PL213215B1

PL213215B1 - Zastosowanie ludzkiego przeciwciala przeciw TNFα

Info

Publication number: PL213215B1
Application number: PL376705A
Authority: PL
Inventors: Zehra Kaymakcalan; Robert Kamen
Original assignee: Abbott Biotech Ltd
Priority date: 2002-10-24
Filing date: 2003-10-24
Publication date: 2013-01-31
Also published as: SI1578439T1; BR0315597A; TWI361696B; AU2010206042B2; EP1578439A4; US20040166111A1; NZ596945A; AU2003301522B2; ATE517632T1; AR045710A1; PL398520A1; CA2497909A1; AU2010206042A1; WO2004037205A2; ES2370351T3; PL376705A1; JP5594803B2; CN1732015A; NZ585493A; WO2004037205A8

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie ludzkiego przeciwciała przeciw TNFa.

Tło wynalazku

Czynnik martwicy nowotworów a (TNFa) jest cytokiną wytwarzaną przez liczne rodzaje komórek, w tym monocyty i makrofagi, którą początkowo zidentyfikowano w oparciu o jej zdolność do powodowania martwicy niektórych nowotworów u myszy (patrz np. Old L. (1985) Science 230: 630-632). Następnie wykazano, że czynnik nazwany kachektyną, związany z kacheksją to ta sama cząsteczka, co TNFa. Sugerowano, że TNFa pośredniczy we wstrząsie (patrz np. Beutler B. i Cerami A. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57: 505-518, Beutler B. i Cerami A. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7: 625-655). Ponadto sugerowano udział TNFa w patofizjologii różnych innych chorób i zaburzeń u ludzi, obejmujących posocznicę, zakażenia, choroby autoimmunologiczne, odrzucanie przeszczepu i chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi (patrz np. Moeller A. i in. (1990) Cytokine 2: 162-169, opis patentowy US nr 5231024, Moeller i in., publikacja patentu europejskiego nr 260610 B1, Moeller A. i in., Vasilli P. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10: 411-452, Tracey K. J. i Cerami A. (1994) Annu. Rev. Med. 45: 491-503).

Ze względu na szkodliwą rolę ludzkiego TNFa (hTNFa) w różnych zaburzeniach u ludzi, opracowano strategie lecznicze hamowania lub przeciwdziałania działaniu hTNFa. W szczególności poszukiwano przeciwciał, które wiązałyby i neutralizowały TNFa jako sposobu na hamowanie działania hTNFa. Niektórymi z najwcześniejszych takich przeciwciał były mysie przeciwciała monoklonalne (mAb) wydzielane przez hybrydomy wytwarzane z limfocytów myszy immunizowanych hTNFa (patrz Hahn T i in., (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82: 3814-3818, Liang C-M. i in. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 137: 847-854, Hirai M. i in. (1987) J. Immunol. Methods 96: 57-62, Fendly B. M. i in. (1987) Hybridoma 6: 359-370, Moeller A. i in. (1990) Cytokine 2: 162-169, opis patentowy US 5231024, Moeller i in., publikacja patentu europejskiego nr 186833 B1, Wallach, D., publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr 218868 A1, Old i in., publikacja patentu europejskiego nr 260610 B1, Moeller A. i in.). Chociaż te mysie przeciwciała przeciw hTNFa często wykazywały wysokie powinowactwo wobec hTNFa (np. Kd < 10^-9M) i były zdolne do neutralizacji działania hTNFa, ich zastosowanie w warunkach in vivo mogły ograniczać problemy związane z podawaniem ludziom mysich przeciwciał, takie jak krótki czas półtrwania w surowicy, niezdolność do wywołania niektórych funkcji efektorowych u człowieka i indukowanie niepożądanej odpowiedzi odpornościowej przeciw mysim przeciwciałom u człowieka (reakcja „ludzkich przeciwciał antymysich” (HAMA)).

Próbując pokonać problemy związane z zastosowaniem w pełni mysich przeciwciał u ludzi, mysie przeciwciała przeciw-hTNFa genetycznie zmodyfikowano tak, żeby były bardziej „podobne do ludzkich. Przykładowo wytworzono przeciwciała chimeryczne, w których regiony zmienne łańcuchów przeciwciała są pochodzenia mysiego a regiony stałe łańcuchów przeciwciała są pochodzenia ludzkiego (Knight D. M. i in. (1993) Mol. Immunol. 30: 1443-1453, publikacja PCT nr WO 92/16553, Daddona P. E. i in.). Dodatkowo wytworzono także humanizowane przeciwciała, w których hiperzmienne domeny zmiennych regionów przeciwciała są pochodzenia mysiego, ale pozostała część regionów zmiennych i regiony stałe przeciwciała są pochodzenia ludzkiego (publikacja PCT nr WO 92/11383, Adair J. R. i in.). Jednakże ponieważ te chimeryczne i humanizowane przeciwciała w dalszym ciągu zachowują pewne sekwencje mysie, mogą w dalszym ciągu wywoływać niepożądaną reakcję odpornościową, reakcję człowiek przeciw przeciwciałom chimerycznym (HACA), w szczególności gdy są podawane przez dłuższe okresy czasu, np. we wskazaniach przewlekłych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów (patrz np. Elliott M. J. i in., (1994) Lancet 344: 1125-1127, Elliot M. J. i in. (1994) Lancet 344: 1105-1110).

Korzystniejszym środkiem hamującym hTNFa od mysich mAb lub ich pochodnych (np. chimerycznych lub humanizowanych przeciwciał) może być całkowicie ludzkie przeciwciało przeciw-hTNFa, ponieważ taki środek nie powinien wywoływać reakcji HAMA nawet jeśli będzie stosowany przez dłuższy okres czasu. Wytworzono ludzkie autoprzeciwciała przeciwciała monoklonalne przeciw hTNFa przy użyciu technik hybrydoma (Boyle P. i in. (1993) Cell. Immunol. 152: 556-568, Boyle P. i in., (1993) Cell. Immunol. 152: 569-581, publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr 614984 A2, Boyle i in.). Jednakże podawano, że te autoprzeciwciała monoklonalne uzyskane z hybrydoma mają zbyt małe powinowactwo wobec hTNFa, aby można było je obliczyć znanymi metodami, nie wiązały rozpuszczalnego hTNFa i nie neutralizowany cytotoksyczności wywoływanej przez hTNFa (patrz Boyle i in., jak wyżej). Ponadto powodzenie techniki ludzkiego hybrydoma zależy od naturalnej obecności we krwi obwodowej limfocytów wytwarzających autoprzeciwciała swoiste wobec hTNFa. W niektórych

PL 213 215 B1 badaniach wykryto u ludzi w surowicy autoprzeciwciała przeciw hTNFa (Fomsgaard A. i in. (1989)

Scand. J. Immunol. 30: 219-223, Bendtzen K. i in. (1990) Prog. Leukocyte Biol. 10B: 447-452), podczas gdy w innych ich nie wykryto (Leusch H-G. i in. (1991) J. Immunol. Methods 139: 145-147).

Alternatywą dla naturalnie występujących ludzkich przeciwciał przeciw-hTNFa mogą być rekombinowane przeciwciała przeciw-hTNFa. Opisano rekombinowane ludzkie przeciwciała, które wiążą hTNFa ze względnie niskim powinowactwem (tj. Kd ~ 10^-7M) i szybkim oddysocjowaniem (tj. Ko_ff ~

10^-2 sek^-1) (Griffiths A. D. i in. (1993) EMBO J. 12: 725-734). Jednakże ze względu na ich względnie szybką kinetykę dysocjacji, przeciwciała te mogą nie nadawać się do zastosowania leczniczego. Dodatkowo opisano rekombinowane ludzkie przeciwciała przeciw-hTNFa, które nie neutralizują działania hTNFa, ale raczej nasilają wiązanie hTNFa z powierzchnią komórek i nasilają internalizację hTNFa (Lidbury A. i in. (1994) Biotechnol. Ther. 5: 27-45; Publikacja PCT nr WO 92/03145, Aston R. i in.).

Odpowiednio istnieje w dalszym ciągu zapotrzebowanie na ludzkie przeciwciała, takie jak rekombinowane ludzkie przeciwciała, które wiązałyby rozpuszczalny hTNFa z wysokim powinowactwem i wolną kinetyką dysocjacji i wywierały działanie lecznicze w zaburzeniach, w których działanie TTNFa jest szkodliwe.

Streszczenie wynalazku

Wynalazek dotyczy zastosowania ludzkiego przeciwciała przeciw TNFa, które jest albo przeciwciałem D2E7 albo Iudzkim przeciwciałem przeciw TNFa mającym właściwości równoważne D2E7, które oddysocjowuje od ludzkiego TNFa z Kd równą 1 x 10^-8 M lub mniejszą i stałą oddysocjowania

-3 -1

Koff równą 1 x 10^-3 sek^-1 lub mniejszą, przy czym obie stałe są określane za pomocą rezonansu plazmonów powierzchniowych, i neutralizuje cytotoksyczność ludzkiego TNFa w zwykłym teście L929 w warunkach in vitro, przy IC50 wynoszącym 1 x 10^-7 M lub mniej, do wytwarzania leku do leczenia lub łagodzenia zapalenia stawów, polegającego na podawaniu osobnikowi cierpiącemu na zapalenie stawów skutecznej dawki ludzkiego przeciwciała przeciw TNFa, z użyciem małej dawki wynoszącej 0,01 -0,11 mg/kg, takiej, że to zapalenie stawów jest leczone lub łagodzone.

Korzystne jest zastosowanie, w którym zapaleniem stawów jest reumatoidalne zapalenie stawów.

Korzystne jest zastosowanie, w którym objawy związane z zapaleniem stawów są łagodzone.

Korzystne jest zastosowanie, w którym łagodzone objawy są wybrane z grupy obejmującej nadżerki kości, nadżerki chrząstki, zapalenie i unaczynienie.

Korzystne jest zastosowanie, w którym zapalenie stawów jest leczone przez łagodzenie objawów wybranych z grupy obejmującej wykrzywienie stawu, obrzęk, zniekształcenie stawu, usztywnienie zgięciowe i poważne upośledzenie ruchów.

Korzystne jest zastosowanie, w którym ludzkie przeciwciało przeciw TNFa, powoduje sekwestrację TNFa w kompleksy u osobnika cierpiącego na to zapalenie stawów.

Korzystne jest zastosowanie, w którym stężenie TNFa w surowicy jest wyższe niż stężenie TNFa w surowicy u osobnika niecierpiącego na to zapalenie stawów.

Skrócony opis rysunków

Fig. 1 pokazuje wskaźniki zapalenia stawów każdej myszy w grupach terapeutycznych otrzymujących różne dawki D2E7. Wskaźniki zapalenia stawów były rejestrowane co tydzień, począwszy od 1 tygodnia życia. W każdej grupie na wykresie pokazano średnią ± błąd standardowy wskaźników zapalenia stawów. Pokazano następujące grupy terapeutyczne: Grupa kontrolna: 11 samic, 9 samców myszy (n = 20), grupa otrzymująca dawkę 10 mg/kg: 2 samice, 2 samce myszy (n = 4), grupa otrzymująca dawkę 5 mg/kg: 6 samic, 1 samiec myszy (n = 7), grupa otrzymująca dawkę 1 mg/kg: 5 samic, 3 samce myszy (n = 8), grupa otrzymująca dawkę 0,5 mg/kg: 3 samice, 2 samce myszy (n = 5), grupa otrzymująca dawkę 0,1 mg/kg: 3 samice, 3 samce myszy (n = 6), grupa otrzymująca dawkę 0,01 mg/kg: 4 samice, 2 samce myszy (n = 6).

Fig. 2 pokazuje wskaźniki zapalenia stawów każdej myszy w grupach terapeutycznych otrzymujących różne dawki Remicade. Wskaźniki zapalenia stawów były rejestrowane co tydzień, począwszy od 1 tygodnia życia. W każdej grupie na wykresie pokazano średnią ± błąd standardowy wskaźników zapalenia stawów. Pokazano następujące grupy terapeutyczne: Grupa kontrolna: 11 samic, 9 samców myszy (n = 20), grupa otrzymująca dawkę 10 mg/kg: 4 samice, 1 samiec myszy (n = 5), grupa otrzymująca dawkę 5 mg/kg: 3 samice, 4 samce myszy (n = 7), grupa otrzymująca dawkę 1 mg/kg: 6 samic, 2 samce myszy (n = 8), grupa otrzymująca dawkę 0,5 mg/kg: 4 samice, 2 samce myszy (n = 6), grupa otrzymująca dawkę 0,1 mg/kg: 1 samica, 4 samce myszy (n = 5), grupa otrzymująca dawkę 0,01 mg/kg: 2 samice, 3 samce myszy (n = 5).

PL 213 215 B1

Fig. 3 pokazuje wskaźniki zapalenia stawów każdej myszy w grupach terapeutycznych otrzymujących różne dawki Enbrel. Wskaźniki zapalenia stawów były rejestrowane co tydzień, począwszy od 1 tygodnia życia. W każdej grupie na wykresie pokazano średnią ± błąd standardowy wskaźników zapalenia stawów. Pokazano następujące grupy terapeutyczne: Grupa kontrolna: 11 samic, 9 samców myszy (n = 20), grupa otrzymująca dawkę 10 mg/kg: 3 samice, 2 samce myszy (n = 5), grupa otrzymująca dawkę 5 mg/kg: 3 samice, 3 samce myszy (n = 6), grupa otrzymująca dawkę 1 mg/kg: 5 samic, 1 samiec myszy (n = 6), grupa otrzymująca dawkę 0,5 mg/kg: 4 samice, 3 samce myszy (n = 7), grupa otrzymująca dawkę 0,1 mg/kg: 2 samice, 3 samce myszy (n = 5), grupa otrzymująca dawkę 0,01 mg/kg: 2 samice, 4 samce myszy (n = 6).

Fig. 4 pokazuje ostateczne wskaźniki zapalenia stawów u myszy huTNF-Tg197 w wieku 10 tygodni życia, leczonych D2E7, Remicade i Enbrel.

Fig. 5A-D pokazują ocenę histopatologiczną różnych tkanek pobranych ze stawów objętych zapaleniem stawu.

Fig. 6A, 6B i 6C pokazują stężenia huTNF we krwi u myszy huTNF-Tg197 leczonych D2E7, Remicade i Enbrel.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek umożliwia zatem prowadzenie sposobów podawania małych dawek w leczeniu zaburzeń, w których działanie TNFa, np. działanie ludzkiego TNFa, jest szkodliwe. Sposoby obejmują podawanie osobnikowi skutecznej ilości inhibitora TNFa w małej dawce, tak że zaburzenie jest leczone. Możliwe są także sposoby, w których inhibitor TNFa jest podawany w małej dawce w połączeniu z innym środkiem terapeutycznym i środków farmaceutycznych zawierających inhibitor TNFa i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Stosowane w opisie określenie „ludzki TNFa” (w opisie skrót huTNF, hTNFa lub po prostu hTNF) ma dotyczyć ludzkiej cytokiny, która występuje w postaci wydzielanej o masie cząsteczkowej 17 kD i postaci związanej z błoną komórkową o masie 26 kD, której biologicznie czynna postać składa się z trimeru niekowalencyjnie połączonych cząsteczek o masie 17 kD. Budowę hTNFa opisano bardziej szczegółowo np. w Pennica D. i in. (1984) Nature 312: 724-729; Davis J. M. i in. (1987) Biochemistry 26: 1322-1326 i Jones E. Y. i in. (1989) Nature 338: 225-228. Określenie ludzki TNFa, ma obejmować rekombinowany ludzki TNFa (rhTNFa), który można otrzymywać zwykłymi rekombinacyjnymi metodami ekspresji lub nabyć w handlu (R & D Systems, nr katalogowy 210-TA, Minneapolis, MN).

Określenie „inhibitor TNFa” obejmuje środki, które hamują TNFa. Przykłady inhibitorów TNFa obejmują etanercept (ENBREL, Immunex), infliksimab (REMICADE, Johnson and Johnson), ludzkie przeciwciało monoklonalne przeciw-TNF (D2E7, Knoll Pharmaceuticals), CDP 571 (Celltech) i CDP 870 (Celltech) i inne związki, które hamują działanie TNFa, tak że gdy zostaną podane osobnikowi chorującemu na zaburzenie, w którym działanie TNFa jest szkodliwe lub zagrożonych jego wystąpieniem, zaburzenie jest poddawane leczeniu. Określenie obejmuje także każde z ludzkich przeciwciał przeciw-TNFa i części przeciwciał opisanych w opisie oraz tych ujawnionych w opisach patentowych US nr 6090382 i 6258562 B1 i w zgłoszeniach patentowych US numery seryjne 09/540018 i 09/801185.

Stosowane w opisie określenie „przeciwciało” ma dotyczyć cząsteczki immunoglobuliny składającej się z czterech łańcuchów polipeptydowych: dwóch łańcuchów ciężkich (H) i dwóch łańcuchów lekkich (L) wzajemnie połączonych wiązaniami disulfidowymi. Każdy łańcuch ciężki składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (w opisie oznaczanego skrótem HCVR lub VH) oraz regionu stałego łańcucha ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego składa się z trzech domen: CH1, CH2 i CH3. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (w opisie oznaczanego skrótem LCVR lub VL) oraz regionu stałego łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego składa się z jednej domeny, CL. Regiony VH i VL można dodatkowo podzielić na regiony hiperzmienne, zwane regionami determinującymi komplementarność (CDR), przeplatane regionami, które są bardziej zachowane, zwane regionami zrębowymi (FR). Każdy VH i VL składa się z trzech CDR i czterech FR, ułożonych od końca aminowego do końca karboksylowego w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Przeciwciała są opisane bardziej szczegółowo w opisach patentowych US nr 6090382 i 6258562 B1 i w zgłoszeniach patentowych US numery seryjne 09/540018 i 09/801185.

Stosowane w opisie określenie „część wiążąca antygen” przeciwciała (lub po prostu „część przeciwciała”) dotyczy jednego lub większej liczby fragmentów przeciwciała, które zachowują zdolność do swoistego wiązania antygenu (np. hTNFa). Wykazano, że czynność wiązania antygenu przeciwciała

PL 213 215 B1 można zrealizować przy użyciu fragmentów przeciwciała o pełnej długości. Przykłady wiążących fragmentów objęte określeniem „część wiążąca antygen” przeciwciała obejmują (i) fragment Fab, jednowartościowy fragment składający się z domen VL, VH, CL i CH1, (ii) fragment F(ab')2, dwuwartościowy fragment składający się z dwóch fragmentów Fab połączonych mostkiem disulfidowym w regionie zawiasowym, (iii) fragment Fd składający się z domen VH i CH1, (iv) fragment Fv składający się z domen VL i VH pojedynczego ramienia przeciwciała, (v) fragment dAb (Ward i in., (1989) Nature 341: 544-546), który składa się z domeny VH i (vi) izolowany region determinujący komplementarność (CDR). Ponadto chociaż dwie domeny fragmentu Fv, VL i VH, są kodowane przez osobne geny, mogą zostać połączone, przy użyciu technik rekombinacji, syntetycznym łącznikiem, który umożliwia ich wytwarzanie jako pojedynczego łańcucha białkowego, w którym regiony VL i VH są połączone, tworząc cząsteczki jednowartościowe (zwane jednołańcuchowym Fv (scFv), patrz np. (Bird i in. (1988) Science 242: 423-426 i Huston i in. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Takie przeciwciała składające się z pojedynczego łańcucha mają także być objęte określeniem „część wiążąca antygen” przeciwciała. Obejmuje ono także inne postacie przeciwciał składających się z pojedynczego łańcucha, takie jak diaciała. Diaciała są dwuwartościowymi, dwuswoistymi przeciwciałami, w których domeny VH i VL ulegają ekspresji w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym, ale przy użyciu łącznika, który jest za krótki, by doszło do tworzenia par między dwoma domenami na tym samym łańcuchu, w ten sposób zmuszając domeny do tworzenia par z komplementarnymi domenami innego łańcucha i tworząc dwa miejsca wiążące antygeny (patrz np. Holliger P. i in. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, Poljak R. J. i in. (1994) Structure 2: 1121-1123). Części przeciwciała są opisane bardziej szczegółowo w opisach patentowych US nr 6090382 i 6258562B1 i w zgłoszeniach patentowych US numery seryjne 09/540018 i 09/801185.

Zgodnie z wynalazkiem przeciwciała D2E7 i inne ludzkie przeciwciała i części przeciwciał mające właściwości równoważne D2E7, takie jak wiązanie z wysokim powinowactwe m hTNFa z niską kinetyką dysocjacji i wysoką zdolnością neutralizacji, są stosowane w sposobach, w których stosuje się małe dawki, leczenia zaburzeń związanych ze szkodliwym działaniem TNF. Zgodnie z wynalazkiem ludzkie przeciwciało, które oddysocjowuje od ludzkiego TNFa z K_d równą co najwyżej 1 x 10^-8 M i stałą

-3 - 1 oddysocjowania Koff równą co najwyżej 1 x 10^-3 sek^{- 1}, przy czym obie stałe są określane za pomocą rezonansu plazmonów powierzchniowych, i które neutralizuje cytotoksyczność ludzkiego TNFa w zwykłym teście L929 w warunkach in vitro, przy IC50 wynoszącym co najwyżej 1 x 10^-7 M, stosuje się w sposobach, w których stosuje się małe dawki, leczenia zaburzeń związanych ze szkodliwym działaniem TNF. Przykładowo izolowane ludzkie przeciwciało, które oddysocjowuje od ludzkiego

-4 -1

TNFa przy stałej oddysocjowania Koff równej co najwyżej 1 x 10^-4 sek^-1, stosuje w sposobach, w których stosuje się małe dawki, leczenia zaburzeń związanych ze szkodliwym działaniem TNF. Korzystniej izolowane ludzkie przeciwciało neutralizuje cytotoksyczność ludzkiego TNFa w zwykłym teście L929 w warunkach in vitro, przy IC50 wynoszącym co najwyżej 1 x 10^-8 M, jeszcze korzystniej przy IC50 wynoszącym co najwyżej 1 x 10^-9 M, a jeszcze korzystniej przy IC50 wynoszącym co najwyżej 5 x 10^-10 M.

Stosowane w opisie określenie „mała dawka lub „małe dawki” dotyczy ilości inhibitora TNFa, który jest podawany osobnikowi, przy czym ilość ta jest zasadniczo niższa niż zwykle stosowana. „Leczenie z użyciem małej dawki” obejmuje schemat leczenia, który opiera się na podawaniu małej dawki inhibitora TNFa. W jednej postaci wynalazku mała dawka D2E7 jest podawana osobnikowi w leczeniu zaburzeń związanych z TNFa, które są szkodliwe. W szczególności stosowana jest mała dawka inhibitora TNFa, obejmującego np. D2E7, w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów i objawów związanych z tą chorobą. Przykładowo objawy, które można leczyć z użyciem małej dawki D2E7, obejmują nadżerki kości, nadżerki chrząstki, zapalenie i unaczynienie. Małe dawki inhibitora TNFa są korzystne z wielu powodów, obejmujących zmniejszenie częstości i ciężkości działań ubocznych, które mogą być związane z przepisaną normalną dawką inhibitora TNFa.

I. Zastosowanie inhibitorów TNFa według wynalazku

Sugerowano udział TNFa w patofizjologii szeregu zaburzeń (patrz np. Moeller A. i in. (1990) Cytokine 2: 162-169, opis patentowy US nr 5231024, Moeller i in., publikacja patentu europejskiego nr 260610 B1, Moeller A.). Wynalazek dostarcza sposób hamowania działania TNFa u osobnika chorującego na takie zaburzenie, przy czym sposób polega na podawaniu osobnikowi małej dawki przeciwciała, części przeciwciała lub innego inhibitora TNFa według wynalazku, tak że hamowane jest działanie TNFa u tego osobnika. Korzystnie TNFa stanowi ludzki TNFa, a osobnikiem jest człowiek. Alternatywnie osobnik może być ssakiem, u którego zachodzi ekspresja TNFa, z którym przeciwciało według wynalazku reaguje krzyżowo. Przeciwciało można podawać osobnikowi będącemu człowiekiem

PL 213 215 B1 w celach leczniczych w małych dawkach (dodatkowo omówiono poniżej ). Ponadto małą dawkę przeciwciała według wynalazku można podawać ssakowi nie będącemu człowiekiem, u którego zachodzi ekspresja TNFa, z którym przeciwciało reaguje krzyżowo (np. naczelnym, świni lub myszy) w celach weterynaryjnych lub jako zwierzęcy model choroby człowieka. Odnośnie tej ostatniej, takie zwierzęce modele mogą być użyteczne do oceny skuteczności leczniczej przeciwciał według wynalazku (np. badania dawek i przebiegu podawania w czasie).

Stosowane w opisie określenie „zaburzenie, w którym działanie TNFa jest szkodliwe” ma obejmować choroby i inne zaburzenia, w których, jak wykazano, obecność TNFa u osobnika chorującego na zaburzenie jest odpowiedzialna lub podejrzewa się, że jest odpowiedzialna za patofizjologię zaburzenia lub jest czynnikiem, który przyczynia się do zaostrzenia zaburzenia. Dla celów wynalazku leczenie zaburzenia, w którym działanie TNFa jest szkodliwe, obejmuje, lecz nie wyłącznie, łagodzenie objawów związanych z tym zaburzeniem. Odpowiednio zaburzenie, w którym działanie TNFa jest szkodliwe jest zaburzeniem, w którym oczekuje się, że hamowanie działania TNFa złagodzi objawy i/lub postęp choroby. Na takie choroby może wskazywać np. wzrost stężenia TNFa w płynie biologicznym u osobnika chorującego na dane zaburzenie (np. wzrost stężenia TNFa w surowicy, osoczu, płynie maziowym, itp. danego osobnika), które można wykryć np. przy użyciu przeciwciała przeciw-TNFa, jak opisano wyżej. Istnieją liczne przykłady zaburzeń, a których działanie TNFa jest szkodliwe. Zastosowanie małej dawki przeciwciał, części przeciwciał i innych inhibitorów TNFa według wynalazku w leczeniu konkretnych zaburzeń omówiono dodatkowo poniżej. W niektórych postaciach mała dawka przeciwciała, części przeciwciała lub inhibitora TNFa według wynalazku jest podawana osobnikowi w połączeniu z innym środkiem terapeutycznym, jak opisano poniżej.

Reumatoidalne zapalenie stawów

Sugerowano, że TNFa aktywuje zapalenie tkanek i powoduje niszczenie stawów w reumatoidalnym zapaleniu stawów (patrz np. Moeller A. i in. (1990) Cytokine 2: 162-169, opis patentowy US nr 5231024, Moeller i in., publikacja patentu europejskiego nr 260610 B1, Moeller A., Tracey i Cerami, patrz wyżej, Arend W. P. i Dayer J-M. (1995) Arth. Rheum. 38: 151-160, Fava R. A. i in. (1993) Clin. Exp. Immunol. 94: 261-266). Chimeryczne i humanizowane mysie przeciwciała przeciw-hTNFa badano w badaniach klinicznych w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów (patrz np. Elliott M. J. i in. (1994) Lancet 344: 1125-1127, Elliot M. J. i in. (1994) Lancet 344: 1105-1110, Rankin E. C. i in. (1995) Br. J. Rheumatol. 34: 334-342).

Mała dawka przeciwciał przeciw-TNFa może być zgodnie z wynalazkiem zastosowana do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów. Małe dawki przeciwciał przeciw-TNFa mogą być zastosowane do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów przez złagodzenie objawów związanych z tym zaburzeniem. Przykłady objawów podmiotowych lub objawów przedmiotowych często związanych z reumatoidalnym zapaleniem stawów obejmują, lecz nie wyłącznie, nadżerki kości w stawach, nadżerki chrząstki w stawach, zapalenie w stawach, unaczynienie w stawach i ich połączenia. Inne przykłady objawów związanych z reumatoidalnym zapaleniem stawów obejmują przyrost masy ciała, wykrzywienie stawu, obrzęk stawów, zniekształcenie stawu, usztywnienie zgięciowe, poważne upośledzenie ruchów i ich połączenia.

Ludzkie przeciwciała zgodnie z wynalazkiem mogą być stosowane do leczenia chorób obejmujących reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów i dnawe zapalenie stawów. Typowo przeciwciało, podaje się układowo, chociaż w niektórych zaburzeniach korzystne może być miejscowe podawanie przeciwciała w miejscu zapalenia (np. miejscowe podawanie dostawowe w reumatoidalnym zapaleniu stawów osobno lub w połączeniu z pochodną cykloheksanylidenu, jak opisano w publikacji PCT nr WO 93/19751). Przeciwciało, część przeciwciała lub inny inhibitor TNFa według wynalazku może także być podawany z jednym lub większą liczbą dodatkowych środków terapeutycznych użytecznych w leczeniu chorób autoimmunologicznych, jak omówiono dodatkowo w części II.

Przeciwciała mogą także być stosowane do leczenia młodzieńczego zapalenia stawów, łuszczycowego zapalenia stawów i zapalenia kości i stawów.

II. Środki farmaceutyczne i podawanie leku

Ujawnione tu przeciwciała mogą być umieszczane w kompozycjach farmaceutycznych odpowiednich do podawania osobnikowi w małej dawce. Typowo środek farmaceutyczny zawiera przeciwciało i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Stosowane w opisie określenie „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” obejmuje wszystkie rozpuszczalniki, ośrodki dyspersyjne, powłoczki, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, środki izotoniczne i opóźniające wchłanianie itp., które są fizjologicznie zgodne. Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych nośników obejmują jeden lub większą

PL 213 215 B1 liczbę z grupy obejmującej wodę, sól fizjologiczną, sól fizjologiczną buforowaną fosforanami, dekstrozę, glicerynę, etanol itp. oraz ich połączenia. W wielu przypadkach korzystne będzie dodanie do kompozycji środków izotonicznych, np. cukrów, alkoholi wielowodorotlenowych, takich jak mannit, sorbitol lub chlorek sodu. Ponadto farmaceutycznie dopuszczalne nośniki mogą obejmować niewielkie ilości substancji pomocniczych, takich jak środki zwilżające lub emulgujące, konserwujące lub bufory, które wydłużają okres trwałości lub poprawiają skuteczność przeciwciała, części przeciwciała lub innego inhibitora TNFa.

Środki mogą występować w wielu postaciach odpowiednich do podawania w małej dawce. Obejmują one np. ciekłe, półstałe i stałe postaci dawkowania, takie jak ciekłe roztwory (np. roztwory do podawania we wstrzykiwaniach i we wlewach), dyspersje lub zawiesiny, tabletki, pigułki, proszki, liposomy i czopki. Korzystna postać zależy od zamierzonego sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego. Typowe korzystne kompozycje występują w postaci roztworów do podawania we wstrzykiwaniach lub we wlewach, takich jak środki podobne do kompozycji stosowanych do biernej immunizacji ludzi innymi przeciwciałami lub innymi inhibitorami TNFa. Korzystnym sposobem podawania jest droga pozajelitowa (np. dożylnie, podskórnie, dootrzewnowo, domięśniowo). W korzystnej postaci mała dawka przeciwciała jest podawana w postaci wlewu lub wstrzyknięcia dożylnego. W innej korzystnej postaci mała dawka przeciwciała jest podawana w postaci domięśniowego lub podskórnego wstrzyknięcia.

Kompozycje terapeutyczne typowo muszą być jałowe i stabilne w warunkach produkcji i przechowywania. Kompozycja może być formułowana jako roztwór, mikroemulsja, dyspersja, Iiposom lub inna uporządkowana struktura odpowiednia dla wysokiego stężenia leku. Jałowe roztwory do wstrzykiwań mogą być wytwarzane przez umieszczenie małej dawki czynnego związku (tj. przeciwciała) w wymaganej ilości w odpowiednim rozpuszczalniku z jednym lub połączeniem składników wymienionych powyżej, w zależności od wymagań, a następnie sterylizacji przez filtrację. Ogólnie dyspersje są wytwarzane przez umieszczenie czynnego związku w jałowym podłożu, które zawiera podstawowy ośrodek dyspersyjny i wymagane inne składniki z tych wymienionych powyżej. W przypadku jałowych proszków do wytwarzania jałowych roztworów do wstrzykiwań, korzystnymi sposobami wytwarzania są suszenie próżniowe i liofilizacja, które dają proszek czynnego składnika plus każdy dodatkowy pożądany składnik z wcześniej sterylizowanego przez filtrację jego roztworu. Właściwą płynność roztworu można zachować np. przez zastosowanie powłoczki, takiej jak lecytynowa, przez zachowanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i przez zastosowanie substancji powierzchniowo czynnych. Przedłużone wchłanianie kompozycji podawanych we wstrzykiwaniu można uzyskać przez umieszczenie w kompozycji środka, który opóźnia wchłanianie, np. soli monostearynianowych i żelatyny.

Ujawniono tu także pakowane środki farmaceutyczne, które zawierają małą dawkę inhibitora TNFa i instrukcję stosowania inhibitora w leczeniu konkretnego zaburzenia, w którym szkodliwe jest działanie TNFa, jak opisano powyżej.

Środki farmaceutyczne według wynalazku mogą obejmować „terapeutycznie skuteczną ilość” lub „profilaktycznie skuteczną ilość” przeciwciała. „Terapeutycznie skuteczną ilością” jest każda ilość, która, jak określono, jest wymagana do eliminacji tego zaburzenia lub zmniejszenia i/lub łagodzenia objawów tego zaburzenia. W korzystnej postaci wynalazku „terapeutycznie skuteczna ilość” dotyczy ilości, która jest skuteczna, podawana w małych dawkach i przez okres czasu konieczny do uzyskania pożądanego wyniku terapeutycznego. Terapeutycznie skuteczna ilość przeciwciała może być różna w zależności od czynników takich, jak stan chorobowy, wiek, płeć i masa ciała osobnika oraz zdolność przeciwciała wywoływania pożądanej odpowiedzi u osobnika. Terapeutycznie skuteczną ilością jest także taka, w której terapeutycznie korzystne efekty przewyższają wszystkie toksyczne lub szkodliwe efekty przeciwciała.

Schematy dawkowania mogą być modyfikowane w celu dostarczenia optymalnej pożądanej odpowiedzi (np. odpowiedzi terapeutycznej lub profilaktycznej). Przykładowo może być podawane jako bolus, może być podawanych kilka podzielonych małych dawek w pewnym okresie czasu lub mała dawka może być proporcjonalnie zmniejszona lub zwiększona, jak wskazują wymagania danej sytuacji terapeutycznej. Szczególnie korzystne jest formułowanie kompozycji pozajelitowych w postaci małej dawki jednostkowej w celu łatwego podawania i dla jednorodności dawki. Stosowana w opisie postać dawki jednostkowej dotyczy fizycznie odrębnych jednostek odpowiednich do podawania leczonemu osobnikowi będącemu ssakiem jako pojedynczych dawek; każda jednostka zawiera określoną z góry ilość czynnego związku, która, jak obliczono, wywołuje pożądany efekt terapeutyczny, w połączeniu

PL 213 215 B1 z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Specyfikacja postaci dawki jednostkowej według wynalazku jest narzucana i określana przez (a) jedyną w swoim rodzaju charakterystykę czynnego związku oraz konkretny efekt terapeutyczny lub profilaktyczne, jaki ma być osiągnięty, i (b) ograniczenia typowe dla wytwarzania mieszanek z takim związkiem czynnym do leczenia wrażliwości u osobników.

Przykładowy, nieograniczający zakres dla terapeutycznie lub profilaktycznie skutecznej ilości przeciwciała wynosi 0,01 - 0,11 mg/kg. Należy zauważyć, że wartości dawek mogą zmieniać się wraz z typem i ciężkością łagodzonego stanu. Należy dodatkowo zrozumieć, że dla każdego konkretnego osobnika swoisty schemat dawkowania należy modyfikować w czasie leczenia zgodnie z konkretnym zapotrzebowaniem i osądem zawodowym osoby podającej lub nadzorującej podawanie kompozycji, a zakresy dawek podane w opisie są jedynie zakresami przykładowymi i nie mają ograniczać zakresu praktyki zastrzeżonych kompozycji.

Zgodnie z wynalazkiem terapeutycznie skuteczną ilością przeciwciała przeciw-TNFa jest mała dawka. Mała dawka przeciwciała, podawana osobnikowi chorującemu na zaburzenie, w którym TNFa jest szkodliwy, wynosi od około 0,01 do 0,11 mg/kg, około 0,06 - 0,11 mg/kg. W korzystnej postaci przeciwciałem jest D2E7. Zakresy dawek obejmowane przez wspomniane wyżej dawki mają także stanowić część wynalazku. Przykładowo zakresy wartości wykorzystujące połączenie którychkolwiek z podanych wyżej wartości jako górną i/lub dolną granicę mają mieścić się w zakresie wynalazku.

Mała dawka przeciwciał może być podawana różnymi znanymi sposobami, chociaż dla wielu zastosowań terapeutycznych korzystną drogą/sposobem podawania jest wlew lub wstrzyknięcie dożylne. Jak dostrzeże fachowiec, droga/sposób podawania mogą być różne w zależności od pożądanych wyników. W niektórych postaciach czynny związek może być wytwarzany z nośnikiem, który nie będzie pozwalał na gwałtowne uwalnianie związku, tak jak preparat o kontrolowanym uwalnianiu, obejmujący wszczepy, plastry transdermalne i mikrokapsułkowane układy dostarczania. Mogą być stosowane ulegające biologicznej degradacji, biologicznie zgodne polimery, takie jak octan etylenowinylu, polibezwodniki, polikwas glikolowy, kolagen, poliortoestry i polikwas mlekowy. Wiele sposobów wytwarzania takich preparatów jest opatentowanych lub ogólnie znanych fachowcom. Patrz np. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, red., Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork, 1978.

W niektórych postaciach mała dawka przeciwciała może być podawana doustnie, np. z obojętnym rozcieńczalnikiem lub przyswajalnym jadalnym nośnikiem. Związek (i inne składniki, jeśli jest to pożądane) mogą także być zamknięte w kapsułce żelatynowej z twardą lub miękką powłoczką, prasowane w tabletki lub domieszane bezpośrednio do pożywienia osobnika. Dla celów doustnego podawania terapeutycznego związki mogą być umieszczane z zarobkami i stosowane w postaci tabletek do połykania, tabletek dopoliczkowych, pastylek, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, opłatków itp. Dla podania małej dawki związku inaczej niż pozajelitowo, konieczne może być powlekanie związku lub łączne podawanie związku z substancją, która zapobiega jego inaktywacji.

W kompozycjach mogą być także umieszczane pomocnicze czynne związki. W niektórych postaciach mała dawka przeciw ciała lub części przeciwciała jest formułowana łącznie i/lub podawana łącznie z jednym lub większą liczbą dodatkowych środków terapeutycznych, które są użyteczne do leczenia zaburzeń, w których działanie TNFa jest szkodliwe. Przykładowo mała dawka przeciwciała przeciw-hTNFa może być formułowana łącznie i/lub podawana łącznie z jednym lub większą liczbą dodatkowych przeciwciał, które wiążą się z innymi celami (np. przeciwciałami, które wiążą inne cytokiny lub które wiążą cząsteczki powierzchniowe komórek), jedną lub większą liczbą cytokin, rozpuszczalnym receptorem TNFa (patrz np. publikacja PCT nr WO 94/06476), i/lub jednym lub większą liczbą środków chemicznych, które hamują produkcję lub działanie hTNFa (takimi jak pochodną cykloheksanylidenu, jak opisano w publikacji PCT nr WO 93/19751). Ponadto mała dawka jednego lub większej liczby przeciwciał może być stosowana w połączeniu z jednym lub większą liczbą z powyższych środków terapeutycznych. Takie terapie skojarzone mogą korzystnie wykorzystywać nawet mniejsze dawki podawanych środków terapeutycznych, w ten sposób unikając możliwych działań toksycznych lub powikłań związanych z różnymi środkami stosowanymi w monoterapii.

III. Inne środki terapeutyczne

Wyrażenie „w połączeniu ze” środkiem terapeutycznym obejmuje łączne podawanie małej dawki przeciwciała, części przeciwciała lub innego inhibitora TNFa według wynalazku ze środkiem terapeutycznym, najpierw podanie małej dawki przeciwciała, a następnie podanie środka terapeutycznego

PL 213 215 B1 i najpierw podanie środka terapeutycznego, a następnie podawanie małej dawki przeciwciała, części przeciwciała. Konkretny związek(-ki) terapeutyczny(-e) są ogólnie wybierane w oparciu o konkretne leczone zaburzenie, jak omówiono poniżej.

Nieograniczające przykłady środków terapeutycznych w reumatoidalnym zapaleniu stawów, z którymi może być łączona mała dawka przeciwciała, obejmują następujące: niesteroidowy(-e) lek(-i) przeciwzapalny(-e) (NLPZ), lek(-i) przeciwzapalny(-e) hamujący(-e) cytokiny (LPHC), CDP-571/BAY-10-3356 (humanizowane przeciwciało przeciw-TNFa, Celltech/Bayer), cA2 (chimeryczne przeciwciało przeciw-TNFa, Centocor), 75 kd TNFR-IgG (75 kD białko fuzyjne TNF receptor-IgG, Immunex, patrz np. Arthritis & Rheumatism (1994) Tom 37, S295, J. Invest. Med. (1996) Tom 44, 235A), 55 kd TNFR-IgG (55 kD białko fuzyjne IgG receptora TNF, Hoffmann-La Roche), IDEC-CE9.1/SB 210396 (przeciwciało przeciw CD-4, prymatyzowane, nie prowadzące do zmniejszenia CD-4, IDEC/SmithKline, patrz np. Arthritis & Rheumatism (1995) Tom 38, S185), DAB 486-IL-2 i/lub DAB 389-IL-2 (białka fuzyjne IL-2, Seragen, patrz np. Arthritis & Rheumatism (1993) Tom 36, 1223), Anti-Tac (humanizowane przeciwciało przeciw-IL-2Ra, Protein Design Labs/Roche), IL-4 (cytokina przeciwzapalna, DNAX/Schering), IL-10 (SCH 52000; rekombinowana IL-10, cytokina przeciwzapalna, DNAX/Schering), IL-4, IL-10 i/lub agoniści IL-4 (np. przeciwciała o działaniu agonistycznym), IL-1RA (antagonista receptora IL-1, Synergen/Amgen), TNF-bp/s-TNFR (rozpuszczalne białko wiążące TNF, patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (suplement), S284, Amer. J. Physiol. -Heart and Circulatory Physiology (1995) Tom 268, str. 37-42), R973401 (inhibitor fosfodiesterazy Typu IV, patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom. 39, Nr 9 (suplement), S282), MK-966 (inhibitor COX-2, patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (suplement), S81), Iloprost (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (suplement), S82); metotreksat, talidomid (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (suplement), S282) i leki talidomidopodobne (np. Celgen), leflunomid (lek przeciwzapalny i inhibitor cytokin, patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (suplement), S131, Inflammation Research (1996) Tom 45, str. 103-107), kwas traneksamowy (inhibitor aktywacji plazminogenu, patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (suplement), S284), T-614 (inhibitor cytokin, patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (suplement), S282), prostaglandyna E1 (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (suplement), S282), Tenidap (niesteroidowy lek przeciwzapalny, patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (suplement), S280), Naproksen (niesteroidowy lek przeciwzapalny, patrz np. Neuro Report 91996) Tom 7, str. 1209-1213), Meloksykam (niesteroidowy lek przeciwzapalny), Ibuprofen (niesteroidowy lek przeciwzapalny), Piroksykam (niesteroidowy lek przeciwzapalny), Diklofenak (niesteroidowy lek przeciwzapalny), Indometacynę (niesteroidowy lek przeciwzapalny), Sulfasalazynę (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (suplement), S281), Azatiopryna (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (suplement), S281), inhibitor ICE (inhibitor enzymu przekształcającego interleukinę-1 β), inhibitor zap-70 i/lub lck (inhibitor kinazy tyrozynowej zap-70 lub lck), inhibitor VEGF i/lub VEGF-R (inhibitory naczyniowego śródbłonkowego czynnika wzrostu lub receptora naczyniowego śródbłonkowego czynnika wzrostu; inhibitory angiogenezy), kortykosteroidowe leki przeciwzapalne (np. SB203580), inhibitory TNF-konwertazy, przeciwciała przeciw-IL-12, interleukina-11 (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (suplement), S296), interleukinę-13 (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (supplement), S308), inhibitory interleukiny-17 (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (suplement), S120), złoto, penicylaminę, chlorochinę, hydroksychlorochinę, chlorambucyl, cyklofosfamid, cyklosporynę, całkowite napromienienie narządów limfoidalnych, globulinę antytymocytarną, przeciwciała przeciw-CD4, CD5-toksyny, doustnie podawane peptydy i kolagen, lobenzaryt disodowy, środki regulujące cytokiny (CRA) HP228 i HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.), tiofosforanowe oligodeoksynukleotydy antysensowne ICAM-1 (ISIS 2302, Isis Pharmaceuticals, Inc.), rozpuszczalny receptor dopełniacza 1 (TP10, T Cell Sciences, Inc.), prednizon, orgoteinę, polisiarczan glikozaminoglikanu, minocyklinę, przeciwciała przeciw-IL2R, lipidy ze zwierząt morskich i roślin (kwasy tłuszczowe ryb i nasion roślin, patrz np. DeLuca i in. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21: 759-777), auranofinę, fenylbutazon, kwas meklofenamowy, kwas flufenamowy, dożylną immunoglobulinę, zileuton, kwas mykofenolowy (RS-61443), takrolimus (FK-506); sirolimus (rapamycyna), amiprylozę (terafektyna), kladrybinę (2-chlorodeoksyadenozyna) I azarybinę.

Wynalazek dodatkowo ilustrują poniższe przykłady, których nie należy postrzegać jako ograniczenie.

PL 213 215 B1

P r z y k ł a d 1:

Badanie skuteczności D2E7 podawanego w małych dawkach

Przeprowadzono badania dla określenie skuteczności D2E7, infliksimabu i etanerceptu w małych dawkach w zapobieganiu zapaleniu wielostawowemu przy użyciu transgenicznego (Tg197) mysiego modelu reumatoidalnego zapalenia stawów (rzs). Infliksimab jest chimerycznym przeciwciałem ludzkim-mysim a etanercept jest p75 konstruktem receptora TNF. D2E7 jest w pełni ludzkim przeciwciałem uzyskanym w biblioteki genowej ludzkich immunoglobulin. Myszy transgeniczne Tg197 posiadają ludzki gen TNFa i spontanicznie rozwijają chorobę podobną do ludzkiego reumatoidalnego zapalenia stawów (Keffer J. i in., 1991, EMBO J. 10: 4025). Objawy przedmiotowe zapalenia stawów, także reumatoidalnego zapalenia stawów, obejmują wolniejszy przyrost masy ciała, wykrzywienie i obrzęk stawów, zniekształcenie i usztywnienie stawu i upośledzenie ruchów. Cechy histopatologiczne obejmują rozrost błony maziowej, naciek leukocytów, tworzenie łuszczki, niszczenie chrząstki stawowej i kości. Podawanie środków przeciw-TNF zapobiega rozwojowi zapalenia wielostawowego w sposób zależny od dawki.

A. Porównanie właściwości wiązania D2E7, Remicade i Enbrel

Infliksimab (Remicade) i Etanercept (Enbrel) to dwa leki skierowane przeciw TNF zatwierdzone do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów. Remicade jest chimerycznym ludzko-mysim przeciwciałem IgG1, a Enbrel jest białkiem fuzyjnym sporządzonym z zewnątrzkomórkowej domeny p75 receptora TNF i stałego regionu cząsteczki IgG1. D2E7 jest w pełni ludzkim przeciwciałem klasy IgG1 kappa, wybranym z bibliotek genowych ludzkich immunoglobulin. Wszystkie trzy środki przeciw-TNF wiążą się z ludzkim TNF ze względnie podobną siłą. Wewnętrzne powinowactwo D2E7, Remicade i Enbrel dla TNF wynoszą odpowiednio 8,6 x 10^-11, 9,5 x 10^-11 i 15,7 x 10^-11 M (wartości Kd). Kinetyki wiązania są podobne dla przeciwciał D2E7 i Remicade. Z drugiej strony Enbrel szybko wiąże się i dysocjuje od TNF. Dlatego czas półtrwania kompleksu Enbrel:TNF jest znacznie krótszy niż 184 i 255 minuty czasy półtrwania odpowiednio kompleksów Remicade i D2E7:TNF.

Dla uzyskania parametrów kinetyki wiązania między ludzkim TNF a środkami przeciw-TNF zastosowano instrument BIAcore 300. Z chipami bioczujników były kowalencyjnie związane kozie przeciwciała skierowane przeciw fragmentom Fc ludzkich przeciwciał. Następnie środki przeciw-TNF (D2E7, Remicade i Enbrel) wychwytywano na chipach i dodawano różne stężenia huTNF.

Analizowano dane dotyczące wiązania, uzyskując z nich parametry wiązania, które opisano w tabeli 1.

T a b e l a 1.

Wiązanie D2E7, Remicade lub Enbrel z ludzkim TNF

Środek	Szybkość wiązania (M'¹s'¹)	Szybkość dysocjacji (s^-1)	Kd (M)
D2E7	5,37 x 10⁵	4,53 x 10'⁵	8,56 x 10'¹¹
Remicade	6,71 x 10⁵	6,29 x 10'⁵	9,45 x 10'¹¹
Enbrel	4,47 x 10⁶	7,02 x 10'⁴	1,57 x 10'¹⁰

B. Zapobieganie objawom zapalenia stawów

Jako model do badania wpływu schematu wykorzystującego małą dawkę D2E7, Remicade i Enbrel na zmniejszenie objawów często związanych z reumatoidalnym zapaleniem stawów stosowano myszy Tg197. Myszy transgeniczne, u których zachodzi ekspresja ludzkiego TNF, zidentyfikowano i zweryfikowano przy użyciu PCR. Od pierwszego tygodnia życia osobne mioty myszy Tg197 przydzielano do różnych grup badania. Myszy Tg197 heterozygotyczne wobec ludzkiego genu TNF otrzymywały dootrzewnowe dawki D2E7, Remicade i Enbrel raz na tydzień. Każda grupa dla dawki podawanego leku składała się z myszy z pojedynczego miotu. Grupa kontrolna otrzymywała jako rozcieńczalnik sól fizjologiczną buforowaną fosforanem i składała się z myszy z 4 miotów. Raz na tydzień, przed podaniem dawki leku, rejestrowano masy ciała zwierząt w każdej grupie. Każda grupa otrzymywała jedno dootrzewnowe wstrzykniecie raz na tydzień zgodnie ze schematem:

Kontrolny nośnik

D2E7, 10 mg/kg Remicade, 10 mg/kg Enbrel, 10 mg/kg

D2E7, 5 mg/kg Remicade, 5 mg/kg Enbrel, 5 mg/kg

PL 213 215 B1

D2E7, 1 mg/kg Remicade, 1 mg/kg D2E7, 0,5 mg/kg Remicade, 0,5 mg/kg D2E7, 0,1 mg/kg Remicade, 0,1 mg/kg

Enbrel, 1 mg/kg

Enbrel, 0,5 mg/kg Enbrel, 0,1 mg/kg D2E7, 0,01 mg/kg Remicade, 0,01 mg/kg Enbrel, 0,01 mg/kg

Raz na tydzień w każdej grupie rejestrowano wskaźnik zapalenia stawów, przy użyciu następującego systemu oceny:

brak zapalenia stawów łagodne zapalenie stawów (wykrzywienie stawu) umiarkowane zapalenie stawów (obrzęk, zniekształcenie stawu) ciężkie zapalenie stawów (usztywnienie zgięciowe i ciężkie upośledzenie ruchów)

Leczenie prowadzono przez 10 tygodni. Wyniki dotyczące wskaźników zapalenia stawów pokazano na fig. 1, 2 i 3. Fig. 4 pokazuje ostateczny wskaźnik zapalenia stawów dla trzech przeciwciał u leczonych myszy Tg197 w tygodniu 10. Wyniki pokazują, że do zapobiegnięcia wzrostowi wskaźników zapalenia stawów potrzebne były wyższe dawki preparatu Enbrel. Wartość ED50 dla preparatu Enbrel była bliska 1 mg/kg, natomiast wartość ED50 dla D2E7 i Remicade była niższa od 0,5 mg/kg. Porównując dwa przeciwciała, D2E7 zapewniał większą ochronę niż Remicade w tych samych dawkach. Ponadto opóźniono wystąpienie początku choroby u myszy leczonych 0,5 mg/kg D2E7 o maksymalnie 5 tygodni, a u myszy leczonych dawką 0,1 mg/kg D2E7 o maksymalnie 4 tygodnie (fig. 1). Natomiast wystąpienie początku choroby opóźniono u myszy leczonych 0,1 mg/kg lub 0,5 mg/kg Remicade jedynie o 3 tygodnie (fig. 2).

Podsumowując, wszystkie trzy środki D2E7, Remicade i Enbrel zapobiegały rozwojowi zapalenia stawów u myszy Tg197 w sposób zależny od dawki. Leczone myszy miały niższe wskaźniki zapalenia stawów i mniejsze zapalenie i uszkodzenie stawów i przybrały bardziej na wadze, niż nieleczone myszy. Schemat odpowiedzi był podobny dla wszystkich trzech antagonistów TNF, ale stopień ochrony dostarczanej przez te trzy środki był różny. Chociaż najwyższe, nasycające dawki nie umożliwiały odróżnienia środków, siła ochrony dla dawek pośrednich była największa u myszy leczonych D2E7, następnie dla myszy leczonych infliksimabem (Remicade), a najsłabsza była dla Etanerceptu (Enbrel).

C. Analiza stężenia huTNF we krwi u leczonych myszy

W czasie badania pobierano krew w 5 i 10 tygodniu. Otrzymywano surowicę i określano stężenie ludzkiego TNF przy użyciu zestawu ELISA Medgenix do oznaczania ludzkiego TNF. Poziom TNF mierzono dla każdej myszy w grupach terapeutycznych. Wyniki badania pokazano na fig. 6. Dla każdej grupy na rysunku pokazano średnią ± błąd standardowy stężenia TNF. Dla orientacji na każdym rysunku poprowadzono ciągłą linię wskazującą stężenie 2 ng/ml TNF. W nieleczonej grupie stężenia huTNF były niskie, 0,1 i 0,2 ng/ml odpowiednio w 5 i 10 tygodniu. Podawanie środków przeciw-TNF raz w tygodniu doprowadziło do sekwestracji TNF w surowicy. Stężenia huTNF w surowicy były podobne u myszy leczonych D2E7 lub Remicade. Średnie poziomy huTNF spadły z 2 do 0,1 ng/ml w funkcji podawanej dawki. Z drugiej strony u myszy leczonych preparatem Ebrel stężenia huTNF w surowicy były znacznie wyższe, osiągając 20 ng/ml.

Podsumowując, pomiar ludzkiego TNF przy użyciu testu Medgenix ELISA, który wykrywa zarówno wolny, jak i związany TNF, wskazują, że środki przeciw-TNF prowadziły do sekwestracji TNF w kompleksy. Obserwowano wykrywalne stężenia TNF w surowicy leczonych myszy w porównaniu z bardzo niskimi stężeniami u nieleczonych myszy. Co interesujące, stężenie nieusuniętych kompleksów TNF dla etanerceptu było 10-krotnie wyższe niż u myszy leczonych infliksimabem lub D2E7. Opóźnienie klirensu TNF w przypadku stosowania etanerceptu opisano w opublikowanych modelach zwierzęcych i badaniach klinicznych.

D. Badanie mikroskopowe leczonych myszy

Po 10 tygodniach leczenia wszystkie myszy uśmiercano. Od dwóch myszy z każdej grupy terapeutycznej odcięto prawą i lewą tylną kończynę. Kończyny utrwalano w 10% obojętnej buforowanej formalinie, a następnie odwapniano. Trzy kolejne skrawki z fragmentu każdej kończyny umieszczano na szkiełkach i zakodowane preparaty wysyłano do niezależnego badania histopatologicznego.

Preparaty barwiono hematoksyliną/eozyną. Patolog oceniał każdy preparat pod kątem nasilenia unaczynienia, zapalenia, nadżerek chrząstki i kości w skali 1-4. Wyniki pokazano w poniższej tabeli 2.

PL 213 215 B1

T a b e l a 2.

Orientacyjne wartości ED50 (mg/kg) dla D2E7, Remicade lub Enbrel dla zapobiegania mikroskopowym cechom zapalenia stawów u myszy Tg197.

	D2E7 ED50, mg/kg	Remicade ED50, mg/kg	Enbrel ED50, mg/kg
Zapalenie	0,1	0,5	0,5
Unaczynienie	0,1	0,1	1 < ED50 < 5
Nadżerki chrząstki	0,01 < ED50 < 0,1	0,1 < ED50 < 0,5	0,5
Nadżerki kości	0,01 < ED50 < 0,1	0,1 < ED50 < 0,5	0,5 < ED50 < 1

Wyniki tego eksperymentu pokazano także na fig. 5. Na fig. 5 badano trzy preparaty z każdej kończyny, dlatego histopatologicznie oceniano 6 preparatów od jednej myszy i 12 preparatów na grupę terapeutyczną. Dla każdej grupy terapeutycznej na rysunku pokazano średnią ± standardowe odchylenie wskaźników histopatologicznych. Większość zmian była związana ze stawami skokowymi i wszystkie wydawały się symetryczne (tj. uzyskano podobne wskaźniki dla lewej i prawej kończyny u danej myszy). Niszczenie chrząstki było głównie wynikiem śródkostnych zmian nadżerkowych i było ogólnie mniej nasilone niż nadżerki kości. Na zapalenie składały się głównie komórki jednojądrzaste z niewieloma granulocytami wielojądrzastymi i bez miejsc gęstych od granulocytów wielojądrzastych.

Różnice między trzema środkami przeciw-TNF były bardziej nasilone pod względem mikroskopowych cech aktywności choroby w stawach zajętych zapaleniem stawów niż zewnętrznych objawów mierzonych w postaci wskaźników zapalenia stawów. Dawka 0,5 mg/kg D2E7 całkowicie wyeliminowała nadżerki kości. Dla osiągnięcia tego samego efektu potrzebowano znacznie wyższej dawki Remicade lub Enbrel, 5 mg/kg. Dawka 0,1 mg/kg D2E7 całkowicie wyeliminowała nadżerki chrząstki. Dla osiągnięcia tego samego efektu potrzebowano znacznie wyższej dawki Remicade, 1 mg/kg lub Enbrel, 5 mg/kg. Zapalenie w stawach całkowicie wyeliminowała dawka 0,5 mg/kg D2E7. Dla osiągnięcia tego samego efektu potrzebowano znacznie wyższej dawki innych leków: 5 mg/kg Remicade i 10 mg/kg Enbrel. Unaczynienie w stawach całkowicie wyeliminowała dawka 0,5 mg/kg D2E7 lub Remicade. Dla osiągnięcia tego samego efektu potrzebowano znacznie wyższej dawki Enbrel, 5 mg/kg.

Istniała wyraźna różnica zależności dawka-odpowiedź między D2E7, infliksimabem i etanerceptem pod względem zapobiegania mikroskopowemu uszkodzeniu stawu. Podczas gdy D2E7 całkowicie zapobiegało powstawaniu nadżerek kości, niszczeniu chrząstki, zapaleniu i rozrostowi naczyń w dawce 0,5 mg/kg, zarówno infliksimab, jak i etanercept wymagały dawki 1 lub 5 mg/kg dla osiągnięcia podobnego poziomu skuteczności. Podsumowując, u myszy transgenicznych, u których zachodzi ekspresja ludzkiego TNF, Tg197, D2E7 zapobiegało zapaleniu wielostawowemu silniej, niż etanercept lub infliksimab, szczególnie w małych dawkach.

Claims

1. Zastosowanie ludzkiego przeciwciała przeciw TNFa, które jest albo przeciwciałem D2E7 albo ludzkim przeciwciałem przeciw TNFa mającym właściwości równoważne D2E7, które oddysocjowuje od ludzkiego TNFa z Kd równą 1 x 10^-8 M lub mniejszą i stałą oddysocjowania Koff równą 1 x 10^-3 sek^-1lub mniejszą, przy czym obie stałe są określane za pomocą rezonansu plazmonów powierzchniowych, i neutralizuje cytotoksyczność ludzkiego TNFa w zwykłym teście L929 w warunkach in vitro, przy IC50 wynoszącym 1 x 10^-7 M lub mniej, do wytwarzania leku do leczenia lub łagodzenia zapalenia stawów, polegające na podawaniu osobnikowi cierpiącemu na zapalenie stawów skutecznej dawki ludzkiego przeciwciała przeciw TNFa, z użyciem małej dawki wynoszącej 0,01-0,11 mg/kg, takiej, że to zapalenie stawów jest leczone lub łagodzone.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym zapaleniem stawów jest reumatoidalne zapalenie stawów.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, w którym objawy związane z zapaleniem stawów są łagodzone.

PL 213 215 B1

4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 3, w którym łagodzone objawy są wybrane z grupy obejmującej nadżerki kości, nadżerki chrząstki, zapalenie i unaczynienie.

5. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 3, w którym zapalenie stawów jest leczone przez łagodzenie objawów wybranych z grupy obejmującej wykrzywienie stawu, obrzęk, zniekształcenie stawu, usztywnienie zgięciowe i poważne upośledzenie ruchów.

6. Zastosowanie według zastrz. 1 - 5, w którym ludzkie przeciwciało przeciw TNFa, powoduje sekwestrację TNFa w kompleksy u osobnika cierpiącego na to zapalenie stawów.

7. Zastosowanie według zastrz. 1 - 6, w którym stężenie TNFa w surowicy jest wyższe niż stężenie TNFa w surowicy u osobnika niecierpiącego na to zapalenie stawów.