ES2356863T3 - Mutantes de spi2 de salmonella atenuada como portadores de antígenos. - Google Patents

Abstract

Célula de Salmonella atenuada que comprende el locus génico SPI2, en la que por lo menos un gen del locus SPI2 está inactivado, en la que dicha inactivación produce una atenuación/reducción de la virulencia en comparación con el tipo natural de dicha célula y en la que por lo menos un gen adicional dispuesto fuera del locus SPI2 está inactivado, en la que la inactivación produce una atenuación/reducción adicional de la virulencia en comparación con el tipo natural.

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En 1996, más de 17 millones de personas en todo el mundo, principalmente en países en desarrollo, murieron por diversas infecciones. La aparición y la propagación de resistencias a antibióticos unido al aumento en los viajes por todo el mundo ha conducido a un riesgo creciente del brote de infecciones pandémicas. Esta posibilidad debe 5 considerarse seriamente puesto que, para algunas bacterias patógenas, las alternativas terapéuticas disponibles se han reducido a una única opción. De manera desconcertante, también se ha descubierto que las bacterias patógenas son un factor relevante en muchas enfermedades crónicas. El cáncer de estómago, por ejemplo, es el segundo cáncer más común en todo el mundo y está directamente vinculado con infecciones crónicas por Helicobacter pylori. Se ha detectado Chlamydia pneumoniae en placas arterioscleróticas y recientemente se ha encontrado esta bacteria en las 10 regiones con enfermedad del cerebro de personas que padecen enfermedad de Alzheimer. Muchas enfermedades autoinmunitarias, tales como artritis reumatoide, parecen tener un origen bacteriano. Borrelia burgdorferi es, además de muchas otras bacterias, un ejemplo prominente de un organismo que provoca una enfermedad que afecta a números crecientes de personas. Finalmente, se han identificado Nanobacteria en los riñones con enfermedad crónica de pacientes con depósitos cristalinos. Otras enfermedades crónicas graves están provocadas por patógenos virales, los 15 más clínicamente relevantes son los virus de la hepatitis B y C (cáncer de hígado) y el virus del papiloma humano (cáncer de cuello uterino).

La importancia clínica creciente de los patógenos bacterianos ha provocado un aumento del debate referente al paradigma de la prevención o el tratamiento médico como medio para tratar enfermedades crónicas. Consecuentemente, algunas enfermedades crónicas se han curado satisfactoriamente mediante tratamiento con 20 antibióticos. Sin embargo, tal como se indicó anteriormente, todos los microorganismos son genéticamente capaces de generar rápidamente progenies con resistencias a antibióticos adecuadas, impidiendo así el tratamiento de rutina eficaz. De manera concluyente, las vacunas representan una alternativa excelente a los fármacos farmacológicos y, considerando el aspecto económico de que la prevención de la enfermedad presenta costes menos elevados que la terapia, la opción de vacunación es incluso más atractiva. Por tanto, el enfoque de vacunación terapéutica ha adquirido 25 particular relevancia, especialmente con respecto al tratamiento de cáncer y enfermedades bacterianas o virales crónicas.

El enfoque más frecuentemente puesto en práctica utiliza la administración oral de o bien patógenos inactivados (vacuna muerta) o bien inyecciones parenterales de una mezcla definida de componentes purificados (vacunas de subunidades). La mayoría de las vacunas muertas son eficaces, sin embargo, el riesgo de que el 30 procedimiento de inactivación esté inacabado y que el vacunado se infecte sigue siendo un problema. Además, las vacunas muertas muy a menudo no cubren todas las variantes genéticas que aparecen en la naturaleza. Las vacunas de subunidades suprimen la mayoría de las desventajas de las vacunas muertas tradicionales. Sin embargo, requieren preparaciones de antígeno y adyuvantes tecnológicamente avanzadas, lo que hace que tales vacunas sean relativamente caras. Además, las vacunas de subunidades se inoculan preferentemente por vía parenteral, que no es la 35 ruta óptima para provocar una respuesta inmunitaria amplia. En particular, la rama de la mucosa del sistema inmunitario, que es la línea primaria de protección contra muchos patógenos, está fuertemente desaprovechada por las inmunizaciones parenterales.

Otra generación de vacunas está representada por vacunas atenuadas vivas, que se basan en virus o bacterias patógenas que se han mutado para proporcionar variantes no patógenas. Estas variantes se multiplican in vivo durante 40 un periodo de tiempo limitado antes de que el huésped las elimine completamente. Su prevalencia limitada en el tejido del huésped es suficiente para estimular adecuadamente el sistema inmunitario del huésped, que entonces puede establecer una respuesta inmunitaria protectora. Con respecto al aspecto de seguridad, las vacunas bacterianas atenuadas vivas están más favorecidas que las vacunas virales atenuadas vivas. Si una vacuna bacteriana viva se convierte en una amenaza para un vacunado, las bacterias atenuadas pueden controlarse generalmente mediante 45 tratamiento con antibióticos. En cambio, las vacunas virales vivas, que utilizan el aparato de replicación de la célula huésped, son casi imposibles de controlar. Las vacunas bacterianas vivas se administran normalmente por vía oral y sirven como estimuladores excelentes del sistema inmunitario de la mucosa. Además, las vacunas bacterianas vivas son también buenos estimuladores del sistema inmunitario sistémicamente activo, concretamente las ramas humoral y celular. Debido a estas excelentes características inmunoestimuladoras, las cepas de vacunas bacterianas vivas, tales 50 como Salmonella, son portadores ideales para expresar antígeno de un patógeno heterólogo. Tales vacunas bivalentes (o multivalentes) median la protección frente a dos patógenos: el patógeno homólogo al portador así como el patógeno cuyo(s) antígeno(s) protector(es) se expresa(n) mediante el portador. Aunque no está actualmente en utilización ninguna vacuna bacteriana bivalente que exprese antígenos heterólogos, los posibles portadores actualmente en investigación incluyen Bacille Calmette-Guerin (BCG), especies de Salmonella, Vibrio cholerae y Escherichia coli. 55

En el proceso de atenuación, se dirigen preferentemente mutaciones a genes que soportan la supervivencia del patógeno en el huésped. Inicialmente, se aplicaron regímenes de mutación química a la cepa Ty2 de Salmonella typhi, dando como resultado lo que se pensó que eran patógenos perfectamente atenuados que podían mediar la inmunidad protectora, en contraposición al homólogo muerto. Sin embargo, ensayos clínicos a gran escala posteriores revelados que tales cepas no eran todavía suficientemente eficaces en la prevención de la fiebre tifoidea. Parece que tales cepas 60 estaban mutadas en varios genes, dando como resultado una sobreatenuación, que afecta de manera adversa al

potencial inmunogénico de la cepa. Se han desarrollado cepas de vacuna tifoidea novedosas mediante la introducción de mutaciones genéticamente definidas. La mayoría de estas mutaciones se han establecido en S. typhimurium. La infección con S. typhimurium provoca síntomas similares a la fiebre tifoidea en ratones y la salmonelosis murina es un modelo bien aceptado para la fiebre tifoidea humana. Tales cepas de vacuna contienen mutaciones en proteínas que provocan deficiencias en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos (por ejemplo aroA, aroC y aroD) o purinas (por 5 ejemplo purA y purE), en el gen de la adenilato ciclasa (cya) o la proteína receptora de AMPc (crp), o poseen mutaciones que afectan a la regulación de varios factores de virulencia (phoP y phoQ). Sin embargo, aunque varios mutantes atenuados se han generado y caracterizado en el modelo de ratón con respecto a su papel en la virulencia, relativamente pocos de ellos se han evaluado como portadores de vacuna en seres humanos. El motivo de esto es que los mutantes utilizados son o bien todavía demasiado virulentos, provocando efectos secundarios graves en el huésped, 10 o bien no son suficientemente inmunogénicos, debido a una presentación inadecuada al sistema inmunitario, que requiere un nivel crítico de persistencia de la cepa de vacuna en el huésped para la activación.

Un reciente estudio reveló que la inactivación de genes de Salmonella individuales provocando la atenuación de la virulencia influye directamente en la calidad de una respuesta inmunitaria contra la cepa portadora de vacuna. Partiendo de este hallazgo, puede concluirse que podría ser posible generar una variedad de cepas de vacuna de 15 Salmonella atenuadas de manera diferente, cada una con un perfil único y capacidades individuales para provocar una respuesta inmunitaria. Con este repertorio, podría ser posible confeccionar una cepa de vacuna según exigencias inmunológicas específicas. Como consecuencia lógica, también deben poderse desarrollar cepas de vacuna de Salmonella atenuadas para fines o bien profilácticos o bien terapéuticos. Sin embargo, deben determinarse los medios mediante los cuales se obtiene y se desarrolla adicionalmente un repertorio representativo de este tipo de cepas de 20 vacuna de Salmonella.

En casos en los que se utiliza una cepa de vacuna de Salmonella como portador para antígenos heterólogos, deben considerarse parámetros adicionales. Tradicionalmente, se han expresado antígenos heterólogos en el citosol de Salmonella. En el modelo tifoideo de ratón, se demostró que, cuando se expresan antígenos heterólogos a altos niveles en el citosol de Salmonella, se forman a menudo cuerpos de inclusión, que influyen negativamente en la 25 inmunogenicidad de la cepa de vacuna viva recombinante en el huésped vacunado. Se concluyó que la formación de cuerpos de inclusión podría ser fatal para la bacteria, disminuyendo además la vitalidad y aumentando la atenuación, y por tanto reduciendo la inmunogenicidad. De hecho, sistemas de expresión específicos que evitan este principio de atenuación secundaria, por ejemplo el sistema de expresión regulado en 2 fases, pueden mejorar la eficacia de la presentación de antígenos heterólogos al sistema inmunitario del huésped. 30

Se ha demostrado que la secreción de antígenos por Salmonella atenuada viva puede ser superior a la expresión intracelular de los mismos antígenos tanto en la producción de respuestas de células T protectoras (Hess et al., 1996; Hess et al., 1997b) como en la producción de niveles elevados de anticuerpo específico de antígeno (Gentschev et al., 1998). Sin embargo, las eficacias de los sistema de secreción dirigidos por HlyA son habitualmente bajas (el 30% o menos del antígeno sintetizado total) (Hess et al., 1997a; Hess et al., 1996), y el sistema parece ser 35 problemático en S. typhi para la exportación de antígenos heterólogos (Orr et al., 1999).

Se induce un perfil inmunológico similar mediante los dos sistemas de secreción de tipo III, que están codificados por las islas de patogenicidad 1 y 2 de Salmonella. Estas complejas maquinarias de secreción suministran de manera natural “proteínas efectoras” en el citosol de la célula huésped infectada, soportando la supervivencia del patógeno dentro de la célula huésped. Por medio de tecnología génica, las “proteínas efectoras” pueden convertirse en 40 vehículos portadores para epítopos de antígenos heterólogos. Tales “proteínas efectoras” quiméricas pierden su carácter virulento pero conservan su carácter secretor. En consecuencia, la “proteína efectora” quimérica se suministra a la luz de la célula huésped, en la que se procesa de manera apropiada y posteriormente estimula la rama citotóxica del sistema inmunitario del huésped.

La proteína más abundante secretada por Salmonella es la flagelina (véase, por ejemplo (Hueck et al., 1995)). 45 En S. typhimurium, la flagelina se produce en dos variantes alélicas, FliC o FljB, mientras que S. typhi porta sólo el gen de FliC. La flagelina se secreta mediante la ruta de exportación específica de flagelo (FEX) (Macnab, 1996; Minamino y Macnab, 1999), que es homóloga a la ruta de secreción de tipo III (Hueck, 1998). Se ha mostrado también recientemente que la ruta de FEX funciona en la secreción de proteínas que no son de flagelos en Yersinia enterocolitica (Young et al., 1999). Como en la secreción de tipo III, el extremo amino terminal de FliC dirige la secreción. Por tanto, se 50 secreta de manera constitutiva una versión truncada de 183 aminoácidos amino terminales de FliC (la longitud completa es de 495 aa) en grandes cantidades (Kuwajima et al., 1989). En analogía a la secreción de tipo III, la señal de secreción eficaz en FliC puede ser de tan sólo 10 a 20 aminoácidos. Pueden utilizarse potencialmente las señales de secreción de FliC o FljB para secretar grandes cantidades de una proteína heteróloga que puede servir como antígeno en vacunación heteróloga. Es probable que la cantidad de antígeno secretado pueda incluso aumentarse adicionalmente 55 en mutantes regulatorios afectando a la expresión de genes de biosíntesis de flagelos (Macnab, 1996; Schmitt et al., 1996) o utilizando promotores recombinantes para dirigir la expresión del gen de flagelina.

La secreción mediante la ruta de FEX puede permitir el suministro de grandes cantidades de antígeno en el fagosoma que contiene Salmonella para un procesamiento del antígeno y una presentación del antígeno al sistema inmunitario del huésped temprana y eficaz. Especialmente la rama dependiente del CMH de clase II del sistema 60 inmunitario del huésped está fuertemente soportada por el suministro de antígeno mediado por la ruta de FEX.

Las otras maquinarias de exportación y sistemas de presentación en superficie conocidos de bacterias Gram-negativas pueden aplicarse también a portadores de vacunas bacterianas tales como Salmonella. En general, se logra una buena respuesta inmunitaria cuando el antígeno se presenta en la superficie de Salmonella. Sin embargo, ya que se sabe poco sobre las consecuencias inmunológicas de tales sistemas de presentación de antígenos, se necesita más trabajo experimental. 5

Pueden lograrse efectos inmunomoduladores adicionales cuando se utilizan promotores de Salmonella regulados por el entorno para la expresión de antígenos heterólogos. Por ejemplo, la expresión de un gen heterólogo en una cepa portadora de Salmonella bajo el control del promotor del gen htrA de respuesta al estrés regulado in vivo dio como resultado una respuesta inmunitaria más fuerte que la que se obtuvo bajo el control del promotor inducible de manera anaerobia del gen nirB. 10

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una célula de Salmonella atenuada que comprende el locus génico SPI2, en la que por lo menos un gen del locus SPI2 está inactivado, en la que dicha inactivación da como resultado una atenuación/reducción de la virulencia en comparación con el tipo natural de dicha célula y en la que por lo menos un gen adicional ubicado fuera del locus SPI2 está inactivado, en la que la inactivación da como resultado atenuación/reducción 15 adicional de la virulencia en comparación con el tipo natural.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente solicitud describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos 50 nucleótidos a) de la secuencia de ácido nucleico de una de las figuras 21 A, B, b) de un alelo de la secuencia de ácido nucleico de una de las figuras 21A, B o c) de una secuencia de ácido nucleico 20 que en condiciones rigurosas hibrida con la secuencia de ácido nucleico de una de las figuras 21A, B.

Las condiciones de hibridación rigurosas en el sentido de la presente invención se definen como las descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104. Según esto, hibridación en condiciones rigurosas significa que se observa todavía una señal de hibridación positiva tras lavar durante 1 hora con tampón 1 x SSC y SDS al 0,1% a 55ºC, preferentemente a 62ºC y lo más preferentemente a 25 68ºC, en particular, durante 1 hora en tampón 0,2 x SSC y SDS al 0,1% a 55ºC, preferentemente a 62ºC y lo más preferentemente a 68ºC.

En particular, la presente solicitud describía una molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias codificantes completas o partes de las mismas de los genes ssaD, ssaE, sseA, sseB, sscA, sseC, sseD, sseE, sscB, sseF, sseG, ssaG, ssaH, ssaE, ssaJ, ssrA y ssrB. La solicitud también describe tales ácidos nucleicos, en los que por lo 30 menos una región codificante de dichos genes está funcionalmente delecionada.

En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico comprende un casete de inserción para facilitar la inserción de una molécula de ácido nucleico heterólogo mediante un mecanismo mediado por fago o transposón.

Además, dichas moléculas de ácido nucleico pueden comprender por lo menos una molécula de ácido nucleico heterólogo. En este caso, la molécula de ácido nucleico heterólogo puede estar fusionada en 5’ o 3’, insertada o 35 insertada por deleción en la molécula de ácido nucleico de la invención. Mediante la expresión “insertada por deleción” se entiende que la inserción de la molécula de ácido nucleico heterólogo está asociada con una deleción simultánea de partes de la molécula de ácido nucleico de la invención. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico se inserta o inserta por deleción y en una forma de realización preferida la molécula de ácido nucleico heterólogo está flanqueada en 5’ y 3’ por secuencias de la molécula de ácido nucleico según la invención, en la que cada una de dichas secuencias 40 presenta una longitud de por lo menos 50 nucleótidos, preferentemente 200-250 nucleótidos.

De manera preferida, la molécula de ácido nucleico heterólogo codifica para un polipéptido o péptido, de manera más preferida codifica para un antígeno viral o bacteriano o un homólogo del mismo o para un antígeno tumoral.

Resulta preferido que la molécula de ácido nucleico también comprenda por lo menos un casete de expresión génica para permitir la expresión eficaz de la molécula de ácido nucleico heterólogo. Tal casete de expresión génica 45 comprende habitualmente elementos tales como promotores y/o potenciadores que mejoran la expresión de las moléculas de ácido nucleico heterólogo. Habitualmente, tal casete de expresión génica comprende elementos para la terminación de la transcripción. Sin embargo, puede no preferirse la presencia de terminadores de la transcripción, en casos en los que la molécula de ácido nucleico heterólogo va a transcribirse junto con otros genes en un ARNm cistrónico. 50

La molécula de ácido nucleico, uno o más casetes de marcadores selectivos y uno o más casetes transactivadores y opcionalmente casetes de invertasa para permitir la expresión de las moléculas de ácido nucleico heterólogo en un sistema de una fase o un sistema de dos fases. Además, pueden estar presentes secuencias que codifican para un dominio de direccionamiento de péptido o polipéptido y, por tanto, permiten el direccionamiento del producto de expresión de la molécula de ácido nucleico heterólogo a un compartimento celular predeterminado tal como 55 el citosol, el periplasma o la membrana externa, o la secreción de dicho producto de expresión, o que codifican para un

dominio inmunoestimulador.

La presente solicitud también describe un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente. La presente invención se refiere a una célula de Salmonella que comprende una molécula de ácido nucleico modificado tal como se describió anteriormente mediante inserción de una secuencia heteróloga o el vector recombinante. 5

La presente solicitud también describe un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de péptido que comprende por lo menos 20 aminoácidos a) de la secuencia de una de las figuras 23A-Q, o b) de una secuencia que es el 60%, de manera preferida el 65% y de manera más preferida el 70% homóloga a la secuencia de una de las figuras 23A-Q. En particular, la solicitud describe un polipéptido que comprende la secuencia a) de una de las figuras 23A-Q, o b) que es el 60%, de manera preferida el 65% y de manera más preferida el 70% homóloga a la secuencia de una de las 10 figuras 23A-Q.

La homología en porcentaje (%) se determina según la siguiente ecuación:

H=

n x100

L

en la que H es la homología en %, L es la longitud de la secuencia básica y n es el número de diferencias de nucleótidos o aminoácidos de una secuencia con respecto a la secuencia básica dada.

La presente solicitud también un anticuerpo que se dirige contra un epítopo que está compuesto por el péptido 15 o polipéptido mencionado anteriormente. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. El experto en la materia conoce procedimientos para producir un anticuerpo de este tipo.

La presente solicitud también describe una proteína de fusión que comprende el polipéptido tal como se describió anteriormente, que tiene insertado o insertado por deleción, o que está fusionado en el extremo manera C o NH2-terminal con por lo menos un polipéptido heterólogo. El polipéptido heterólogo preferido es un antígeno, de manera 20 más preferida un antígeno viral o bacteriano o un antígeno tumoral.

La presente solicitud también describe instrucciones para el desarrollo de una variedad de posibles cepas de vacuna de Salmonella viva con diferentes niveles de atenuación, que posteriormente sirven como plataforma para el desarrollo de cepas portadoras de vacuna de Salmonella viva recombinante que expresan antígenos de patógenos heterólogos, sirviendo así como vacunas multivalentes. Tales portadores de vacuna de Salmonella viva recombinante 25 están dotados de módulos que comprenden casetes génicos variables que regulan la expresión de antígenos heterólogos en Salmonella y determinan la presentación de los antígenos heterólogos al sistema inmunitario del huésped. Mediante combinaciones de ambos sistemas, cepas de vacuna de Salmonella viva atenuada de manera diferente y casetes génicos variables, puede generarse una variedad de cepas portadoras de vacuna viva recombinante que presentan, debido a sus características inmunogénicas variables, un amplio espectro de aplicación tanto para 30 utilización profiláctica como terapéutica. El principio de atenuación básico se origina a partir de nuevas mutaciones en el locus génico de la isla de patogenicidad 2 (SPI2) de Salmonella. Se han notificado recientemente mutaciones adicionales, que pueden utilizarse o bien solas o bien en combinación con mutaciones en genes de sse o SPI-2 o en combinación con la mutación de aroA para lograr una atenuación óptima de cepas portadoras de vacuna viva (Heithoff et al., 1999; Valentine et al., 1998). Mediante la combinación de las mutaciones individuales en el locus génico SPI-2 35 entre sí y con otras mutaciones génicas atenuantes conocidas, tales como aroA, etc., puede lograrse un amplio repertorio de atenuación e inmunogenicidad. Pueden introducirse diferentes casetes de expresión en estas plataformas, permitiendo una modulación adicional de la respuesta inmunitaria dirigida contra los antígenos heterólogos. Finalmente, se genera una biblioteca de cepas portadoras de vacuna de Salmonella viva recombinante individuales, que cubre un amplio espectro de potencial inmunoestimulador, a partir de la cual puede confeccionarse una cepa de vacuna viva 40 genuina para lograr la protección o el tratamiento óptimo de seres humanos y/o animales contra una enfermedad o patógenos específicos.

Por tanto, la presente invención se refiere a una célula de Salmonella atenuada que comprende el locus génico SPI2, en la que por lo menos un gen del locus SPI2 está inactivado, en la que dicha inactivación da como resultado una atenuación/reducción de la virulencia en comparación con el tipo natural de dicha célula de Salmonella. 45

Los genes presentes en la isla de patogenicidad 2 de Salmonella que codifican para una variedad de proteínas implicadas en la secreción de tipo III y aquellos que se requieren para la supervivencia y propagación sistémica dentro de células fagocíticas son candidatos ideales para la atenuación de Salmonella ssp patógena.

Varios patógenos bacterianos gram-negativos incluyendo Salmonella ssp, secretan ciertas proteínas de virulencia mediante sistemas de secreción de tipo III especializados. Los factores de virulencia permiten que las 50 bacterias patógenas colonicen un nicho en el huésped a pesar de los ataques específicos del sistema inmunitario. Los sistemas de secreción de tipo III comprenden un gran número de proteínas requeridas para transferir proteínas efectoras específicas a las células huésped eucariotas de una manera dependiente de contacto, por tanto también se han denominado sistemas secretores dependientes de contacto. Aunque varios componentes del aparato del sistema de

secreción muestran una conservación funcional y evolutiva a través de especies bacterianas, las proteínas efectoras están peor conservadas y presentan funciones diferentes.

En el contexto de la presente invención “célula de Salmonella que comprende el locus génico SPI2” es una célula de Salmonella que presenta un locus génico que alberga genes requeridos para la supervivencia y propagación sistémica dentro de células fagocíticas. Huéspedes típicos son mamíferos, por ejemplo, seres humanos, y aves, por 5 ejemplo, pollos. Una célula de Salmonella particularmente preferida es el serotipo de Salmonella typhimurium tipo definitivo 104 (DT 104).

La Salmonella typhimurium es poco corriente porque contiene dos sistemas de secreción de tipo III para determinantes de virulencia. El primero controla la invasión bacteriana de células epiteliales, y está codificado por genes dentro de una isla de patogenicidad de 40 kb (SPI1). El otro está codificado por genes dentro de una segunda isla de 10 patogenicidad de 40 kb (SPI2) y se requiere para el crecimiento sistemático de este patógeno dentro de su huésped. Los genes ubicados en la isla de patogenicidad SPI1 son responsables principalmente de las etapas tempranas del proceso de infección, la invasión de células huésped no fagocíticas por la bacteria. Para la mayoría de los genes de SPI1, las mutaciones dan como resultado una reducción de la invasividad in vitro. Sin embargo, mutantes que son defectuosos en la invasión no son necesariamente avirulentos; estudios en ratones demostraron que, aunque estas mutaciones en 15 genes de SPI1 reducían significativamente la virulencia tras la administración por la vía oral, no tenían ninguna influencia sobre la virulencia tras una vía intraperitoneal de infección. En conjunto, estos resultados indican que mutaciones en genes dentro de la isla de patogenicidad SPI1 no suprimen la infección sistémica y por tanto no son muy útiles para el desarrollo de una cepa portadora de Salmonella atenuada, segura. En comparación, estudios de virulencia de mutantes de SPI2 han mostrado que están atenuados en por lo menos cinco órdenes de magnitud en comparación con la cepa de 20 tipo natural tras la inoculación tanto oral como intraperitoneal de ratones.

Muchos de los genes que codifican para componentes del sistema de secreción de SPI2 están ubicados en un segmento de 25 kb de SPI2. SPI2 contiene genes para un aparato de secreción de tipo III (ssa) y un sistema regulador de dos componentes (ssr), así como genes candidatos para un conjunto de efectores secretados (sse) y sus chaperonas específicas (sse). Basándose en las similitudes con genes presentes en otros patógenos bacterianos, los primeros 13 25 genes dentro del operón ssaKlU y ssaJ codifican para componentes del aparato del sistema de secreción. Varios genes adicionales, incluyendo ssaC (orf 11 en Shea et al., 1996; spiA en Ochman et al., 1996) y ssrA (orf 12 en Shea et al., 1996; spiR en Ochman et al., 1996), que codifican para una proteína del aparato del sistema de secreción y una proteína reguladora de dos componentes, respectivamente, se encuentran en una región a aproximadamente 8 kb de ssaJ.

Preferentemente, la célula de Salmonella atenuada de la presente invención ha inactivado por lo menos un gen 30 seleccionado de genes efectores (sse), genes del aparato de secreción (ssa), genes de chaperonas (ssc) y genes de regulación (ssr). Más preferentemente, el por lo menos un gen inactivado es un gen sse, ssc y/o ssr, incluso se prefiere más un gen sse y/o ssc.

En lo que se refiere a los genes sse afectados por la inactivación, el gen inactivado es preferentemente sseC, sseD, sseE o una combinación de los mismos. En lo que se refiere a los genes ssr afectados por la inactivación, 35 preferentemente por lo menos ssrB está inactivado. En lo que se refiere a los genes ssc afectados por la inactivación, preferentemente por lo menos sscB está inactivado.

La inactivación de dicho gen del locus SPI2 se efectúa mediante una mutación que puede comprender deleción. Se prefieren deleciones de por lo menos seis nucleótidos, y se prefiere más una deleción de la secuencia codificante parcial y, en particular, completa de dicho gen. La mutación también puede comprender la inserción de una 40 molécula de ácido nucleico heterólogo en dicho gen que va a inactivarse o una combinación de deleción e inserción.

La Salmonella ssp. patógena sirve como base para la construcción de un panel de diferentes prototipos de vacuna de Salmonella viva generados mediante atenuaciones graduales logradas a través de la introducción de mutaciones del locus génico SPI2 definidas. Cada prototipo de vacuna de Salmonella viva individual resultante se transforma adicionalmente en una vacuna recombinante multivalente mediante la introducción de módulos de ADN 45 intercambiables que portan (1) genes modificados genéticamente de patógenos heterólogos y (2) sistemas de expresión adecuados que ejecutan una presentación de antígenos eficaz al sistema inmunitario del huésped. En conjunto, estas características provocan una respuesta inmunitaria específica que o bien protege a los huéspedes vacunados frente a la invasión posterior por Salmonella y/u otros patógenos (vacunación profiláctica) o bien elimina patógenos persistentes, tales como Helicobacter pylori (vacunación terapéutica). 50

La Salmonella ssp. patógena se atenúa gradualmente mediante mutaciones en genes de virulencia individuales que son parte del locus génico SPI2, por ejemplo un gen sse que codifica para una proteína efectora, tal como sseC, sseD o sseE, o un gen ssc, tal como sscB, que codifica para una chaperona, o un gen ssr, tal como ssrB, que codifica para un regulador. La mutación individual de cada uno de estos genes conduce a un grado individual único de atenuación que, a su vez, efectúa una respuesta inmunitaria característica a los niveles de la mucosa, humoral y celular. 55 El grado individual de atenuación puede aumentarse moderadamente mediante combinaciones de por lo menos dos mutaciones génicas dentro del locus génico SPI2 o mediante combinación con una mutación en otro gen de Salmonella que se sabe que atenúa la virulencia, por ejemplo un gen aro, tal como aroA. Se logra un grado más fuerte de atenuación mediante la mutación de un gen de virulencia que es parte de una agrupación de genes policistrónica que

codifica para varios factores de virulencia, tal como la unidad transcripcional que comprende los genes sseC, sseD, sseE y sscB, de manera que la mutación ejerce un efecto polar, alterando la expresión de los siguientes genes. El grado de atenuación puede depender directamente del número de genes de virulencia que se ven afectados por la mutación polar así como sus características individuales. Finalmente, se logra la atenuación más fuerte cuando se mutan genes reguladores, tales como ssrB. De nuevo, cada modo de atenuación de una Salmonella ssp. conduce a la generación de 5 una cepa de vacuna de Salmonella viva que provoca una respuesta inmunitaria a los niveles de la mucosa, humoral y celular que es característica del tipo y/o la combinación de mutaciones atenuantes presentes en esa cepa. El panel de cepas de vacuna de Salmonella viva atenuada de manera diferente que se genera representa un conjunto de posibles cepas portadoras a partir del cual puede seleccionarse el portador que provoca la respuesta inmunitaria más eficaz para o bien la prevención o bien la erradicación de la enfermedad conjuntamente con los antígenos heterólogos que se 10 expresan.

Se introducen preferentemente mutaciones que conducen a la atenuación de los genes de virulencia de Salmonella indicados mediante tecnología de ADN recombinante como deleciones definidas que o bien delecionan completamente el gen de virulencia seleccionado o bien dan como resultado un gen truncado que codifica para un factor de virulencia inactivo. En ambos casos, la mutación implica un único gen y no afecta a la expresión de genes vecinos 15 (mutación no polar). Se prefiere una mutación por inserción en uno de los genes de virulencia indicados cuando el gen seleccionado es parte de una agrupación de genes de virulencia policistrónica y todos los siguientes genes de virulencia están incluidos en el proceso de atenuación (mutación polar). Las mutaciones por inserción con efectos no polares se restringen en general a genes que o bien se transcriben individualmente o bien están ubicados en el extremo de una agrupación policistrónica, tal como ssrB. Sin embargo, pueden surgir espontáneamente otras mutaciones atenuantes, 20 mediante mutagénesis química, mutagénesis por energía u otras formas de mutagénesis física o como resultado del acoplamiento u otras formas de intercambio genético.

Por tanto, la mutación que da como resultado la célula de Salmonella atenuada puede ser una mutación polar o no polar. Además, según la presente invención, el grado de atenuación se modifica inactivando un gen adicional fuera del locus SPI2, por ejemplo, otro gen de virulencia o un gen que está implicado en la biosíntesis de un metabolito o un 25 precursor del mismo tal como los genes aro, o cualquier otro gen adecuado tal como superóxido dismutasa (SOD). Se prefiere que el gen adicional sea un gen aro, lo más preferentemente aroA.

La célula de Salmonella atenuada según la invención puede comprender además elementos que facilitan la detección de dicha célula y/o la expresión de una molécula de ácido nucleico heterólogo insertada. Un ejemplo de un elemento que facilita la detección de la célula atenuada es un casete de marcador selectivo, en particular, un casete de 30 marcador selectivo que puede conferir resistencia a antibióticos a la célula. En una forma de realización, el casete de marcador selectivo confiere una resistencia a antibióticos para un antibiótico que no se utiliza para terapia en un mamífero. Ejemplos de elementos que facilitan la expresión de una molécula de ácido nucleico heterólogo son un casete de expresión génica que puede comprender uno o más promotores, potenciadores, opcionalmente terminadores de la transcripción o una combinación de los mismos, un casete transactivador, un casete de invertasa para la expresión en 1 35 fase o 2 fases de un ácido nucleico heterólogo. Un ejemplo de un elemento que facilita la inserción de una molécula de ácido nucleico heterólogo es un casete de inserción.

La presente solicitud también describe un portador para la presentación de un antígeno a un huésped, portador que es la célula de Salmonella atenuada de la invención comprendiendo dicha célula por lo menos una molécula de ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicho antígeno, pudiendo 40 dicha célula expresar dicha molécula de ácido nucleico o pudiendo provocar la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en una célula diana.

Preferentemente, dichas moléculas de ácido nucleico comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica para un antígeno viral o bacteriano o para un antígeno tumoral. Ejemplos de antígenos bacterianos son antígenos de Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Borrelia burgdorferi y Nanobacteria. Ejemplos de antígenos 45 virales son antígenos del virus de la hepatitis, por ejemplo hepatitis B y C, virus del papiloma humano y herpesvirus. La molécula de ácido nucleico heterólogo puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica para por lo menos un dominio de direccionamiento de péptido o polipéptido y/o un dominio inmunoestimulador. Por tanto, el producto de expresión de dicha molécula de ácido nucleico heterólogo puede dirigirse específicamente a compartimentos predeterminados tales como periplasma, membrana externa, etc. La molécula de ácido nucleico 50 heterólogo puede codificar para una proteína de fusión.

Según una forma de realización de la presente invención, la molécula de ácido nucleico heterólogo se inserta en el locus SPI2, de manera preferida, en un gen sse y, de manera más preferida, en sseC, sseD y/o sseE, en particular, sseC.

La inserción puede ser una inserción polar o una inserción no polar. Generalmente, se prefiere la introducción 55 de una inserción no polar, puesto que permite la expresión de los restantes genes de una agrupación de genes policistrónica, que pueden utilizarse para la generación de portadores que presentan diferentes grados de atenuación.

Se utilizan vacunas de Salmonella vivas atenuadas como portadores para antígenos específicos de patógenos heterólogos, por ejemplo Helicobacter, etc., actuando así como una vacuna multivalente. Los antígenos heterólogos se proporcionan mediante un casete de expresión génica (GEC) que se inserta mediante ingeniería genética en el genoma de una cepa de Salmonella atenuada. Preferentemente, la inserción del casete de expresión génica se dirige a uno de los genes de virulencia indicados, provocando de ese modo una mutación por inserción tal como se describió en el 5 párrafo anterior. En otra forma de aplicación, la expresión de los genes heterólogos en el casete de expresión génica se regula mediante factores de actuación en trans codificados por un casete transactivador (TC) o un casete de invertasa que realiza un modo de expresión variable en 2 fases. Preferentemente, la inserción del casete transactivador se dirige a un segundo gen de virulencia seleccionado, que entonces se inactiva. Alternativamente, el casete de expresión génica o el casete transactivador o el casete de invertasa pueden introducirse en el genoma de Salmonella mediante inserción 10 mediada por transposón, que no presenta efecto de atenuación.

Se requieren los principios de ingeniería genética para generar mutaciones o bien por deleción o bien por inserción en genes de virulencia de Salmonella. Generalmente, se introduce en la cepa de Salmonella receptora mediante conjugación un plásmido suicida que porta un casete de gen de virulencia mutado que contiene un casete de marcador selectivo (SMC) o bien solo o bien en combinación con un casete de expresión génica o un casete 15 transactivador o el casete de invertasa. El gen de virulencia original se reemplaza por el casete de gen de virulencia mutado mediante recombinación homóloga, y el plásmido suicida, que no puede replicarse en la cepa receptora de Salmonella, se agota rápidamente. Puede seleccionarse Salmonella recombinada de manera satisfactoria basándose en propiedades (tales como, pero sin limitarse a, resistencia a antibióticos) conferidas por el producto del/de los gen(es) dentro del casete de marcador selectivo. El casete de gen de virulencia mutado comprende secuencias de ADN que son 20 homólogas al genoma de la cepa de Salmonella receptora en la que se localiza el gen de virulencia original. En el caso en el que el gen de virulencia original va a delecionarse completamente, sólo aquellas secuencias de ADN genómico que limitan con el gen de virulencia original (indicadas como regiones flanqueantes) se incluyen en el casete de gen de virulencia mutado. La arquitectura general de un casete de gen de virulencia mutado incluye en cada extremo una secuencia de ADN de por lo menos 50 nucleótidos, de manera ideal 200 - 250 nucleótidos, que es homóloga al 25 segmento del genoma en el que se localiza el gen de virulencia original. Estas secuencias de ADN flanquean una casete de marcador y los otros casetes, tales como el casete de expresión génica (GEC) o el casete transactivador (TC) o el casete de invertasa. Tal como se indicó anteriormente, estos casetes se utilizan para generar mutaciones por inserción que alteran la expresión génica original. Para deleciones en marco, se utiliza preferentemente un casete de marcador selectivo. 30

El casete de marcador selectivo (SMC) consiste principalmente en un gen que media la resistencia a un antibiótico que puede inactivar la cepa de Salmonella receptora pero que realmente no se utiliza en el tratamiento de salmonelosis. Alternativamente, puede utilizarse otro marcador seleccionable. El casete de marcador selectivo se inserta en marco en el gen de virulencia seleccionado como diana y, en consecuencia, la expresión del gen marcador está bajo el control del promotor del gen de virulencia. Alternativamente, el casete se inserta dentro de una unidad transcripcional 35 policistrónica, en cuyo caso el gen marcador está bajo del control del promotor para esta unidad. En otra aplicación, el gen de marcador selectivo está bajo el control de su propio promotor; en este caso se incluye un terminador de la transcripción en el sentido de 3’ del gen. El marcador selectivo se necesita para indicar la inserción satisfactoria del casete de gen de virulencia mutado en el genoma de la cepa de Salmonella receptora. Además, el marcador de resistencia a antibiótico se necesita para facilitar la evaluación inmunológica preclínica de las diversas cepas de 40 Salmonella atenuadas. En otra forma de aplicación, el marcador selectivo está flanqueado por repeticiones directas, que, en ausencia de presión selectiva, conducen a la escisión recombinatoria del casete de marcador selectivo del genoma, dejando la secuencia corta de la repetición directa. Alternativamente, el casete de marcador selectivo puede eliminarse completamente mediante tecnología de ADN recombinante. En primer lugar, el casete de marcador selectivo se elimina mediante una endonucleasa de restricción adecuada del casete del gen de virulencia mutado original en el 45 plásmido suicida dejando las secuencias de regiones flanqueantes que son homólogas al genoma de Salmonella. El plásmido suicida se transfiere entonces a la cepa de Salmonella receptora atenuada mediante conjugación en la que el casete del gen de virulencia mutado agotado en SMC reemplaza el casete del gen de virulencia mutado que porta SMC mediante recombinación. Tras la eliminación del marcador selectivo, la cepa de Salmonella atenuada es libre para la aplicación en seres humanos. Se incluyen generalmente secuencias de terminador de la transcripción en los casetes 50 cuando se establecen mutaciones polares.

El casete de expresión génica (GEC) comprende elementos que permiten, facilitan o mejoran la expresión de un gen. En un modo funcional, el casete de expresión génica comprende adicionalmente una o más unidades de expresión génica derivadas o bien de genes completos de una fuente heteróloga o bien de fragmentos de los mismos, con un tamaño mínimo de un epítopo. Múltiples unidades de expresión génica se organizan preferentemente como una 55 estructura concatemérica. Los genes o fragmentos de genes se modifican por ingeniería genética adicionalmente, de manera que las proteínas o proteínas de fusión resultantes se expresan en el citosol, en el periplasma, se presentan en la superficie o se secretan. Además, los genes o fragmentos de genes pueden fusionarse con secuencias de ADN que codifican para partes de proteínas inmunológicamente reactivas, por ejemplo citocinas o toxinas bacterianas atenuadas. Los genes o fragmentos de genes o bien se controlan en un modo de una fase a partir de un promotor dentro del casete 60 de expresión génica o bien en un modo de 2 fases o indirectamente mediante un casete transactivador (TC). En el modo de una fase, el promotor es preferentemente un promotor de Salmonella que se activa, es decir, se induce, por señales del entorno pero también pueden utilizarse promotores constitutivos de diferente fuerza. En el modo de 2 fases, la

expresión del casete génico está controlada por una invertasa que se deriva de un casete de invertasa. La invertasa cataliza la inversión de un segmento de ADN que comprende el casete génico. El segmento de ADN está flanqueado en cada extremo por una repetición invertida que es el sustrato específico para la invertasa, produciendo finalmente dos orientaciones del casete génico con respecto al promotor del casete de expresión génica. En la orientación ON, el casete génico está correctamente colocado permitiendo la transcripción del casete génico. En OFF, la orientación del 5 casete génico es incorrecta y no se produce transcripción. El casete de invertasa comprende una invertasa que está controlada por un promotor constitutivo o un promotor de Salmonella inducido o desreprimido por señales del entorno.

Pueden expresarse antígenos heterólogos codificados dentro del casete de expresión génica bajo el control de un promotor, por ejemplo un promotor específico de tejido, que puede ser constitutivo o inducible. La expresión puede activarse en una célula diana, mediante lo cual se transmite una señal desde la célula diana hasta el interior de la célula 10 de Salmonella, señal que induce la expresión. La célula diana, por ejemplo, puede ser un macrófago. El producto de expresión puede comprender un dominio de direccionamiento o un dominio inmunoestimulador, por ejemplo en forma de una proteína de fusión. La propia proteína heteróloga puede ser también una proteína de fusión. Los antígenos heterólogos pueden expresarse opcionalmente como proteínas citosólicas, periplásmicas, presentadas en la superficie o secretoras o proteínas de fusión con el fin de lograr una respuesta inmunitaria eficaz. Las secuencias que codifican para 15 el antígeno pueden fusionarse a secuencias auxiliares que dirigen las proteínas al periplasma o la membrana externa de la célula de Salmonella o al medio extracelular. Si los polipéptidos heterólogos se secretan, la secreción puede producirse utilizando un sistema de secreción de tipo III. La secreción mediante el sistema de secreción de tipo III de SPI2 es adecuada. Las proteínas que están destinadas al compartimento citosólico de la Salmonella no necesitan secuencias auxiliares, en este caso, deben eliminarse secuencias auxiliares que se producen de manera natural de los 20 genes que codifican para tales antígenos.

Las secuencias auxiliares para el compartimento periplásmico de Salmonella comprenden una secuencia de ADN deducida a partir del péptido señal localizado en el extremo amino-terminal de una proteína heteróloga translocada de manera natural mediante la ruta de secreción general, por ejemplo CtxA, etc.

Las secuencias auxiliares para el compartimento de la membrana externa de Salmonella comprenden 25 preferentemente secuencias de ADN deducidas a partir de las partes funcionalmente relevantes de una proteína secretora de tipo IV (autotransportador), por ejemplo, AIDA o IgA proteasa. La proteína de fusión apropiada contiene un péptido señal localizado en el extremo amino-terminal y, en el extremo carboxilo-terminal, un dominio transmembrana con forma de barril β al que se acopla la proteína pasajera foránea mediante un espaciador que ancla la proteína pasajera a la superficie bacteriana. 30

Las secuencias auxiliares para la secreción al medio extracelular comprenden secuencias de ADN deducidas a partir de proteínas secretadas de manera natural mediante el sistema de secreción de tipo III. En una proteína de fusión generalmente funcional, el antígeno heterólogo se fusiona en el centro de una proteína secretada de manera natural mediante la ruta de tipo III o en el extremo carboxilo-terminal de la respectiva proteína.

Los casetes transactivadores (TC) proporcionan activadores que generalmente mejoran la expresión de los 35 antígenos heterólogos codificados por los diversos casetes de expresión génica. Tales activadores actúan o bien directamente (ARN polimerasa) o bien indirectamente (activador transcripcional) sobre el nivel de transcripción en un orden altamente específico. Preferentemente, la expresión de tales activadores está controlada por promotores de Salmonella que se inducen in vivo mediante señales del entorno. En otra forma de aplicación, la síntesis del activador dentro del casete transactivador está regulada en un modo de 2 fases. La invertasa expresada por el casete de 40 invertasa coloca el fragmento de ADN que codifica para el activador en dos orientaciones con respecto al promotor transcripcional. En la orientación ON, el gen activador está en el orden de transcripción correcto. En el modo OFF, el activador está orientado incorrectamente y no se produce expresión.

En el sistema sencillo, el producto génico del casete transactivador ejerce su efecto directamente sobre el promotor presente en el casete de expresión génica, activando directamente o desreprimiendo la expresión del gen 45 heterólogo. En el sistema complejo, la activación del promotor en el casete de expresión de gen heterólogo depende de dos o más factores de interacción, por lo menos uno de los cuales (codificado en el casete transactivador) puede estar regulado por señales externas. Se encuentra complejidad adicional en sistemas en cascada, en los que la señal externa no ejerce directamente su efecto sobre el casete transactivador, sino más bien a través de un proceso de múltiples etapas, o en los que el producto génico del casete transactivador no ejerce directamente su efecto sobre el casete de 50 expresión de gen heterólogo, sino más bien a través de un proceso de múltiples etapas.

La presente invención se refiere a una célula de Salmonella atenuada que comprende el locus génico SPI2, caracterizado por una falta de por lo menos un polipéptido de SPI2, en la que dicha falta da como resultado una atenuación/reducción de la virulencia en comparación con el tipo natural de dicha célula. Preferentemente, dicho polipéptido de SPI2 que falta es uno o más polipéptidos efectores, polipéptidos del aparato de secreción, polipéptidos de 55 chaperonas o polipéptidos reguladores. Además, dicha célula de Salmonella atenuada puede ser un portador que entonces se caracteriza por la presencia de por lo menos un péptido o polipéptido heterólogo que presenta propiedades inmunogénicas.

Otro aspecto de la presente invención consiste en una composición farmacéutica que comprende como agente

activo una vacuna viva inmunológicamente protectora que es una célula de Salmonella atenuada según la invención. La composición farmacéutica comprenderá aditivos tales como diluyentes, portadores y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Estos aditivos los conoce el experto en la materia. Habitualmente, la composición se administrará a un paciente por medio de una superficie mucosa o por medio de la vía parenteral.

La presente solicitud describe un procedimiento para la preparación de una vacuna viva, que comprende 5 proporcionar una célula de Salmonella viva que comprende el locus SPI2 e inactivar por lo menos un gen del locus SPI2 para obtener una célula de Salmonella atenuada de la invención, y opcionalmente insertar por lo menos una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica para un antígeno para obtener un portador según la invención. Un aspecto adicional se refiere a un procedimiento para la preparación de una composición de vacuna viva que comprende formular una célula de Salmonella atenuada según la invención en una cantidad farmacéuticamente eficaz junto con diluyentes, 10 portadores y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

Resultarán evidentes para el experto en la materia procedimientos para detectar una propiedad específica de la célula de Salmonella atenuada, que no está presente en el tipo natural. Por ejemplo, si esta propiedad específica de la célula de Salmonella atenuada comprende una deleción de una o más partes del locus SPI2, entonces la presencia de dicha célula puede detectarse proporcionando un par de cebadores específicos que son complementarios a secuencias 15 que flanquean esta deleción y amplificando un fragmento de longitud específica utilizando procedimientos de amplificación tales como PCR.

Otra forma de realización de la invención es la utilización de la célula de Salmonella atenuada según la invención para la preparación de un fármaco para el tratamiento preventivo o terapéutico de una enfermedad crónica o aguda provocada esencialmente por una bacteria o un virus. Por ejemplo, para la prevención o el tratamiento de una 20 infección por Salmonella se administrará una célula de Salmonella atenuada para generar la respuesta inmunitaria de un paciente afectado.

El potencial inmunoprotector individual de cada una de las cepas de vacuna de Salmonella recombinante establecidas se determina en un modelo de ratón utilizando Salmonella typhimurium patógena como cepa de exposición.

- Determinación del potencial de virulencia de la cepa de vacuna de Salmonella recombinante: (1) índice 25 competitivo o DL50; (2) prevalencia sistémica en sangre, hígado y bazo estrictamente excluida.

- Determinación del potencial inmunoestimulador de la cepa portadora con un antígeno de prueba heterólogo expresado de manera citosólica: (1) inmunización oral única y evaluación posterior de la respuesta inmunitaria a corto y largo plazo: (a) análisis del perfil de respuesta inmunitaria humoral, (b) análisis del perfil de respuesta inmunitaria de la mucosa, (c) análisis del perfil de respuesta inmunitaria celular; (2) inmunizaciones orales 30 múltiples y posterior evaluación de la respuesta inmunitaria a corto y largo plazo: (a) análisis del perfil de respuesta inmunitaria humoral, (b) análisis del perfil de respuesta inmunitaria de la mucosa, (c) análisis del perfil de respuesta inmunitaria celular.

- Determinación del potencial inmunoestimulador de la cepa portadora para la administración de ADN heterólogo (vacunación con ADN). 35

Preferentemente, la cepa aceptora de Salmonella presenta una amplia gama de huéspedes, mostrando una patogenicidad significativa tanto en animales como en seres humanos. De manera ideal, esta es una cepa de Salmonella que es fuertemente patógena para ratones, tal como S. typhimurium. Tras el desarrollo satisfactorio de la cepa de vacuna de Salmonella recombinante, la cepa puede aplicarse directamente para su utilización tanto en animales como en seres humanos. Si una cepa aceptora de Salmonella ideal de este tipo no es satisfactoria para el huésped 40 respectivo, debe seleccionarse otra Salmonella específica de huésped, tal como S. typhi para seres humanos.

La presente invención se refiere a la utilización de una molécula de ácido nucleico tal como se muestra en la figura 21A o B o una de las figuras 22A-Q, opcionalmente modificada tal como se describió anteriormente en la presente memoria para la preparación de una célula de Salmonella atenuada, y a la utilización del locus SPI2 de Salmonella para la preparación de una célula de Salmonella atenuada para la presentación de un antígeno a un huésped. En este 45 contexto, la expresión “locus SPI2 de Salmonella” se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico, codificante o no codificante, y al producto de expresión de secuencias codificantes.

La presente solicitud describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un ácido nucleico de por lo menos 100 nucleótidos a) de la secuencia de ácido nucleico de una de las figuras 24A, B, b) de una secuencia de ácido nucleico que en condiciones rigurosas se hibrida con la secuencia de ácido nucleico de una de las figuras 24A, B. 50

En particular, dicha molécula de ácido nucleico puede inducir la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido o polipéptido operativamente unido a dicha molécula de ácido nucleico.

El promotor inducible in vivo Pivi comprende un fragmento de ADN que porta secuencias para un operador y un promotor transcripcional. Tal promotor inducible in vivo puede identificarse aplicando un enfoque de gen indicador adecuado. Se han identificado dos de tales promotores inducibles in vivo dentro del locus SPI2 que inician la expresión 55 del operón ssaBCDE (promotor A2) y el operón sseABsscAsseCDEsscBsseFG (promotor B), respectivamente. Estos

promotores se inducen mediante un sistema regulador que comprende los productos génicos de ssrA y ssrB. Este sistema regulador es parte del locus SPI2 responsable de la activación de genes del locus SPI2 adicionales. El sistema regulador se activa en macrófagos mediante señal(es) del entorno por medio de la proteína sensora SsrA. La proteína SsrB finalmente se une a una secuencia de ADN definida que inicia la transcripcion a través de la ARN polimerasa.

En una forma de aplicación, el fragmento de ADN que comprende secuencias operadoras/promotoras se 5 inserta en frente de un gen de invertasa o un gen activador o un casete de expresión génica, ejerciendo de ese modo una expresión inducible in vivo en bacterias que portan por lo menos los genes ssrA y ssrB o el locus SPI2 completo.

Por tanto, en otra forma de realización, la invención se refiere a un sistema de expresión para la expresión inducible in vivo de un ácido nucleico heterólogo en una célula diana, que comprende una célula de Salmonella que comprende dicho ácido nucleico heterólogo, en el que dicha célula de Salmonella comprende (a) un polipéptido que 10 presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 23P (ssrA) o un homólogo funcional de la misma, (b) un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 23Q (ssrB) o un homólogo funcional de la misma, y (c) la molécula de ácido nucleico de una de las figuras 24A, B o un homólogo funcional de la misma, tal como se describió anteriormente.

La célula diana puede ser cualquier célula adecuada pero preferentemente es un macrófago. La célula diana 15 puede comprender también uno o más de los elementos descritos anteriormente tales como casetes de marcadores selectivos, casetes de expresión génica, casetes transactivadores, casetes de invertasa y/o casetes de inserción. Además, puede comprender un ácido nucleico heterólogo, en particular, los ácidos nucleicos heterólogos pueden insertarse en un casete de expresión génica, haciendo así que el GEC sea funcional.

Procedimientos experimentales 20

Las cepas, el material y los procedimientos utilizados en el sistema de secreción de tipo III del trabajo sobre la isla de patogenicidad 2 (SPI2) de Salmonella descrito anteriormente son los siguientes:

Ratones

Se mantuvieron ratones BALB/c (H-2d) hembra de 6-12 semanas de edad en condiciones convencionales según las directrices institucionales. Este estudio fue aprobado por un comité ético para la utilización de animales en 25 investigación experimental.

Cepas bacterianas, fagos y plásmidos

Las cepas bacterianas, los fagos y los plásmidos utilizados en este estudio se indican en la tabla 1. A menos que se indique lo contrario, se hicieron crecer las bacterias a 37ºC en agar o caldo Luria Bertani (LB), complementado con ampicilina (50 μg/ml), kanamicina (50 μg/ml) o cloranfenicol (50 μg/ml) cuando sea apropiado. Se hicieron crecer 30 células eucariotas en RPMI 1640 complementado con suero de ternera fetal (FCS) al 10%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 50 μg/ml, 2-mercaptoetanol 5x10-5 M y L-glutamina 1 mM (GIBCO BRL; Prisley, Escocia). Para lograr la expresión constitutiva de β-gal, se introdujo por electroporación el plásmido pAH97 (Holtel et al., 1992) en las cepas portadoras tal como se describe en otro sitio (O’Callaghan y Charbit, 1990).

Tabla 1. Fagos, plásmidos y cepas bacterianas utilizados en este trabajo. 35

Fago, plásmido o cepa

Descripción Referencia

Fagos

λ1

clon de una biblioteca de ADN genómico de S. typhimurium en λ1059 Shea et al., 1996

λ2

clon de una biblioteca de ADN genómico de S. typhimurium en λ1059 Shea et al., 1996

λ5

clon de una biblioteca de ADN genómico de S. typhimurium en λ1059 Shea et al., 1996

Plásmidos pBluescriptKS+,

Ampr; vectores de clonación de alto número de copias Stratagene,

pBluescriptSK+ pUC18

Ampr; vector de clonación de alto número de copias Heidelberg Gibco-BRL, Eggenstein

pT7-Blue

Ampr; vector de clonación de alto número de copias Novagcn, Heidelberg

pCVD442

vector suicida Donnenberg et al., 1991

pACYC184

Cmr,Tetr; vector de clonación de bajo número de copias Chang y Cohen, 1978

pGPL01

R6K ori, Ampr; vector suicida dependiente de λpir para fusiones luc Gunn y Miller, 1996

pLB02

R6K ori, Ampr; vector suicida dependiente de λpir para fusiones luc Gunn y Miller, 1996

pGP704

R6K ori, Ampr; vector suicida dependiente de λpir Miller y Mekalanos, 1988

pKAS32

Ampr; vector suicida dependiente de λpir; rpsls Skorupski y Taylor, 1996

pNQ705

R6K ori, Cmr; vector suicida dependiente de λpir Forsberg et al.,

pSB315

Kanr, Ampr 1994 Galan et al., 1992

p1-6

Ampr, fragmento de PstI/BamHI de 4,8 kb de λ1 en pT7-Blue este trabajo

p1-20

fragmento de BamHI/HincII de 1,7 kb de p1-6 en pKS+ este trabajo

p1-21

casete aphT en el sitio EcoRV de p1-20 este trabajo

p1-22

inserto de XbaI/KpnI de p1-21 en pKAS32 este trabajo

p2-2

Ampr, fragmento de BamHI de 5,7 kb de λ2 en pUC18 este trabajo

p2-20

fragmento de HindIII/HincII de 1,6 kb de p2-2 este trabajo

p2-21

en el casete pKS+ aphT digerido con HindIII/SmaI en el sitio HincII de p2-20 este trabajo

p2-22

inserto de p2-21 en pKAS32 este trabajo

p2-50

fragmento de BamHI/KpnI de 3,7 kb de p2-2 en pKS+ este trabajo

p5-2

Ampr; fragmento de EcoRI de 5,7 kb de λ5 en pKS+ este trabajo

p5-30

fragmento de PstI/EcoRI de 3,0 kb de p5-2 en pUC18 este trabajo

p5-31

casete aphT en el sitio EcoRV de p5-30 este trabajo

p5-33

inserto de SphI/EcoRI de p5-31 en pGP704 este trabajo

p5-4

Ampr; fragmento de HindIII de 5,8 kb de λ5 en pSK+ este trabajo

p5-40

fragmento de SstI/HindIII de 4,5 kb de p5-2 en pKS+ este trabajo

p5-41

casete aphT en el sitio SmaI de p5-40 este trabajo

p5-43

inserto de KpnI/SstI de p5-41 en pNQ705 este trabajo

p5-5

Ampr; digestión con PstI de p5-4 y religación del fragmento más grande este trabajo

p5-50

fragmento de BamHI/ClaI de 2,6 kb de p5-2 en pKS+ este trabajo

Tabla 1 (continuación)

Fago, plásmido o cepa

Descripción Referencia

p5-51

casete aphT en el sitio HindIII de p5-50 tras relleno con fragmento Klenow este trabajo

p5-53

inserto de XbaI/SalI de p5-51 en pGP704 este trabajo

p5-60

digestión con ClaI de p5-2 y religación del fragmento más grande este trabajo

p5-8

Ampr, fragmento de PstI/HindIII de 2,2 kb de p5-2 en pSK+ este trabajo

psseA

Cmr; sseA en pACYC184 este estudio

psseB

Cmr; sseB en pACYC184 este estudio

psseC

Cmr; sseC en pACYC184 este trabajo

Cepas de E. coli

DH5α

véase la referencia Gibco-BRL

S17-1 λpir

fago lisogénico λpir (véase la referencia) Miller y Mekalanos, 1988

CC118 λpir

fago lisogénico λpir (véase la referencia) Herrero et al., 1990

XL1-Blue

véase la referencia Stratagene

Cepas de S. typhimurium

NCTC12023

tipo natural Colindale, RU

CS015

phoP-102::Tn10d-Cm Miller et al., 1989

CS022

phoPc Miller et al., 1989

P2D6

ssaV::mTn5 Shea et al., 1996

P3F4

ssrA::mTn5 Shea et al., 1996

P4H2

hilA::mTn5 Monack et al., 1996

P6E11

spaRS::mTn5 Shea et al., 1996

P8G12

ssrB::mTn5 Shea et al.,1996

P9B6

ssaV::mTn5 Shea et al.,1996

P9B7

ssaT::mTn5 Shea et al.,1996

P11D10

ssaJ::mTn5 Shea et al.,1996

NPssaV

ssaV::aphT. Kmr; mutación no polar Deiwick et al., 1998

HH100

sseAΔ:::aphT, Kmr; mutación no polar este estudio

HH101

HH100 que contiene psseA este estudio

HH102

sseBΔ:::aphT, Kmr; mutación no polar este estudio

HH103

HH102 que contiene psseB este estudio

HH107

sseFΔ:::aphT, Kmr; mutación no polar este estudio

HH108

sseG::aphT, Kmr; mutación no polar este estudio

MvP102

ΔsseEsscB,_Kmr; mutación no polar este trabajo

MvP103

sseC::aphT, Kmr; mutación no polar este trabajo

MvP103[psseC]

MvP103 que contiene psseC este trabajo

MvP131

ssaB::luc en S. typhimurium NCTC12023 este trabajo

MvP127

sseA::luc en S. typhimurium NCTC12023 este trabajo

MvP239

sipC::lacZY, EE638 en S. typhimurium NCTC 12023 Hueck et al., 1995; este trabajo

MvP244

ssaB::luc en S. typhimurium P8G12 este trabajo

MvP266

ssaH::luc en S. typhimurium NCTC12023 este trabajo

MvP284

ssrA::aphT, Kmr; mutación no polar este trabajo

MvP320

ssrB::aphT, Kmr; mutación no polar este trabajo

Tabla 1 (continuación)

Fago, plásmido o cepa

Descripción Referencia

MvP337

deleción en marco en sseC este trabajo

MvP338

deleción en marco en sseD este trabajo

MvP339

deleción en marco en sscB este trabajo

MvP340

deleción en marco en ssrA este trabajo

SL7207

S. typhimurium 2337-65 hisG46, DEL407 oroA::Tn1(Tc-s) donación de B.A.D. Stocker

III-57 sseC

Δ sseC este trabajo

EJEMPLO 1: Distribución de la isla de patogenicidad SPI-2 dentro de diferentes cepas de Salmonella

Se analizó la presencia de marcos de lectura abiertos de la región SPI-2 en diversos aislados de Salmonella y E. coli K-12 mediante hibridación de tipo Southern tal como se muestra en la tabla 2. 5

Tabla 2: Prevalencia de genes de SPI-2 en diversas Salmonella ssp. deducida a partir de sondas génicas representativas

Especie S. enterica S. enterica S. enterica

subesp. I I II serovar/serotipo typhimurium typhi ssrAB + + + ORF + + +

S. enterica

IIIa + +

S. enterica

IIIb + +

S. enterica

IV + +

S. enterica

VI + +

S. enterica

VII + +

S. bongori S. bongori E. coli K-12

66:z41:-- 44:z48:-- - - - + + -

La presencia o ausencia de bandas de hibridación se indica mediante + o -, respectivamente.

Hibridación

Se preparó ADN genómico de diversas cepas de Salmonella y E. coli K-12 tal como se describió anteriormente (Hensel et al., 1997a). Para el análisis por hibridación de tipo Southern, se digirió el ADN genómico con EcoRI o EcoRV, se fraccionó en geles de agarosa al 0,6% y se transfirió a membranas Hybond N+ (Amersham, Braunschweig). Se obtuvieron diversas sondas correspondientes a la región SPI-2 como fragmentos de restricción del inserto subclonado 5 de λ1. Se generaron sondas correspondientes a ORF 242 y ORF 319 mediante PCR utilizando los conjuntos de cebadores D89 (5’-TTTTTACGTGAAGCGGGGTG-3’) (SEC ID nº: 44) y D90 (5’-GGCATTAGCGGATGTCTGACTG-3’) (SEC ID nº: 45), y D91 (5’-CACCAGGAACCATTTTCTCTGG-3’) (SEC ID nº: 46) y D92 (5’-CAGCGATGACGATATTCGACAAG-3’) (SEC ID nº: 47), respectivamente. Se realizó la PCR según las especificaciones del fabricante (Perkin-Elmer, Weiterstadt). Se sometieron los productos de PCR a electroforesis en gel 10 de agarosa y se recuperaron fragmentos del tamaño esperado y se purificaron. Se marcaron las sondas de hibridación utilizando el sistema de marcaje con DIG tal como describe el fabricante (Boehringer, Mannheim).

EJEMPLO 2: Caracterización de genes sse y construcción de cepas MvP103, MvP101 y MvP102 de S. typhimurium mutantes para sseC::aphT, sseD::aphT y sseEΔ

Organización de genes sse y ssc 15

Con el fin de caracterizar SPI2 genética y funcionalmente, se ha clonado y secuenciado una región central de la isla de patogenicidad (figura 1A). Se subclonaron fragmentos de ADN que cubrían la región entre ssaC y ssaJ en plásmidos p5-2 y p5-4 tal como se indica en la figura 1C. La disposición y la denominación de los genes en la región de 8 kb entre ssaC y ssaK se muestra en la figura 1B. Esta secuencia estará disponible a partir de la base de datos EMBL con el número de registro AJ224892 en un futuro cercano. La región secuenciada extiende el marco de lectura abierto 20 (ORF) de un gen que codifica para una supuesta subunidad del aparato de secreción de tipo III denominada spiB (Ochman et al., 1996). Por coherencia con la nomenclatura universal para subunidades del sistema de secreción de tipo III (Bogdanove et al., 1996) y la nomenclatura de otros genes de SPI2 (Hensel et al., 1997b), este gen se ha denominado ssaD. La secuencia de aminoácidos deducida de ssaD es un 24% idéntica a YscD de Y. enterocolitica. A esta le sigue un ORF con capacidad codificante para una proteína de 9,3 kDa, un 34% idéntica a YscE de Y. 25 enterocolitica. Por tanto, este gen se denomina ssaE. Una secuencia de 263 pb separa ssaE y un conjunto de nueve genes, varios de los cuales codifican para proteínas con similitud de secuencia con proteínas efectoras secretadas o sus chaperonas de otros patógenos. Estos genes están separados por regiones intergénicas cortas o tienen marcos de lectura solapantes y es probable que algunos se transcriban conjuntamente y estén acoplados traduccionalmente. Por tanto, los genes con similitud con aquellos que codifican para chaperonas se denominaron sscA y sscB, y los otros 30 sseA-E. La secuencia de aminoácidos deducida sscA muestra el 26% de identidad/el 49% de similitud a lo largo de 158 residuos de aminoácido con SycD, el producto de lcrH de Y. pseudotuberculosis que actúa como una chaperona específica de secreción para YopB y YopD (Wattiau et al., 1994). La secuencia de aminoácidos deducida de sscB muestra el 23% de identidad/el 36% de similitud a lo largo de 98 residuos de aminoácido con Ippl de Shigella flexneri. Ippl es una chaperona para proteínas de invasión de S. flexneri (Ipas) (Baundry et al., 1988). Como en el caso de las 35 chaperonas de secreción SycD, Ippl y SicA (Kaniga et al., 1995), SscB presenta un pl ácido (tabla 3), mientras que SscA presenta un pl inusitadamente alto de 8,8. SseB es el 25% idéntico/el 47% similar a EspA de EPEC a lo largo de la longitud completa de la proteína de 192 residuos de aminoácido (figura 2b). SseD es el 27% idéntico/el 51% similar a EspB de EPEC a lo largo de 166 residuos de aminoácido. SseC presenta una similitud de secuencia con una clase de proteínas efectoras implicadas en la translocación otros efectores en la célula huésped diana. Estas incluyen YopB de Y. 40 enterocolitica, EspD de EPEC y PepB de Pseudomonas aerugunosa. SseC es aproximadamente el 24% idéntica/el 48% similar tanto a EspD de EPEC como a YopB de Y. enterocolitica (figura 2a). EspD y YopB presentan dos dominios hidrófobos que se pronostica que se insertan en membranas celulares diana (Pallen et al., 1997). SseC contiene tres regiones hidrófobas que podrían representar dominios que se extienden por la membrana. Otras características de estas proteínas efectoras pronosticadas se muestran en la tabla 1. Utilizando el programa TMpredict (Hofmann y Stoffel, 45 1993), se pronostican hélices transmembrana para todas las proteínas efectoras aparte de SseA que es muy hidrófila. En la figura 2b se muestran alineaciones de SseC con homólogos en otros patógenos. Los aminoácidos conservados están agrupados principalmente en la parte central, más hidrófoba de la proteína, pero a diferencia de YopB, no hay ninguna similitud significativa con la familia RTX de toxinas. Los residuos conservados en SseD están presentes principalmente en la mitad N-terminal de la proteína. La comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de 50 sseABCDEF con entradas de la base de datos PROSITE no reveló la presencia de ningún motivo de proteína característico. Se sometieron las secuencias de aminoácidos pronosticadas de los genes sse a búsquedas utilizando los programas COIL y MULTICOIL tal como se describe por Pallen et al. (1997). Se pronostica que SseA y SseD presentan una hélice trimérica cada una, y se pronostica que SseC presenta dos hélices triméricas (tabla 3). Dado que se pronostica que EspB y EspD presentan una y dos hélices triméricas, respectivamente (Pallen et al., 1997), esto 55 proporciona pruebas adicionales de que estas proteínas están funcionalmente relacionadas.

Tabla 3. Características de proteínas pronosticadas

Proteína

Mr (kDa) pI Pronósticos de Tm Hélices pronosticadas

SseA

12,5 9,3 hidrófila por lo menos una (trímero)

SseB

21,5 4,7 una hélice transmembrana ninguna

SseC

52,8 6,3 tres hélices transmembrana por lo menos dos (trímeros)

SseD

20,6 4,8 tres hélices transmembrana por lo menos una (trímero)

SseE

16,3 9,7 una hélice transmembrana ninguna

SscA

18,1 8,8 hidrófila ninguna

SscB

16,4 4,7 hidrófila ninguna

Expresión de genes de SPI2

Generación de anticuerpos contra proteínas de SPI2 recombinantes

Con el fin de monitorizar la expresión de los genes de SPI2 sseB, sscA y ssaP, se realizó un análisis por inmunotransferencia de tipo Western de células bacterianas totales con anticuerpos policlonales generados contra las 5 proteínas de SPI2 recombinantes SseB, SscA y SsaP.

Se realizó la inmunotransferencia de tipo Western y la electroforesis en gel de proteínas tal como se describe en otro sitio (Laemmli, 1970 y Sambrook et al., 1989). Se construyeron plásmidos para la expresión de proteína de SPI2 recombinante clonando los genes de SPI2 individuales en plásmidos pQE30, pQE31 o pQE32 (Qiagen, Hilden) con el fin de generar fusiones en marco con la etiqueta de 6His N-terminal. Se expresaron genes de SPI2 recombinantes en E. 10 coli M15 (Qiagen) y se purificaron mediante cromatografía de quelación de metales según las recomendaciones del fabricante (Qiagen). Para la inmunización, se emulsionó aproximadamente 1 mg de proteínas de SPI2 recombinantes con adyuvante completo e incompleto de Freund para inmunizaciones primaria y de refuerzo, respectivamente. Se inmunizaron conejos por vía subcutánea según protocolos convencionales (Harlow y Lane, 1988). Se detectaron proteínas de SPI2 con antisueros generados contra proteínas de SPI2 recombinantes tras la separación electroforética 15 de proteínas de células totales y se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa (Schleicher and Schuell) utilizando un dispositivo de transferencia “semiseco” (Bio-Rad) según el manual del fabricante. Se visualizó el anticuerpo unido utilizando un conjugado de anticuerpo secundario-fosfatasa alcalina según protocolos convencionales (Harlow y Lane).

Generación de fusiones de genes indicadores: 20

Se obtuvieron fusiones del gen indicador luciferasa de luciérnaga (luc) con diversos genes en SPI2 utilizando los vectores suicidas pLB02 y pGPL01 (Gunn y Miller, 1996), proporcionados amablemente por los Dr. Gunn y Miller (Seattle).

Para la generación de una fusión con ssaB, se subclonó un fragmento de EcoRV de 831 pb de p2-2 en pSK+ digerido con EcoRV. Para la generación de una fusión transcripcional con sseA, se subclonó un fragmento de 25 SmaI/HincII de 1060 pb de p5-4 en pSK+. Se recuperaron los insertos de los constructos resultantes como un fragmento de EcoRI/KpnI y se ligaron con los vectores indicadores digeridos con EcoRI/KpnI pGPL01 y pLB02. Para la generación de una fusión transcripcional con ssaJ, se subclonó directamente un fragmento de SmaI/KpnI de 3 kb de p5-2 en pGPL01 y pLB02.

Se integraron constructos con fusiones transcripcionales de genes de SPI2 con luc en el cromosoma de S. 30 typhimurium mediante apareamiento entre E. coli S17-1 λpir que albergaba el constructo respectivo y un mutante espontáneo de S. typhimurium resistente a ácido nalidíxico 100 μg x ml-1 y selección de exconjugantes resistentes a carbenicilina y ácido nalidíxico. Se confirmó la integración dirigida en SPI2 (para constructos que utilizan pGLP01) o la región zch (para constructos que utilizan pLB02) mediante análisis de tipo Southern. Se transfirieron entonces las fusiones a una cepa con pase en ratones de S. typhimurium NCTC 12023 mediante transducción con P22 según 35 procedimientos convencionales (Maloy et al., 1996).

Ensayo de genes indicadores

Se determinaron las actividades β-galactosidasa de fusiones de genes indicadores según procedimientos convencionales (Miller, 1992).

Se cultivaron cepas bacterianas que albergaban fusiones de luciferasa de luciérnaga con genes de SPI2 (cepa 40 MvP127, sseA::luc, cepa MvP131, ssaB::luc, cepa MvP266, ssaH::luc) en un medio con diversas concentraciones de Mg2+. Se determinó la actividad luciferasa de alícuotas de los cultivos utilizando el kit de ensayo de luciferasa de

Promega (Heidelberg) o reactivos preparados a medida en consecuencia. En resumen, se sedimentaron las bacterias mediante centrifugación durante 5 min. a 20000 x g a 4ºC y se resuspendieron en tampón de lisis (KHPO4 100 mM, pH 7,8, EDTA 2 mM, Triton X-100 al 1%, albúmina de suero bovino 5 mg x ml-1, DTT 1 mM, lisozima 5 mg x ml-1). Se incubaron los lisados durante 15 min. a temperatura ambiente con agitación repetida y se sometieron a un ciclo de congelación/descongelación. Se transfirieron alícuotas de los lisados (25 μl) a placas de microtitulación (MicroFLUOR, 5 Dynatech) y se sometieron a ensayo inmediatamente tras la adición de 50 μl de reactivo de luciferasa (Tricina-HCl 20 mM, pH 7,8, (MgCO3)4Mg(OH)2 1,07 mM, EDTA 100 μM, DTT 33,3 mM, Li3-coenzima A 270 μM, D(-)-luciferina 470 μM, Mg-ATP 530 μM) para la emisión de fotones utilizando el luminómetro MicroBeta TriLux (Wallac, Turku). Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se repitieron en ocasiones independientes.

La expresión de genes de SPI2 tales como ssaB y ssaH se induce mediante bajas concentraciones de Mg2+ del medio 10 de crecimiento

Se cultivaron una cepa de tipo natural de S. typhimurium y cepas que alojaban fusiones de genes indicadores luc con ssaB (cepa MvP131) y con ssaH (cepa MvP266) hasta la fase semilogarítmica (DO a 600 nm de aproximadamente 0,5) en medios mínimos que contenían altas cantidades de Mg2+ (MgCl2 10 mM). Este medio se denomina medio G. Se recuperaron bacterias mediante centrifugación, se lavaron tres veces en medio mínimo que 15 contenía Mg2+ 8 μM. Este medio se denomina medio F. Se resuspendieron bacterias en medio F o medio G y se continuó el crecimiento a 37ºC. Se extrajeron alícuotas de los cultivos de cepas MvP131 y MvP266 a los diversos puntos de tiempo diferentes indicados y se sometieron a análisis de actividad luciferasa. Se extrajeron alícuotas de la cepa de tipo natural a los mismos puntos de tiempo. Se separó la proteína de las células bacterianas totales mediante SDS-PAGE y se transfirió a membranas de nitrocelulosa. Se incubaron estas transferencias con anticuerpos generados frente 20 a proteína SsaP y SscA recombinante con el fin de detectar proteínas sintetizadas tras el cambio de la concentración de magnesio en la concentración de magnesio.

Tras cambiar las bacterias de un medio de crecimiento con altas cantidades de Mg2+ a un medio con cantidades limitantes de Mg2+, se indujo altamente la expresión de genes de SPI2. Esta inducción puede monitorizarse utilizando el gen indicador luc fusionado en diferentes posiciones de SPI2. Además, se detectaron proteínas sintetizadas 25 tras la inducción de SPI2 mediante inmunotransferencias de tipo Western. Sin embargo, incluso en presencia de altas cantidades de Mg2+, se observó un bajo nivel de expresión de genes de SPI2.

La expresión de genes de SPI2 tales como sseA y ssaB se modula mediante la regulación por PhoP/PhoQ

No se observó expresión de sseB o sscA durante el crecimiento en diversos medios ricos, o medios de cultivo celular con o sin suero. Sin embargo, se detectaron bajas cantidades de SsaP tras el crecimiento en LB u otros medios 30 ricos tales como infusión de cerebro y corazón (BHI). El crecimiento en medio mínimo que contenía menos de 30 μM de Mg2+ induce la expresión de genes de SPI2. Tal efecto de la concentración de Mg2+ sólo se ha observado hasta el momento para genes regulados por PhoP/PhoQ. Esta observación está en contraposición a un informe previo de Valdivia y Falkow (1997) que postularon que la expresión de genes de SPI2 es independiente de PhoP/PhoQ. Sin embargo, en un antecedente de cepas PhoPc (constitutiva) (CS022, Miller et al., 1989) la expresión de genes de SPI2 no 35 era constitutiva sino que dependía todavía de la concentración de Mg2+ del medio. Esto indica que la expresión de genes de SPI2 está modulada por PhoP/PhoQ, pero que se necesitan elementos reguladores adicionales tales como SsrA/B.

Clonación y secuenciación de ADN

Se llevaron a cabo preparaciones de ADN y manipulaciones genéticas según protocolos convencionales (Sambrook et al, 1989). La transformación de ADN de plásmido de células bacterianas se realizó mediante 40 electroporación (O’Callaghan y Charbit, 1990).

Se identificaron clones que albergaban fragmentos de SPI2 a partir de una biblioteca de ADN genómico de S. typhimurium en A 1059 que se ha descrito anteriormente (Shea et al., 1996). Se subclonaron los genes sse y ssc a partir del clon λ5 en un fragmento de EcoRI de 5,7 kb (p5-2) y un fragmento de HindIII de 5,8 kb (p5-4) en pBluescriptKS + tal como se indica en la figura 1 y tabla 1. 45

Se realizó la secuenciación del ADN utilizando una estrategia de paseo con cebador. Se aplicó el procedimiento de didesoxilo (Sanger et al., 1977) utilizando el sistema de secuenciación de T7 de Pharmacia para la secuenciación manual y la química de un terminador de colorante para el análisis automático en un instrumento de secuenciación ABI377. Se realizó el ensamblaje de cóntigos a partir de secuencias de ADN por medio del software AssemblyLign y MacVector (Oxford Molecular, Oxford). Para análisis de secuencia adicionales, se utilizaron programas del paquete GCG 50 versión 8 (Devereux et al., 1984) en la red HGMP.

Construcción de mutaciones no polares

A continuación se describe la construcción de mutaciones no polares en sseC (MvP103), sseD (MvP101) y sseE (MvP102). Se confirmaron todas las modificaciones cromosómicas mediante análisis de hibridación de tipo Southern y PCR (Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98: 503-517). 55

- Mutante MvP103, sseC. Se recuperó un fragmento de 2,6 kb tras digestión con BamHI y ClaI de p5-2 y se subclonó

en pBluescript II KS+ digerido con BamHI/ClaI. Se digirió el constructo resultante denominado p5-50 mediante HindIII, se hicieron los extremos romos utilizando el fragmento Klenow de ADN polimerasa y se ligó al casete aphT. Se ligó un fragmento de HincII de 900 pb de pSB315 que contenía un gen de aminoglicósido 3’-fosfotransferasa (aphT) del que se había eliminado el terminador de la transcripción (Galán et al., 1992) en la misma orientación en el sitio HindIII de extremos romos del plásmido p5-50. Tras la transformación de XL-1 Blue de E. coli y selección 5 para determinar la resistencia a kanamicina y carbenicilina (50 μg/ml cada una) se ha seleccionado un clon y se ha aislado el plásmido que lo albergaba. Este plásmido se denominó p5-51 y se confirmó su identidad mediante análisis de restricción. Se digirió adicionalmente con SalI y XbaI y se ligó el inserto de 3,5 kb con pGP704 digerido con SalI/XbaI. Se sometió a electroporación este plásmido en CC118 λpir de E. coli y se seleccionaron los transformante para determinar la resistencia a kanamicina y carbenicilina (50 μg/ml cada uno). Tal como se hizo 10 anteriormente, se eligió un clon, se aisló su plásmido con el fragmento de ADN correspondiente en pGP704, denominado p5-53, y se confirmó mediante análisis de restricción. Se sometió a electroporación el plásmido p5-53 en S17-1 λpir de E. coli y se transfirió a NCTC12023 de S. typhimurium (resistente a ácido nalidíxico, 100 μg/ml) mediante conjugación tal como se ha descrito anteriormente (de Lorenzo y Timmis, 1994). Se seleccionaron exconjugantes en los que el gen sseC se había sustituido por el gen clonado perturbado por la inserción del casete 15 aphT mediante resistencia a kanamicina y ácido nalidíxico (100 μg/ml). Finalmente se sometieron a prueba los exconjugantes resultantes para determinar un fenotipo negativo para lactosa y su sensibilidad a carbenicilina. Los clones seleccionados se examinaron adicionalmente mediante análisis de transferencia de tipo Southern. Con el fin de excluir posibles mutaciones que se han adquirido durante el procedimiento de clonación, se transfirió el alelo de sseC mutado a un antecedente de Salmonella reciente mediante transducción con P22 (descrito por Maloy et al., 20 1996). Se examinó la cepa MvP103 de Salmonella resultante para determinar la presencia del casete de resistencia dentro del gen sseC gene mediante la utilización de PCR. Se realizó la amplificación utilizando los cebadores E25 (5’-GAAATCCCGCAGAAATG-3’) (SEC ID nº: 48) y E28 (5’-AAGGCGATAATATAAAC-3’) (SEC ID nº: 49). El fragmento resultante presenta un tamaño de 1,6 kb para el tipo natural de S. typhimurium y 2,5 kb para la cepa MvP103. 25

Para la complementación de mutaciones no polares en sseC, se amplificaron los genes correspondientes mediante PCR a partir de ADN genómico utilizando una serie de cebadores correspondientes a la región 5’ de los codones de iniciación putativos y los extremos 3’ de los genes. Estos cebadores introdujeron sitios de restricción BamHI en los extremos terminales de los genes amplificados. Tras la digestión con BamHI, se ligaron los genes con pACYC184 digerido con BamHI (Chang y Cohen, 1978) y se transfirieron a DH5α de E. coli. Se determinó la orientación del inserto 30 mediante PCR, y además, se realizó la secuenciación del ADN para confirmar la orientación y la secuencia de ADN correcta de los insertos. Se seleccionaron plásmidos con insertos en la misma orientación de la transcripción que el gen Tetr de pACYC184 para estudios de complementación y se sometieron a electroporación en las cepas de S. typhimurium que albergaban mutaciones no polares correspondientes.

- Mutante MvP101, sseD. Se recuperó un fragmento de 3,0 kb tras digestión con PstI y EcoRI de p5-2 y se subclonó 35 en pUC18 digerido con PstI/EcoRI. Se digirió el constructo resultante denominado p5-30 con EcoRV y se trató con fosfatasa alcalina. Se aisló el casete aphT tal como se describió anteriormente y se ligó con el plásmido linealizado p5-30 en la misma orientación en el sitio EcoRV único. Tras la transformación de XL-1 Blue de E. coli y selección frente a kanamicina y carbenicilina (50 μg/ml cada una) se ha elegido un clon y se ha aislado el plásmido que lo albergaba. Este plásmido se denominó p5-31 y se confirmó su identidad mediante análisis de restricción. Se digirió 40 adicionalmente p5-31 con SphI y EcoRI, se aisló un fragmento de 4,0 kb y se ligó con pGP704 digerido con SphI/EcoRI. Se sometió a electroporación este plásmido en CC118 λpir de E. coli y se seleccionaron transformantes frente a la kanamicina y carbenicilina (50 μg/ml cada una). Tal como se hizo anteriormente, se seleccionó un clon, se aisló su plásmido con el fragmento de ADN correspondiente en pGP704, denominado p5-33, y se confirmó mediante análisis de restricción. Se sometió a electroporación el plásmido p5-33 en S17-1 λpir de E. coli y se 45 transfirió a NCTC12023 de S. typhimurium (resistente a ácido nalidíxico) mediante conjugación tal como se ha descrito anteriormente (de Lorenzo y Timmis, 1994). Se seleccionaron exconjugantes en los que el gen sseD se había sustituido por el gen clonado perturbado mediante la inserción del casete aphT mediante resistencia a kanamicina y ácido nalidíxico (100 μg/ml). Finalmente se sometieron a prueba los exconjugantes resultantes para determinar un fenotipo negativo para lactosa y su sensibilidad frente a carbenicilina. Se examinaron adicionalmente 50 los clones seleccionados mediante análisis de transferencia de tipo Southern. Con el fin de excluir posibles mutaciones que podrían haberse acumulado durante el procedimiento de clonación, se transfirió el alelo de sseD mutado a un antecedente de Salmonella reciente mediante transducción con P22 (descrito por Maloy et al., 1996). Se examinó la cepa MvP101 de Salmonella resultante cepa para determinar la presencia del casete de resistencia dentro del gen sseD mediante la utilización de PCR. Se realizó la amplificación utilizando los cebadores E6 (5-55 AGAGATGTATTAGATAC-3’) (SEC ID nº: 50) y E28 (5’-AAGGCGATAATATAAAC-3’) (SEC ID nº: 49). El fragmento resultante presentaba un tamaño de 0,8 kb para el tipo de natural de S. typhimurium y 1,7 kb en el caso de la cepa MvP101.

- Mutante MvP102, deleción de partes de sseE y sscB. Se recuperó un fragmento de 4,5 kb tras digestión con SstI y HindIII de p5-2 y se subclonó en pKS+ digerido con SstI/HindIII. Se digirió el constructo resultante denominado p5-60 40 con SmaI, se digirió con fosfatasa alcalina y se ligó con el casete aphT en la misma orientación en el sitio SmaI único creado en el plásmido de deleción de sseE/sseB p5-40 tal como se describió anteriormente. Tras la transformación de XL-1 Blue de E. coli y selección frente a kanamicina y carbenicilina (50 μg/ml cada una) se eligió

un clon y se aisló el plásmido que lo albergaba. Este plásmido se denominó p5-41 y se confirmó su identidad a través de análisis de restricción. Se digirió adicionalmente con KpnI y SstI y se ligó el inserto con pNQ705 digerido con KpnI/SstI. Se sometió a electroporación este plásmido en CC118 λpir de E. coli y se seleccionaron bacterias transformadas frente a la kanamicina y el cloranfenicol (50 μg/ml cada uno). Tal como se hizo anteriormente, se seleccionó un clon, se aisló su plásmido con el fragmento de ADN correspondiente en pNQ705, denominado p5-43, 5 y se confirmó mediante análisis de restricción. Se utilizó el plásmido resultante para transferir el gen mutado al cromosoma de Salmonella tal como se describió anteriormente. Los clones resultantes se han examinado adicionalmente mediante análisis de transferencia de tipo Southern. Para excluir posibles mutaciones que podrían haberse adquirido durante el procedimiento de clonación se transfirió el alelo de sseE/sscB mutado a un antecedente de Salmonella reciente mediante transducción con P22 (descrito por Maloy et al., 1996). Se examinó la 10 cepa MvP102 de Salmonella resultante para determinar la presencia del casete de resistencia dentro del gen sseE/sseB mediante la utilización de PCR. Se realizó la amplificación utilizando los cebadores E6 (5’-AGAGATGTATTAGATAC-3’) (SEC ID nº: 50) y E4 (5’-GCAATAAGAGTATCAAC-3’) (SEC ID nº: 51). El fragmento resultante presentaba un tamaño de 1,6 kb para el tipo natural de S. typhimurium y un tamaño de 1,9 kb para la cepa MvP102. 15

Construcción de cepas mutantes que portan deleciones en marco en sseC, sseD y sscB:

Basándose en la observación de que una no polar en sseE no dio como resultado una atenuación significativa de la virulencia en el modelo de ratón (Hensel et al., 1998), la generación de un mutante de deleción para el gen sseE no es de interés para la generación de cepas portadoras.

Construcción de una deleción en marco en sseC, mutante MvP337 20

Se generó una deleción de 158 pb entre el codón 264 y 422 de sseC. Se digirió el plásmido p5-2 con ClaI y se recuperó el fragmento más grande que contenía la parte de vector y se autoligó para generar p5-60. Se linealizó el plásmido p5-60 mediante digestión con HindIII, que corta una vez dentro del gen sseC. Se diseñaron cebadores sseC-del-1 (5’- GCT AAG CTT CGG CTC AAA TTG TTT GGA AAA C -3’) (SEC ID nº: 52) y sseE-del-2 (5’- GCT AAG CTT AGA GAT GTA TTA GAT ACC -3’) (SEC ID nº: 53) para introducir sitios HindIII. Se realizó PCR utilizando p5-60 25 linealizado como ADN de molde. Se utilizó la polimerasa TaqPlus (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. Se configuraron reacciones de 100 μl de volumen utilizando 10 μl de 10 x tampón TaqPlus Precision que contenía cloruro de magnesio, 0,8 μl de dNTP 100 mM, 250 ng de molde de ADN (p5-8 linealizado), 250 ng de cada cebador y 5 U de ADN polimerasa TaqPlus. Se llevó a cabo PCR durante 35 ciclos de: 95ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 6 minutos. Entonces se añadió una etapa final de 72ºC durante 10 minutos. Se analizaron 10 μl de la 30 reacción de PCR. Se recuperó un producto del tamaño esperado, se digirió con HindIII, se autoligó, y se utilizó la mezcla de ligación para transformar DH5α de E. coli para resistencia a carbenicilina. Se aislaron plásmidos a partir de transformantes y se analizó la integridad del inserto y la deleción mediante digestión de restricción y secuenciación de ADN. Se aisló el inserto de un constructo confirmado tras digestión con XbaI y KpnI y se ligó con el vector pKAS32 digerido con XbaI/KpnI. Se utilizó el constructo resultante para transformar S17-1 λpir de E. coli para resistencia a 35 carbenicilina, y se realizó la transferencia por conjugación del plásmido a S. typhimurium (NalR, StrepR) según procedimientos convencionales (de Lorenzo y Timmis, 1994). Se seleccionaron exconjugantes que presentaban integrado el plásmido suicida mediante recombinación homóloga mediante resistencia a ácido nalidíxico y carbenicilina, y se examinaron para determinar sensibilidad frente a estreptomicina. Se hicieron crecer tales clones en LB hasta DO600 de aproximadamente 0,5 y se sembraron en placa alícuotas en LB que contenía estreptomicina 250 μg/ml para 40 seleccionar colonias que habían perdido el plásmido integrado y experimentado un intercambio alélico. Se utilizaron clones resistentes a estreptomicina pero sensibles a carbenicilina para el análisis adicional. Se realizó una selección de mutantes con una deleción dentro del locus sseC mediante PCR utilizando cebadores sseC-For (5’- ATT GGA TCC GCA AGC GTC CAG AA -3’) (SEC ID nº: 54) y sseC-Rev (5- TAT GGA TCC TCA GAT TAA GCG CG-3’) (SEC ID nº: 55). La amplificación de ADN a partir de clones que contenían el alelo de sseC de tipo natural dio como resultado un 45 producto de PCR de 1520 pb, la utilización de ADN de clones que albergaban un alelo de sseC con una deleción interna dio como resultado un producto de PCR de 1050 pb. Se confirmó adicionalmente la integridad de clones que albergaban la deleción de sseC mediante análisis de tipo Southern del locus sseC. Finalmente, se trasladó el locus sseC que contenía la deleción en marco interna a un antecedente de cepa reciente de S. typhimurium mediante transducción con P22 (Maloy et al., 1996) y la cepa resultante se denominó MvP337. 50

Construcción de una deleción en marco en sseD, cepa mutante MvP338

Se generó una deleción de 116 pb entre el codón 26 y 142 de sseD. Se digirió el plásmido p5-2 con HindIII/PstI y se aisló un fragmento de 2,1 kb y se subclonó en vector pBluescript SK+ digerido con HindIII/PstI. El constructo resultante se denominó p5-8. Se linealizó p5-8 mediante digestión con EcoRV, que corta dos veces dentro del gen sseD. Se diseñaron los cebadores sseD-del-1 (5’-ATA GAA TTC GGA GGG AGA TGG AGT GGA AG -3’) (SEC ID nº: 56) y 55 sseD-del-2 (5’- ATA GAA TTC GAA GAT AAA GCG ATT GCC GAC -3’) (SEC ID nº: 57) para introducir sitios EcoRI. Se realizó PCR utilizando p5-8 linealizado como ADN de molde. Se utilizó la polimerasa TaqPlus (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. Se configuraron reacciones de 100 μl de volumen utilizando 10 μl de 10 x tampón TaqPlus Precision que contenía cloruro de magnesio, 0,8 μl de dNTP 100 mM, 250 ng de molde de ADN (p5-8 linealizado), 250 ng de cada cebador y 5 U de ADN polimerasa TaqPlus. Se llevó a cabo PCR durante 35 ciclos de: 95ºC durante 1 60 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 5 minutos. Entonces se añadió una etapa final de 72ºC durante 10

minutos. Se analizaron 10 μl de la reacción de PCR. Se recuperó un producto del tamaño esperado, se digirió con EcoRI, se autoligó, y se utilizó la mezcla de ligación para transformar DH5α de E. coli para resistencia a carbenicilina. Se aislaron plásmidos a partir de transformantes y se analizó la integridad del inserto y la deleción mediante mapeo de restricción y secuenciación de ADN. Se aisló el inserto de un constructo confirmado tras digestión con Xbal y KpnI y se ligó con el vector pKAS32 digerido con XbaI/KpnI. Se utilizó el constructo resultante para transformar S17-1 λpir de E. 5 coli para resistencia a carbenicilina, y se realizó la transferencia por conjugación del plásmido a S. typhimurium (NalR, StrepR) según procedimientos convencionales (de Lorenzo y Timmis, 1994). Se seleccionaron exconjugantes que presentaban integrado el plásmido suicida mediante recombinación homóloga mediante resistencia a ácido nalidíxico y carbenicilina, y se examinaron para determinar la sensibilidad a estreptomicina. Se hicieron crecer tales clones en LB hasta DO600 de aproximadamente 0,5 y se sembraron en placa alícuotas en LB que contenía estreptomicina 250 μg/ml 10 para seleccionar colonias que habían perdido el plásmido integrado y experimentado intercambio alélico. Se utilizaron clones resistentes a estreptomicina pero sensibles a carbenicilina para el análisis adicional. Se realizó la selección de mutantes con una deleción dentro del locus sseD mediante PCR utilizando cebadores sseD-For (5’- GAA GGA TCC ACT CCA TCT CCC TC -3’) (SEC ID nº: 58) y sseD-Rev (5- GAA GGA TCC ATT TGC TCT ATT TCT TGC-3’) (SEC ID nº: 59). La amplificación de ADN a partir de clones que contenían el alelo de sseD de tipo natural dio como resultado un 15 producto de PCR de 560 pb, la utilización de ADN de clones que albergaban un alelo de sseD con una deleción interna dio como resultado un producto de PCR de 220 pb. Se confirmó adicionalmente la integridad de los clones que albergaban la deleción de sseD mediante análisis de tipo Southern del locus sseD. Finalmente, se trasladó el locus sseD que contenía la deleción en marco interna a un antecedente de cepa de S. typhimurium mediante transducción con P22 (Maloy et al., 1996) y la cepa resultante se denominó MvP338. 20

Construcción de una deleción en marco en sscB, cepa mutante MvP339

Se generó una deleción de 128 pb entre el codón 32 y 160 de sscB. Se ligó un fragmento BglII de 3 kb de plásmido p5-2 en el sitio BamHI de pBluescript KS+ para generar el plásmido p5-70. Se linealizó el plásmido p5-70 mediante digestión con NcoI, que corta una vez dentro del gen sscB. Se diseñaron los cebadores sscB-del-1 (5’- ATG GGA TCC GAG ATT CGC CAG AAT GCG CAA -3’) (SEC ID nº: 60) y sscB-del-2 (5’- ATG GGA TCC ACT GGC ATA 25 AAC GGT TTC CGG -3’) (SEC ID nº: 61) para introducir sitios BamHI. Se realizó PCR utilizando p5-70 linealizado como ADN de molde. Se utilizó la polimerasa TaqPlus (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. Se configuraron reacciones de 100 μl de volumen utilizando 10 μl de 10 x tampón TaqPlus Precision que contenía cloruro de magnesio, 0,8 μl de dNTP 100 mM, 250 ng de molde de ADN (p5-70 linealizado), 250 ng de cada cebador y 5 U de ADN polimerasa TaqPlus. Se llevó a cabo PCR durante 35 ciclos de: 95ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 72ºC 30 durante 6 minutos. Entonces se añadió una etapa final de 72ºC durante 10 minutos. Se analizaron 10 μl de la reacción de PCR. Se recuperó un producto del tamaño esperado, se digirió con BamHI, se autoligó, y se utilizó la mezcla de ligación para transformar DH5α de E. coli para resistencia a carbenicilina. Se aislaron plásmidos a partir de transformantes y se analizó la integridad del inserto y la deleción mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN. Se aisló el inserto de un constructo confirmado tras digestión con Xbal y KpnI y se ligó con vector pKAS32 digerido 35 con XbaI/KpnI. Se utilizó el constructo resultante para transformar S17-1 λpir de E. coli para resistencia a carbenicilina, y se realizó la transferencia por conjugación del plásmido a S. typhimurium (NalR, StrepR) según procedimientos convencionales (de Lorenzo y Timmis, 1994). Se seleccionaron exconjugantes que presentaban integrado el plásmido suicida mediante recombinación homóloga mediante resistencia a ácido nalidíxico y carbenicilina, y se examinaron para seleccionar sensibilidad a estreptomicina. Se hicieron crecer tales clones en LB hasta DO600 de aproximadamente 0,5 y 40 se sembraron en placa alícuotas en LB que contenía estreptomicina 250 μg/ml para seleccionar colonias que habían perdido el plásmido integrado y experimentado intercambio alélico. Se utilizaron clones resistentes a estreptomicina pero sensibles a carbenicilina para el análisis adicional. Se realizó la selección de mutantes con una deleción dentro del locus sseC mediante PCR utilizando los cebadores sscB-For (5’- ATT GGA TCC TGA CGT AAA TCA TTA TCA -3’) (SEC ID nº: 62) y sscB-Rev (5- ATT GGA TCC TTA AGC AAT AAG TGA ATC-3’) (SEC ID nº: 63). La amplificación de ADN a 45 partir de clones que contenían el alelo de sscB de tipo natural dio como resultado un producto de PCR de 480 pb, la utilización de ADN de clones que albergaban un alelo de sscB con una deleción interna dio como resultado un producto de PCR de 100 pb. Se confirmó adicionalmente la integridad de los clones que albergaban la deleción de sseC deleción mediante análisis de tipo Southern del locus sscB. Finalmente, se trasladó el locus sscB que contenía la deleción en marco interna a un antecedente de cepa reciente de S. typhimurium mediante transducción con P22 (Maloy et al., 1996) 50 y la cepa resultante se denominó MvP339.

Construcción de una mutación por deleción en el gen sseC

En un enfoque adicional se delecionó la secuencia completa del gen sseC cromosómico mediante sustitución alélica con una copia delecionada del gen. La deleción se construyó en un plásmido suicida (pCVD442 (Donnenberg et al., 1991). En primer lugar se amplificaron mediante PCR dos fragmentos de ADN que flanqueaban el gen sseC 55 (fragmento A, que portaba sitios SalI y XbaI artificiales en sus extremos 5’ y 3’, respectivamente; y fragmento B, que portaba sitios XbaI y SacI artificiales en sus extremos 5’ y 3’, respectivamente). Los oligonucleótidos utilizado para PCR fueron: 1.) sseDelfor1 GCTGTCGACTTGTAGTGAGTGAGCAAG (el nucleótido en 3’ corresponde al pb 941 en la SEC ID nº: 1: figura 21 A); 2.) sseCDelrev2 GGATCTAGATTTTAGCTCCTGTCAGAAAG (el nucleótido en 3’ corresponde al pb 2585 en la SEC ID nº: 1, el oligonucleótido se une a la cadena inversa); 3.) sseCDelfor2 60 GGATCTAGATCTGAGGATAAAAATATGG (el nucleótido en 3’ corresponde al pb 4078 en la SEC ID nº: 1); 4.) sseDelrev1 GCTGAGCTCTGCCGCTGACGGAATATG (el nucleótido en 3’ corresponde al pb 5592 en la SEC ID nº:1, el

oligonucleótido se une a la cadena inversa). Se fusionaron los fragmentos de PCR resultantes entre sí a través del sitio Xbal. El fragmento resultante se cortó con Sall y Sacl y se clonó en pCVD442 cortado con Sall y Sacl. Se introdujo el plásmido resultante en NCTC12023 de S. typhimurium mediante conjugación y se seleccionaron integrantes cromosómicos del plásmido en el locus sseC para determinar marcador de resistencia a ampicilina codificada por el plásmido. En una segunda etapa, se examinaron los clones que habían perdido el plásmido para determinar la pérdida 5 de resistencia a ampicilina. Se sometieron a prueba los clones resultantes para determinar la deleción cromosómica del gen sseC mediante PCR, y se confirmó la deleción de un fragmento de 1455 pb, que comprendía el marco de lectura abierto de sseC completo. Esta cepa mutante de ∆sseC se denominó III-57∆sseC.

Construcción de un mutante doble de sseC-aroA

Con el fin de construir un mutante doble que pudiera servir como prototipo para una vacuna atenuada viva, se 10 transfirió el marcador sseC:aphT (Kmr) de MvP103 mediante transducción con el fago P22 en SL7207 de S. typhimurium (hisG46 DEL407 [aroA544:Tn10], TcR) una cepa que porta una deleción estable en el gen aroA.

EJEMPLO 3: Invasión y crecimiento intracelular en cultivo tisular

Replicación dentro de macrófagos de las cepas mutantes

Se han sometido a prueba varias cepas que son defectuosas en cuando a su capacidad para replicarse dentro 15 de macrófagos y líneas celulares similares a macrófagos, ya que se piensa que la supervivencia y la replicación en macrófagos representan un aspecto importante de la patogenia de Salmonella in vivo (Fields et al., 1986). Anteriormente se ha notificado que varias cepas mutantes de SPI2 no eran defectuosas para su supervivencia o replicación dentro de macrófagos RAW (Hensel et al., 1997b) pero experimentos posteriores han revelado que puede mostrarse que algunos mutantes de SPI2 presentan un defecto de replicación si se utilizan cultivos bacterianos de fase estacionaria aireados 20 opsonizados con suero de ratón normal (véase también el artículo adjunto: Cirillo et al., 1998). El aumento ufc para diferentes cepas en macrófagos RAW a lo largo de un periodo de 16 h se muestra en la figura 3. Se observaron defectos de replicación para cepas que portaban mutaciones en ssaV (que codifica para un componente del aparato de secreción), sseB y sseC y en menor grado para cepas que portaban mutaciones en sseE. Se logró una complementación parcial de este defecto con cepas que albergaban plásmidos que portaban copias funcionales de sseB 25 y sseC, HH103 y MvP103[psseC], respectivamente. También se ha sometido a prueba la capacidad de las cepas mutantes de SPI2 para replicarse dentro de la línea celular de macrófagos J774.1 (figura. 4A) y en macrófagos peritoneales provocados por peryodato de ratones C3H/HeN (figura 4B). Se observaron defectos de replicación similares de S. typhimurium que portaba transposón o mutaciones no polares en genes de SPI2, independientemente del tipo de fagocitos examinados, aunque las células peritoneales provocadas presentaban actividad antimicrobiana similar superior 30 en comparación con cualquier línea celular.

Ensayos de supervivencia en macrófagos

Se hicieron crecer células RAW 264.7 (ECACC 91062702), una línea celular similar a macrófago murino, en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero de ternero fetal al (FCS) al 10% y glutamina 2 mM a 37ºC en CO2 al 5%. Se hicieron crecer cepas de S. typhimurium en LB hasta fase estacionaria y se diluyeron hasta 35 una DO600 de 0,1 y se opsonizaron durante 20 min. en DMEM que contenía suero de ratón normal al 10%. Entonces se centrifugaron bacterias sobre macrófagos sembrados en placas de cultivo tisular de 24 pocillos a una multiplicidad de infección de aproximadamente 1:10 y se incubaron durante 30 min. Tras la infección, se lavaron los macrófagos dos veces con PBS para eliminar las bacterias extracelulares y se incubaron durante 90 min. (2 h tras la infección) o 16 h en medio que contenía gentamicina (12 μg/ml). Se lavaron dos veces los macrófagos infectados con PBS y se lisaron con 40 Triton X-100 al 1% durante 10 min. y se sembraron en placa alícuotas y diluciones apropiadas sobre agar LB para enumerar las ufc.

Se determinó la supervivencia de cepas de S. typhimurium opsonizadas en células J774.1 (Ralph et al., 1975) o células de exudado peritonial murino C3H/HeN (de Charles River Laboratories, Wilmington, MA) esencialmente tal como se describe por DeGroote et al. (1997), pero sin la adición de interferón-γ. En resumen, se sembraron células 45 peritoneales recogidas en PBS con suero de ternero fetal al 10% inactivado por calor 4 días después de la inyección intraperitoneal de peryodato de sodio 5 mM (Sigma, St. Louis, MO) en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y se dejó adherir durante 2 h. Se eliminaron las células no adherentes mediante lavado con medio precalentado que contenía suero de ternero fetal al 10% inactivado por calor. En estudios previos, se estableció que > 95% de las células que quedaban tras este procedimiento son macrófagos. Se opsonizó S. 50 typhimurium de cultivos aireados durante la noche con suero de ratón normal y se centrifugó sobre células adherentes a una razón de efector con respecto a diana de 1:10. Se dejaron internalizar las bacterias durante 15 min., y se lavaron con medio que contenía gentamicina 6 μg/ml para destruir las bacterias extracelulares. A las 0 h y 20 h, se lisaron las células con PBS que contenía desoxicolato al 0,5% (Sigma, St. Louis, MO), con sembrado en placa de diluciones en serie para enumerar las unidades formadoras de colonias. 55

EJEMPLO 4: Evaluación de seguridad en el modelo de ratón de S. typhimurium de salmonelosis

Pruebas de virulencia con cepas portadoras de mutaciones no polares

El análisis de secuencia de ADN sugirió que los genes sse podrían codificar para proteínas efectoras del sistema de secreción, pero aparte de un posible efecto polar de una inserción de transposón en sscA no se recuperó ninguna cepa que portara mutaciones en estos genes en el examen de STM original para determinar genes de virulencia 5 de S. typhimurium utilizando mutagénesis de mTn5 (Hensel et al., 1995), y su papel en la virulencia no estaba claro. Para abordar esta cuestión, se han construido cepas portadoras de mutaciones no polares en sseC, sseD y sseEsscB (figura 1) y se han sometido a pruebas de virulencia. La tabla 4 muestra que todos los ratones inoculados con cepas portadoras de mutaciones sseC y sseD sobrevivieron a una dosis de 1 x 104 ufc, tres órdenes de magnitud superior a la DL50 de la cepa de tipo natural, que es inferior a 10 ufc cuando el inóculo se administra por vía i.p. (Buchmeier et al., 10 1993; Shea et al, 1996). También se inocularon las mismas cepas que contenían un plásmido que portaba el alelo de tipo natural correspondiente en ratones a una dosis de 1 x 104 ufc. Ningún ratón sobrevivió a estas infecciones, lo que muestra que cada mutación puede complementarse mediante la presencia de una copia funcional de cada gen, y que cada uno de estos genes desempeña un papel importante en la virulencia de Salmonella. Cepas que portaban mutaciones no polares en sseEsscB provocaron infecciones letales cuando se inocularon aproximadamente 1 x 104 15 células de cada cepa en ratones mediante vía i.p. (tabla 4) y se analizaron en más detalle mediante un ensayo de competición con la cepa de tipo natural en infecciones mixtas (cinco ratones/prueba) para determinas si su virulencia se había atenuado. El índice competitivo, definido como la razón de salida de mutante con respecto a bacterias de tipo natural, dividida entre la razón de entrada de mutante con respecto a bacterias de tipo natural, muestra que el mutante de sseEsscB no era significativamente diferente al de una cepa totalmente virulenta que portaba un marcador de 20 resistencia a antibiótico, lo que implica que este gen no desempeña un papel significativo en la infección por Salmonella sistémica del ratón.

Tabla 4. Virulencia de cepas de S. typhimurium en ratones.

Cepa

Genotipo Supervivencia de ratón tras inoculacióna con cepa bacteriana Supervivencia de ratón tras inoculacióna con mutante + plásmido de complementación Índice competitivo in vivo

NCTC12023

tipo natural 0/5 n.d. 0,98b

MvP101

∆sseD::aphT 5/5 n.d. >0,01

MvP102

∆sseEsscB::αphT 4/4 n.d. 0,79

MvP103

sseC::aphT 5/5 0/5 >0,01 (oral) >0,01 (i.p.)

a Se inocularon ratones por vía intraperitoneal con 1 x 104 células de cada cepa

b Resultado de competición entre la cepa de tipo natural NCTC12023 y un mutante mTn5 virulento identificado en el examen de STM

EJEMPLO 5: Vacunación con la cepas MvP103 y MvP101 de S. typhimurium mutantes de sseC::aphT, y 25 ∆sseD::aphT

Cepas portadoras de mutaciones no polares como portadores de vacuna viva

Para confirmar la idoneidad de los mutantes de MvP101 y MvP103 como portadores de vacuna viva se evaluó su nivel de atenuación determinando la DL50 tras inoculación oral en ratones. Se alimentaron grupos de 10 ratones con diluciones en serie o bien de MvP101, MvP103 o bien la cepa NCTCNCTC 12023 original de tipo natural y se registraron 30 los animales muertos en el plazo de un periodo de 10 días tras la infección. Los resultados obtenidos demostraron que ambos mutantes se ven altamente atenuados cuando se administran por vía oral a ratones BALB/c (DL50 por encima de 109) en comparación con la cepa original (DL50 = 6,9 x 105 UFC). Tras inoculación intraperitoneal la DL50 de NCTC12023 de tipo natural de S. typhimurium en BALB/c es de 6 bacterias, y la DL50 de MvP103 en BALB/c es de 2,77 x 106 tras inoculación intraperitoneal. La mutación puede complementarse mediante psseC, pero no se realizó ninguna 35 determinación de DL50 para la cepa mutante complementada. La DL50 de MvP101 en BALB/c es de 3,54 x 106 tras inoculación intraperitoneal. Fue posible una complementación parcial mediante el plásmido p5-K1. Se determinó una DL50 intraperitoneal para MvP101 [p5-K1] de 8,45 x 102. (Descripción de p5-K1: se subclonó un fragmento PstI de 3,2 kb de p5-2 que contiene sseC’sseDsseEsscBsseF’ en el vector de clonación pWSK29 de bajo número de copias).

Determinación de la DL50

Se inocularon por vía oral dosis que oscilaban desde 105 hasta 109 UFC o bien de NCTCNCTC12023 de S. typhimurium (tipo natural) o bien de los mutantes MvP103 y MvP101 en grupos de 10 ratones y se registró la supervivencia a lo largo de 10 días. Se determinó la DL50 de cepas de tipo natural de S. typhimurium y cepas mutantes MvP101 y MvP103 tras infección intraperitoneal mediante inoculación de dosis que oscilaban desde 101 hasta 107 UFC en grupos de 5 ratones BALB/c hembra de 6 a 8 semanas de edad. Se registró la supervivencia a lo largo de un periodo 5 de tres semanas. Se calculó la dosis DL50 de las cepas de exposición mediante el procedimiento de Reed y Muench (Reed y Muench, 1938).

Protocolos de inmunización

Para la vacunación, se hicieron crecer bacterias durante la noche hasta que alcanzaron la fase logarítmica del medio. Entonces, se recogieron mediante centrifugación (3.000 x g) y se resuspendieron en bicarbonato de sodio al 5%. 10 Se inmunizaron ratones cuatro veces a intervalos de 15 días alimentándolos con cuidado con la suspensión bacteriana (109 UFC/ratón) en un volumen de aproximadamente 30 μl. Se vacunaron ratones control con el portador, que carece de plásmido.

Ensayo de citotoxicidad

Se obtuvieron células de bazo de ratones 14 días tras la última inmunización y se reestimularon 2x106 células 15 efectoras in vitro durante 5 días en medio completo complementado con 20 U/ml de rIL-2 y 20 μM del péptido βGP1 (β-gal p876-884, TPHPARIGL), que engloba el epítopo de β-gal restringido por H-2Ld inmunodominante. Tras la reestimulación, se realizó el ensayo utilizando el procedimiento de incorporación de [3H]-timidina. En resumen, se marcaron 2x106 de células P815 por ml con [3H]-timidina durante 4 h o bien en medio completo o bien en medio completo complementado con 20 μM de péptido βGP1 y se utilizaron como células diana. Tras lavar, se incubaron 2x105 20 células diana marcadas con diluciones en serie de células efectoras en 200 μl de medio completo durante 4 h a 37ºC. Se recogieron las células y se determinó la lisis específica tal como sigue: [(c.p.m. retenido en ausencia de efectores) - (c.p.m. retenido experimentalmente en presencia de efectores) /c.p.m. retenido en ausencia de efectores] x 100.

EJEMPLO 6: Evaluación de la respuesta inmunitaria inducida

Inducción de respuestas inmunitarias en la mucosa tras vacunación oral 25

Para lograr protección frente a patógenos de la mucosa utilizando portadores de Salmonella viva, es altamente deseable provocar una respuesta eficaz de la mucosa. Por tanto, se investigó la presencia de anticuerpos específicos de β-gal en las paredes intestinales de ratones inmunizados o bien con MvP101, MvP103 o bien con SL7207 que portaba pAH97 52 días tras la inmunización. Tal como se muestra en la figura 5, la inmunización con los tres portadores estimula la producción de cantidades significativas de IgA específica de β-gal y, en un menor grado, favorece la transudación de 30 IgG específica de antígeno en la luz intestinal. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre las respuestas de la mucosa frente a los diferentes clones recombinantes.

Respuestas inmunitarias celulares desencadenadas tras inmunización oral con mutantes de sseC y sseD que expresaban β -gal

Para evaluar la eficacia de las respuestas de células T específicas de antígeno generadas en ratones 35 inmunizados, se enriquecieron células de bazo en células T CD4+ y se reestimularon in vitro durante cuatro días con β-gal. Tal como se muestra en la figura 6, aunque se generaron células de bazo enriquecidas en CD4 + específicas de antígeno tras la vacunación con los tres portadores, MvP103 y MvP101 fueron significativamente más eficaces que SL7207 (P 0,05) para desencadenar una respuesta inmunitaria celular específica. Por el contrario, células aisladas de ratones inmunizados con el portador solo no proliferaron en presencia de β-gal. 40

Para investigar el tipo de Th de la respuesta inmunitaria desencadenada mediante la inmunización, se midió el contenido en IFN-γ, IL-2, IL-4, IL- 5, IL-6 e IL-10 en los fluidos sobrenadantes de células reestimuladas. Los resultados demostraron que se inducía un patrón de respuesta Th 1 predominante en ratones inmunizados con todos los portadores. IFN-γ fue la única citocina con niveles significativamente aumentados en comparación con los observados en sobrenadantes de células de bazo aisladas de ratones inmunizados con portadores sin plásmido (figura 7). De 45 manera interesante, de acuerdo con los patrones de isotipo IgG, los niveles de IFN-γ detectados en sobrenadantes de células de ratones inmunizados con MvP103 [pAH97] fuero significativamente más altos (P 0,05) que los de los animales que recibieron o bien MvP101 [pAH97] o bien SL7207 [pAH97] (figura 7).

Respuestas de anticuerpo específicas de antígeno generadas en ratones inmunizados por vía oral con los portadores de vacuna de S. typhimurium atenuada que expresan el antígeno modelo β-gal 50

Se inmunizaron grupos de de ratones con las cepas recombinantes MvP101 [pAH97] y MvP103 [pAH97]. Para estimar la eficacia de los prototipos se vacunó otro grupo con la cepa de portador bien establecida SL7207 [pAH97]. Se determinaron las capacidades de los diferentes portadores para inducir una respuesta humoral sistémica midiendo el título de anticuerpos específicos de β-gal en el suero de ratones vacunados. Tal como se muestra en la figura 8, se

detectaron títulos significativos de anticuerpos IgG e IgM específicos de β-gal en el día 30 en todos los animales vacunados. A diferencia de los títulos de IgM que alcanzan una meseta en el día 30, los títulos de IgG aumentaron de manera constante hasta el día 52 desde la inmunización cuando se concluyó el experimento. Aunque todos los portadores sometidos presentan un rendimiento excelente, el mutante MvP1 03 era el más eficaz para inducir anticuerpos IgG anti-β-gal (P 0,05). No se detectaron niveles significativos de IgA específica de β-gal en ratones 5 inmunizados con ninguno de los tres clones recombinantes (datos no mostrados).

Para determinar la distribución de subclases del IgG anti-β-gal, se analizaron muestras de suero para detectar niveles específicos de IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3. Los resultados mostrados en la figura 9 demuestran que el isotipo de IgG específica de β-gal principal presente en los sueros de todos los ratones inmunizados era IgG2, lo que sugiere una respuesta Th1 predominante. De manera interesante, se observó una concentración más baja de IgG1 (P 0,05) en 10 ratones inmunizados con MvP103 que en los que recibieron MvP101 y SL7202, lo que indicaba un patrón de respuesta similar en animales inmunizados con los dos últimos portadores.

Recogida de muestras

Se recogieron muestras de suero a diferentes puntos de tiempo y se monitorizaron para detectar la presencia de anticuerpos específicos de β-gal. En el día 52 tras la inmunización, se obtuvieron lavados intestinales lavando el 15 intestino delgado con 2 ml de PBS complementado con EDTA 50 mM, albúmina de suero bovino al 0,1% y 0,1 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja (Sigma). Entonces, se centrifugaron los lavados (10 min. a 600 x g) para eliminar el residuo, se retiraron los sobrenadantes y se complementaron con fluoruro de con fenilmetilsulfonilo (10 mM) y NaN3, y se almacenaron a -20ºC.

Ensayos de anticuerpos 20

Se determinaron títulos de anticuerpos mediante un ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA). En resumen, se recubrieron placas de ensayo de 96 pocillos Nunc-Immuno MaxiSorp™ (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con 50 μl/pocillo de β-gal (5 μg/ml) en tampón de recubrimiento (Na2HPO4 0,1 M, pH 9,0). Tras incubación durante la noche a 4ºC, se bloquearon las placas con FCS al 10% en PBS durante 1 h a 37ºC. Se añadieron diluciones de dos veces en serie de suero en FCS-PBS (100 μl/pocillo) y se incubaron las placas durante 2 h a 37ºC. Tras cuatro lavados con PBS-25 Tween 20 al 0,05%, se añadieron anticuerpos secundarios: anticuerpos de cabra específicos de cadena γ biotinilados anti- IgG ratón, de cabra específicos de cadena μ anti-IgM de ratón, de cabra específicos de cadena α anti-IgA de ratón (Sigma, St. Louis, MO) o, para determinar la subclase de IgG, anticuerpos de rata conjugados con biotina anti-IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 de ratón (Pharmingen) y se incubaron las placas adicionalmente durante 2 h a 37ºC. Tras cuatro lavados, se añadieron 100 μl de estreptavidina conjugada con peroxidasa (Pharmingen, St. Diego, CA) a cada pocillo y 30 se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 1 h. Tras cuatro lavados, se revelaron las reacciones utilizando ABTS [ácido 2,2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)] en tampón citrato-fosfato 0,1 M (pH 4,35) que contenía H2O2 al 0,01%. Los títulos del punto final se expresaron como la inversa de log2 de la última dilución que proporcionó una densidad óptica a 405 nm 0,1 unidades por encima de los valores de los controles negativos tras una incubación de 30 min. 35

Para determinar la concentración de Ig total presente en los lavados intestinales, se incubaron diluciones en serie de las muestras correspondientes en placas de microtitulación que se habían recubierto con anticuerpos de cabra anti-IgG, IgM e IgA de ratón como anticuerpos de captura (100 μg/pocillo, Sigma) y se utilizaron diluciones en serie de IgG, IgM e IgA de ratón purificados (Sigma) para generar curvas patrón. La detección de Ig específica de antígeno se realizó tal como se describió anteriormente. 40

Inducción de respuestas de CTL específicas de antígeno en ratones inmunizados por vía oral con las cepas portadoras que expresan β-gal

Es particularmente importante provocar respuestas restringidas al CMH de clase I para la protección frente a muchos tumores y patógenos intracelulares. Se ha mostrado que CTL CD8 + específicas de antígeno pueden generarse tanto in vitro como in vivo tras inmunización con Salmonella spp. recombinante que expresa antígenos heterólogos. Por 45 tanto, se consideró importante determinar si los portadores sometidos a prueba también podían desencadenar una respuesta de CTL específica de β-gal. Se recogieron células de bazo de ratones vacunados o bien con MvP101 [pAH97], MvP103 [pAH97] o bien con SL7207 [pAH97] en el día 52 desde la inmunización y se reestimularon in vitro con células de bazo singénicas pulsadas con βGP1 durante 5 días. Tal como se muestra en la figura 10, las células de bazo de ratones inmunizados con cualquiera de los tres constructos indujeron lisis significativa de células diana cargadas con 50 βGP1 en comparación con los controles no cargados. Se observaron las respuestas más eficaces utilizando la cepa portadora MvP103. La lisis se medió por células T CD8 + puesto que la actividad citotóxica se derogó completamente cando se agotaron las células efectoras T CD8 + (datos no mostrados).

Determinación de citocinas

Se recogieron sobrenadantes de cultivo de células en proliferación en los días 2 y 4, y se almacenaron a -70ºC. 55 Se realizó la determinación de IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IFN-γ mediante ELISA específico. En resumen, se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos durante la noche a 4ºC con AcM de rata purificado anti-IL-2 de ratón (clon JESG-1A12), AcM anti-IL-4 (clon 11B11), AcM anti-IL-5 (clon TRFK5), AcM anti-IL-6 (clon MP5-20F3), AcM anti-IL-

10 (clon JES5-2A5), y AcM anti-IFN-γ (clon R4-6A2) (Pharmingen). Tras tres lavados, se bloquearon las placas y se añadieron diluciones de dos veces de los fluidos sobrenadantes. Se generó una curva patrón para cada citocina utilizando IL-2 (rIL-2), rIL-4, rIL-5, rIL-6, rIFN-γ y rIL-10 murinas recombinantes (Pharmingen). Se incubaron adicionalmente las placas a 4ºC durante la noche. Tras lavar, se añadieron 100 μl/pocillo de anticuerpos monoclonales de rata biotinilados anti-IL-2 (clon JES6-5H4), IL-4 (clon BVD6-24G2), IL-5 (clon TRFK4), IL-6 (clon MP5-32C 11), IL-10 5 (clon SXC-1) y INF-γ (clon XMG1.2) de ratón y se incubaron durante 45 min. a TA. Tras seis lavados, se añadió conjugado de estreptavidina-peroxidasa y se incubó durante 30 min. a TA. Finalmente, se revelaron las placas utilizando ABTS.

Agotamiento de células de bazo CD8+.

Se agotó el subconjunto de células CD8+ utilizando microperlas MiniMACS Magnetic Ly-2 según las 10 instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec). Las preparaciones de células agotadas contenían un 1% de células CD8 +.

Análisis FACScan

Se incubaron aproximadamente 5x105 células en tampón de tinción (PBS complementado con FCS al 2% y azida sódica al 0,1%) con el anticuerpo deseado o combinación de anticuerpos durante 30 min. a 4ºC. Tras los lavados, se analizaron las células en un aparato FACScan (Becton Dickinson). Los anticuerpos monoclonares utilizados fueron 15 anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 conjugados con FITC (clones H129.19 y 53-6.7; Pharmingen).

EJEMPLO 7: Proliferación celular

Ensayo de proliferación celular

Se enriquecieron suspensiones de células de bazo para células T CD4+ utilizando microperlas MiniMACS Magnetic Ly-2 y microperlas de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón indirecto según las instrucciones del fabricante 20 (Mitenyi Biotec GmbH, Alemania). Las preparaciones celulares contenían > 65% de células CD4+. Se ajustaron las células a 2x106 células/ml en medio completo complementado con 20 U/ml de rIL-2 de ratón (Pharmigen), se sembraron a 100 μl/pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano (Nunc, Roskilde, Dinamarca) y se incubaron durante cuatro días en presencia de diferentes concentraciones de β-gal soluble. Durante las 18 horas finales de cultivo se añadió 1 μCi de [3H]-timidina (Amersham International, Amersham, R.U) por pocillo. Se recogieron las 25 células en filtros de papel utilizando un colector de células y se determinó la [3H]-timidina incorporada en el ADN de células en proliferación en un contador de centelleo β.

EJEMPLO 8: Caracterización de genes ssr y construcción y caracterización de las cepas MvP284, MvP320 y MvP333 de S. typhimurium mutantes de ssr

Homología de los genes reguladores de dos componentes ssrA y ssrB de SPI2 con otras proteínas bacterianas 30

El gen de SPI2 ssrA codifica para una proteína similar a componentes sensores de sistemas reguladores de dos componentes bacterianos tal como se ha descrito anteriormente (Ochman et al., 1996). Por coherencia con la nomenclatura de los genes de virulencia de SPI2 (Hensel et al., 1997b; Valdivia y Falkow, 1997), este gen se denomina ssrA. En el sentido de 3’ de ssrA se identificó un ORF con capacidad codificante para una proteína de 24,3 kDa. Este gen comparte similitud significativa con una familia de genes que codifica para activadores de la transcripción como 35 DegU de Bacillus subtilis, UvrY de E. coli y BvgA de Bordetella pertussis. Por tanto, es probable que la proteína actúe como el componente regulador del sistema de ssr y el gen se denominó ssrB.

Regulación inversa de SPI1 y SPI2

La expresión de los sistemas de secreción de tipo III de SPI1 y SPI2 se ve rigurosamente controlada por las condiciones del entorno. Aunque SPI1 se induce durante la fase logarítmica tardía/estacionaria temprana tras el 40 crecimiento en medios ricos de alta osmolaridad y concentración de O2 (oxígeno) limitante, no se observó inducción de la expresión de genes de SPI2. Por el contrario, tras el crecimiento en medio mínimo con cantidades limitantes de Mg2+ (8 μM) la fusión de ssaB::luc se expresaba altamente mientras que la fusión de sipC::lacZ no se expresaba. La expresión de la fusión de ssaB::luc depende de la función de SsrA/B, puesto que no se da expresión en la cepa P8G 12 antecedente negativa para ssrB (Hensel et al., 1998). La expresión de la fusión de sipC::lacZ depende de HilA, el 45 regulador de la transcripción de SPI1. También se observó que una mutación en ssrB afecta a la expresión de la fusión de sipC::lacZ. Esto indica que SPI2 tiene un efecto regulador sobre la expresión de genes de SPI1.

Se hicieron crecer cepas bacterianas que albergaban una fusión de luc con ssaB en SPI2 (cepa MvP131) y una fusión de lacZ con sipC en SPI1 (cepa MvP239) en condiciones que se mostró anteriormente que inducían la expresión de gen de SPI. Se hicieron crecer bacterias durante la noche en medio mínimo que contenía Mg2+ 8 μM o durante la 50 noche en caldo LB que contenía NaCl al 1% (LB NaCl al 1%). Se determinaron la actividad Luc de la cepa MvP131 y la actividad β-galactosidasa de la cepa MvP239. Como control, se sometieron a ensayo ambas fusiones de indicador en el antecedente de cepa negativa para ssrB de P8G12.

Se sometieron a ensayo los niveles de expresión de fusiones de gen indicador lacZ con genes de SPI tal como

se describe por Miller, 1992.

Construcción y análisis de fusión de gen indicador sseA

Se subclonó un fragmento SmaI/HincII de 1,1 kb de p5-4 en pGPLO1, un vector suicida para la generación de fusiones de luc (Gunn y Miller, 1996). Se utilizó el constructo resultante, en el que se fusionan por transcripción 1,0 kb en el sentido de 5’ y 112 pb de sseA con luc para transformar S17-1 λpir de E. coli, y se realizó la transferencia por 5 conjugación a S. typhimurium tal como se describió anteriormente (Gunn y Miller, 1996). Se confirmaron cepas que habían integrado la fusión de gen indicador en el cromosoma mediante recombinación homóloga mediante análisis de hibridación de tipo Southern y PCR. Posteriormente, se trasladó la fusión mediante transducción con P22 al antecedente de tipo natural y diversos antecedentes de cepas mutantes con inserciones de mTn5 en genes de SPI1 o SPI2 (Maloy et al., 1996). Como control, se construyó una cepa que albergaba una integración cromosómica de pLB02, un plásmido 10 suicida sin una fusión de promotor con el gen luc (Gunn y Miller, 1996). Para el análisis de la expresión génica, se hicieron crecer cepas durante 16 h en medio mínimo con aireación. Se lisaron alícuotas de los cultivos bacterianos y se determinó la actividad luciferasa utilizando un kit de ensayo de luciferasa según el protocolo del fabricante (Boehringer Mannheim). Se realizó la detección de fotones en un contador de centelleo/luminiscencia de microplacas (Wallac, Turku). Todos los ensayos se realizaron por triplicado, y se replicaron en ocasiones independientes. 15

La expresión de sseA depende de SsrAB

Para establecer si los genes sse forman parte del sistema de secreción de SPI2, se ha investigado la expresión de una fusión de gen indicador sseA::luc, integrada mediante recombinación homóloga en el cromosoma de cepas mutantes de SPI2 diferentes, (figura 11). La actividad de transcripción de sseA en un antecedente de tipo natural durante el crecimiento en medio mínimo se redujo drásticamente mediante la inactivación del sistema de dos 20 componentes de SPI2. Inserciones de transposión en ssrA (cepa mutante P3F4) y ssrB (cepa mutante P8G12), que codificaban para el componente sensor y el activador de la transcripción, respectivamente, dieron como resultado una expresión reducida de 250 a 300 veces de sseA. La inactivación de hilA, el activador de la transcripción de SPI1 (Bajaj et al., 1996), no presentó ningún efecto sobre la expresión del gen sseA. Inserciones de transposón en dos genes que codificaban para componentes del aparato de secreción de tipo III de SPI2 (ssaJ::mTn5 y ssaT::mTn5; cepas mutantes 25 P11D10 y P9B7; Shea et al., 1996) tampoco presentaron ningún efecto significativo sobre la expresión de sseA. Estos datos muestran que se requiere SsrA/B para la expresión de sseA, pero que no se requiere hilA.

La expresión de genes de SPI2 dentro de macrófagos depende de SsrA/B

La presencia de S. typhimurium dentro de células eucariotas (macrófagos) induce la expresión de genes de SPI2 tal como se indica mediante el análisis de fusiones con ssaB y ssaH. Esta expresión depende del sistema 30 regulador de dos componentes SsrA/B codificado por SPI2.

Se utilizó la línea celular de línea de macrófagos murina J744 para este experimento. Se infectaron macrófagos a una multiplicidad de infección de 10 bacterias por macrófago con MvP131 (fusión de luc con ssaB), MvP266 (fusión de luc con ssaH) y MvP244 (fusión de luc con ssaB en un antecedente negativo para ssrB). Se destruyeron bacterias extracelulares mediante la adición de gentamicina (20 μg/ml). A diversos puntos de tiempo, se lisaron macrófagos 35 mediante la adición de Triton X-100 al 0,1%, y se enumeraron las bacteria intracelulares mediante sembrado en placa de diluciones en serie sobre placas de agar LB. Se recuperó una alícuota adicional de las bacterias y se determinó la actividad luciferasa. Se expresaron las actividades luciferasa como emisión de luz relativa por bacteria.

Efectos de una mutación en ssrB sobre la proteína efectora secretada de SipC de SPI1

El análisis de proteínas secretadas en el medio de crecimiento por la cepa mutante MvP320 de SPI2 de S. 40 typhimurium (mutación no polar en un, figura 12) reveló la ausencia o la fuerte reducción en las cantidades de la proteína efectora SPI1 secretada (Hensel et al., 1997b). También se reduce la capacidad de estos mutantes de SPI2 para invadir células epiteliales cultivadas o macrófagos cultivados (Hensel et al., 1997b). Para examinar este fenómeno en mayor detalle, se expresó SipC recombinante (rSipC) y se generaron anticuerpos frente a rSipC en conejos. En inmunotransferencias de tipo Western, el antisuero frente a rSipC reaccionó con una proteína de 42 kDa a partir de 45 precipitados de sobrenadantes de cultivo de la cepa de tipo natural NCTC12023 de S. typhimurium. No se observó ninguna reacción con los sobrenadantes de los cultivos de EE638, una cepa deficiente en SipC (Hueck et al., 1995). Además, en las inmunotransferencias de tipo Western no pudo detectarse SipC en los sobrenadantes de cultivo de los mutantes MvP320 de SPI2. Sin embargo, se detectó SipC en los sobrenadantes de cultivo de otros mutantes de SPI2 como P2D6 (ssaV::mTn5), P9B6 (ssaV::mTn5) y NP ssaV (ssaV::aphT) (Deiwick et al., 1998). La detección mediante 50 antisuero de SipC en sobrenadantes de cultivo de diversas cepas concordaba con la presencia o ausencia de SipC tal como se detectó mediante SDS-PAGE. Además, se analizó si la ausencia de SipC en sobrenadantes de cultivo de cepas mutantes de SPI2 se debía a una secreción defectuosa de SipC a través del sistema de secreción de tipo III o a una síntesis reducida de SipC en estas cepas. Se utilizó antisuero frente a rSipC para detectar SipC en sedimentos de cultivos que se hicieron crecer en condiciones de inducción para la expresión de genes de SPI1 (es decir fase 55 estacionaria, alta osmolaridad, poco oxígeno) (Bajaj et al., 1996). El análisis de cepas de tipo natural y de cepas que portaban diversas mutaciones en genes de SPI1 y SPI2 indicó cantidades altamente reducidas de SipC en los mutantes con una mutación no polar en ssrB. Sin embargo, se detectó SipC a niveles comparables con los observados en

sedimentos de cultivos de tipo natural y cepas mutantes de SPI2 P2D6, P9B6 y NP ssaV. El efecto sobre la síntesis de SipC no se debe a tasas de crecimiento reducidas o niveles de proteína reducidos en mutantes de SPI2, puesto que ambos parámetros eran comparables para el tipo natural y los mutantes de SPI2.

Efectos de una mutación en el gen de SPI2 ssrB sobre la expresión de genes de SPI1

Con el fin de someter a ensayo el efecto de mutaciones de SPI2 sobre la expresión de genes de SPI1, se 5 transdujeron fusiones caracterizadas anteriormente de lacZ con diversos genes de SPI1 (Bajaj et al., 1995; Bajaj et al., 1996) en el mutante MvP320 de SPI2 y diversos mutantes de SPI1 para generar un conjunto de cepas de fusión de indicador. Se sometió a ensayo la expresión del indicador β-galactosidasa en cultivos que se habían hecho crecer en condiciones inductoras para la expresión de SPI1 (véase anteriormente). Una inserción de Tn en hilA (P4H2) redujo la expresión de prgK así como sipC, mientras que una inserción en spaRS (P6E 11) sólo afectó a la expresión de sipC. 10 Algunas cepas mutantes con una mutación en el gen de SPI2 ssrB que codificaba para un componente del sistema regulador de dos componentes mostraron expresión reducida de las fusiones de indicador con prgK y sipC (figura 11). Los efectos sobre la expresión de ambos genes fueron similares. Otras cepas mutantes con inserciones de Tn en ssaV (P2D6, P9B6), así como el mutante NP ssaV que albergaba una inserción no polar en ssaV, presentaban niveles de expresión de prgK y sipC comparables con los de las fusiones de indicador correspondientes en un antecedentes 15 genético de tipo natural. El análisis de fusiones de lacZ con prgH e invF revelaron un efecto similar sobre la expresión tal como se muestra para prgK y sipC.

Una mutación en el gen de SPI2 ssrB afecta a la expresión del regulador de SPI1 hilA

El análisis de fusiones de indicador con sipC y prgK indicó que la expresión de genes en dos operones diferentes de SPI1 puede verse afectada por mutaciones de SPI2, lo que sugiere que estas mutaciones afectan a otros 20 genes de SPI1 implicados en la regulación de sipC y prgK. Anteriormente se ha demostrado que la expresión de genes de SPI1 está bajo el control del activador de la transcripción HilA (Bajaj et al., 1995; Bajaj et al., 1996). Por tanto, la expresión de hilA se analizó en presencia de una mutación de SPI2 en ssrB. La cepa mutante MvP320 de SPI2 presentaba niveles enormemente disminuidos de expresión de hilA. De nuevo, se observaron niveles muy bajos de expresión de hilA en mutantes que presentaban niveles reducidos de expresión de prgK y sipC. Para analizar si el efecto 25 de la mutación de SPI2 sobre la expresión de sipC resultaba de la expresión reducida de hilA, a continuación se realizaron experimentos de complementación en diversas cepas mutantes que albergaban pVV135 (expresión constitutiva de hilA) (Bajaj et al., 1996) o pVV214 (expresión de hilA a partir del promotor nativo) (Bajaj et al., 1995). Según un estudio previo (Bajaj et al., 1995), la mutación de hilA de la cepa P4H2 se complementaba mediante pVV214. Sin embargo, no se restableció la expresión de sipC en la cepa mutante MvP320 que albergaba o bien pVV135 o bien 30 pVV214.

Construcción de las cepas MvP284 y MvP320 de S. typhimurium mutantes de ssrA y ssrB

Mutante MvP284, ssrA. Se subclonó el gen ssrA (figura 12) a partir del plásmido p2-2 derivado del clon λ2 de fago en un fragmento BamHI de 5,7 kb en pUC18 tal como se indica en la tabla 1. Se recuperó un fragmento de 1,6 kb tras digestión con HindIII y EcoRV de p2-2 y se subclonó en pBluescript II KS + digerido con HindIII/HincII. Se digirió el 35 constructo resultante denominado p2-20 con Hincll y se desfosforiló con fosfatasa alcalina. Se aisló el casete aphT tal como se describió anteriormente y se ligó con el plásmido p2-20 linealizado en la misma orientación en el sitio Hincll único. Tras la transformación de XL-1 Blue de E. coli y selección frente a kanamicina y carbenicilina (50 μg/ml cada una) se ha elegido un clon y se ha aislado el plásmido que lo albergaba. Este plásmido se denominó p2-21 y se demostró su identidad a través de análisis de restricción. Se digirió adicionalmente p2-21 con KpnI y XbaI, un fragmento de 2,5 kb 40 aislado y ligado con pKAS32 digerido con KpnI/XbaI. Se sometió a electroporación este plásmido en CC118 λpir de E. coli y se seleccionaron transformantes frente a kanamicina y carbenicilina (50 μg/ml cada una). Tal como se hizo anteriormente, se eligió un clon, se aisló su plásmido con el fragmento de ADN correspondiente en pKAS32, denominado p2-22, y se confirmó mediante análisis de restricción. Se sometió a electroporación el plásmido p2-22 en S17-1 λpir de E. coli y se transfirió a NCTC12023 de S. typhimurium (resistente a estreptomicina) mediante conjugación 45 tal como se ha descrito anteriormente (de Lorenzo y Timmis, 1994). Se seleccionaron exconjugantes en los que el gen ssrA se había sustituido por el gen clonado perturbado mediante la inserción del casete aphT mediante su crecimiento en placas de agar de medio mínimo M9 + glucosa (Maloy et al., 1996) y su resistencia a kanamicina y carbenicilina (100 μg/ml). Finalmente se mostró que los exconjugantes resultantes presentaban un fenotipo negativo para lactosa y que eran sensibles a kanamicina y estreptomicina. Se examinaron adicionalmente los clones seleccionados mediante 50 análisis de transferencia de tipo Southern. Con el fin de excluir posibles mutaciones que podrían haberse desarrollado durante el procedimiento de clonación, se transfirió el alelo de ssrA mutado a un antecedente de Salmonella reciente mediante transducción con P22 (descrito por Maloy et al., 1996). Se examinó la cepa de Salmonella resultante MvP284 para determinar la presencia del casete de resistencia dentro del gen ssrA mediante la utilización de los cebadores ssrA-For (5’- AAG.GAA TTC AAC AGG CAA CTG GAG G-3’) (SEC ID nº 64) y ssrA-Rev (5- CTG CCC TCG CGA AAA TTA 55 AGA TAA TA -3’) (SEC ID nº 65). La amplificación de ADN a partir de clones que contenían el alelo de ssrA de tipo natural dio como resultado un producto de PCR de 2800 pb, la utilización de ADN de clones que albergaban un alelo de ssrA perturbado por el casete aphT dio como resultado un producto de PCR de 3750 pb. Se examinó la cepa de Salmonella resultante MvP320 para determinar la presencia del casete de resistencia dentro del gen ssrB mediante la utilización de análisis de hibridación de tipo Southern del ADN total de los exconjugantes. 60

Mutante MvP320, ssrB. Se subclonó el gen ssrB (figura 12) a partir del plásmido p1-6 derivado del clon λ1 de fago en un fragmento PstI/BamHI de 4,8 kb en pT7-Blue tal como se indica en la tabla 1. Se recuperó un fragmento de 1,7 kb tras digestión con BamHI y HincII de p 1-6 y se subclonó en pBluescript II KS+ digerido con BamHI/HincII. Se digirió el constructo resultante denominado p1-20 con EcoRV y se desfosforiló con fosfatasa alcalina. Se aisló el casete aphT tal como se describió anteriormente y se ligó con el plásmido p1-20 linealizado en la misma orientación en el sitio 5 EcoRV único. Tras la transformación de XL-1 Blue de E. coli y selección frente a kanamicina y carbenicilina (50 μg/ml cada una) se ha elegido un clon y se ha aislado el plásmido que lo albergaba. Este plásmido se denominó p1-21 y se confirmó su identidad mediante análisis de restricción. Se digirió adicionalmente p1-21 con KpnI y XbaI, un fragmento de 2,5 kb aislado y ligado con pKAS32 digerido con KpnI/XbaI. Se sometió a electroporación este plásmido en CC118 λpir de E. coli y se realizaron bacterias transformadas seleccionadas frente a kanamicina y carbenicilina (50 μg/ml cada una). 10 Tal como se hizo anteriormente, se eligió un clon, se aisló su plásmido con el fragmento de ADN correspondiente en pKAS32, denominado p1-22, y se confirmó mediante análisis de restricción. Se sometió a electroporación el plásmido p 1-22 en S17-1 λpir de E. coli y se transfirió a NCTC12023 de S. typhimurium (resistente a estreptomicina) mediante conjugación tal como se ha descrito anteriormente (de Lorenzo y Timmis, 1994). Se seleccionaron exconjugantes en los que el gen ssrB se había sustituido por el gen clonado perturbado mediante la inserción del casete aphT mediante su 15 crecimiento en placas de agar de medio mínimo M9 + glucosa (Maloy et al., 1996) y su resistencia a kanamicina y carbenicilina (100 μg/ml). Finalmente se mostró que los exconjugantes resultantes presentaban un fenotipo negativo para lactosa y que eran sensibles a kanamicina y estreptomicina. Se examinaron adicionalmente clones seleccionados mediante análisis de transferencia de tipo Southern. Con el fin de excluir posibles mutaciones que podrían haberse adquirido durante el procedimiento de clonación, se transfirió el alelo de ssrB mutado a un antecedente de Salmonella 20 reciente mediante transducción con P22 (descrito por Maloy et al., 1996). Se realizó la selección de mutantes con una inserción del casete aphT dentro del locus ssrB mediante PCR utilizando los cebadores ssrB-For (5’- CTT AAT TTT CGC GAG GG -3’) (SEC ID nº 66) y ssrB-Rev (5’- GGA CGC CCC TGG TTA ATA -3’) (SEC ID nº 67). La amplificación de ADN a partir de clones que contenían el alelo de ssrB de tipo natural dio como resultado un producto de PCR de 660 pb, la utilización de ADN de clones que albergaban un alelo de ssrB perturbado mediante la inserción del casete aphT 25 dio como resultado un producto de PCR de 1600 pb. Se examinó la cepa de Salmonella resultante MvP320 para determinar la presencia del casete de resistencia dentro del gen ssrB mediante la utilización de análisis de hibridación de tipo Southern del ADN total de los exconjugantes.

Construcción de la cepa mutante MvP340 que porta una deleción en marco en ssrA

Se generó una deleción de 407 codones entre el codón 44 y 451 de ssrB. Se digirió el plásmido p2-2 con 30 BamHI y KpnI, se recuperó un fragmento de 3,7 kb y se subclonó en pBluescript KS + para generar p2-50. Se linealizó el plásmido p2-50 mediante digestión con PstI, que corta una vez dentro del fragmento subclonado del gen ssrA. Se diseñaron los cebadores ssrA-del-1 (5’- GGT CTG CAG GAT TTT TCA CGC ATC GCG TC -3’) (SEC ID nº 68) y ssrB-del-2 (5’- GGT CTG CAG AAC CAT TGA TAT ATA AGC TGC -3’) (SEC ID nº 69) para introducir sitios PstI. Se realizó PCR utilizando p2-50 linealizado como ADN de molde. Se utilizó la polimerasa TaqPlus (Stratagene) según las 35 instrucciones del fabricante. Se configuraron reacciones de 100 μl de volumen utilizando 10 μl de 10 x tampón TaqPlus Precision que contenía cloruro de magnesio, 0,8 μl de dNTP 100 mM, 250 ng de molde de ADN (p2-50 linealizado), 250 ng de cada cebador y 5 U de ADN polimerasa TaqPlus. Se llevó a cabo PCR durante 35 ciclos de: 95ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 6 minutos. Entonces se añadió una etapa final de 72ºC durante 10 minutos. Se analizaron 10 μl de la reacción de PCR. Se recuperó un producto del tamaño esperado, se digirió con PstI, 40 se autoligó, y se utilizó la mezcla de ligación para transformar DH5α de E. coli para resistencia a carbenicilina. Se aislaron plásmidos a partir de transformantes y se analizó la integridad del inserto y la deleción mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN. Se aisló el inserto de un constructo confirmado tras digestión con XbaI y KpnI y se ligó con el vector pKAS32 digerido con XbaI/KpnI. Se utilizó el constructo resultante para transformar S17-1 λpir de E. coli para resistencia a carbenicilina, y se realizó la transferencia por conjugación del plásmido a S. typhimurium (NalR, 45 StrepR) según procedimientos convencionales (de Lorenzo y Timmis, 1994). Se seleccionaron exconjugantes que habían integrado el plásmido suicida mediante recombinación homóloga mediante resistencia a ácido nalidíxico y carbenicilina, y se examinaron para determinar su sensibilidad a estreptomicina. Se hicieron crecer tales clones en LB hasta DO600 de aproximadamente 0,5 y se sembraron en placa alícuotas en LB que contenía estreptomicina 250 μg/ml para seleccionar colonias que habían perdido el plásmido integrado y experimentado intercambio alélico. Se utilizaron clones 50 resistentes a estreptomicina pero sensibles a carbenicilina para un análisis adicional. Se realizó la selección de mutantes con una deleción dentro del locus ssrA mediante PCR utilizando los cebadores ssrA-For (5’- AAG GAA TTC AAC AGG CAA CTG GAG G-3’) (SEC en nº 64) y ssrA-Rev (5- CTG CCC TCG CGA AAA TTA AGA TAA TA -3’) (SEC en nº 65). La amplificación de ADN a partir de clones que contenían el alelo de ssrA de tipo natural dio como resultado un producto de PCR de 2800 pb, la utilización de ADN de clones que albergaban un alelo de ssrA con una deleción interna dio como 55 resultado un producto de PCR de 1580 pb. Se confirmó adicionalmente la integridad de los clones que albergaban la deleción de ssrA mediante análisis de tipo Southern del locus ssrA. Finalmente, se trasladó el locus ssrA que contenía la deleción en marco interna a un antecedente de cepa reciente de S. typhimurium mediante transducción con P22 (Maloy et al., 1996) y la cepa resultante se denominó MvP340.

Hibridación de tipo Southern 60

Se preparó ADN genómico de Salmonella tal como se describió anteriormente (Hensel et al., 1997). Para en análisis de hibridación de tipo Southern, se digirió ADN genómico con EcoRI o EcoRV, se fraccionó en geles de agarosa

al 0,6% y se transfirió a membranas Hybond N+ (Amersham, Braunschweig). Se obtuvieron diversas sondas correspondientes a la región de ssrA y ssrB como fragmentos de restricción del inserto subclonado de λ1 y λ2.

EJEMPLO 9: Evaluación de seguridad de la cepa MvP320 de S. typhimurium

Para los ensayos de competición entre la cepa de tipo natural de S. typhimurium y la cepa mutante MvP320, se hicieron crecer bacterias en LB hasta una densidad óptica a 600 nm de 0,4 - 0,6. Se diluyeron cultivos y se mezclaron 5 alícuotas de los dos cultivos para formar un inóculo que contenía cantidades iguales de ambas cepas. Se determinó la razón de ambas cepas sembrando diluciones en placas de LB que contenían antibióticos selectivos para cepas individuales. Se utilizó un inóculo de aproximadamente 104 unidades formadoras de colonias (ufc) para infectar durante 6 a 8 semanas ratones BALB/c hembra viejos (Charles River Breeders, Wiga) mediante inyección en la cavidad peritoneal. A diversos puntos de tiempo tras la infección se sacrificaron los ratones mediante dislocación cervical y se 10 determinó la carga bacteriana del hígado y bazo mediante sembrado en placa de homogeneizados de tejido utilizando el dispositivo de sembrado en placa espiral “WASP” (Meintrup, Lähden). El sembrado en placa se realizó utilizando placas de LB que contenían kanamicina 50 μg/ml o ácido nalidíxico 100 μg/ml para seleccionar las cepas mutantes o de tipo natural, respectivamente.

Se recuperó la cepa MvP320 que albergaba el casete génico aphT en ssrB en números por lo menos 1000 15 veces inferiores que la cepa de tipo natural de S. typhimurium. Estos datos indican que ssrB contribuye significativamente a infecciones sistémicas de S. typhimurium en el modelo de ratón de salmonelosis.

Análisis estadístico de todos los experimentos.

Se determinó la significación estadística entre muestras apareadas mediante la prueba de la t de Student. Se determinó la significación de los resultados obtenidos utilizando el software statgraphic plus para windows 2.0 (Statistical 20 Graphic Corp.).

EJEMPLO 10: Caracterización del promotor PssaE inducible in vivo (promotor B, figura 24B)

Se mostró que el promotor que estaba dispuesto en el sentido de 5’ de ssaE (PssaE, anteriormente denominado promotor B) estaba regulado por el locus ssrAB. Se mostró que un fragmento de ADN que comprende los nucleótidos 800 a 120 (800-1205) en la secuencia incluida (figura 21A) confería regulación dependiente de ssrB tras la expresión de 25 un gen indicador (gfp) fusionado con el promotor. Se clonó el fragmento de ADN en un plásmido de bajo número de copias delante del gen gfp. Tal como se ha mostrado anteriormente para otros constructos de genes indicadores, se observó la inducción de la expresión a partir de PssaE (800-1205) en medio mínimo de magnesio (Deiwick et al., 1999) y dependía de la presencia de un alelo de tipo natural cromosómico de ssrB. Un fragmento de ADN más corto, que comprendía los nucleótidos 923 a 1205 (923-1205) en la secuencia incluida, no confería regulación tras la expresión de 30 gfp. Sin embargo, se redujo la expresión en comparación con el fragmento de PssaE (800-1205) y no se indujo en medio mínimo de magnesio ni dependía de ssrB. Por tanto, el fragmento de PssaE (800-1205) comprende secuencias activas y reguladoras de promotor, que incluyen probablemente un sitio de unión a SsrB.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Mapa de la isla de patogenicidad 2 de Salmonella (A) que indica las posiciones de las mutaciones en 35 las cepas MvP101, MvP102 y MvP103 (B). Se muestra un mapa de restricción parcial de la región genómica, y se indican las posiciones de insertos de plásmido relevantes para este trabajo (C). B, BamHI; C, Clal; E, EcoRI; P, PstI; V, EcoRV; S, SmaI; se indican los números de registro de la base de datos EMBL para las secuencias en (A).

Figura 2a. Alineación de la secuencia de aminoácidos de SseB deducida con respecto a EspA de EPEC (Elliot et al., 1998). Se utilizó el algoritmo ClustalW del programa MacVector 6.0 para construir las alineaciones. Residuos de 40 aminoácido similares están en recuadro, residuos idénticos están en recuadro y sombreados.

Figura 2b. Alineación de la secuencia de aminoácidos de SseC deducida con respecto a EspD de EPEC (Elliot et al., 1998), YopB de Yersinia enterocolitica (Hakansson et al., 1993), y PepB de Pseudomonas aeruinosa (Hauser et al., 1998). Se utilizó el algoritmo ClustalW del programa MacVector 6.0 para construir las alineaciones. Posiciones en las que por lo menos tres residuos de aminoácido son similares están en recuadro, en las que por lo menos tres residuos 45 son idénticos están en recuadro y sombreadas.

Figura 3. Acumulación intracelular de mutantes de SPI2 de S. typhimurium en macrófagos RAW 264.7. Tras la opsonización e infección, se lisaron los macrófagos y se cultivaron para la enumeración de bacterias intracelulares (protegidas frente a gentamicina) a las 2 h y 16 h tras la infección. Los valores mostrados representan el aumento en veces calculado como una razón de las bacterias intracelulares entre las 2 h y 16 h tras la infección. Se realizó la 50 infección por triplicado para cada cepa y se muestra el error estándar de la media.

Figura 4. Supervivencia intracelular y replicación de mutante de SPI2 de S. typhimurium en (A) células J774.1 y (B) macrófagos peritoneales provocados por peryodato de ratones C3H/HeN. Tras la opsonización e internalización, se lisaron fagocitos y se cultivaron para la enumeración de bacterias intracelulares viables en el tiempo 0 h. Los valores mostrados representan la proporción de este inóculo intracelular viable a las 20 h ± el error estándar de la media. Las 55

muestras se procesaron por triplicado, y se realizó cada experimento por lo menos dos veces.

Figura 5. Anticuerpos específicos de β-gal en lavados intestinales de ratones inmunizados por vía oral o bien con MvP101[pAH97], MvP103 [pAH97], SL7207 [pAH97] o bien con MvP101 en el día 52 tras la inmunización. Los resultados se expresan como porcentaje de la subclase de Ig total correspondiente presente en el lavado intestinal, el EEM se indica mediante líneas verticales. No pudieron detectarse niveles significativos de IgM específica de antígeno en 5 ninguno de los grupos. Los resultados obtenidos con MvP103 y SL7207 (no mostrados) fueron similares a los de MvP101.

Figura 6. Respuesta proliferativa específica de β-gal de células de bazo enriquecidas en CD4+ de ratones inmunizados por vía oral o bien con MvP101 [pAH97], MvP103 [pAH97], SL7207 [pAH97] o bien con MvP101. Se reestimularon las células in vitro durante una incubación de 4 días con diferentes concentraciones de β-gal soluble. Los 10 valores se expresan como cpm medio de valores por triplicado; el EEM fue en todos los casos inferior al 10%. Se restaron los valores de fondo obtenidos de pocillos sin el antígeno de estimulación. Los resultados obtenidos con MvP103 y SL7207 (no mostrados) fueron similares a los obtenidos con MvP101.

Figura 7. IFN-γ presente en sobrenadantes de células de bazo enriquecidas en CD4+ cultivadas de ratones inmunizados por vía oral o bien con MvP101 [pAH97], MvP103 [pAH97], SL7207 [pAH97] o bien con MvP101 sin 15 plásmido en el día 2 y 4 de cultivo. Se aislaron células de bazo de ratones en el día 52 tras la inmunización, y se reestimularon in vitro poblaciones enriquecidas en CD4+ durante cuatro días en presencia de β-gal soluble (20 μg/ml). Se determinó la producción de IFN-γ mediante ELISA, los resultados representan las medias de tres determinaciones. El EEM se indica mediante líneas verticales, se obtuvieron resultados similares utilizando cualquiera de los portadores sin plásmido (no mostrado). No se observaron diferencias significativas con los grupos control cuando se sometieron a 20 prueba IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10 (no mostrado).

Figura 8. Cinética de las respuestas de anticuerpos IgG (símbolos rellenos) e IgM (símbolos sin rellenar) séricos específicos de β-gal en ratones (n = 5) tras inmunización oral o bien con MvP101 [pAH97] (triángulo), MvP103 [pAH97] (círculo), SL7207 [pAH97] (cuadrado) o bien con MvP101 sin plásmido (rombo). Los resultados se expresan como la inversa de log2 de la media geométrica del título de punto final (GMT), el EEM fue en todos los casos inferior al 25 10%. Se obtuvieron resultados similares utilizando cualquiera de los portadores sin plásmido (no mostrado), las inmunizaciones se indican mediante flechas.

Figura 9. Perfiles de subclases de los anticuerpos IgG específicos de β-gal presentes en el suero de ratones (n = 5) inmunizados por vía oral o bien con MvP101 [pAH97], MvP103 [pAH97], SL7207 [pAH97] o bien con MvP101 sin plásmido en el día 52 tras la inmunización. Los resultados se expresan como ng/ml, el EEM se indica mediante líneas 30 verticales. Se obtuvieron resultados similares utilizando cualquiera de los portadores sin plásmido (no mostrado).

Figura 10. Reconocimiento del epítopo βGP1 restringido por el CMH de clase I mediante linfocitos sensibilizados in vivo en ratones mediante vacunación oral o bien con MvP101 [pAH97], MvP103 [pAH97], SL7207 [pAH97] o bien con MvP101 sin plásmido. Se reestimularon in vitro células de bazo de ratones inmunizados cinco días en presencia de βGP1 20 μM. Al final del cultivo, se sometieron a prueba los linfocitos en un ensayo de liberación de 35 [3H]-timidina utilizando P815 (símbolos sin rellenar) y P815 cargado con βGP1 (símbolos rellenos) como dianas. Los resultados con valores medios de pocillos por triplicado (se muestra uno de cada tres experimentos independientes) y se expresan como: [(cpm retenido en ausencia de efectores) - (cpm retenido experimentalmente en presencia de efectores) / cpm retenido en ausencia de efectores] x 100; los EEM fueron inferiores al 5% de los valores. Se obtuvieron resultados similares utilizando cualquiera de los portadores sin plásmido (no mostrado). 40

Figura 11. Expresión de una fusión de sseA::luc en cepas de tipo natural y cepas mutantes de mTn5 de S. typhimurium.

Figura 12. Mapa de la isla de patogenicidad 2 de Salmonella (A) que indica las posiciones de las mutaciones en cepas MvP284 y MvP320 (B). Se muestra un mapa de restricción parcial de la región genómica, y se indica la posición de insertos de plásmidos relevantes para este trabajo (C). B, BamHI; C, Clal; H, HindIII; P, PstI; V; S, SmaI; EcoRV; II, 45 HincII.

Figura 13. Modelo para la organización de la transcripción de genes de virulencia de SPI2. Este modelo se basa en la observación de la dirección de la transcripción de genes de SPI2, caracterización de actividades de promotor

Figura 14. Representa el principio de cómo pueden generarse mutaciones que tienen un grado diferente de atenuación. Tal como se muestra en A, la inactivación de un gen efector tal como sse da como resultado un bajo grado 50 de atenuación. Tal como se muestra en B, la inactivación adicional de un gen ubicado dura del locus SPI2 tal como aroA da como resultado un grado medio de atenuación. Mediante mutación por inserción con un efecto polar todos los genes en una agrupación policistrónica se ven afectados, lo que da como resultado un alto grado de atenuación, tal como se muestra en C. Tal como se muestra en D, la inactivación de un gen regulador tal como ssrB da como resultado una atenuación suprema. 55

Figura 15. Muestra el principio de la mutación por inserción mediante un ejemplo de mutación por inserción en un gen de virulencia. Pueden insertarse diferentes casetes tales como SMC, GEC, TC y/o casete de invertasa en un gen

de virulencia clonado, proporcionando así un gen de virulencia inactivado que puede introducirse en una célula mediante recombinación homóloga utilizando un casete de gen de virulencia.

Figura 16. Ilustra el casete de marcador selectivo.

Figura 17. Ilustra el casete de expresión génica y la inducción del mismo en un sistema de dos fases. El casete de expresión génica comprende un promotor, opcionalmente un casete génico que comprende una o más unidades de 5 expresión y opcionalmente uno o más terminadores de la transcripción para las unidades de expresión y/o una secuencia transcrita en el sentido de 5’ con respecto al casete de expresión génica.

Figura 18. Representa los requisitos estructurales de la unidad de expresión génica para el suministro de antígenos heterólogos en diversos compartimentos, es decir, secuencias auxiliares que dirigen la selección como diana del producto de expresión. 10

Figura 19. Representa un casete transactivador en un sistema de una sola fase y un sistema de dos fases.

Figura 20. Representa los diferentes modos de expresión génica tal como se realiza mediante la combinación de diferentes secuencias auxiliares y/o casetes en un sistema de una sola fase y un sistema de dos fases.

Figura 21A. Representa la secuencia genómica de una región del locus SPI2 de Salmonella que comprende las secuencias completas de los genes ssaE a ssal y secuencias parciales de ssaD y ssaJ (véase la figura 12). 15

Figura 21B. Representa la secuencia de nucleótidos de una región del locus SPI2 de Salmonella que comprende las secuencias codificantes para ssrA y ssrB.

Figuras 22A-Q. Representa cada una la secuencia de nucleótidos del gen respectivo indicado.

Figuras 23A-Q. Muestra cada una la secuencia de aminoácidos del polipéptido respectivo indicado.

Figuras 24A,B. Muestra cada una una secuencia de nucleótidos que comprende un promotor inducible in vivo. 20

LISTADO DE SECUENCIAS

SEC ID nº: 1

región genómica ácido nucleico figura 21A

SEC ID nº: 2

región genómica ácido nucleico figura 21B

SEC ID nº: 3

sseA ácido nucleico figura 22A

SEC ID nº: 4

sseA producto de traducción figura 23A

SEC ID nº: 5

sseB ácido nucleico figura 22B

SEC ID nº: 6

sseB producto de traducción figura 23B

SEC ID nº: 7

sseC ácido nucleico figura 22C

SEC ID nº: 8

sseC producto de traducción figura 23C

SEC ID nº: 9

sseD ácido nucleico figura 22D

SEC ID nº: 10

sseD producto de traducción

SEC ID nº: 11

sseD proteína figura 23D

SEC ID nº: 12

sseE ácido nucleico figura 22E

SEC ID nº: 13

sseE producto de traducción figura 23E

SEC ID nº: 14

sseF ácido nucleico figura 22F

SEC ID nº: 15

sseF producto de traducción figura 23F

SEC ID nº: 16

sseG ácido nucleico figura 22G

SEC ID nº: 17

sseG producto de traducción figura 23G

SEC ID nº: 18

sscA ácido nucleico figura 22H

SEC ID nº: 19

sscA producto de traducción figura 23H

SEC ID nº: 20

sscB ácido nucleico figura 22I

SEC ID nº: 21

sscB producto de traducción figura 23I

SEC ID nº: 22

ssaD ácido nucleico figura 22J

SEC ID nº: 23

ssaD producto de traducción figura 23J

SEC ID nº: 24

ssaE ácido nucleico figura 22K

SEC ID nº: 25

ssaE producto de traducción figura 23K

SEC ID nº: 26

ssaG ácido nucleico figura 22L

SEC ID nº: 27

ssaG producto de traducción figura 23L

SEC ID nº: 28

ssaH ácido nucleico figura 22M

SEC ID nº: 29

ssaH producto de traducción figura 23M

SEC ID nº: 30

ssaI ácido nucleico figura 22N

SEC ID nº: 31

ssaI producto de traducción figura 23N

SEC ID nº: 32

ssaJ ácido nucleico figura 22O

SEC ID nº: 33

ssaJ producto de traducción figura 23O

SEC ID nº: 34

ssrA ácido nucleico figura 22P

SEC ID nº: 35

ssrA producto de traducción figura 23P

SEC ID nº: 36

ssrB ácido nucleico figura 22Q

SEC ID nº: 37

ssrB producto de traducción figura 23Q

SEC ID nº: 38

Promotor A2 ácido nucleico figura 24A

SEC ID nº: 39

Promotor B ácido nucleico figura 24B

SEC ID nº: 40

Esp A proteína figura 2A

SEC ID nº: 41

Esp D proteína figura 2B

SEC ID nº: 42

Yop B proteína figura 2B

SEC ID nº: 43

Pep B proteína figura 2B

SEC ID nº: 44

D89 ácido nucleico página 33

SEC ID nº: 45

D90 ácido nucleico página 33

SEC ID nº: 46

D91 ácido nucleico página 33

SEC ID nº: 47

D92 ácido nucleico página 33

SEC ID nº: 48

E25 ácido nucleico página 41

SEC ID nº: 49

E28 ácido nucleico página 41

SEC ID nº: 50

E6 ácido nucleico página 42

SEC ID nº: 51

E4 ácido nucleico página 43

SEC ID nº: 52

sseC-del1 ácido nucleico página 44

SEC ID nº: 53

sseE-del1 ácido nucleico página 44

SEC ID nº: 54

sseC-For ácido nucleico página 45

SEC ID nº: 55

sseC-Rev ácido nucleico página 45

SEC ID nº: 56

sseD-del1 ácido nucleico página 45

SEC ID nº: 57

sseD-del2 ácido nucleico página 45

SEC ID nº: 58

sseD-For ácido nucleico página 46

SEC ID nº: 59

sseD-Rev ácido nucleico página 46

SEC ID nº: 60

sscB-del1 ácido nucleico página 47

SEC ID nº: 61

sscB-del2 ácido nucleico página 47

SEC ID nº: 62

sscB-For ácido nucleico página 47

SEC ID nº: 63

sscB-Rev ácido nucleico página 47/48

SEC ID nº: 64

ssrA-For ácido nucleico página 66

SEC ID nº: 65

ssrA-Rev ácido nucleico página 66

SEC ID nº: 66

ssrB-For ácido nucleico página 67

SEC ID nº: 67

ssrB-Rev ácido nucleico página 67

SEC ID nº: 68

ssrA-del1 ácido nucleico página 67

SEC ID nº: 69

ssrB-del2 ácido nucleico página 68

BIBLIOGRAFÍA

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<130> EMEBW/P28005EPdiv1

<140> 08075560.6

<141> 03-09-1999

<150> EP 98116827.1 20

<151> 04-09-1998

<160> 69

<170> PatentIn ver. 2.1

<210> 1

<211> 8457 25

<212> ADN

<213> Salmonella

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<212> ADN

<213> Salmonella

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<212> ADN

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<212> PRT

<213> Salmonella

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<213> Salmonella

<220>

<221> CDS

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<220>

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<212> PRT

<213> Salmonella

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<212> PRT

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<303> Mol. Microbiol. 10

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<212> PRT

<213> EPEC

<300>

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<306> 1-4

<307> 1998

<400> 41

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<212> PRT 5

<213> Yersinia enterocolitica

<300>

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Schesser, K.

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<212> PRT

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

<400> 49

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

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<400> 52

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial 35

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

<400> 54

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

<400> 55 10

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

<400> 56

atagaattcg gagggagatg gagtggaag 29

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador 25

<400> 57

atagaattcg aagataaagc gattgccgac 30

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador 5

<400> 59

gaaggatcca tttgctctat ttcttgc 27

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<212> ADN 10

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

<400> 60

atgggatccg agattcgcca gaatacacaa 30 15

<210> 61

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

<400> 61

atgggatcca ctggcataaa cggtttccgg 30

<210> 62

<211> 27 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

<400> 62 30

attggatcct gacgtaaatc attatca 27

<210> 63

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 35

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

<400> 63

attggatcct taagcaataa gtgaatc 27

<210> 64

<211> 25 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

<400> 64 10

aaggaattca acaggcaact ggagg 25

<210> 65

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

<400> 65

ctgccctcgc gaaaattaag ataata 26

<210> 66 20

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador 25

<400>66

cttaattttc gcgaggg 17

<210> 67

<211> 18

<212> ADN 30

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

<400> 67

ggacgcccct ggttaata 18 35

<210> 68

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador 5

<400> 68

ggtctgcagg atttttcacg catcgcgtc 29

<210> 69

<211> 30

<212> ADN 10

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

<400> 69

ggtctgcaga accattgata tataagctgc 30 15

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1. Célula de Salmonella atenuada que comprende el locus génico SPI2, en la que por lo menos un gen del locus SPI2 está inactivado, en la que dicha inactivación produce una atenuación/reducción de la virulencia en comparación con el tipo natural de dicha célula y en la que por lo menos un gen adicional dispuesto fuera del locus SPI2 está inactivado, en la que la inactivación produce una atenuación/reducción adicional de la virulencia en comparación 5 con el tipo natural.

2. 2. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 1, en la que dicho gen adicional es un gen aro.

3. 3. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 2, en la que el gen aro es aroA.

4. 4. Célula de Salmonella atenuada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho por lo menos un gen en el locus SPI2 se selecciona de entre genes efectores (sse), genes del aparato de secreción (ssa), 10 genes de chaperonas (ssc) y genes reguladores (ssr).

5. 5. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 1, en la que la inactivación de dicho gen se efectúa mediante una deleción, o una inserción o una combinación de deleción e inserción.

6. 6. Célula de Salmonella atenuada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la Salmonella es S. typhimurium o S. typhi. 15

7. 7. Célula de Salmonella atenuada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la presentación de un antígeno a un huésped, en la que dicha célula comprende por lo menos una molécula de ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho antígeno, pudiendo dicha célula expresar dicha molécula de ácido nucleico.

8. 8. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 7, en la que la secuencia de ácido nucleico que 20 codifica dicho antígeno está en un casete de expresión génica.

9. 9. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 8, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica dicho antígeno está bajo el control de un promotor de Salmonella.

10. 10. Célula de Salmonella atenuada según las reivindicaciones 8 a 9, en la que dicho casete de expresión génica comprende además una secuencia auxiliar para la secreción del antígeno. 25

11. 11. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 7, en la que el antígeno es un antígeno bacteriano o viral o tumoral.

12. 12. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 11, en la que el antígeno es un antígeno del virus de la hepatitis (tal como hepatitis B o C), virus del papiloma humano, herpesvirus, Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Borrelia burgdorferi o Nanobacteria. 30

13. 13. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 7, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno está fusionada a una secuencia de ácido nucleico que codifica una parte de proteína inmunológicamente reactiva.

14. 14. Célula de Salmonella atenuada según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en la que la molécula de ácido nucleico heterólogo está insertada en el locus SPI2. 35

15. 15. Célula de Salmonella atenuada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su utilización en medicina.

16. 16. Composición farmacéutica que comprende una célula de Salmonella atenuada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y un diluyente, portador y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

17. 17. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 1, para su utilización en el tratamiento preventivo o 40 terapéutico de una enfermedad provocada por Salmonella.

18. 18. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 11 y 13, en la que el antígeno es un antígeno tumoral, para su utilización en el tratamiento preventivo o terapéutico de un tumor.

19. 19. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 11, en la que el antígeno es un antígeno viral, para su utilización en el tratamiento preventivo o terapéutico de una enfermedad provocada por dicho virus. 45

20. 20. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 11, en la que el antígeno es un antígeno bacteriano, para su utilización en el tratamiento preventivo o terapéutico de una enfermedad provocada por dicha bacteria.

21. 21. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 7, para su utilización en la presentación del antígeno a un huésped. 50