgcgcgcacc | ggcgccgatt | 3900 |
| ttggcgtgat | gagcggcggc | ggtattcgcg | actcgattga | ggcgggagat | attacctata | 3960 |
| aaagcgtgct | caaggtacag | ccgttcggca | acattgtggt | gtatgccgat | atgagcggca | 4020 |
| aagaggtggt | tgattatctc | accgccgtag | cacagatgaa | accggactcc | ggcgcctatc | 4080 |
| cacagctcgc | caatgtgagc | tttgtcgcca | aagagggcaa | gctcaccgat | ctgaaaatca | 4140 |
| aaggcgagcc | tgttgatccg | gctaaaacct | atcgcatggc | gacgctgagt | ttcaacgcca | 4200 |
| cgggcggcga | tggttatccg | cgcattgata | acaaaccggg | ctacgtgaat | accgggttta | 4260 |
| ttgacgcgga | agtgctgaaa | gagtttattc | agcaaaattc | accgctggat | gcggcggcgt | 4320 |
| ttacgccaaa | tggtgaggtg | agctggctgt | ag | 4352 |
PL 213 066 B1
Literatura
1. Hoiseth, S.K., and B.A. Stocker. 1981. Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines. Nature 291:238-239.
2. Dougan, G., S. Chatfield, D. Pickard, J. Bester, D. O'Callaghan, and D. Maskell. 1988. Construction and characterization of vaccine strains of Salmonella harboring mutations in two different aro genes. J Infect Dis 158:1329-1335.
3. Sydenham, M., G. Douce, F. Bowe, S. Ahmed, S. Chatfield, and G. Dougan. 2000. Salmonella enterica serovar typhimurium surA mutants are attenuated and effective live oral vaccines. Infect Immun 68:1109-1115.
4. Chatfield, S.N., K. Strahan, D. Pickard, I.G. Charles, C.E. Hormaeche, and G. Dougan. 1992. Evaluation of Salmonella typhimurium strains harbouring defined mutations in htrA and aroA in the murine salmonellosis model. Microb Pathog 12:145-151.
5. Coynault, C., V. Robbe-Saule, and F. Norel. 1996. Virulence and vaccine potential of Salmonella typhimurium mutants deficient in the expression of the RpoS (sigma S) regulon. Mol Microbiol 22:149-160.
6. Dougan, G., C.E. Hormaeche, and D.J. Maskell. 1987. Live oral Salmonella vaccines: potential use of attenuated strains as carriers of heterologous antigens to the immune system. Parasite Immunol 9:151-160.
7. Gentschev, I., S. Spreng, H. Sieber, J. Ures, F. Mollet, A. Collioud, J. Pearman, M.E. GriotWenk, J. Fensterle, U.R. Rapp, W. Goebel, S.A. Rothen, and G. Dietrich. 2007. Vivotif--a 'magic shield' for protection against typhoid fever and delivery of heterologous antigens. Chemotherapy 53:177-180.
8. Cheminay, C., and M. Hensel. 2008. Rational design of Salmonella recombinant vaccines.
Int J Med Microbiol 298:87-98.
9. Bermudes, D., L.M. Zheng, and I.C. King. 2002. Live bacteria as anticancer agents and tumor-selective protein delivery vectors. Curr Opin Drug Discov Devel 5:194-199.
10. Pawelek, J.M., K.B. Low, and D. Bermudes. 1997. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Cancer Res 57:4537-4544.
11. Clairmont, C., K.C. Lee, J. Pike, M. Ittensohn, K.B. Low, J. Pawelek, D. Bermudes, S.M. Brecher, D. Margitich, J. Turnier, Z. Li, X. Luo, I. King, and L.M. Zheng. 2000. Biodistribution and genetic stability of the novel antitumor agent VNP20009, a genetically modified strain of Salmonella typhimurium. J Infect Dis 181:1996-2002.
12. Toso, J.F., V.J. Gill, P. Hwu, F.M. Marincola, N.P. Restifo, D.J. Schwartzentruber, R.M. Sherry, S.L. Topalian, J.C. Yang, F. Stock, L.J. Freezer, K.E. Morton, C. Seipp, L. Haworth, S. Mavroukakis, D. White, S. MacDonald, J. Mao, M. Sznol, and S.A. Rosenberg. 2002. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol 20:142-152.
13. Bereta, M., A. Hayhurst, M. Gajda, P. Chorobik, M. Targosz, J. Marcinkiewicz, and H.L. Kaufman. 2007. Improving tumor targeting and therapeutic potential of Salmonella VNP20009 by displaying cell surface CEA-specific antibodies. Vaccine 25:4183-4192.
14. Cossart, P., and P.J. Sansonetti. 2004. Bacterial invasion: the paradigms of enteroinvasive pathogens. Science 304:242-248.
15. Hersh, D., D.M. Monack, M.R. Smith, N. Ghori, S. Falkow, and A. Zychlinsky. 1999. The Salmonella invasin SipB induces macrophage apoptosis by binding to caspase-1. Proc Natl Acad Sci USA 96:2396-2401.
16. Freeman, J.A., M.E. Ohl, and S.I. Miller. 2003. The Salmonella enterica serovar typhimurium translocated effectors SseJ and SifB are targeted to the Salmonella-containing vacuole.
Infect Immun 71:418-427.
17. Posfai, G., V. Kolisnychenko, Z. Bereczki, and F.R. Blattner. 1999. Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome. Nucleic Acids
Res 27:4409-4415.
PL 213 066 B1
18. Burns, D.M., and LR. Beacham. 1986. Identification and sequence analysis of a silent gene (ushAO) in Salmonella typhimurium. J Mol Biol 192:163-175.
19. Innes, D., LR. Beacham, C.A. Beven, M. Douglas, M.W. Laird, J.C. Joly, and D.M. Burns. 2001. The cryptic ushA gene (ushA(c)) in natural isolates of Salmonella enterica (serotype Typhimurium) has been inactivated by a single missense mutation. Microbiology 147:1887-1896.
Claims (5)
1. Szczep Samonella enterica serotyp Typhimurium uzyskany ze znanego szczepu VNP20009 zawierający zintegrowaną z chromosomem bakteryjnym kasetę ekspresyjną PsifB-sipB przedstawioną jako SEQ ID 1.
2. Zastosowanie szczepu określonego w zastrz. 1 do otrzymywania szczepionki, zwłaszcza szczepionki przeciwnowotworowej.
3. Sposób otrzymywania terapeutycznego wektora szczepionkowego ze szczepu VNP20009 bakterii Samonella enterica serotyp Typhimurium, znamienny tym, że w bakteryjnym szczepie wektorowym VNP20009 bakterii Samonella enterica serotyp Typhimurium, specyficznym wobec komórek nowotworowych, wprowadza się modyfikację genetyczną umożliwiającą opóźnioną nadekspresję genu kodującego białko odpowiedzialne za zdolności inwazyjne wspomnianego szczepu, przy czym otrzymuje się kasetę ekspresyjną zawierającą sekwencję przedstawioną jako SEQ ID 1 obejmującą gen sipB kodujący białko pod kontrolą promotor PsifB kontrolującego jego opóźnioną nadekspresję, a następnie integruje się wspomnianą kasetę ekspresyjną z chromosomem bakteryjnym.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że kasetą ekspresyjną integrowaną z chromosomem bakteryjnym jest kaseta wybrana spośród PsifB-sipB przedstawionej jako SEQ ID 1 lub ushA-5'-PsifB-sipB-ushA-V przedstawionej jako SEQ ID 2.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera dodatkowo etap usuwania genu antybiotykooporności z genomu bakteryjnego.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL387319A PL213066B1 (pl) | 2009-02-23 | 2009-02-23 | Nowy szczep bakterii Salmonella enterica s. Typhimurium, jego zastosowanie i sposób otrzymywania terapeutycznego wektora szczepionkowego |
| US13/148,139 US8916372B2 (en) | 2009-02-23 | 2010-02-23 | Strain of Salmonella enterica s. typhimurium, its use and a method to obtain a therapeutic vaccine vector |
| PCT/PL2010/050005 WO2010095966A1 (en) | 2009-02-23 | 2010-02-23 | New strain of salmonella enterica s. typhimurium, its use and a method to obtain a therapeutic vaccine vector |
| EP10713040.3A EP2406277B1 (en) | 2009-02-23 | 2010-02-23 | New strain of salmonella enterica s. typhimurium, its use and a method to obtain a therapeutic vaccine vector |
| ES10713040T ES2430861T3 (es) | 2009-02-23 | 2010-02-23 | Nueva cepa de Salmonella enterica s. Typhimurium, su uso y un procedimiento para obtener un vector de vacuna terapéutico |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL387319A PL213066B1 (pl) | 2009-02-23 | 2009-02-23 | Nowy szczep bakterii Salmonella enterica s. Typhimurium, jego zastosowanie i sposób otrzymywania terapeutycznego wektora szczepionkowego |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL387319A1 PL387319A1 (pl) | 2010-08-30 |
| PL213066B1 true PL213066B1 (pl) | 2013-01-31 |
Family
ID=42236362
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL387319A PL213066B1 (pl) | 2009-02-23 | 2009-02-23 | Nowy szczep bakterii Salmonella enterica s. Typhimurium, jego zastosowanie i sposób otrzymywania terapeutycznego wektora szczepionkowego |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8916372B2 (pl) |
| EP (1) | EP2406277B1 (pl) |
| ES (1) | ES2430861T3 (pl) |
| PL (1) | PL213066B1 (pl) |
| WO (1) | WO2010095966A1 (pl) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8771669B1 (en) | 2010-02-09 | 2014-07-08 | David Gordon Bermudes | Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria |
| US9597379B1 (en) | 2010-02-09 | 2017-03-21 | David Gordon Bermudes | Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies |
| US8524220B1 (en) | 2010-02-09 | 2013-09-03 | David Gordon Bermudes | Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria |
| CN102477440A (zh) * | 2010-11-29 | 2012-05-30 | 南京大学 | 治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达方法及应用 |
| US10987432B2 (en) * | 2013-09-05 | 2021-04-27 | The University Of Hong Kong | Therapeutic delivery and expression system, methods and uses thereof |
| US9737592B1 (en) | 2014-02-14 | 2017-08-22 | David Gordon Bermudes | Topical and orally administered protease inhibitors and bacterial vectors for the treatment of disorders and methods of treatment |
| US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
| US10676723B2 (en) | 2015-05-11 | 2020-06-09 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| US11471497B1 (en) | 2019-03-13 | 2022-10-18 | David Gordon Bermudes | Copper chelation therapeutics |
| US12285437B2 (en) | 2019-10-30 | 2025-04-29 | The Research Foundation For The State University Of New York | Reversing the undesirable pH-profile of doxorubicin via activation of a disubstituted maleamic acid prodrug at tumor acidity |
| US10973908B1 (en) | 2020-05-14 | 2021-04-13 | David Gordon Bermudes | Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine |
| US12537071B1 (en) | 2020-07-22 | 2026-01-27 | David Gordon Bermudes | Bacteria having boolean control pathways expressing therapeutic proteins including immunotherapeutic cytotoxins |
| US20240009252A1 (en) * | 2020-08-18 | 2024-01-11 | Curators Of The University Of Missouri | Compositions and methods of treatment comprising tumor-targeting bacteria and chemotherapy or immunotherapy agent |
| CN114480462A (zh) * | 2020-10-26 | 2022-05-13 | 南京吉芮康生物科技研究院有限公司 | 一种减毒沙门氏菌分泌表达ntd结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统及其应用 |
-
2009
- 2009-02-23 PL PL387319A patent/PL213066B1/pl unknown
-
2010
- 2010-02-23 US US13/148,139 patent/US8916372B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-02-23 WO PCT/PL2010/050005 patent/WO2010095966A1/en not_active Ceased
- 2010-02-23 ES ES10713040T patent/ES2430861T3/es active Active
- 2010-02-23 EP EP10713040.3A patent/EP2406277B1/en not_active Not-in-force
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2406277B1 (en) | 2013-06-26 |
| EP2406277A1 (en) | 2012-01-18 |
| PL387319A1 (pl) | 2010-08-30 |
| WO2010095966A1 (en) | 2010-08-26 |
| ES2430861T3 (es) | 2013-11-22 |
| US8916372B2 (en) | 2014-12-23 |
| US20120164687A1 (en) | 2012-06-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2406277B1 (en) | New strain of salmonella enterica s. typhimurium, its use and a method to obtain a therapeutic vaccine vector | |
| US9598697B2 (en) | Recombinant bacterium to decrease tumor growth | |
| ES2543079T3 (es) | Métodos para construir vacunas sin resistencia antibiótica | |
| US9198950B2 (en) | Recombinant bacterium comprising a toxin/antitoxin system | |
| ES2356863T3 (es) | Mutantes de spi2 de salmonella atenuada como portadores de antígenos. | |
| JP3415145B2 (ja) | 弱毒化細菌における組換えタンパク質の発現 | |
| Hegazy et al. | Salmonella enterica as a vaccine carrier | |
| Moreno et al. | Salmonella as live trojan horse for vaccine development and cancer gene therapy | |
| JP3024982B2 (ja) | 生菌ワクチン | |
| ES2286905T3 (es) | Sistema de estabilizacion de plasmidos para el suministro de antigenos. | |
| US9045742B2 (en) | Recombinant Edwardsiella bacterium | |
| EP2411503B1 (en) | Salmonella enterica presenting c. jejuni n-glycan or derivatives thereof | |
| JP2002511752A (ja) | 生弱毒ワクチン | |
| EP2214840A1 (en) | Compositions and methods of enhancing immune responses to flagellated bacterium | |
| Chatfield et al. | The development of oral vaccines based on live attenuated Salmonella strains | |
| ES2256514T3 (es) | Vacuna bacterial. | |
| Chabalgoity et al. | Live bacteria as the basis for immunotherapies against cancer | |
| ES2370885T3 (es) | Electroporación de mycobacterium y sobreexpresión de antígenos en micobacterias. | |
| US11969468B2 (en) | Live self-destructing bacterial adjuvants to enhance induction of immunity | |
| EP2403525B1 (en) | Attenuated salmonella enterica serovar paratyphi a and uses thereof | |
| ES2842748T3 (es) | Escherichia coli patogénica atenuada o inactivada para el tratamiento del cáncer urogenital | |
| Kumar | Live-attenuated bacterial vectors for delivery of mucosal vaccines, DNA vaccines, and cancer immunotherapy | |
| Ahmed et al. | A directed intimin insertion mutant of a rabbit enteropathogenic Escherichia coli (REPEC) is attenuated, immunogenic and elicits serogroup specific protection | |
| US20230165955A1 (en) | Live self-destructing bacterial adjuvants to enhance induction of immunity | |
| Endmann | Novel Salmonella vectors with in vivo amplifiable plasmids for vaccination and tumor therapy |