PL215125B1 - Zastosowanie immunogenu, poliaminokwas lub koniugat pochodzacy ze zwierzecego APP lub Abeta, immunogenna kompozycja, fragment kwasu nukleinowego i wektor - Google Patents

Zastosowanie immunogenu, poliaminokwas lub koniugat pochodzacy ze zwierzecego APP lub Abeta, immunogenna kompozycja, fragment kwasu nukleinowego i wektor

Info

Publication number
PL215125B1
PL215125B1 PL369099A PL36909902A PL215125B1 PL 215125 B1 PL215125 B1 PL 215125B1 PL 369099 A PL369099 A PL 369099A PL 36909902 A PL36909902 A PL 36909902A PL 215125 B1 PL215125 B1 PL 215125B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
residues
amino acid
epitope
app
acid residues
Prior art date
Application number
PL369099A
Other languages
English (en)
Other versions
PL369099A1 (pl
Inventor
Peter Birk Rasmussen
Martin Roland Jensen
Klaus Gregorius Nielsen
Peter Koefoed
Florence Dal Degan
Original Assignee
Pharmexa As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=32870659&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL215125(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Pharmexa As filed Critical Pharmexa As
Publication of PL369099A1 publication Critical patent/PL369099A1/pl
Publication of PL215125B1 publication Critical patent/PL215125B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0312—Animal model for Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6093—Synthetic polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG], Polymers or copolymers of (D) glutamate and (D) lysine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hematology (AREA)

Abstract

Ujawnione są nowe sposoby zwalczania chorób charakteryzujących się złogami amyloidu. Sposoby ogólnie polegają na immunizacji przeciwko prekursorowemu białku amyloidu (APP) lub amyloidu beta (Aβ). Immunizacja jest korzystnie uzyskiwana przez podawanie analogów autologicznego APP lub Aβ, przy czym analogi te są zdolne do indukowania produkcji przeciwciał przeciwko autologicznym amyloidogennym polipeptydom. Zwłaszcza korzystny jako immunogen jest autologiczny Aβ, który został zmodyfikowany przez wprowadzenie jednego pojedynczego lub kilku obcych, immunodominujących i różnorodnych epitopów limfocytów T. Również ujawniono szczepionkę kwasu nukleinowego przeciwko APP lub Aβ i szczepienie z zastosowaniem żywych szczepionek, jak również sposoby i środki użyteczne do szczepienia. Takie sposoby i środki obejmują sposoby wytwarzania analogów preparatów farmaceutycznych, jak również fragmenty kwasów nukleinowych, wektory, transformowane komórki, polipeptydy i preparaty farmaceutyczne.

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie immunogenu, poliaminokwas lub koniugat pochodzący ze zwierzęcego APP lub Αβ, immunogenna kompozycja, fragment kwasu nukleinowego i wektor. Rozwiązania według wynalazku dostarczają ulepszeń w leczeniu i zapobieganiu chorobie Alzheimera (AD) i innych chorób charakteryzujących się odkładaniem amyloidu, np. charakteryzujących się złogami amyloidowymi w ośrodkowym układzie nerwowym (CNS). Niniejszym opisano sposób obniżania poziomu (niepożądanych) złogów amyloidu przez umożliwienie wytwarzania przeciwciał przeciwko odpowiedniemu białku (APP lub Αβ) lub jego składnikom u osobników cierpiących na lub zagrożonych wystąpieniem chorób, których patologia obejmuje złogi amyloidu. Niniejszym przedstawiono również sposoby wytwarzania polipeptydu użytecznego w rozwiązaniach według wynalazku, jak również samego zmodyfikowanego polipeptydu jako takiego. Również objęte obecnym wynalazkiem są fragmenty kwasów nukleinowych kodujących zmodyfikowany polipeptyd jak również wektory obejmujące te fragmenty kwasów nukleinowych. Obecny wynalazek również dostarcza nowy typ sprzężonego peptydowego immunogenu.
Podstawa wynalazku
Amyloidozą określa się zewnątrzkomórkowe złogi nierozpuszczalnych włókienek białkowych prowadzące do uszkodzenia tkanek i chorób (Pepys, 1996; Tan i wsp., 1995; Kelly, 1996). Włókienka tworzą się gdy normalnie rozpuszczalne białka i peptydy asocjują między sobą w abnormalny sposób (Kelly, 1997).
Amyloid jest związany z poważnymi chorobami obejmującymi układową amyloidozę, AD, cukrzycę dorosłych, chorobę Parkinsona, chorobę Huntingtona, demencję czołowo-skroniową i encefalopatie gąbczaste związane z prionami (kuru i choroba Creutzfeldta-Jacoba u ludzi, oraz scrapie i BSE odpowiednio u owcy i bydła), i tworzeniem się płytek amyloidowych, na przykład, w chorobie Alzheimera wydaje się być blisko związane z postępem choroby u ludzi. W modelach zwierzęcych wykazano, że nadekspresja, lub ekspresja zmodyfikowanych form, białek stwierdzonych w złogach, typu białka β-amyloidu, wywołuje różne objawy choroby, np. objawy typu choroby Alzheimera. Nie istnieje sp ecyficzne leczenie amyloidowych złogów i choroby te zwykle są śmiertelne.
Podjednostki włókienek amyloidu mogą być typu dzikiego, wariantami lub białkami skróconymi i podobne włókienka mogą być formowane in vitro z oligopeptydów i zdenaturowanych białek (Bradbury i wsp., 1960; Filshie i wsp., 1964; Burke & Rougvie, 1972). Rodzaj składnika włókienka polipeptydowego definiuje charakter amyloidozy. Pomimo dużych różnic w wielkości, natywnej strukturze i funkcji białek amyloidu, wszystkie amyloidowe włókienka są nieokreślonej długości, nierozgałęzione, o średnicy 70 do 120 A i wykazują charakterystyczne barwienie czerwienią Kongo (Pepys, 1996). Mają one charakterystykę struktury krzyżowej β (Pauling & Corey, 1951), w której łańcuch polipeptydowy jest zorganizowany w β-kartkę. Pomimo, że białka amyloidu mają bardzo różne prekursorowe struktury, mogą one wszystkie przechodzić przekształcenie strukturalne, być może zgodnie z podobną ścieżką, do nieprawidłowo złożonej postaci, to jest elementu tworzącego β-kartkę helisy protofilamentu.
Ten odmienny wzór budowy doprowadził do amyloidozy, zwanej β-fibrylozą (Glenner, 1980a,b) i fibrylarne białko AD zostało nazwane białkiem β zanim jego drugorzędowa struktura została poznana (Glenner & Wong, 1984). Charakterystyka obrazu dyfrakcyjnego struktury krzyżowej β, razem z wyglądem włókienek i właściwościami barwienia są obecnie akceptowanymi diagnostycznymi cechami charakterystycznymi amyloidu i sugerują, że włókienka, pomimo, że utworzone z całkiem różnych białek prekursorowych, mają podobne w pewnym stopniu właściwości strukturalne i należą do strukturalnej nadrodziny, niezależnie od charakteru ich prekursorowych białek (Sunde M, Serpell LC, Bartlam M, Fraser PE, Pepys MB, Blake CCFJ Mol Biol 1997 Oct 31; 273 (3):729-739).
Jedną z najbardziej rozprzestrzenionych i dobrze znanych chorób, w których złogi amyloidowe w ośrodkowym układzie nerwowym, jak się sugeruje, odgrywają główną rolę w postępie choroby, jest AD.
Choroba Alzheimera (AD)
Choroba Alzheimera (AD) jest nieodwracalną, progresywną chorobą mózgu, która występuje stopniowo i prowadzi do utraty pamięci, zmian behawioralnych i osobowych, i obniżenia zdolności psychicznych. Te zmiany są związane ze śmiercią komórek mózgu i zniszczeniem połączeń pomiędzy nimi. Przebieg tej choroby zmienia się w zależności od osoby, tak jak i szybkość obniżania sprawności. Średnio, pacjenci z chorobą Alzheimera żyją przez 8 do 10 lat od momentu zdiagnozowania, jednakże choroba może trwać do 20 lat.
PL 215 125 B1
AD postępuje etapami, od wczesnego, łagodnego zapominania do ciężkiej utraty funkcji umysłowych. Ta utrata jest zwana demencją. U większości ludzi cierpiących na AD, objawy najpierw występują w wieku po 60, lecz wcześniejsze rozpoczęcie choroby nie jest częste. Wcześniejsze objawy często obejmują utratę pamięci, niewłaściwą ocenę i zmiany osobowości. Często, ludzie z wczesnymi etapami AD myślą mniej jasno i zapominają imiona ludzi bliskich i zwykłych przedmiotów. Później w trakcie choroby, mogą oni zapominać jak należy wykonać nawet proste czynności. Ostatecznie, ludzie cierpiący na AD tracą całkowicie zdolności rozumowania i stają się zależni od innych ludzi pod względem codziennego życia. Ostatecznie, choroba staje się tak otępiająca, że pacjenci są przykuci do łóżka i mogą rozwijać się u nich inne choroby i infekcje. Najczęściej, ludzie cierpiący na AD umierają z powodu zapalenia płuc.
Pomimo, że ryzyko rozwoju AD zwiększa się z wiekiem, AD i objawy demencji nie są częścią normalnego starzenia. AD i inne choroby powodujące demencję są powodowane przez choroby, które dotykają mózg. Przy normalnym starzeniu, komórki nerwowe w mózgu nie są tracone w dużej ilości. Przeciwnie, AD przerywa trzy kluczowe procesy: połączenia komórek nerwowych, metabolizm i naprawę. To przerwanie ostatecznie powoduje, że wiele komórek nerwowych przestaje funkcjonować, traci połączenia z innymi komórkami nerwowymi i umiera.
Na początku, AD niszczy neurony w częściach mózgu, które kontrolują pamięć, zwłaszcza w hipokampie i pokrewnych strukturach. Gdy komórki nerwowe w hipokampie przestaną funkcjonować właściwie, krótkoterminowa pamięć zawodzi i często, zdolność osoby do wykonywania łatwych i znanych czynności zaczyna się obniżać. AD również atakuje korę mózgową, zwłaszcza obszary odpowiedzialne za język i rozumowanie. Ostatecznie, wiele innych obszarów mózgu jest włączonych w ten proces, wszystkie te regiony mózgu podlegające atrofii (kurczeniu) i pacjent z AD zostaje przykuty do łóżka, nie trzyma moczu i stolca, jest całkowicie bezradny i nie reaguje na otaczający go świat (źródło: National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Wpływ choroby Alzheimera
AD jest najczęstszym powodem demencji u ludzi w wieku 65 lat i starszych. Stanowi ona główny problem zdrowotny, ze względu na niezwykły wpływ na osoby, ich rodziny, system opieki zdrowotnej i społeczeństwo jako całość. Naukowcy szacują, że do 4 milionów ludzi obecnie cierpi z powodu choroby i chorobowość podwaja się co 5 lat powyżej 65 lat. Szacuje się również, że w przybliżeniu 360 000 nowych przypadków (wystąpień) pojawi się każdego roku, choć liczba ta ulegnie zwiększeniu wraz ze starzeniem się populacji (Brookmeyer i wsp., 1998).
AD nakłada ciężki obowiązek na społeczeństwo. Obecne badanie w Stanach Zjednoczonych wykazało szacunkowo, że roczny koszt opieki nad jednym pacjentem cierpiącym na chorobę Alzheimera wynosi $18 408 dla pacjenta z łagodną AD, $30 096 dla pacjenta z umiarkowaną AD i $36 132 dla pacjenta z ciężką AD. Roczny koszt narodowy opieki dla AD pacjentów w US, jak oszacowano, wynosi niewiele ponad $50 miliardów (Leon i wsp., 1998).
W przybliżeniu 4 miliony Amerykanów ma 85 lat lub więcej i w większości uprzemysłowionych państw, ta grupa wiekowa jest jedną z najszybciej rosnących segmentów populacji. Szacuje się, że ta grupa będzie liczyła prawie 8,5 milionów do roku 2030 w US; niektórzy eksperci, którzy badali trendy w populacji sugerują, że liczba ta może być nawet większa. Gdy coraz więcej ludzi żyje dłużej, liczba ludzi dotkniętych chorobami związanymi ze starzeniem, obejmującymi AD, będzie nadal rosła. Na przykład, pewne badania wykazują prawie połowę wszystkich ludzi w wieku 85 i starszych mają pewne postacie demencji. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Główna charakterystyka choroby Alzheimera
Dwie anormalne struktury w mózgu są cechami charakterystycznymi choroby Alzheimera: płytki amyloidowe i sploty neurofibrylarne (NFT). Płytki są zwartymi, w dużej mierze nierozpuszczalnymi złogami białka i komórkowego materiału za zewnątrz i dokoła neuronów mózgu. Sploty są nierozpuszczalnymi skręconymi włóknami, które odkładają się wewnątrz neuronów.
Występują dwa typy choroby Alzheimera: rodzinna AD (FAD), która występuje zgodnie z pewnym wzorem dziedziczenia i sporadyczna AD, gdzie nie ma oczywistego wzoru dziedziczenia. Ze względu na różnice w wieku, w którym następuje rozpoczęcie choroby, AD jest również opisana jako o wczesnym początku (występująca u ludzi młodszych niż 65) lub o późnym początku (występująca u osób w wieku 65 i starszych). AD o wczesnym początku jest rzadka (około 10 procent przypadków) i ogólnie dotyka ludzi w wieku 30 do 60. Pewne formy AD o wczesnym początku są dziedziczone i przebiegają w rodzinach. AD o wczesnym początku również często postępuje szybciej, niż częstsza, postać o późnym początku.
PL 215 125 B1
Wszystkie przypadki FAD znane do tej pory mają wczesny początek i aż 50 procent przypadków FAD obecnie znanych jest powodowanych przez defekty w trzech genach zlokalizowanych na trzech różnych chromosomach. Są to mutacje w genie APP na chromosomie 21; mutacje w genie na chromosomie 14, zwanym genem preseniliny 1; i mutacje w genie na chromosomie 1, zwanym genem preseniliny 2. Nie istnieje żaden dowód, jednakże, że dowolna z tych mutacji odgrywa główną rolę w częstszej, sporadycznej lub nierodzinnej postaci AD o późnym początku. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Płytki amyloidowe
W chorobie Alzheimera płytki amyloidowe rozwijają się najpierw w obszarach mózgu wykorzystywanych w funkcjach pamięci i innych funkcjach poznawczych. Składają się one w dużej mierze z nierozpuszczalnych złogów amyloidu beta (tutaj poniżej oznaczony Αβ) - fragment białkowy większego białka zwanego prekursorowym białkiem amyloidu (APP, którego aminokwasową sekwencję przedstawiono jako SEK NR ID: 2) - przeplatającym się z częściami neuronów i z komórkami innymi niż neurony takie, jak komórki mikroglejowe i astrocyty. Nie wiadomo czy płytki amyloidowe same stanowią główną przyczynę choroby Alzheimera lub czy są one produktem ubocznym procesu choroby Alzheimera. Z pewnością, zmiany w białku APP może powodować AD, jak przedstawiono w dziedzicznej postaci choroby Alzheimera powodowanej przez mutacje w genie APP i tworzenie płytek Αβ wydaje się być blisko związane z postępem choroby u ludzi (Lippa C. F. i wsp. 1998).
APP
APP jest jednym z wielu białek, które są związane z błonami komórkowymi. Po wytworzeniu, APP ulega osadzeniu w błonie komórkowej komórek nerwowych, częściowo wewnątrz i częściowo na zewnątrz komórki. Obecne badania wykorzystujące transgeniczne myszy wykazują, że APP wydaje się odgrywać ważną rolę we wzroście i przeżyciu neuronów. Na przykład, pewne postacie i ilości APP mogą zabezpieczać neurony przeciwko zarówno krótko- jak i długoterminowemu uszkodzeniu i mogą czynić uszkodzone neurony lepiej przygotowanymi do samonaprawy i wspomagać części neuronów we wzroście po uszkodzeniu mózgu.
Podczas gdy APP jest osadzone w błonie komórkowej, proteazy działają na szczególne miejsca w obrębie APP, tnąc go na białkowe fragmenty. Jedna proteaza wspomaga cięcie APP z wytworzeniem Αβ, a inna proteaza tnie APP w środku amyloidowego fragmentu, tak że Αβ nie może być utworzone. Utworzone Αβ ma dwie różne długości, krótszą 40 (lub 41) aminokwasową Αβ, która jest stosunkowo rozpuszczalna i agreguje powoli, i nieco dłuższa, 42 aminokwasowa „lepka Αβ, która gwałtownie tworzy nierozpuszczalne skupiska. Podczas gdy Αβ jest tworzony, nie wiadomo jeszcze dokładnie jak, przemieszcza się przez i wokół komórek nerwowych. W końcowych etapach tego procesu, „lepki Αβ agreguje w długie filamenty zewnątrzkomórkowe i wraz z fragmentami martwych i umierających neuronów i komórek mikroglejowych i astrocytów, tworzy płytki, które są charakterystyczne dla choroby Alzheimera w tkance mózgowej.
Istnieją pewne dowody, że mutacje w APP powodują, że Αβ będzie z większym prawdopodobieństwem odcięty od prekursorowego APP, zatem powodując wytworzenie więcej całkowitej Αβ lub stosunkowo więcej „lepkiej formy. Również wydaje się, że mutacje w genach kodujących presenilinę mogą brać udział w degeneracji neuronów na przynajmniej dwa sposoby: przez zmodyfikowanie wytwarzania Αβ lub przez wyzwalanie śmierci komórek bardziej bezpośrednio. Inni naukowcy sugerują, że zmutowane preseniliny 1 i 2 mogą brać udział w przyśpieszaniu tempa apoptozy.
Można się spodziewać, że gdy choroba postępuje, coraz więcej płytek będzie tworzonych, wypełniając coraz więcej obszarów mózgu. Badania sugerują, że może to być tak, że Αβ ulega agregacji i rozdzieleniu w tym samym czasie, w pewnym rodzaju równowagi dynamicznej. To budzi nadzieję, że może być możliwe zniszczenie płytek nawet po ich utworzeniu. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Uważa się, że Αβ jest toksyczny dla neuronów. W badaniach hodowli tkankowych, naukowcy obserwowali wzrost śmierci w przypadku komórek nerwowych hipokampu, zaprojektowanych tak, że prowadzą nadekspresję zmutowanych form ludzkiego APP w porównaniu do neuronów prowadzących nadekspresję normalnego ludzkiego APP (Luo i wsp., 1999).
Ponadto, nadekspresja lub ekspresja zmodyfikowanych form białka Αβ, jak wykazano w modelach zwierzęcych, indukuje objawy typu choroby Alzheimera, (Hsiao K. i wsp., 1998).
Wiedząc, że wzrost wytwarzania Αβ, jego agregacja w płytki i wytworzona neurotoksyczność może prowadzić do AD, terapeutycznie jest ważne, aby badać warunki, w jakich agregacja Αβ w płytki mogłaby być spowolniona lub nawet zablokowana.
PL 215 125 B1
Preseniliny
Mutacje preseniliny-1 (S-180) wyjaśniają niemal 50% wszystkich przypadków o wczesnym początku rodzinnej AD (FAD). Około 30 mutacji zidentyfikowano, jako dające początek AD. Początek choroby Alzheimera zmienia się z mutacjami. Mutacje w presenilinie-2 wyjaśniają znacznie mniejszą część przypadków FAD, lecz nadal jest to znaczący czynnik. Nie wiadomo czy preseniliny biorą udział w sporadycznej nierodzinnej AD. Funkcja presenilin nie jest znana, lecz wydają się brać udział w obróbce APP, w celu otrzymania Αβ-42 (dłuższa, bardziej lepka forma peptydu, SEK NR ID: 2, reszty 673-714), gdyż pacjenci cierpiący na AD z mutacjami w presenilinie mają podwyższone poziomy tego peptydu. Nie jest jasne czy preseniliny również mają udział w wywoływaniu wytwarzania NFT. Pewne badania sugerują, że preseniliny mogą również mieć bardziej bezpośrednią rolę w degeneracji neuronów i śmierci neuronów. Gen kodujący presenilinę-1 jest zlokalizowany na chromosomie 14 podczas gdy presenilinę-2 jest połączony z chromosomem 1. Jeśli u osoby występuje zmutowana wersja tylko jednego z tych genów, to jest niemal pewne, że będzie u osoby tej rozwijała się będzie AD o wczesnym początku.
Istnieje niepewność co do tego czy presenilina-1 jest identyczna z hipotetyczną gama-sekretazą biorącą udział w obróbce APP (Naruse i. wsp., 1998).
Apolipoproteina E
Apolipoproteina E jest zwykle związane z cholesterolem, lecz również została stwierdzona w płytkach i splotach w mózgach osób chorych na chorobę Alzheimera. Podczas gdy allele 1-3 nie wydają się brać udziału w chorobie Alzheimera istnieje znacząca korelacja pomiędzy obecnością allelu ΑΡOΕ-ε4 i rozwijaniem się późnej AD (Strittmatter i wsp., 1993). Jest to, jednakże, czynnik ryzyka i nie stanowi bezpośredniej przyczyny, jak ma to miejsce w przypadku preseniliny i mutacji APP, i nie jest ograniczony do rodzinnej AD.
Sposoby, w jaki białko ΑPOΕ-ε4 zwiększa prawdopodobieństwo rozwoju AD nie są znane z pewnością, lecz jedna z możliwych teorii, polega na tym, że ułatwia nagromadzenie Αβ i bierze udział w obniżaniu wieku początku choroby Alzheimera, lub obecność lub brak pewnych alleli APOE może wpływać na sposób, w jaki neurony odpowiadają na uszkodzenie (Buttini i wsp., 1999).
Również wykazano, że Apo A1 jest amyloidogenny. Nienaruszony apo A1 może sam tworzyć włókienka typu amyloidowego in vitro, które są pozytywne względem czerwieni Kongo (Am J Pathol 147 (2): 238-244 (Aug 1995), Wisniewski T, Golabek AA, Kida E, Wisniewski KE, Frangione B).
Wydaje się, że istnieją pewne sprzeczne wyniki, wskazujące, że istnieje pozytywny wpływ allelu ΑΡOΕ-ε4 na obniżanie objawów utraty świadomości, w porównaniu do innych alleli (Stern, Brandt, 1997, Annals of Neurology 41).
Sploty neurofibrylarne
Ta druga cecha charakterystyczna choroby Alzheimera obejmuje anormalne gromadzenie się skręconych nici obecnych wewnątrz komórek nerwowych. Głównym składnikiem splotów jest jedna forma białka zwanego tau (τ). W ośrodkowym układzie nerwowym, białka tau są najlepiej znane pod względem ich zdolności do wiązania i pomocy w stabilizacji mikrotubul, które są jednym składnikiem wewnętrznej szkieletowej struktury komórki, lub szkieletu. Jednakże, w chorobie Alzheimera tau jest zmienione chemicznie i to zmienione tau nie może dalej stabilizować mikrotubul, powodując, że ulegają one rozpadowi. To załamanie układu transportu może na początku prowadzić do wadliwego funkcjonowania komunikacji pomiędzy komórkami nerwowymi, a później może prowadzić do śmierci neuronów.
W chorobie Alzheimera, chemicznie zmienione tau skręca się w sparowane helikalne filamenty dwie nici tau, które skręcają się dookoła siebie. Te filamenty są główną substancją stwierdzoną w splotach neurofibrylarnych. W jednym z obecnych badań, naukowcy stwierdzili neurofibrylarne zmiany u mniej niż 6 procent neuronów, w szczególnej części hipokampu w zdrowych mózgach, ponad 43 procent takich neuronów u ludzi, którzy zmarli na łagodną postać AD i 71 procent takich neuronów u ludzi którzy zmarli na ciężką postać AD. Gdy badano utratę neuronów, stwierdzono podobny postęp. Dowód tego typu jest poparciem idei, że tworzenie splotów i utrata neuronów postępują razem w czasie choroby Alzheimera. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Tauopatie i sploty
Kilka neurodegeneracyjnych chorób, innych niż AD, charakteryzuje się agregacją tau w nierozpuszczalne filamenty w neuronach i gleju, prowadząc do dysfunkcji i śmierci. Ostatnio, kilka grup naukowców, którzy badali rodziny o różnych wrodzonych demencjach innych niż AD, stwierdzili jedną mutację w genie kodującym tau w chromosomie 17 (Clark i wsp., 1998; Hutron i wsp., 1998; Poorkaj
PL 215 125 B1 i wsp., 1998; Spillantyni i wsp., 1998). W tych rodzinach, mutacje w genie kodującym tau powodują śmierć komórek nerwowych i demencję. Te zaburzenia, które mają pewne wspólne cechy charakterystyczne z AD, lecz różnią się w kilku ważnych aspektach, są razem zwane „czołowo skroniową demencją i parkinsonizmem połączonym z chromosomem 17 (FTDP-17). Są to choroby, takie jak choroba Parkinsona, niektóre postacie stwardnienia zanikowego bocznego (ALS), degeneracja korowopodstawna, progresywne nadjądrowe porażenie i choroba Picka i wszystkie one charakteryzują się anormalną agregacją białka tau.
Inne neurologiczne choroby typu AD
Występują ważne podobieństwa pomiędzy AD oraz innymi neurologicznymi chorobami, obejmującymi choroby powodowane przez priony (takie jak kuru, choroba Creutzfelda-Jacoba i bydlęce gąbczaste zapalenie mózgu), chorobę Parkinsona, chorobę Huntingtona i demencję czołowo-skroniową. Wszystkie obejmują złogi anormalnych białek w mózgu. AD i choroby powodowane przez priony, powodują demencję i śmierć, i obie są związane z tworzeniem nierozpuszczalnych włókienek amyloidu, lecz z białek błonowych, które są od siebie różne.
Naukowcy badając chorobę Parkinsona, drugą co do częstości neurodegeneracyjną chorobę po AD, ujawnili pierwszy gen związany z tą chorobą. Gen ten koduje białko zwane synukleiną, które, niespodziewanie, również jest obecne w płytkach amyloidowych występujących w mózgach pacjentów z chorobą Alzheimera (Lavedan C, 1998, Genom Res. 8(9): 871-80). Badający również ujawnili, że genetyczne defekty w chorobie Huntingtona, kolejnej progresywnej neurodegeneracyjnej chorobie powodującej demencję, powodują, że białko Huntingtona tworzy nierozpuszczalne włókienka bardzo podobne do włókienek Αβ w chorobie Alzheimera i włókienek białkowych w chorobach powodowanych przez priony (Scherzinger E, i wsp., 1999, PNAS U.S.A. 96 (8): 4604-9).
Naukowcy również ujawnili nowy gen, który jeśli jest zmutowany, jest odpowiedzialny za brytyjską rodzinną demencję (FBD, ang. familial British dementia), rzadką dziedziczoną chorobę, która powoduje dotkliwe zaburzenia w poruszaniu i progresywną demencję podobną do tej obserwowanej w chorobie Alzheimera. W biochemicznej analizie włókienek amyloidu występujących w płytkach FBD, stwierdzono wyjątkowy peptyd nazwany ABri (Vidal i wsp., 1999). Mutacja w szczególnym punkcie wzdłuż tego genu prowadzi do wytwarzania dłuższego niż normalnie białka Bri. Peptyd ABri, który jest odcięty od zmutowanego końca białka Bri jest gromadzony jako amyloidowe włókienka. Te płytki jak się uważa prowadzą do dysfunkcji neuronów i demencji, która charakteryzuje FBD.
Immunizacja Αβ
Układ odpornościowy będzie normalnie brał udział w usuwaniu obcego białka i białkowych cząsteczek z organizmu, lecz złogi związane z powyżej wymienionymi chorobami składają się głównie z własnych białek, co czyni rolę układu odpornościowego w kontroli tych chorób mniej oczywistą. Ponadto, złogi są zlokalizowane w obszarze CNS (ośrodkowy układ nerwowy) normalnie oddzielonym od układu odpornościowego, oba fakty sugerują, że każda szczepionka lub immunoterapeutyczne podejście mogą być nieudane.
W każdym razie, naukowcy ostatnio próbowali immunizować myszy szczepionką złożoną z heterogenicznego ludzkiego Αβ i substancji znanej, pobudzającej układ odpornościowy (Schenk i wsp., 1999 i WO 99/27944). Szczepionkę badano w częściowym modelu choroby Alzheimera na transgenicznych myszach z ludzkim zmutowanym genem kodującym APP wprowadzonym do DNA myszy. Myszy uzyskiwały zmodyfikowane białko APP i rozwinęły płytki amyloidowe wraz z ich wzrostem z wiekiem. Ten mysi model zastosowano aby zbadać czy szczepienie przeciwko zmodyfikowanemu transgenicznemu ludzkiemu APP miało wpływ na nabudowanie płytki. W pierwszym doświadczeniu, jedna grupa transgenicznych myszy otrzymywała miesięczne iniekcje szczepionki rozpoczynające się od 6 tygodnia życia i kończące się na 11 miesiącu. Druga grupa transgenicznych myszy nie otrzymała iniekcji i służyła jako grupa kontrolna. W wieku 13 miesięcy, myszy w grupie kontrolnej miały płytki obejmujące 2 do 6 procent ich mózgów. Przeciwnie, immunizowane myszy nie miały faktycznie żadnych płytek.
W drugim doświadczeniu, naukowcy rozpoczęli iniekcje w 11 miesiącu, gdy pewne płytki już się rozwinęły. Przez okres 7-miesięcy, kontrolne transgeniczne myszy miały 17-krotny wzrost ilości płytek w ich mózgach, podczas gdy te otrzymujące szczepionkę miały 99-procentowe obniżenie w porównaniu do 18-miesięcznych kontrolnych transgenicznych myszy. U pewnych myszy, niektóre z istniejących uprzednio złogów płytkowych wydawały się usunięte w wyniku leczenia. Również stwierdzono, że inne uszkodzenia związane z płytkami, takie jak zapalenie i anormalne procesy w komórkach nerwowych, zmniejszyły się w wyniku immunizacji.
PL 215 125 B1
Powyższe stanowi zatem wstępne badanie u myszy i na przykład, naukowcy muszą określić czy szczepione myszy pozostają zdrowe w innych aspektach i czy pamięć tych szczepionych myszy pozostaje normalna. Ponadto, ponieważ mysi model nie w pełni stanowi reprezentację choroby Alzheimera (zwierzęta nie rozwijają splotów neurofibrylarnych ani nie wiele z ich neuronów umiera), dodatkowe badania będą potrzebne aby określić czy ludzie mają podobne czy różne reakcje jak myszy. Drugą sprawą, którą trzeba rozważyć, jest że sposób może ewentualnie „leczyć amyloidowe złogi ale nie zatrzyma rozwoju demencji.
Techniczne rozwiązania również stanowią duże wyzwanie. Na przykład, jest mało prawdopodobne, że jest to nawet możliwe, stosując tę technologię, stworzenie szczepionki, która umożliwi ludziom wytworzenie przeciwciał przeciwko ich własnym białkom. Tak liczne problemy bezpieczeństwa i skuteczności będą musiały być rozwiązane zanim wszelkie testy u ludzi mogą być rozważane.
Praca Schenka i wsp. zatem wykazała, że jeśli byłoby możliwe wytworzenie silnej odpornościowej odpowiedzi na własne białka w białkowych złogach w ośrodkowym układzie nerwowym, takie jak płytki utworzone w chorobie Alzheimera, to również byłoby możliwe zapobieganie tworzeniu złogów, jak również usuwanie już utworzonych płytek.
Ostatnio, testy kliniczne wykorzystujące powyżej omówione szczepionki Αβ zostały zakończone ze względu na szkodliwe działania uboczne: pewna liczba szczepionych osobników rozwinęła chroniczne zapalenie mózgu, które może być wynikiem niekontrolowanej autoimmunizacji przeciwko Αβ w CNS (ośrodkowym układzie nerwowym).
Cel wynalazku
Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie autoszczepionki przeciwko amyloidowi, w celu otrzymania nowego sposobu leczenia AD i innych patologicznych zaburzeń w których rolę odgrywają złogi amyloidowe.
Streszczenie wynalazku
Opisano poniżej zastosowanie technologii autoszczepienia do wytwarzania silnych odpornościowych odpowiedzi przeciwko w inny sposób nie-immunogennym APP i Αβ. Opisano również sposoby wytwarzania takich szczepionek do zapobiegania, możliwie leczenia lub złagodzenia objawów chorób związanych z odkładaniem amyloidu.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie immunogenu, który
a) jest poliaminokwasem składającym się z przynajmniej jednej kopii podsekwencji reszt 672-714 z SEK NR ID: 2, przy czym co najmniej jeden obcy epitop pomocniczy T (epitop TH) jest włączony poprzez addycję aminokwasu i/lub insercję i/lub delecję i/lub podstawienie, podsekwencja jest wybrana z grupy składającej się z reszt 1-40, reszt 1-39, reszt 1-35, reszt 1-34, reszt 1-28, reszt 1-12, reszt 1-5, reszt 13-28, reszt 13-35, reszt 17-28, reszt 25-35, reszt 35-40, reszt 36-42 i reszt 35-42 sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych 673-714 z SEK NR ID: 2, a Phe w pozycji 19 reszt aminokwasowych 673-714 z SEK NR ID: 2 może być ewentualnie podstawiona, korzystnie Pro; lub
b) jest koniugatem zawierającym szkielet polihydroksypolimerowy, z którym oddzielnie jest sprzężony poliaminokwas określony w a); lub
c) jest kwasem nukleinowym kodującym poliaminokwas określony a); lub
d) jest niepatogennym mikroorganizmem lub wirusem niosącym fragment kwasu nukleinowego, który koduje i umożliwia ekspresję poliaminokwasu określonego w a), do wytwarzania preparatu farmaceutycznego zawierającego immunogen do leczenia, zapobiegania lub polepszania stanu zwierzęcia cierpiącego na chorobę Alzheimera lub inne choroby charakteryzujące się złogami amyloidowymi.
Korzystnie poliaminokwas lub koniugat stanowiące immunogen zgodnie z zastosowaniem według wynalazku obejmuje:
- przynajmniej jedno pierwsze ugrupowanie cząsteczkowe, które powoduje skierowanie poliaminokwasu do komórek prezentujących antygen (APC) lub limfocytu B, i/lub
- przynajmniej jedno drugie ugrupowanie cząsteczkowe, które stymuluje układ odpornościowy, i/lub
- przynajmniej jedno trzecie ugrupowanie cząsteczkowe, które optymalizuje prezentację poliaminokwasu układowi odpornościowemu.
Korzystniej pierwsze i/lub drugie i/lub trzecie ugrupowanie cząsteczkowe poliaminokwasu lub koniugatu jest/są przyłączone jako grupa boczna, kowalencyjnym lub niekowalencyjnym wiązaniem, do odpowiednich chemicznych grup w sekwencji APP lub Αβ.
PL 215 125 B1
Jeszcze korzystniej poliaminokwas lub koniugat stanowiące immunogen zawiera polipeptyd fuzyjny.
Również korzystnie poliaminokwas lub koniugat stanowiące immunogen do zastosowania według wynalazku obejmuje podwojenie przynajmniej jednego epitopu APP lub Αβ limfocytów B i/lub wprowadzenie haptenu.
Ponadto korzystnie obcy epitop limfocytu T jest immunodominujący u zwierzęcia, korzystniej jest wspólny, tak jak obcy epitop limfocytu T, który jest wybrany spośród naturalnego wspólnego epitopu limfocytu T i sztucznej sekwencji peptydu wiążącego MHC-II, a najkorzystniej naturalny epitop limfocytu T jest wybrany spośród epitopu anatoksyny tężca, takiego jak P2 lub P30, epitopu anatoksyny błonicy, epitopu hemaglutyniny wirusa grypy i epitopu CS P. falciparum.
W korzystnej postaci wykonania poliaminokwas lub koniugat stanowiące immunogen do zastosowania według wynalazku obejmuje epitopy limfocytów B, które nie są eksponowane do fazy zewnątrzkomórkowej, gdy są obecne w związanej z komórką postaci prekursora polipeptydu Αβ. Również korzystnie poliaminokwas lub koniugat nie ma przynajmniej jednego epitopu limfocytu B, który jest eksponowany do fazy zewnątrzkomórkowej, gdy jest obecny w związanej z komórką postaci prekursora polipeptydu Αβ.
Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku immunogen z punktu (a) obejmuje lub składa się z poliaminokwasu wybranego z grupy składającej się z:
- reszt aminokwasowych epitopu P2 anatoksyny tężca, po których następują reszty aminokwasowe 1-28 Αβ, a następnie reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca;
- reszt aminokwasowych 1-12 Αβ, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe epitopu P2 anatoksyny tężca oraz reszty aminokwasowe 13-28 Αβ;
- reszt aminokwasowych 1-12 Αβ, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe 1-12 Αβ, reszty aminokwasowe epitopu P2 anatoksyny tężca oraz reszty aminokwasowe 1-12 Αβ;
- reszt aminokwasowych 13-28 Αβ, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe 13-28 Αβ, reszty aminokwasowe epitopu P2 anatoksyny tężca oraz reszty aminokwasowe 13-28 Αβ;
- reszt aminokwasowych 1-12 Αβ, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe 13-35 Αβ, reszty aminokwasowe epitopu P2 anatoksyny tężca oraz reszty aminokwasowe 36-42 Αβ;
- reszt aminokwasowych 1-28 Αβ, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe 1-28 Αβ, reszty aminokwasowe epitopu P2 anatoksyny tężca oraz reszty aminokwasowe 1-28 Αβ; i
- reszt aminokwasowych 1-43 Αβ, przy czym Phe 19 została zastąpiona Pro, a Met 35 została zastąpiona Lys, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe epitopu P2, przy czym wszystkie sekwencje aminokwasowe są wyszczególnione w kierunku od końca N do C.
W kolejnej korzystnej postaci wykonania przynajmniej dwie kopie poliaminokwasu lub koniugatu są połączone kowalencyjnie lub niekowalencyjnie z cząsteczką nośnika zdolną do przeprowadzenia prezentacji wielokrotnych kopii determinant antygenowych.
Zgodnie z korzystną postacią wykonania zastosowania według wynalazku w immunogenie z punktu (b) poliaminokwas jest połączony do polihydroksypolimeru za pośrednictwem wiązania amidowego, a polihydroksypolimer jest wielocukrem.
Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku poliaminokwas lub koniugat przygotowano w formie z adiuwantem, co ułatwia przełamanie autotolerancji na autoantygeny.
Korzystnie preparat farmaceutyczny otrzymany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do podawania drogą wybraną spośród podawania pozajelitowego, takiego jak podawanie śródskórne, podskórne i domięśniowe; podawania dootrzewnowego; podawania doustnego; podawania dopoliczkowego; podawania podjęzykowego; podawania nadtwardówkowego; podawania dordzeniowego; podawania doodbytniczego i podawania wewnątrzczaszkowego. Korzystniej taki preparat farmaceutyczny zawiera skuteczną ilość poliaminokwasu lub koniugatu wynoszącą od 0,5 μg do 2000 μg.
W innej korzystnej postaci zastosowania według wynalazku preparat farmaceutyczny obejmujący kwas(y) nukleinowy(e) kodujący(e) poliaminokwas lub koniugat zgodnie z punktem (c) jest przePL 215 125 B1 znaczony do wprowadzenia tego kwasu nukleinowego do komórek zwierzęcia i w ten sposób otrzymywania in vivo ekspresji w komórkach, do których wprowadzono kwas(y) nukleinowy(e). Korzystniej wprowadzony(e) kwas(y) nukleinowy(e) jest/są wybrane spośród nagiego DNA, DNA przygotowanego z naładowanymi lub nienaładowanymi lipidami, DNA przygotowanego w liposomach, DNA włączonego do wektora wirusowego, DNA przygotowanego z ułatwiającym transfekcję białkiem lub polipeptydem, DNA przygotowanego z ukierunkowującym białkiem lub polipeptydem, DNA przygotowanego z wapniowymi środkami strącającymi, DNA sprzężonego z obojętną cząsteczką nośnika, DNA kapsułkowanego w chitynie lub chitozanie i DNA przygotowanego z adiuwantem.
W innej korzystnej postaci wykonania zastosowania według wynalazku preparat farmaceutyczny jest przeznaczony do podawania przynajmniej w jednym, przynajmniej 2, przynajmniej 3, przynajmniej 4, przynajmniej 6 i przynajmniej 12 podaniach/wprowadzeniach na rok.
Ponadto preparat farmaceutyczny zgodny z zastosowaniem według wynalazku jest korzystnie przeznaczony do obniżenia poziomu APP lub Αβ w takim stopniu, aby całkowita ilość amyloidu była obniżona lub aby szybkość tworzenia amyloidu była obniżona w stopniu klinicznie istotnym.
Przedmiotem wynalazku jest również poliaminokwas lub koniugat pochodzący ze zwierzęcego APP lub Αβ, jak określono powyżej, do którego wprowadzono modyfikację, w wyniku której immunizacja zwierzęcia poliaminokwasem lub koniugatem indukuje wytwarzanie przeciwciał przeciwko autologicznym APP lub Αβ zwierzęcia.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest immunogenna kompozycja zawierająca immunogennie skuteczną ilość poliaminokwasu lub koniugatu według wynalazku oraz ponadto farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalny nośnik i/lub zaróbkę oraz ewentualnie adiuwant.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest fragment kwasu nukleinowego, który koduje poliaminokwas lub koniugat według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto wektor niosący fragment kwasu nukleinowego według wynalazku, przy czym wektor ten jest zdolny do autonomicznej replikacji. Korzystnie wektor według wynalazku jest wybrany z grupy składającej się plazmidu, faga, kosmidu, mini-chromosomu i wirusa.
Zatem, rozwiązania według wynalazku dostarczają środków do obniżania in vivo poziomu białka prekursorowego amyloidu (APP) lub amyloidu beta (Αβ) u zwierzęcia, łącznie z człowiekiem, obejmującego przeprowadzenie prezentacji układowi odpornościowemu zwierzęcia immunogennie skutecznej ilości przynajmniej jednego analogu APP lub Αβ, który ma włączony do tej samej cząsteczki przynajmniej jeden epitop limfocytów B APP i/lub Αβ i przynajmniej jeden obcy epitop pomocniczych limfocytów T (epitop TH) tak, że immunizacja zwierzęcia analogiem wywołuje wytwarzanie przeciwciał przeciwko autologicznym APP lub Αβ zwierzęcia.
Obecny uprawiony wcześniej zgłosił międzynarodowe zgłoszenia patentowe dotyczące bezpiecznych strategii szczepienia przeciwko amyloidogennym polipeptydom, takim jak APP i Αβ, patrz WO 01/62284. Zgłoszenie to nie zostało opublikowane do dnia zgłoszenia obecnego zgłoszenia patentowego, a ponadto nie zawiera szczegółów dotyczących powyżej wymienionych użytecznych analogów APP i Αβ.
Legenda do figur
Fig. 1: Schematyczne przedstawienie wariantów Autovac pochodzących z prekursorowego białka amyloidu w celu wytworzenia odpowiedzi przeciwciał przeciwko białku Αβ Αβ-43 (lub C-100). Przedstawiono APP schematycznie na górze figury i pozostałe schematyczne konstrukty wykazały, że modelowe epitopy P2 i P30 są podstawione lub wprowadzono różne skrócenia APP. Na figurze, czarny wzór wskazuje na sekwencję sygnałową APP, podwójne zakreskowanie krzyżowe odpowiada zewnątrzkomórkowej części APP, ciemne zakreskowanie pionowe określa transbłonową domenę APP, jasne pionowe zakreskowanie określa międzykomórkową domenę APP, grube podwójne zakreskowanie krzyżowe wskazuje epitop P30 i drobne krzyżowe zakreskowanie wskazuje epitop P2. Prostokąt obwiedziony pełną linią wskazuje Αβ-42/43 i prostokąt obwiedziony linią nieprzerywaną i linią kropkową razem wskazują C-100. „Abeta oznacza Αβ.
Fig. 2: Schematyczne przedstawienie rozwiązania syntezy ogólnie stosowanych immunogennych koniugatów. Peptyd A (o dowolnej antygenowej sekwencji, np. sekwencja Αβ opisana tutaj) i peptyd B (aminokwasowa sekwencja obejmująca obcy epitop pomocniczych limfocytów T) zsyntetyzowano i zmieszano. Następnie kontaktowano je z odpowiednim aktywowanym polihydroksypolimerem, peptydy A i B przyłączono poprzez aktywację grup w częściach odpowiadających wstępnym stosunkom pomiędzy tymi dwoma substancjami w peptydowej mieszaninie. Patrz Przykład 4 opisujący to szczegółowo.
PL 215 125 B1
Szczegółowe ujawnienie wynalazku
Definicje
Poniżej pewna liczba terminów zastosowanych w obecnym opisie i zastrzeżeniach zostanie zdefiniowana i wyjaśniona szczegółowo, w celu szczegółowego wyjaśnienia granic i zakresu wynalazku.
Terminy „amyloid i „białko amyloidu, które są zastosowane wymiennie tutaj oznaczają klasę białkowych nierozgałęzionych włókienek nieokreślonej długości. Amyloidowe włókienka charakteryzują się tym, że ulegają barwieniu czerwienią Kongo i mają wspólną strukturę krzyżową-β, w której łańcuch polipeptydowy jest zorganizowany w β-kartkę. Amyloid ogólnie pochodzi z amyloidogennych białek, które mają bardzo różne prekursorowe struktury, lecz które mogą wszystkie przechodzić przekształcenie strukturalne do nieprawidłowo złożonej postaci, która jest elementem budującym protofilamentu - helisy β-kartki. Zazwyczaj, średnica włókienka amyloidu waha się od około 70 do około 120 A.
Termin „amyloidogenne białko ma oznaczać polipeptyd, który bierze udział w tworzeniu amyloidowych złogów, zarówno poprzez stanowienie części złogów jako taki lub poprzez uczestniczenie w ścieżce biosyntezy prowadzącej do utworzenia złogów. Zatem, przykłady amyloidogennych białek obejmują APP i Αβ, lecz również białka biorące udział w metabolizmie tych, być może, amyloidogennych białek.
„Polipeptyd amyloidu ma tutaj oznaczać polipeptyd zawierający aminokwasową sekwencję powyżej omówionych amyloidogennych białek pochodzących od ludzi lub innych ssaków (lub obcięte fragmenty mające wspólną zasadniczą ilość limfocytów B z nienaruszonym amyloidogennym białkiem) - amyloidogenny polipeptyd może zatem, np. zawierać zasadnicze części prekursora amyloidogennego polipeptydu (w przypadku Αβ, możliwy polipeptyd amyloidu może pochodzić z APP). Również nieglikozylowane postacie amyloidogennego polipeptydu, które wytworzono w prokariotycznym układzie są objęte w obrębie zakresu terminu, tak jak postacie mające różne schematy glikozylacji ze względu na zastosowanie, np. drożdży lub innych niessaczych eukariotycznych układów ekspresji. Należy, jednakże, zauważyć, że gdy stosując termin „amyloidogenny polipeptyd zamierzonym jest, aby polipeptyd rozpatrywany był normalnie nieimmunogenny, gdy przedstawiony zwierzęciu, które ma być leczone. Innymi słowy, amyloidogenny polipeptyd jest własnym białkiem lub jest analogiem takiego własnego białka, które nie będzie normalnie wywoływać odpowiedzi odpornościowej przeciwko amyloidogennym białkom rozpatrywanego zwierzęcia.
„Analog oznacza cząsteczkę pochodzącą z APP lub Αβ, która ma włączoną jedną lub kilka zmian w jej strukturze molekularnej. Taka zmiana może, np., być w postaci fuzyjnych poliaminokwasów APP lub Αβ z odpowiednim fuzyjnym partnerem (to jest zmiana pierwszorzędowej struktury wyłącznie obejmująca C- i/lub N-końcowe addycje reszt aminokwasowych) i/lub może być w postaci insercji i/lub delecji i/lub podstawień w polipeptydowej sekwencji aminokwasowej. Również objęte terminem są pochodne cząsteczki pochodzące z APP lub Αβ, patrz omówienia poniżej dotyczące modyfikacji APP lub Αβ. W pewnych przypadkach analog może być tak skonstruowany, aby był mniej zdolny lub nawet niezdolny do wywoływania przeciwciał przeciwko normalnemu prekursorowemu białku(om) amyloidu, przez co unika się niepożądanego oddziaływania z (fizjologicznie normalną) niezagregowaną formą polipeptydu będącą prekursorowym białkiem amyloidu.
Należy zauważyć, że zastosowanie jako szczepionki u człowieka kseno-analogu (np. psi lub świński analog) ludzkiego APP lub Αβ można sobie wyobrazić, że doprowadzi do pożądanej odporności przeciwko APP lub Αβ. Takie zastosowanie kseno-analogu do immunizacji jest również rozważane.
Termin „polipeptyd w obecnym kontekście ma oznaczać zarówno krótkie peptydy od 2 do 10 reszt aminokwasowych, oligopeptydy od 11 do 100 reszt aminokwasowych i polipeptyd o więcej niż 100 resztach aminokwasowych. Ponadto, termin również ma obejmować białka, to jest funkcjonalne cząsteczki biologiczne zawierające przynajmniej jeden polipeptyd; gdy zawierają przynajmniej dwa polipeptydy, mogą one tworzyć kompleksy, być kowalencyjnie połączone, lub mogą być niekowalencyjnie połączone. Polipeptyd(y) w białku może być glikozylowany i/lub lipidowany i/lub zawierać prostetyczne grupy. Również, termin „poliaminokwas jest równoważny z terminem „polipeptyd.
Terminy „limfocyt T i „komórka T zostanie użyty wymiennie dla limfocytów pochodzących z grasicy, które są odpowiedzialne za różne zachodzące za pośrednictwem komórek odpowiedzi odpornościowe, jak również za aktywność pomocniczą w humoralnej odpowiedzi odpornościowej. Podobnie, terminy „limfocyt B i „komórka B zostanie użyty wymiennie dla limfocytów wytwarzających przeciwciała.
PL 215 125 B1
Termin „podsekwencja oznacza dowolny, ciągły obszar o przynajmniej 3 aminokwasach lub, jeśli ma to zastosowanie, o przynajmniej 3 nukleotydach, pochodzących bezpośrednio z odpowiednio naturalnie występującej aminokwasowej sekwencji amyloidu lub sekwencji kwasu nukleinowego.
Termin „zwierzę w obecnym kontekście ogólnie ma oznaczać gatunek zwierzęcia (korzystnie ssaka), takiego jak Homo sapiens, Canis domesticus, itp., a nie tylko jedno pojedyncze zwierzę. Jednakże, termin również oznacza populację takich zwierzęcych gatunków, gdyż jest ważne, aby immunizowane osobniki wszystkie wykazywały zasadniczo takie same APP lub Αβ, pozwalając na immunizację zwierząt tym samym immunogenem(immunogenami). Będzie jasne dla specjalisty w dziedzinie, że zwierzę w obecnym kontekście oznacza żywe stworzenie, które ma układ odpornościowy. Korzystnie zwierzę jest kręgowcem, takim jak ssak.
Termin „obniżanie in vivo poziomu APP lub Αβ jest tutaj rozumiany jako obniżenie w żywym organizmie całkowitej ilości białka amyloidu w złogach (lub amyloidu jako takiego) odpowiedniego typu. Obniżanie poziomu (regulacja w dół) może być otrzymana za pośrednictwem kilku mechanizmów: z czego najprostszy polega oddziaływaniu z amyloidem przez wiązanie przeciwciałami, tak aby zapobiegać nieprawidłowej agregacji. Jednakże, wiązanie przeciwciał może również prowadzić do usunięcia amyloidu przez komórki żerne (takie jak makrofagi i inne fagocytowe komórki) oraz przeciwciała mogą oddziaływać z innymi amyloidogennymi polipeptydami pośredniczącymi w tworzeniu amyloidu. Dalsza możliwość jest taka, że przeciwciała wiążą się z Αβ poza CNS (ośrodkowym układem nerwowym), przez co Aβ jest skutecznie usuwany z CNS poprzez prostą zasadę działania mas.
Wyrażanie „prowadzenie prezentacji ... w układzie odpornościowym ma oznaczać, że układ odpornościowy zwierzęcia jest poddany immunogennej prowokacji w kontrolowany sposób. Jak będzie zrozumiałe z ujawnienia poniżej, taka prowokacja układu odpornościowego może być uzyskiwana na wiele sposobów, z których najważniejsze to szczepienie polipeptydem zawartym w „farmaszczepionkach (ang. pharmaccines) (to jest szczepionkach, które są podawane do leczenia lub łagodzenia trwającej choroby) lub szczepienie „farmaszczepionką z kwasem nukleinowym. Ważnym wynikiem, który ma być osiągnięty, jest to, że kompetentne komórki odpornościowe u zwierzęcia są konfrontowane z antygenem w immunologicznie skuteczny sposób, podczas gdy precyzyjny sposób uzyskiwania tego wyniku ma mniejsze znaczenie w wynalazczej idei stanowiącej podstawę obecnego wynalazku.
Termin „immunogennie skuteczna ilość ma swoje typowe w dziedzinie znaczenie, tj. jest to ilość immunogenu, który jest zdolny do indukowania odpowiedzi odpornościowej, która znacząco angażuje patogenne czynniki mające wspólne z immunogenem właściwości immunologiczne.
Stosując wyrażenie, że APP lub Αβ został „zmodyfikowany tutaj rozumiane jest to jako chemiczna modyfikacja polipeptydu przeprowadzona w APP lub Αβ. Taką modyfikacją może, np., być utworzenie pochodnej (np. alkilacja) pewnych reszt aminokwasowych w sekwencji, lecz jak będzie można docenić z ujawnienia poniżej, korzystne modyfikacje zawierają zmiany pierwszorzędowej struktury sekwencji aminokwasowej.
Omawiając „autotolerancję wobec APP lub Αβ zrozumiałe jest, że ponieważ polipeptyd jest białkiem własnym w populacji, która ma być szczepiona, normalne osobniki w populacji nie zwiększają odpowiedzi odpornościowej przeciwko polipeptydowi; nie można wykluczyć, jednakże, że sporadyczne przypadki osobników w populacji zwierząt mogą być w stanie uzyskać przeciwciała przeciwko natywnemu polipeptydowi, np. jako część zaburzeń autoimmunizacyjnych. W każdym razie, zwierzę będzie prawidłowo jedynie autotolerancyjne względem własnego APP lub Αβ, lecz nie można wykluczyć, że analogi pochodzące z innych gatunków zwierząt lub z populacji mających różne fenotypy mogą również być tolerowane przez to zwierzę.
„Obcy epitop limfocytu T (lub „obcy epitop komórki T) oznacza peptyd, który jest w stanie wiązać się z cząsteczką MHC i który stymuluje limfocyty T u gatunków zwierząt. Korzystnie obce epitopy limfocytów T według wynalazku są „wspólnymi (ang. promiscuous) epitopami, to jest epitopami, które wiążą się z zasadniczą frakcją szczególnej klasy cząsteczek MHC u gatunków lub populacji zwierząt. Jedynie bardzo ograniczona liczba takich wspólnych epitopów limfocytów T jest znana i zostaną one omówione szczegółowo poniżej. Wspólne epitopy limfocytów T są również oznaczone jako „powszechne (ang. universal) epitopy limfocytów T. Należy zauważyć, że aby immunogeny, które są stosowane w rozwiązaniach według wynalazku były skuteczne w tak dużym ułamku populacji zwierząt jak to możliwe, może być konieczne aby 1) wprowadzić kilka obcych epitopów limfocytów T w tym samym analogu lub 2) przygotować kilka analogów, gdzie każdy analog ma wprowadzony różny wspólny epitop. Należy zauważyć również, że idea obcych epitopów limfocytów T obejmuje ponadto zastosowanie ukrytych epitopów limfocytów T, to jest epitopów, które pochodzą z własnego białka
PL 215 125 B1 i które jedynie wykazuje immunogenne zachowanie, gdy występuje w wyodrębnionej postaci, nie będącej częścią rozpatrywanego własnego białka.
„Obcy epitop pomocniczego limfocytu T (obcy epitop TH) oznacza obcy epitop limfocytu T, który wiąże się z cząsteczką MHC z Klasy II i może być prezentowany na powierzchni komórki prezentującej antygen (APC) związanej z cząsteczką MHC klasy II.
„Część funkcjonalna (bio)cząsteczki w obecnym kontekście ma oznaczać część cząsteczki, która jest odpowiedzialna za przynajmniej jedno z biochemicznych lub fizjologicznych działań wywoływanych przez cząsteczkę. Doskonale wiadomo w dziedzinie, że wiele enzymów i innych cząsteczek efektorowych ma aktywne miejsce, które jest odpowiedzialne za działania wywoływane przez tę cząsteczkę. Inne części cząsteczki mogą służyć do zwiększania stabilizacji lub rozpuszczania, i dlatego mogą być nieuwzględnione, jeśli te cele nie odnoszą się do kontekstu pewnych rozwiązań wynalazku. Na przykład, jest możliwe zastosowanie pewnych cytokin jako reszt modyfikujących w APP lub Αβ (patrz szczegółowe omówienie poniżej) i w takim przypadku, problem stabilności może nie mieć zastosowania, gdyż sprzęganie z APP lub Αβ może zapewnić konieczną stabilność.
Termin „adiuwant ma swoje zwykłe znaczenie w dziedzinie szczepionek, i oznacza substancję lub kompozycję, która 1) sama nie jest zdolna do zwiększania specyficznej odpowiedzi odpornościowej przeciwko immunogennej szczepionce, lecz która 2) w każdym razie jest zdolna do wzmacniania odpowiedzi odpornościowej przeciwko immunogenowi. Bądź, innymi słowy, szczepienie samym adiuwantem nie zapewnia odpowiedzi odpornościowej przeciwko immunogenowi, szczepienie immunogenem może lub nie zapoczątkować odpowiedzi odpornościowej przeciwko immunogenowi, lecz połączone szczepienie immunogenem i adiuwantem indukuje odpowiedź odpornościową przeciwko immunogenowi, która jest silniejsza niż ta indukowana przez sam immunogen.
„Ukierunkowanie (ang. targeting) cząsteczki w obecnym kontekście ma oznaczać sytuację, w której cząsteczka w wyniku wprowadzenia do zwierzęcia będzie pojawiać się preferencyjnie w pewnej tkance(kach) lub będzie szczególnie związana z pewnymi komórkami lub typami komórek. Działanie może być uzyskane rożnymi sposobami obejmującymi preparat cząsteczki w kompozycji ułatwiającej ukierunkowanie, lub przez wprowadzenie do cząsteczki grupy, która ułatwia ukierunkowanie. Te problemy omówiono szczegółowo poniżej.
„Stymulacja układu odpornościowego oznacza, że substancja lub kompozycja według wynalazku wykazuje ogólne, niespecyficzne immunostymulatorowe działanie. Wiele adiuwantów i domniemanych adiuwantów (takich jak pewne cytokiny) ma wspólną zdolność do stymulacji układu odpornościowego. Wynikiem stosowania czynnika immunostymulacyjnego jest zwiększenie „czujności układu odpornościowego oznaczające, że równoczesna lub kolejna immunizacja immunogenem indukuje znacząco bardziej skuteczną odpowiedź odpornościową w porównaniu do osobnego zastosowania immunogenu.
„Produktywne wiązanie oznacza wiązanie peptydu z cząsteczką MHC (Klasy I lub II) tak, aby stymulować limfocyty T, które angażują komórkę, która prezentuje peptyd związany z cząsteczką MHC. Na przykład, peptyd związany z cząsteczką MHC klasy II na powierzchni APC jest uważany za produktywnie związany, jeśli ta APC będzie stymulować limfocyt TH, który wiąże się z prezentowanym kompleksem peptyd-MHC klasy II.
Obniżanie poziomu amyloidu
Korzystnie analog zastosowany jako immunogen w sposobie tu opisanym jest zmodyfikowaną cząsteczką APP lub Αβ, o przynajmniej jednej zmianie obecnej w sekwencji aminokwasowej APP lub Αβ, ponieważ w ten sposób szanse istotnego przełamania autotolerancji są znacząco zwiększone jest to, na przykład, widoczne na podstawie wyników przedstawionych w przykładzie 2 w niniejszym opisie, w którym immunizacja cząsteczkami typu dzikiego Αβ jest porównana z immunizacją wariantem cząsteczki Αβ. Wykazano (w pracy Dalum I i wsp., 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804), że potencjalnie autoreaktywne limfocyty B, rozpoznające własne białka są fizjologicznie obecne u normalnych osobników. Jednakże, w celu indukowania tych limfocytów B, w celu rzeczywistego uzyskania przeciwciał reaktywnych z istotnymi własnymi białkami, konieczna jest pomoc od wytwarzających cytokiny pomocniczych limfocytów T (komórki TH lub limfocyty TH). Normalnie pomoc ta nie jest dostarczona, ponieważ limfocyty T ogólnie nie rozpoznają epitopów limfocytów T pochodzących z własnego białka, gdy są prezentowane przez komórki prezentujące antygen (APC). Jednakże, przez dostarczenie elementu „obcości we własnym białku (to jest przez wprowadzenie immunologicznie znaczącej modyfikacji), limfocyty T rozpoznające obcy element są aktywowane w wyniku rozpoznawania obcego epitopu na APC (takiego jak, początkowa jednojądrowa komórka). Poliklonalne limfocyty B (które są rówPL 215 125 B1 nież APC) zdolne do rozpoznawania własnych epitopów na zmodyfikowanym własnym białku również internalizują antygen, a następnie prezentują obcy(e) epitop(y) Iimfocytu(ów) T i aktywowane limfocyty T następnie dostarczają pomoc cytokin tym autoreaktywnym poliklonalnym limfocytom B. Ponieważ przeciwciała uzyskiwane przez te poliklonalne limfocyty B są reaktywne z różnymi epitopami w zmodyfikowanym polipeptydzie, obejmującym te, które są również obecne w natywnym polipeptydzie, indukowane jest przeciwciało reagujące krzyżowo z niezmodyfikowanym własnym białkiem. Podsumowując, limfocyty T mogą być wprowadzone, aby działały jak gdyby populacja poliklonalnych limfocytów B rozpoznała cały obcy antygen, podczas gdy rzeczywiście jedynie wprowadzony epitop jest obcy dla gospodarza. W ten sposób indukowano przeciwciała zdolne do reakcji krzyżowych z niezmodyfikowanymi własnymi antygenami.
Kilka sposobów modyfikowania peptydu własnego antygenu w celu przełamania autotolerancji jest znanych w dziedzinie. W każdym razie korzystne jest, aby obecny analog według wynalazku obejmował:
- wprowadzoną przynajmniej jedną pierwszą resztę cząsteczki, która wpływa na skierowanie zmodyfikowanej cząsteczki do komórek prezentujących antygen (APC), i/lub
- wprowadzoną przynajmniej jedną drugą resztę cząsteczki, która stymuluje układ odpornościowy, i/lub
- wprowadzoną przynajmniej jedną trzecią resztę cząsteczki, która optymalizuje prezentację analogu w układzie odpornościowym.
Jednakże, wszystkie te modyfikacje powinny być przeprowadzone, z utrzymaniem zasadniczej części miejsca pochodzenia epitopów limfocytów B w APP lub Αβ, gdyż rozpoznawanie limfocytu B natywnej cząsteczki jest w ten sposób zwiększone.
W jednym korzystnym rozwiązaniu, grupy boczne (w postaci obcych epitopów limfocytów T lub powyżej wymienionych reszt pierwszej, drugiej i trzeciej) są kowalencyjnie lub niekowalencyjnie wprowadzone. Oznacza to, że obszary reszt aminokwasowych pochodzące APP lub Αβ są przekształcane w pochodne bez zmiany pierwszorzędowej aminokwasowej sekwencji, lub przynajmniej bez wprowadzenia zmiany wiązań peptydowych pomiędzy poszczególnymi aminokwasami w łańcuchu.
Alternatywne i korzystne rozwiązanie wykorzystuje aminokwasowe podstawienie i/lub delecję i/lub insercję i/lub addycję (które może być uzyskiwane środkami do rekombinacji lub za pośrednictwem syntezy peptydu; modyfikacje, które obejmują dłuższe obszary aminokwasów mogą dawać początek fuzyjnemu polipeptydowi). Jedną zwłaszcza korzystną wersję tej postaci wykonania stanowi technika opisana w opisie WO 95/05849, który ujawnia sposób obniżania poziomu (regulacji w dół) własnego białka przez immunizację analogami własnego białka, przy czym pewna liczba aminokwasowych sekwencji została podstawiona odpowiadającą liczbą aminokwasowych sekwencji, z których każda zawiera obcy immunodominujący epitop limfocytu T, podczas gdy w tym samym czasie zachowując ogólną trzeciorzędową strukturę własnego białka w analogu. Zgodnie z celem obecnego wynalazku, jednakże jest wystarczające jeśli modyfikacja (będąca insercją, addycją, delecją lub podstawieniem) daje początek obcemu epitopowi limfocytu T i w tym samym czasie zachowuje zasadniczą liczbę epitopów limfocytów B w APP lub Αβ. Jednakże, w celu otrzymania maksimum skuteczności indukowanej odpowiedzi odpornościowej, korzystne jest utrzymanie ogólnej trzeciorzędowej struktury APP lub Αβ w zmodyfikowanej cząsteczce.
W pewnych przypadkach, korzystnie, APP lub Αβ lub ich fragmenty są zmutowane. Szczególnie korzystne są podstawione warianty, w których metionina w pozycji 35 w Αβ-43 została podstawiona, korzystnie leucyną lub izoleucyną, lub po prostu ją usunięto. Szczególnie korzystne analogi zawierają jedną pojedynczą metioninę, która jest zlokalizowana na C-końcu, zarówno ponieważ występuje ona naturalnie w amyloidogennym polipeptydzie lub obcym epitopie TH, jak i ponieważ została ona wprowadzona lub dodana. Zatem, również korzystne jest aby część analogu, która obejmuje obcy epitop TH była wolna od metioniny, z wyjątkiem możliwej C-końcowej lokalizacji metioniny.
Główną przyczyną usuwania wszystkiego oprócz jednej metioniny jest to, że staje się możliwe rekombinacyjne przygotowanie wielomerowych analogów, które mogą być następnie cięte bromocyjanem pozostawiając pojedyncze analogi. Korzyść polega na tym, że w ten sposób rekombinacyjna produkcja staje się łatwiejsza.
Rzeczywiście, jest to ogólnie korzystne, że wszystkie analogi APP lub Αβ, które zastosowano według wynalazku mają wspólną charakterystykę zaledwie obejmującą jedną pojedynczą metioninę, która jest umiejscowiona jako C-końcowy aminokwas w analogu i że inne metioniny zarówno w amyloidogennym polipeptydzie lub obcym epitopie TH usunięto lub podstawiono przez inny aminokwas.
PL 215 125 B1
Jedna również interesująca mutacja stanowi delecję lub podstawienie fenyloalaniny w pozycji 19 w Αβ-43 i jest szczególnie korzystne to, że mutacja stanowi podstawienie tej reszty fenyloalaniny proliną.
Inne interesujące poliaminokwasy, które mogą być użyte w analogach obejmują skrócone części białka Αβ-43. Mogą one również być zastosowane w immunogennych analogach według wynalazku. Szczególnie korzystne są skrócenia Αβ(1-42), Αβ(1-40), Αβ(1-39), Αβ(1-35), Αβ(1-34), Αβ(1-34), Αβ(1-28), Αβ(1-12), Αβ(1-5), Αβ(13-28), Αβ(13-35), Αβ(17-28), Αβ(25-35), Αβ(35-40), Αβ(36-42) i Αβ(35-42) (gdzie liczby w nawiasach wskazują aminokwasowe obszary Αβ-43, które stanowią istotny fragment - Αβ(35-40) to jest np. identyczne z aminokwasami 706-711 z SEK NR ID: 2). Wszystkie te warianty o skróconych częściach Αβ-43 mogą być uzyskane z fragmentów Αβ opisanych w niniejszym opisie, w szczególności z wariantów 9, 10, 11, 12 i 13 wymienionych w przykładzie 1.
Poniższy wzór opisuje molekularne konstrukty ogólnie objęte wynalazkiem:
(MODi)si(amyloidei)ni(MOD2)s2(amyloide2)n2 (MODx)sx(amyloidex)nx (I) - gdzie amyloidei-amyloidex oznacza x podsekwencji zawierających epitopy limfocytów B APP lub Αβ, które niezależnie są identyczne lub nieidentyczne i które mogą zawierać lub nie zawierać obce grupy boczne, x oznacza liczbę całkowitą > 3, n1-nx oznacza x liczb całkowitych > 0 (przynajmniej jedna jest > 1), MOD1-MODx oznacza x modyfikacji wprowadzonych pomiędzy zachowane epitopy limfocytów B i s1-sx oznaczają x liczb całkowitych > 0 (przynajmniej jedna jest > 1 jeśli nie ma grup bocznych wprowadzonych do sekwencji amyloidex). Zatem znając ogólne funkcjonalne ograniczenia immunogenności konstruktów, wynalazek umożliwia wszystkie rodzaje permutacji wyjściowej sekwencji APP lub Αβ i wszystkie ich rodzaje modyfikacji. Zatem, objęte wynalazkiem są zmodyfikowane APP lub Αβ otrzymane przez ominięcie części sekwencji, które np. wykazują szkodliwe działania uboczne in vivo lub ominięcie części które są normalnie pozakomórkowe i w ten sposób mogłyby dać początek niepożądanym immunologicznym reakcjom.
W korzystnej wersji konstruktów zarysowanych powyżej, jeśli jest ona odpowiednia do zastosowania, stanowi te w których podsekwencja zawierająca epitop limfocytów B białka amyloidu nie jest eksponowana zewnątrzkomórkowo w prekursorowym polipeptydzie, z którego pochodzi amyloid. Przez wytworzenie takiego wyboru epitopów, zapewnia się, że nie są wytworzone takie przeciwciała, które mogłyby być reaktywne z komórkami wytwarzającymi prekursory i przez to odpowiedź odpornościowa, która jest wytworzona staje się ograniczona do odpowiedzi odpornościowej przeciwko niepożądanym złogom amyloidowym. W tym przypadku będzie to np. osiągalne, aby indukować odporność przeciwko epitopom APP lub Αβ, które są tylko eksponowane do fazy zewnątrzkomórkowej, gdy są wolne od wszelkiego sprzężenia z komórkami z których są one uzyskane.
Utrzymanie zasadniczej frakcji epitopów limfocytów B lub nawet ogólnej trzeciorzędowej struktury białka, które jest poddane modyfikacji, jak tutaj opisano, może być uzyskane kilkoma sposobami. Jeden sposób polega po prostu na wytwarzaniu poliklonalnej surowicy odpornościowej skierowanej przeciwko rozpatrywanemu polipeptydowi (np. surowicy odpornościowej wytworzonej u królika), a następnie zastosowanie tej surowicy odpornościowej jako badanego odczynnika (np. w kompetycyjnym teście ELISA) przeciwko zmodyfikowanym białkom, które uzyskano. Zmodyfikowane wersje (analogi) które reagują w tym samym zakresie z surowicą odpornościową jak APP lub Αβ muszą być rozpatrywane jako te o takiej samej ogólnej trzeciorzędowej strukturze, jak APP lub Αβ, podczas gdy analogi wykazujące ograniczoną (lecz nadal znaczącą i specyficzną) reaktywność z taką surowicą odpornościową są rozpatrywane jako mające utrzymaną zasadniczą część wyjściowych epitopów limfocytów B.
W innym rozwiązaniu, wybór monoklonainych przeciwciał reaktywnych z odrębnymi epitopami na APP lub Αβ może być wytworzony i zastosowany jako panel testowy. To podejście ma tę zaletę, że umożliwia 1) mapowanie epitopu APP lub Αβ i 2) mapowanie epitopów, które są utrzymane w wytworzonych analogach.
Oczywiście, trzecie podejście może polegać na wyjaśnieniu 3-wymiarowej struktury APP lub Αβ lub biologicznie aktywnych ich skróconych form (patrz powyżej) i porównanie z opracowaną trójwymiarową strukturą wytworzonych analogów. Trójwymiarowa struktura może być zbadana za pomocą badania dyfrakcji promieniowania X i spektroskopii NMR. Dalsze informacje dotyczące trzeciorzędowej struktury mogą do pewnego stopnia być otrzymane z badań dychroizmem kołowym, które mają tę korzyść, że wymagają niewielkich ilości polipeptydu w czystej postaci (podczas gdy dyfrakcja promieniowania X wymaga dostarczenia wykrystalizowanego polipeptydu, a NMR wymaga dostarczenia izotopowych wariantów polipeptydu) w celu dostarczenia użytecznych informacji dotyczących trzecioPL 215 125 B1 rzędowej struktury danej cząsteczki. Jednakże, ostatecznie dyfrakcja promieniowania X i/lub NMR są konieczne, aby otrzymać końcowe dane, gdyż dychroizm kołowy może jedynie dostarczyć pośredni dowód właściwej 3-wymiarowej struktury poprzez informacje o drugorzędowych elementach strukturalnych.
Jedno korzystne rozwiązanie wykorzystuje wielokrotne prezentacje epitopów limfocytu B APP lub Αβ (to jest wzór I, gdzie przynajmniej jeden epitop limfocytów B jest obecny w dwóch pozycjach). Działanie to może być uzyskane różnymi sposobami, np. po prostu przez wytwarzanie fuzyjnego polipeptydu zawierającego struktury (polipeptyd pochodzący z APP lub Αβ)π, gdzie m oznacza liczbę całkowitą > 2, a następnie wprowadzenie modyfikacji opisanych tutaj do przynajmniej jednej z sekwencji APP lub Αβ. Korzystnie wprowadzone modyfikacje obejmowały przynajmniej jedno podwojenie epitopu limfocytu B i/lub wprowadzenie haptenu. Te rozwiązania obejmujące wielokrotne prezentacje wybranych epitopów są szczególnie korzystne w sytuacjach, gdy zaledwie mniejsze części APP lub Αβ są użyteczne jako składniki w środku szczepionki.
Jak wskazano powyżej, wprowadzenie obcego epitopu limfocytu T może być osiągnięte przez wprowadzenie przynajmniej jednej aminokwasowej insercji, dodania, delecji, lub podstawienia. Oczywiście, normalną sytuacją będzie wprowadzenie więcej niż jednej zmiany w aminokwasowej sekwencji (np. insercji lub podstawienia przez pełen epitop limfocytu T), lecz ważnym celem do osiągnięcia jest to, aby analog, jeśli poddany obróbce przez komórkę prezentującą antygen (APC), dał początek takiemu obcemu immunodominującemu epitopowi limfocytu T, który jest przedstawiony w kontekście cząsteczki MCH Klasy II na powierzchni APC. Zatem, jeśli aminokwasowa sekwencja APP lub Αβ w odpowiednich pozycjach zawiera pewną liczbę reszt aminokwasowych, które mogą również być znalezione w obcym epitopie TH, to wprowadzenie obcego epitopu TH może być osiągnięte przez dostarczenie pozostałych aminokwasów obcego epitopu za pośrednictwem aminokwasowej insercji, dodania, delecji i podstawienia. Innymi słowy, nie jest konieczne wprowadzenie pełnego epitopu TH przez insercję lub podstawienie w celu spełnienia przeznaczenia obecnego wynalazku.
Korzystnie jest, aby liczba aminokwasowych insercji, delecji, podstawień lub addycji wynosiła przynajmniej 2, czyli 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 i 25 insercji, podstawień, addycji lub delecji. Jest ponadto korzystne, aby liczba aminokwasowych insercji, podstawień, addycji lub delecji nie przekraczała 150, czyli co najwyżej 100, co najwyżej 90, co najwyżej 80 i co najwyżej 70. Jest szczególnie korzystne, aby liczba podstawień, insercji, delecji, lub addycji nie przekraczała 60 i w szczególności liczba nie powinna przekraczać 50 lub nawet 40. Najkorzystniejsza jest liczba nie większa niż 30. W odniesieniu do aminokwasowych addycji, należy zauważyć że ta modyfikacja, gdy otrzymany konstrukt jest w postaci fuzyjnego polipeptydu, jest często znacząco wyższa niż 150.
Korzystne rozwiązania według wynalazku obejmują modyfikację przez wprowadzenie przynajmniej jednego obcego immunodominującego epitopu limfocytu T. Będzie zrozumiałe, że kwestia immunodominacji epitopu limfocytu T zależy od gatunku rozpatrywanego zwierzęcia. Jak stosowano w niniejszym opisie, termin „immunodominacja po prostu odnosi się do epitopów, które u szczepionych osobników/populacji dają początek znaczącej odpowiedzi odpornościowej, ale jest dobrze znany fakt, że jednego osobnika/populacji niekoniecznie jest immunodominujący u innego osobnika tego samego gatunku, nawet pomimo tego, że może być zdolny do wiązania cząsteczek MHC-II u tego ostatniego osobnika. Zatem, zgodnie z celem obecnego wynalazku, immunodominanta epitopu limfocytu T jest epitopem limfocytu T, który będzie skuteczny w dostarczaniu pomocniczych limfocytów T, gdy jest obecna w antygenie. Typowo, immunodominanta epitopów limfocytów T ma wrodzoną cechę, że będą one zasadniczo zawsze przedstawione i związane z cząsteczką MHC Klasy II, niezależnie od polipeptydu, gdzie one występują.
Drugi ważny punkt stanowi problem ograniczenia epitopów limfocytów T wobec MHC. Ogólnie, naturalnie występujące epitopy limfocytów T są ograniczone MHC, to jest pewne peptydy tworzące epitop limfocytu T będą jedynie wiązały się skutecznie do podzbioru cząsteczek MHC klasy II. To z kolei ma działanie, takie że w większości przypadków zastosowanie jednego specyficznego epitopu limfocytu T będzie prowadzić do składnika szczepionki, który jest jedynie skuteczny w części populacji i w zależności od wielkości tej części, może być konieczne, aby objąć więcej epitopów limfocytów T w tej samej cząsteczce, lub alternatywnie przygotować wieloskładnikową szczepionkę, w której składnikami są warianty APP lub Αβ, które są odróżniane od siebie poprzez charakter wprowadzonego epitopu limfocytu T.
PL 215 125 B1
Jeśli zastosowane ograniczenie MHC limfocytów T jest całkowicie nieznane (na przykład w sytuacji, w której szczepione zwierzę ma słabo zdefiniowany skład MHC), część populacji objęta specyficzną kompozycją szczepionki, może być podana w przybliżeniu za pomocą poniższego wzoru /population 1 -Π'1-'- gdzie pi oznacza częstość w populacji odpowiadającej na ity obcy epitop limfocytu T obecny w kompozycji szczepionki i n oznacza całkowitą liczbę obcych epitopów limfocytów T w kompozycji szczepionki. Zatem, kompozycja szczepionki zawierająca 3 obce epitopy limfocytów T o częstościach odpowiedzi w populacji 0,8, 0,7 i 0,5, odpowiednio, może dawać
- 0,2 x 0,3 x 0,4 = 0,976
- tj. 97,6 procent populacji będzie statystycznie zwiększać odpowiedź na szczepionkę w której pośredniczy MHC-II.
Powyższy wzór nie ma zastosowania w sytuacjach, w których mniej bardziej precyzyjny wzór ograniczenia MHC zastosowanych peptydów jest znany. Jeśli, na przykład dany peptyd jedynie wiąże się z ludzkimi cząsteczkami MHC-II kodowanymi przez allele HLA-DR DR1, DR3, DR5 i DR7, to zastosowanie tego peptydu razem z drugim peptydem, który wiąże się z pozostałymi cząsteczkami MHC-II kodowanymi przez allele HLA-DR będą osiągać 100% pokrycie w rozpatrywanej populacji. Podobnie, jeśli drugi peptyd wiąże się jedynie z DR3 i DR5, dodanie tego peptydu nie będzie zupełnie powodować wzrostu pokrycia. Jeśli ktoś opiera obliczenia odpowiedzi populacji jedynie na ograniczeniu MHC epitopów limfocytów T w szczepionce, minimalna część populacji objęta specyficzną kompozycją szczepionki może być wyznaczona za pomocą poniższego wzoru:
a f population 1 -Π(1- Ψ]Υ j=l (III)
- gdzie φ oznacza sumę częstości w populacji allelowych haplotypów kodujących cząsteczki MHC, które wiążą się z dowolnym z epitopów limfocytów T w szczepionce i które należą do jego z 3 znanych loci HLA (DP, DR i DQ); w praktyce, na początku określa się które cząsteczki MHC będą rozpoznawać każdy epitop limfocytu T w szczepionce, a następnie są one wymieniane jako typ (DP, DR i DQ) - następnie, poszczególne częstości różnych wymienionych allelowych haplotypów są sumowane dla każdego typu, otrzymując φ1, φ2, φ3.
Może okazać się, że wartość p, we wzorze II przekracza odpowiadającą jej teoretyczną wartość η ^ = 1- P[(i - y,·)2 = 1 (IV)
- gdzie Uj oznacza sumę częstości w populacji allelowych haplotypów kodujących cząsteczki MHC, które wiążą ity epitopu limfocytu T w szczepionce i które należą do jtej z 3 znanych loci HLA (DP, DR i DQ). To oznacza, że w I-JT1 populacji oznacza częstość odpowiadających o fresidual_i =(pi - nj). Dlatego, wzór III może być dostosowany tak aby otrzymać wzór V:
n
Π(ι- fresidual-i) i=l /population 1 fj(l <P,)2 + ( 1 (V)
- gdy wyrażenie 1-iresiduai i osiąga wartość ujemną, to jest ustalona na zero. Należy zauważyć, że wzór V wymaga, aby wszystkie epitopy były haplotypowo zmapowane przeciwko identycznym zestawom haplotypów.
Dlatego, przy selekcji epitopów limfocytów T, które mają być wprowadzone do analogu, ważne jest aby obejmowały one całą wiedzę o epitopach, która jest dostępna: 1) częstość odpowiadających w populacji dla każdego epitopu, 2) dane restrykcyjne MHC i 3) częstość w populacji odpowiednich haplotypów.
PL 215 125 B1
Istnieje pewna liczba naturalnie występujących „wspólnych epitopów limfocytów T, które są aktywne w dużym stosunku osobników z gatunków zwierząt lub populacji zwierząt i te są korzystnie wprowadzone do szczepionki, dzięki czemu zmniejsza się potrzebę bardzo dużej ilości różnych analogów w tej samej szczepionce.
Wspólny epitop może według wynalazku być naturalnie występującym ludzkim epitopem limfocytu T takim jak epitopy anatoksyny tężca (np. epitopy P2 i P30), anatoksyny błonicy, hemaglutyniny wirusa grypy (HA) i antygenem P. falciparum CS.
Przez lata zidentyfikowano pewną liczbę innych wspólnych epitopów limfocytów T. Zwłaszcza zidentyfikowano peptydy zdolne do wiązania dużego stosunku cząsteczek HLA-DR kodowanych przez różne allele HLA-DR i wszystkie one są możliwymi epitopami limfocytów T, które będą wprowadzone do analogów zastosowanych według obecnego wynalazku. Patrz również epitopy omówione w poniższych pozycjach literaturowych, które są zatem wszystkie włączone tutaj przez odniesienie: WO 98/23635 (Frazer IH i wsp., należący do The University of Queensland); Southwood S i wsp., 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F i wsp., 1988, Nature 336: 778-780; Chicz RM i wsp., 1993, J. Exp. Med 178: 27-47; Hammer J i wsp., 1993, Cell 74: 197-203; i Falk K i wsp., 1994, Immunogenetics 39: 230-242. Ten ostatni odnośnik również rozpatruje ligandy HLA-DQ i -DP. Wszystkie epitopy wymienione w tych 5 odnośnikach są odpowiednie jako kandydatury naturalnych epitopów, które będą użyte w rozwiązaniach według wynalazku, tak jak epitopy, które mają wspólne motywy z nimi.
W innym rozwiązaniu, epitop może być dowolnym sztucznym epitopem limfocytu T, który jest zdolny do wiązania dużej ilości procentowej cząsteczek MHC klasy II. W odniesieniu do powyższego peptydy epitopu pan DR („PADRE) opisane w opisie WO 95/07707 i w odpowiadającej mu publikacji Alexandera J i wsp., 1994, Immunity 1: 751-761 (oba ujawnienia są włączone tutaj jako odniesienie) stanowią interesujące kandydatury epitopów, które mają być użyte według wynalazku. Należy zauważyć, że najskuteczniejsze peptydy PADRE ujawnione w tych publikacjach niosą D-aminokwasy na Ci N-końcu w celu poprawienia stabilności gdy są podawane. Jednakże, obecny wynalazek przede wszystkim ma na celu włączenie odpowiednich epitopów jako części analogu, który następnie będzie podzielony enzymatycznie wewnątrz przestrzeni lizosomu komórek APC pozwalając następnie na prezentację w odniesieniu do cząsteczki MHC-II i dlatego nie jest dogodne włączenie D-aminokwasów do epitopów zastosowanych w obecnym wynalazku.
Jeden zwłaszcza korzystny peptyd PADRE jest tym, mającym aminokwasową sekwencję AKFVAAWTLKAAA (SEK NR ID: 17) lub jego immunologicznie skuteczną podsekwencję. Ten i inne epitopy mające ten sam brak ograniczenia MHC są korzystnymi epitopami limfocytów T, które powinny być obecne w analogach zastosowanych w sposobie według wynalazku. Takie super-wspólne epitopy pozwolą na najprostsze rozwiązania według wynalazku, gdzie tylko jeden pojedynczy analog jest przedstawiony układowi odpornościowemu szczepionego zwierzęcia.
Jak wymieniono powyżej, modyfikacja APP lub Αβ może również obejmować wprowadzenie pierwszej reszty cząsteczki, która jest ukierunkowana na zmodyfikowany amyloidogenny polipeptyd na APC lub limfocycie B. Na przykład, pierwsza reszta cząsteczki może być specyficznie związanym partnerem antygenu powierzchniowego specyficznego limfocytu B lub na specyficznym antygenie powierzchniowym APC. Wiele takich specyficznych antygenów powierzchniowych jest znanych w dziedzinie. Na przykład, reszta może być węglowodanem dla którego istnieje receptor na limfocycie B lub APC (np. mannan lub mannoza). W innym rozwiązaniu, druga reszta może być haptenem. Również fragment przeciwciała, który specyficznie rozpoznaje cząsteczkę powierzchniową na komórkach APC lub limfocytach może być użyty jako pierwsza reszta cząsteczki (cząsteczka powierzchniowa może np. być receptorem FCy makrofagów i monocytów, takich jak FCyRI lub, w innym rozwiązaniu dowolny inny specyficzny marker powierzchniowy taki jak CD40 lub CTLA-4). Należy zauważyć, że wszystkie te przykładowe ukierunkowane cząsteczki mogą być użyte jako część adiuwantu również patrz poniżej.
Jako alternatywne lub uzupełniające dla ukierunkowanego analogu pewnego typu komórek, w celu uzyskania wzmocnionej odpowiedzi odpornościowej, jest możliwe aby zwiększyć poziom odpowiedzi układu odpornościowego przez włączenie powyżej wymienionej drugiej reszty, która stymuluje układ odpornościowy. Typowe przykłady takich innych reszt obejmują cytokiny i białka szoku cieplnego lub chaperony molekularne, jak również skuteczne ich części.
Odpowiednie cytokiny, które są stosowane według wynalazku, stanowią to te, które normalnie będą również funkcjonować jako adiuwanty w kompozycji szczepionki, to jest na przykład interferon γ
PL 215 125 B1 (IFN-γ), interleukina 1 (IL-1), interleukina 2 (IL-2), interleukina 4 (IL-4), interleukina 6 (IL-6), interleukina 12 (IL-12), interleukina 13 (IL-13), interleukina 15 (IL-15) i czynnik stymulujący kolonię granulocytów-makrofagów (GM-CSF); w innym rozwiązaniu, funkcjonalna część cytokinowej cząsteczki może być odpowiednia jako druga reszta. W odniesieniu do zastosowania takich cytokin jako adiuwantowych substancji patrz: omówienie poniżej.
Według wynalazku, odpowiednie białka szoku cieplnego lub chaperony molekularne zastosowane jako druga reszta mogą obejmować HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (również znany jako gp96, patrz Wearsch PA i wsp. 1998, Biochemia 37: 5709-19) i CRT (kalretikulina).
Alternatywnie, druga reszta może być toksyną, taką jak listeriolicyna (LLO), lipid A i enterotoksyna wrażliwa na ciepło. Również, pewna liczba mikobakteryjnych pochodnych takich jak MDP (dipeptyd muramylowy), CFA (pełny adiuwant Freunda) i diestery trehalozy TDM i TDE stanowią interesujące możliwości.
Również możliwość wprowadzenia trzeciej reszty, która wzmacnia prezentację analogu w układzie odpornościowym jest ważnym rozwiązaniem według wynalazku. W stanie techniki wykazano kilka przykładów tej zasady. Na przykład, wiadomo, że palmitoilowe lipidacyjne zakotwiczenie białka OspA z Borrelia burgdorferi może być wykorzystane tak, aby dostarczyć samo-wspomagający polipeptyd (patrz np. WO 96/40718) - wydaje się, że lipidowane białko tworzy struktury typu micelli z rdzeniem obejmującym lipidacyjną kotwiczącą część polipeptydu i pozostałe części cząsteczki wystające poza nią, prowadząc do wielokrotnej prezentacji determinant antygenowych. Zatem, zastosowanie tego i podobnych rozwiązań stosując różne lipidacyjne zakotwiczenie (np. grupę mirystylową, grupę farnezylową, grupę geranylo-geranylową, zakotwiczenie GPI i grupę N-acylo diglicerydową) są korzystne według rozwiązania wynalazku, zwłaszcza ponieważ warunki takich lipidacyjnych zakotwiczeń w układach rekombinacyjnych prowadziły do białka dostatecznie prosto i wymagały zaledwie zastosowania np. naturalnie występującej sekwencji sygnałowej jako fuzyjnego partnera analogu. Drugą możliwością jest zastosowanie fragmentu C3d komplementującego czynnika C3 lub samego C3 (patrz Dempsey i wsp., 1996, Science 271, 348-350 i Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462).
Alternatywna postać wykonania wynalazku, która również prowadzi do korzystnej prezentacji wielokrotnych (np. przynajmniej 2) kopii ważnych epitopowo regionów APP lub Αβ w układzie odpornościowym stanowi kowalencyjnie sprzężony analog pewnych cząsteczek, to jest wariantów d i e wymienionych powyżej. Na przykład, mogą być użyte polimery, np. węglowodany, takie jak dekstran, patrz np. Lees A i wsp., 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A i wsp., 1990, J Immunol. 145: 3594-3600, lecz również mannoza i mannan są użytecznymi alternatywami. Integralne białka błonowe np. z E. coli i innych bakterii są również użytecznymi partnerami sprzęgania. Tradycyjne nośnikowe cząsteczki, takie jak hemocyjanina z skałotocza (ang. keyhole limpet hemocyanin - KLH), anatoksyny tężca, anatoksyny błonicy i albuminy z surowicy bydlęcej (BSA) są również korzystnymi i użytecznymi partnerami do sprzęgania.
Korzystne rozwiązania kowalencyjnego sprzęgania materiału pochodzącego z APP lub Αβ z polihydroksypolimerami, takimi jak węglowodany obejmują zastosowanie przynajmniej jednego peptydu pochodzącego z APP lub Αβ i przynajmniej jednego obcego epitopu pomocniczych limfocytów T które są sprzężone oddzielnie z polihydroksypolimerem (to jest obcy epitop pomocniczy limfocytów T i aminokwasowa sekwencja pochodząca z APP lub Αβ nie są sprzężone ze sobą, lecz raczej związanej z polihydroksypolimerem, który następnie służy jako szkielet nośnika). Ponownie, takie rozwiązanie jest najkorzystniejsze, gdy odpowiedni epitop limfocytów B niosący regiony peptydów pochodzących z APP lub Αβ są utworzone przez krótkie peptydowe obszary - jest tak, ponieważ takie podejście jest jednym z bardzo dogodnych sposobów, aby uzyskać wielokrotną prezentację wybranych epitopów w otrzymanym immunogennym środku. Jest, jednakże, również możliwe aby po prostu poddać sprzęganiu analogi już opisane tutaj ze szkieletem polihydroksypolimerowym, tj. aby materiał pochodzący z APP lub Αβ nie był przyłączony do szkieletu oddzielnie od obcych epitopów TH.
Jest szczególnie korzystne, aby sprzęganie obcego epitopu pomocniczych limfocytów T i (poli)peptydu pochodzącego z APP lub Αβ było za pośrednictwem wiązania amidowego, które może być cięte przez peptydazę. Strategia ta ma takie działanie, że komórki APC będą mogły pobrać koniugat i w tym samym czasie będą w stanie poddać koniugat obróbce, a następnie prezentować obcy epitop limfocytu T w odniesieniu do MHC klasy II.
Jeden sposób uzyskiwania sprzęgania peptydów (zarówno peptydu pochodzącego z APP lub Αβ będącego przedmiotem zainteresowania jak również obcego epitopu) polega na aktywacji odpoPL 215 125 B1 wiedniego polihydroksypolimeru grupami trezylu (trifluoroetylosulfonylowymi) lub innymi odpowiednimi grupami aktywacji, takimi jak maleimid, p-Nitrofenylo chloromrówczan (do aktywacji grup OH i tworzenie wiązania peptydowego pomiędzy peptydem a polihydroksypolimerem) i tosyl (p-toluenosulfonyl). Jest, np., możliwe wytwarzanie aktywowanych polisacharydów jak opisano w WO 00/05316 i US 5,874,469 i sprzęganie ich z peptydami pochodzącymi z APP lub Αβ lub poliaminokwasami, jak również z epitopami limfocytów T wytworzonymi za pośrednictwem tradycyjnych technik syntezy peptydów w fazie stałej lub ciekłej. Otrzymany produkt obejmuje szkielet polihydroksypolimerowy (np. szkielet dekstranowy) który ma przyłączone przez ich N-końce lub inne dostępne reszty azotowe, poliaminokwasy pochodzące z APP lub Αβ i z obcych epitopów limfocytów T. Jeśli jest to pożądane, jest możliwe syntetyzowanie peptydów APP lub Αβ, tak aby zabezpieczyć wszystkie dostępne aminowe grupy, oprócz jednej na N-końcu, a następnie sprzęganie otrzymanego zabezpieczonego peptydu z tresylowaną resztą dekstranową i na koniec usunięcie ochrony otrzymanego koniugatu. Specyficzny przykład tego podejścia został opisany w przykładach poniżej.
Zamiast stosować rozpuszczalne w wodzie wielocukrowe cząsteczki, jak opisano w WO 00/05316 i US 5,874,469, jest również możliwe zastosowanie usieciowanych wielocukrowych cząsteczek, przez co otrzymuje się szczególny koniugat polipeptydu i wielocukru - uważa się, że to prowadzi do ulepszonej prezentacji w układzie odpornościowym polipeptydu, gdyż dwa cele zostały osiągnięte, mianowicie efekt miejscowego złoża, gdy koniugat jest wprowadzany i otrzymanie cząsteczek, które są celami przyciągającymi komórki APC. Podejście polegające na stosowaniu takich szczególnych układów również zostało szczegółowo przedstawione w przykładach.
Rozważania stanowiące postawę wybranych obszarów wprowadzenia modyfikacji do APP lub Αβ obejmują a) zachowanie znanych i przewidzianych epitopów limfocytów B, b) zachowanie trzeciorzędowej struktury, c) unikanie epitopów limfocytów B obecnych na „komórkach wytwarzających itp. W każdym razie, jak omówiono powyżej, wyszukanie zestawu analogów, które mają wszystkie być przedmiotem wprowadzenia epitopu limfocytu T w różnych lokalizacjach, jest całkiem łatwe.
Ponieważ najkorzystniejsze rozwiązania obejmują obniżanie poziomu (regulację w dół) ludzkiego Αβ, jest w wyniku tego korzystnie polipeptyd APP lub Αβ omówiony powyżej jest ludzkim polipeptydem Αβ. W tym rozwiązaniu, jest szczególnie korzystne, aby polipeptyd APP lub Αβ był zmodyfikowany przez podstawienie przynajmniej jednej aminokwasowej sekwencji w SEK NR ID: 2 przynajmniej jedną aminokwasową sekwencję o równej lub różnej długości i zawierającej obcy epitop TH. Korzystne przykłady zmodyfikowanych amyloidogennych APP i Αβ przedstawiono schematycznie na Fig. 1 stosując epitopy P2 i P30 jako przykłady. Racjonalne uzasadnienie takich konstruktów omówiono szczegółowo w przykładach.
Bardziej szczegółowo, TH zawierający (lub wypełniający) aminokwasową sekwencję, którą wprowadzono do SEK NR ID: 2 może być wprowadzony przy dowolnym aminokwasie w SEK NR ID: 2. To oznacza, że wprowadzenie jest możliwe po dowolnym z aminokwasów 1-770, lecz korzystnie po dowolnym z aminokwasów 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 i 714 z SEK NR ID: 2. Może to być połączone z delecją dowolnego lub wszystkich aminokwasów 1-671, lub dowolnego lub wszystkich aminokwasów 715-770. Ponadto, gdy stosowana jest technika podstawienia, dowolny z aminokwasów 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 673, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 i 714 z SEK NR ID: 2 może być usunięty w połączeniu z wprowadzeniem.
Drugie rozwiązanie obejmuje prezentację analogów, które nie obejmują żadnej podsekwencji z SEK NR ID: 2, która wiąże się produktywnie z cząsteczkami MHC klasy II zapoczątkowując odpowiedź limfocytu T.
Racjonalne uzasadnienie takiej strategii w celu zaprojektowania immunogenu, który włącza układ odpornościowy do indukowania np. odpowiedzi odpornościowej anty-Αβ jest następujące: Zauważono, że gdy immunizacja zachodzi zasobnymi autologicznymi białkami, takimi jak Αβ, spreparowanymi w adiuwancie, który jest wystarczająco silny, aby przerwać tolerancję organizmu osobnika przeciwko autologicznemu białku, istnieje niebezpieczeństwo, że u pewnych szczepionych osobników indukowane odpowiedzi odpornościowe nie mogą być przerwane po prostu przez przerwanie immunizacji. Jest tak ponieważ indukowana odpowiedź odpornościowa u takich osobników jest najprawdopodobniej kierowana przez natywny epitop TH autologicznego białka i ma to szkodliwe działanie uboczne,
PL 215 125 B1 takie że własne białko szczepionego osobnika będzie w stanie funkcjonować jako czynnik immunizujący w jego własnym interesie: tak ustala się stan autoimmunizacji.
Korzystne sposoby obejmujące zastosowanie obcych epitopów TH nigdy, zgodnie z najlepszą wiedzą twórców nie były obserwowane, w celu uzyskania takiego działania, ponieważ anty-własna odpowiedź odpornościowa jest kierowana przez obcy epitop TH i wykazano wielokrotnie przez twórców, że indukowane odpowiedzi odpornościowe wywołane przez korzystną technologię faktycznie obniżają się po przerwaniu immunizacji. Jednakże, teoretycznie może się to zdarzyć u niewielu osobników, że odpowiedzi odpornościowe mogą również być kierowane przez autologiczny epitop TH istotnego własnego białka, przeciwko któremu jest immunizowany osobnik - zwłaszcza odnosi się to do sytuacji, gdy rozważa się własne białka, które występują stosunkowo obficie, takie jak Ae, podczas gdy inne terapeutycznie związane własne białka są jedynie obecne miejscowo lub w tak niskich ilościach w ciele, że „samo-immunizacyjne działanie nie ma możliwości zaistnieć. Zatem jeden bardzo prosty sposób uniknięcia tego polega na unikaniu w ogóle inkluzji w immunogenie sekwencji peptydowych, które mogą służyć jako epitopy TH (ponieważ peptydy krótsze, niż około 9 aminokwasów nie mogą służyć jako epitopy TH, zastosowanie krótszych fragmentów jest jednym prostym i osiągalnym podejściem). Dlatego, rozwiązanie według wynalazku również ma na celu zapewnienie, że immunogen nie obejmuje sekwencji peptydowych docelowego APP lub Αβ, które mogłyby służyć jako „samo-stymulacyjne epitopy TH obejmujące sekwencje, które jedynie zawierają konserwatywne podstawienia w sekwencji docelowego białka, które może w inny sposób funkcjonować jako epitop TH.
Korzystne rozwiązania prezentacji analogów APP lub Αβ układowi odpornościowemu obejmują zastosowanie chimerowego peptydu zawierającego przynajmniej jeden peptyd pochodzący z APP lub Αβ, który nie wiąże się produktywnie z cząsteczkami MHC klasy II i przynajmniej jeden obcy epitop pomocniczych limfocytów T. Ponadto, korzystnie peptyd pochodzący z APP lub Αβ przenosi epitop limfocytów B. Jest szczególnie korzystne jeśli immunogenny analog jest takim, w którym aminokwasowe sekwencje zawierające jeden lub więcej epitopów limfocytów B przedstawiono albo jako sekwencję ciągłą lub jako sekwencję obejmującą wstawki, przy czym wstawki zawierają obce epitopy pomocniczych limfocytów T.
Ponownie, takie rozwiązanie jest najkorzystniejsze, gdy odpowiednie epitopy limfocytów B niosące regiony APP lub Αβ są utworzone przez krótkie peptydowe obszary, które w żaden sposób nie mogłoby wiązać się produktywnie z cząsteczką MHC klasy II. Wybrany epitop limfocytów B lub epitopy amyloidogennego polipeptydu powinny dlatego zawierać co najwyżej 9 kolejnych aminokwasów z SEK NR ID: 2. Krótsze peptydy są korzystne, takie jak te mające co najwyżej 8, 7, 6, 5, 4, lub 3 kolejnych aminokwasów z aminokwasowych sekwencji amyloidogennych polipeptydów.
Korzystnie analog zawiera przynajmniej jedną podsekwencję z SEK NR ID: 2, tak że każda taka przynajmniej jedna podsekwencja niezależnie obejmuje aminokwasowe regiony z APP lub Αβ wybrane z grupy obejmującej 9 kolejnych aminokwasów, 8 kolejnych aminokwasów, 7 kolejnych aminokwasów, 6 kolejnych aminokwasów, 5 kolejnych aminokwasów, 4 kolejnych aminokwasów i 3 kolejnych aminokwasów.
Jest zwłaszcza korzystne, że kolejne aminokwasy rozpoczynają się od reszty aminokwasowej wybranej z grupy obejmującej resztę 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 i 714 z SEK NR ID: 2.
Szczepienie białkiem/peptydem; preparat i podawanie analogów
Gdy przeprowadza się prezentację analogu układowi odpornościowemu zwierzęcia za pomocą podawania tego związku zwierzęciu, preparat polipeptydu jest zgodny z zasadami ogólnie uznawanymi w dziedzinie.
Preparaty szczepionek, które obejmują peptydowe sekwencje jako aktywne składniki są ogólnie dobrze zrozumiany w dziedzinie, jak przedstawiono na przykład w opisach patentowych U.S. nr 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; i 4,578,770. Typowo, takie szczepionki wytworzono jako środki do wstrzykiwania, zarówno jako roztwory lub zawiesiny ciekłe; stałe postacie odpowiednie do rozpuszczania w, lub dyspergowania w cieczach przed wstrzykiwaniem również mogą być wytworzone. Preparaty mogą również być emulgowane. Aktywny immunogenny składnik jest często mieszany z zaróbkami, które są farmaceutycznie dopuszczalne i kompatybilne z aktywnym składnikiem. Odpowiednie zaróbki obejmują na przykład, wodę, roztwór soli w wodzie, dekstrozę, glicerol, etanol, lub tym podobne i ich połączenia. Ponadto, jeśli jest to pożądane, szczepionka może zawierać mniejsze ilości środka pomocniczego, takiego jak środki zwilżające lub czynniki emulgujące, środki
PL 215 125 B1 buforujące pH, lub adiuwanty, które zwiększają skuteczność szczepionek; patrz szczegółowe omówienie dotyczące adiuwantów w chorobie Alzheimera, poniżej.
Szczepionki są tradycyjnie podawane pozajelitowo, przez iniekcję, na przykład, również podskórnie, śródskórnie, lub domięśniowo. Dodatkowe preparaty, które są odpowiednie do innych sposobów podawania obejmują czopki i, w pewnych przypadkach, doustne, policzkowe, podjęzykowe, śródotrzewnowe, dopochowowe, doodbytnicze, zewnątrzoponowe, rdzeniowe i wewnątrzczaszkowe preparaty. W przypadku czopków, tradycyjne środki wiążące i nośniki mogą obejmować, na przykład, polialkalenoglikole lub trójglicerydy; takie czopki mogą być utworzone z mieszaniny zawierającej aktywny składnik w zakresie od 0,5% do 10%, korzystnie 1-2%. Doustne preparaty obejmują takie normalnie stosowane zaróbki jak, na przykład, farmaceutycznej czystości mannitol, laktozę, skrobię, stearynian magnezu, sacharynian sodu, celuloza, węglan magnezu i tym podobne. Te kompozycje mają postać roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, preparatów o podtrzymywanym uwalnianiu lub proszków i zawierają 10-95% aktywnego składnika, korzystnie 25-70%. W doustnych preparatach, toksyna cholery stanowi interesującego partnera w preparacie (jak również możliwego partnera do sprzęgania).
Polipeptyd może być przygotowany w szczepionce jako obojętny lub w postaci soli. Farmaceutycznie dopuszczalne sole obejmują sole addycyjne z kwasem (utworzone z wolnymi grupami aminowymi peptydu) i które są utworzone z nieorganicznymi kwasami takimi jak, na przykład, kwasy chlorowodorowy lub fosforowy, lub takie organiczne kwasy jak octowy, szczawiowy, winowy, migdałowy i tym podobne. Sole utworzone z wolnymi karboksylowymi grupami, które mogą również pochodzić z nieorganicznych zasad takich jak, na przykład, wodorotlenki sodu, potasu, amonu, wapnia, lub żelaza i takie organiczne zasady jak izopropyloamina, trimetyloamina, 2-etyloaminoetanol, histydyna, prokaina i tym podobne.
Szczepionki są podawane w sposób kompatybilny z dawkowaniem preparatu i w takiej ilości, aby była ona terapeutycznie skuteczna i immunogenna. Ilość jaka ma być podawana zależy od osobnika, który ma być leczony, obejmując, np., pojemność układu odpornościowego osobnika, na zwiększenie odpowiedzi odpornościowej i stopień pożądanego zabezpieczenia. Odpowiednie zakresy dawkowania są rzędu kilku set mikrogramów aktywnego składnika na szczepienie, z korzystnym zakresem od około 0,1 μg do 2,000 μg (nawet jednakże wyższe ilości w rozważanym zakresie 1-10 mg), takie jak w zakresie od około 0,5 μg do 1 000 μg, korzystnie w zakresie od 1 μg do 500 μg i zwłaszcza w zakresie od około 10 μg do 100 μg. Odpowiednie tryby podawania do wstępnego podawania i zastrzyki dawki przypominającej są również zmienne, ale są reprezentowane przez wstępne podawanie, i kolejne zaszczepienia lub inne tryby podawania.
Sposób zastosowania może się znacznie różnić. Dowolny z tradycyjnych sposobów podawania szczepionki może być zastosowany. Sposoby te obejmują podawanie doustne na stałym fizjologicznie dopuszczalnym podłożu lub w fizjologicznie dopuszczalnej zawiesinie, pozajelitowo, przez iniekcję lub tym podobne. Dawkowanie szczepionki będzie zależało od trybu podawania i będzie różne w zależności od wieku osoby, która ma być szczepiona i preparatu antygenu.
Pewne polipeptydy w szczepionce są wystarczająco immunogenne, lecz w przypadku kilku innych odpowiedzi odpornościowe zostaną wzmocnione jeśli szczepionka ponadto zawiera substancję adiuwantową.
Różne sposoby uzyskiwania działania adiuwanta w szczepionkach są znane. Ogólne zasady i sposoby opisano szczegółowo w „The Theory and Practical Application Adjuvants, 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (ed.), Jonn Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6 i również w Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants, 1995, Gregoriadis G i wsp. (red.), Plenum Press, New York,
ISBN 0-306-45283-9.
Jest szczególnie korzystne zastosowanie adiuwanta, który jak można wykazać ułatwia przełamanie autotolerancji na autoantygeny; rzeczywiście, jest to istotne w przypadkach, w których niezmodyfikowany amyloidogenny polipeptyd jest zastosowany jako aktywny składnik w autoszczepionce. Nieograniczające przykłady odpowiednich adiuwantów są wybrane z grupy obejmującej immunoukierunkowany adiuwant; immunomodulujący adiuwant, taki jak toksyna, cytokina i pochodna mikrobakteryjna; preparat oleju; polimer; adiuwant tworzący micele; saponinę; matrycę immunostymulującego kompleksu (ISCOM); cząsteczka; DDA; adiuwanty glinu; adiuwanty DNA; γ-inulina i adiuwant kapsułkujący. Ogólnie należy zauważyć, że ujawnienie powyższe, które dotyczy związków i czynników użytecznych jako pierwsza, druga i trzecia reszta w analogach również dotyczy mutatis mutandis ich zastosowania w adiuwancie szczepionki.
PL 215 125 B1
Zastosowanie adiuwantów obejmuje zastosowanie czynników takich jak wodorotlenek lub fosforan glinu (alum), zwykle stosowane jako 0,05 do 0,1 procentowy roztwór w buforowanym roztworze soli w wodzie, w mieszaninie z syntetycznymi polimerami cukrów (np. Karbopol®) zastosowanych jako 0,25 procentowy roztwór, agregacja białka w szczepionce w wyniku obróbki cieplnej w temperaturach w zakresie od 70° do 101°C przez 30 sekund do 2 minuty odpowiednio i również agregacja za pośrednictwem czynników sieciujących są możliwe. Agregacja w wyniku reaktywacji pepsyną traktowanych przeciwciał (fragmenty Fab) na albuminę, mieszanina z bakteryjnymi komórkami takimi jak C. parvum lub endotoksyny lub lipowielocukrowe składniki gram-ujemnych bakterii, emulsja w fizjologicznie dopuszczalnym olejowym nośniku, takim jak mono-oleinian mannidu (Aracel A) lub emulsja z 20 procentowym roztworem fluoropochodnej węglowodoru o wszystkich atomach wodoru postawionych fluorem (Fluosol-DA) zastosowanym jako blokowy podstawnik może również być zastosowany. Mieszanina z olejami, takimi jak skwalen i IFA jest również korzystna.
Według wynalazku DDA (bromek dimetyldioktadecyloamonu) jest interesującym kandydatem na adiuwanta jak i DNA i γ-inulina, lecz również pełny i niepełny adiuwant Freunda, jak również quillaja saponiny, takie jak QuilA i QS21 są interesujące podobnie jak RIBI. Ponadto możliwości obejmują monofosforylolipid A (MPL), wyżej wymienione C3 i C3d i dipeptyd muramylowy (MDP).
Preparaty liposomowe są również znane, jako nadające działanie adiuwantowe i dlatego liposomowe adiuwanty są korzystne według wynalazku.
Również adiuwanty typu macierzy immunostymulujących kompleksów (ISCOM® matrix) są korzystnymi według wynalazku, zwłaszcza ponieważ wykazano, że taki rodzaj adiuwantów jest zdolny do regulacji w górę (zwiększania poziomu) ekspresji MHC klasy II przez komórki APC. Macierz ISCOM® obejmuje (ewentualnie frakcjonowane) saponiny (triterpenoidy) z Quillaja saponaria, cholesterol i fosfolipid. Gdy zmieszano immunogenne białko, otrzymany jednorodny preparat jest tym, który jest znany jako cząsteczka ISCOM, w której saponina stanowi 60-70% udział masowy, cholesterol i fosfolipid 10-15% udział masowy i białko 10-15% udział masowy. Szczegóły dotyczące kompozycji i zastosowania immunostymulujących kompleksów mogą, np., być znalezione w powyżej wymienionych podręcznikach omawiających adiuwanty, lecz również w pracy Morein B i wsp., 1995, Clin. Immunother. 3: 461-475 jak również Barr IG i Mitchell GF, 1996, Immunol, i Cell Biol. 74: 8-25, które dostarczają użytecznych instrukcji wytwarzania pełnych immunostymulujących kompleksów.
Drugą bardzo interesującą (a zatem, korzystną) możliwością uzyskiwania działania adiuwanta jest zastosowanie techniki opisanej w pracy Gosselin i wsp., 1992. Pokrótce, prezentacja istotnego antygenu takiego jak antygen według obecnego wynalazku może być wzmocniona przez sprzęganie antygenu z przeciwciałem (lub fragmentami przeciwciała wiążącymi antygen) przeciwko receptorom Fcγ na monocytach/makrofagach. Zwłaszcza koniugaty pomiędzy antygenem a anty-FcγRI, jak wykazano zwiększają immunogenność zgodnie z celem szczepienia.
Inne możliwości obejmują zastosowanie substancji ukierunkowujących i immunomodulujących (między innymi cytokin) wymienionych powyżej jako kandydatów na pierwszą i drugą resztę w zmodyfikowanych wersjach amyloidogennego polipeptydu. W związku z tym, również syntetyczne induktory cytokin typu poli I:C są możliwe.
Odpowiednie mikobakteryjne pochodne są wybrane z grupy obejmującej dipeptyd muramylowy, pełny adiuwant Freunda, RIBI i diester trehalozy, taki jak TDM i TDE.
Odpowiednie uodpornione ukierunkowane adiuwanty są wybrane z grupy obejmującej ligand CD40 i przeciwciało CD40 lub specyficznie związane ich fragmenty (patrz omówienie powyżej), mannozę, fragment Fab i CTLA-4.
Odpowiednie polimerowe adiuwanty są wybrane z grupy obejmującej węglowodan, taki jak dekstran, PEG, skrobia, mannan i mannoza; plastyczny polimer taki jak lateks, np. lateksowe kulki.
Ponadto drugim interesującym sposobem modulowania odpowiedzi odpornościowej jest włączenie immunogenu (ewentualnie razem z adiuwantami i farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami i zaróbkami) do „sztucznego węzła chłonnego (VLN, ang. virtual lymph node) (opatentowane urządzenie medyczne opracowane przez ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (cienkie rurkowe urządzenie) naśladuje strukturę i funkcję węzła chłonnego. Wprowadzenie VLN pod skórę tworzy miejsce sterylnego zapalenia z gwałtownym zwiększeniem cytokin i chemokin. Limfocyty T i B, jak również komórki APC gwałtownie odpowiadają na sygnały niebezpieczeństwa, których miejscem jest obszar zapalny i akumulują wewnątrz porowatego podłoża VLN. Wykazano, że konieczna dawka antygenu wymagana do zwiększenia odpowiedzi odpornościowej na antygen jest obniżona gdy stosuje się VLN i że ochrona immunologiczna nadana przez szczepienie
PL 215 125 B1 z zastosowaniem VLN przewyższa tradycyjną immunizację z zastosowaniem Ribi jako adiuwanta. Technologia jest między innymi opisana pokrótce w pracy Gelber C i wsp., 1998, „Elicitation of Robust Cellular and Humoral Responses to Small of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node, w: From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12th - 15th 1998, Seascape Resort, Aptos, California.
Mikrocząstkowy preparat szczepionki przedstawiono w wielu przypadkach jako zwiększający immunogenność białkowych antygenów i jest dlatego drugim korzystnym rozwiązaniem według wynalazku. Mikrocząsteczki są wytwarzane zarówno jako wspólne preparaty antygenu z polimerem, lipidem, węglowodanem lub innymi cząsteczkami odpowiednimi do wytwarzania cząsteczek, lub mikrocząstki mogą być homogennymi cząstkami obejmującymi jedynie sam antygen.
Przykłady opartych na polimerze mikrocząstek obejmują cząstki oparte na PLGA i PVP (Gupta, R.K. i wsp. 1998), w których polimer i antygen są skondensowane w stałą cząsteczkę. Oparte na lipidach cząsteczki mogą być wytworzone jako micele lipidowe (tak zwane liposomy) wychwytujące antygen wewnątrz miceli (Pietrobon, P.J. 1995). Oparte na węglowodanach cząstki są typowo wytworzone z odpowiednich ulegających rozkładowi węglowodanów, takich jak skrobia lub chitozan. Węglowodan i antygen zmieszano i skondensowano w cząstkę w sposób podobny do tego zastosowanego dla polimerowych cząstek (Kas, H.S. i wsp. 1997).
Cząstki obejmujące jedynie antygen mogą być wytworzone różnymi technikami rozpylania i suszeniem sublimacyjnym. Zwłaszcza odpowiednia do celów obecnego wynalazku jest technologia płynu nadkrytycznego, która jest zastosowana do wytworzenia bardzo jednorodnych cząsteczek o kontrolowanej wielkości (York, P. 1999 & Shekunov, B. i wsp. 1999).
Spodziewano się, że szczepionka powinna być podawana 1-6 razy na rok, czyli 1, 2, 3, 4, 5, lub 6 razy na rok osobnikowi, który tego potrzebuje. Wcześniej wykazano, że pamięć odporności indukowanej przez zastosowanie korzystnej autoszczepionki według wynalazku nie jest stała i dlatego układ odpornościowy musi być okresowo prowokowany amyloidogennym polipeptydem lub zmodyfikowanym amyloidogennym polipeptydem.
Ze względu na genetyczną zmienność, różni osobnicy mogą reagować odpowiedziami odpornościowymi o różnej mocy na ten sam polipeptyd. Dlatego, szczepionka według wynalazku może zawierać kilka różnych polipeptydów, aby zwiększyć odpowiedź odpornościową, patrz również omówienie powyżej dotyczące wyboru wprowadzenia obcego epitopu limfocytu T. Szczepionka może zawierać dwa lub więcej polipeptydów, przy czym wszystkie polipeptydy są takie jak zdefiniowano powyżej.
Szczepionka może w wyniku tego zawierać 3-20 różnych zmodyfikowanych lub niezmodyfikowanych polipeptydów, czyli 3-10 różnych polipeptydów.
Szczepionka z kwasem nukleinowym
Jako alternatywna wobec klasycznego podawania szczepionki opartej na peptydzie, technologia szczepionki z kwasem nukleinowym (również znana jako „immunizacja kwasem nukleinowym, „genetyczna immunizacja i „genowa immunizacja) oferuje pewną liczbę atrakcyjnych właściwości.
Po pierwsze, przeciwnie do tradycyjnego podejścia do szczepionki, szczepionka z kwasu nukleinowego nie wymaga środków pochłaniających wytwarzanie na dużą skalę immunogennego środka (np. w postaci fermentacji na skalę przemysłową mikroorganizmów wytwarzających zmodyfikowany amyloidogenny polipeptyd). Ponadto, nie istnieje potrzeba zapewnienia urządzeń do oczyszczania i schematów składania immunogenu. I na koniec, ponieważ szczepionki z kwasem nukleinowym opierają się na biochemicznej aparaturze szczepionego osobnika w celu uzyskania ekspresji produktu wprowadzonego kwasu nukleinowego, występowanie optymalnej potranslacyjnej obróbki produktu ekspresji jest spodziewane; jest to zwłaszcza ważne w przypadku autoszczepień, gdyż jak wymieniono powyżej, znaczący ułamek wyjściowych epitopów limfocytów B powinno być zachowanych w zmodyfikowanych cząsteczkach i dlatego, że epitopy limfocytów B w zasadzie mogą składać się z części dowolnej (bio)cząsteczki (np. węglowodanu, lipidu, białka itp.). Dlatego, natywne wzory glikozylacji i lipidacji immunogenu mogą mieć znaczenie dla całkowitej immunogenności i najlepiej jest dostarczyć przez posiadanie gospodarza wytwarzającego immunogen.
Zatem, w korzystnej postaci wykonania wariantów a-c wynalazku wywoływana jest prezentacja analogu w układzie odpornościowym przez wprowadzenie kwasu(ów) nukleinowego(ych) kodujących analog w komórkach zwierzęcia i przez to otrzymywanie ekspresji in vivo w komórkach, do których wprowadzono kwas(y) nukleinowy(e).
W tym rozwiązaniu, wprowadzony kwas nukleinowy jest korzystnie DNA który może być w postaci nagiego DNA, DNA przygotowanego z naładowanymi lub nienaładowanymi lipidami, DNA przy24
PL 215 125 B1 gotowanego w liposomach, DNA włączonego do wektora wirusowego, DNA przygotowanego z ułatwiającym transfekcję białkiem lub polipeptydem, DNA przygotowanego z ukierunkowującym białkiem lub polipeptydem, DNA przygotowanego z wapniowymi środkami strącającymi, DNA sprzężonego z obojętną cząsteczką nośnika, DNA kapsułkowanego w polimerze, np. w PLGA (patrz technologia mikrokapsułowania opisana w opisie WO 98/31398) lub w chitynie lub chitozanie i DNA przygotowanego z adiuwantem. W odniesieniu należy zauważyć, że praktycznie wszystkie rozważania dotyczące zastosowania adiuwantów w tradycyjnych preparatach szczepionek stosują się do preparatu szczepionki DNA. Zatem, wszystkie ujawnienia tutaj, które dotyczą zastosowania adiuwantów w kontekście szczepionki opartej na polipeptydzie stosują się mutatis mutandis do ich zastosowania w technologii szczepionki z kwasem nukleinowym.
W odniesieniu do trybów podawania i schematów podawania polipeptydu opartego na szczepionkach, które opisano szczegółowo powyżej, są one również stosowane do szczepionek z kwasem nukleinowym według wynalazku i wszystkie powyższe omówienia dotyczące trybów podawania i schematów podawania polipeptydu stosują się mutatis mutandis do kwasów nukleinowych. Do tego należy dodać, że szczepionki z kwasem nukleinowym mogą odpowiednio być podawane dożylnie i dotętniczo. Ponadto, jest dobrze znane w stanie techniki, że szczepionki z kwasem nukleinowym mogą być podawane przez zastosowanie tak zwanego pistoletu genowego, a zatem również to i równoważne sposoby podawania są rozpatrywane jako część obecnego wynalazku. Na koniec, również zastosowanie VLN w podawaniu kwasów nukleinowych opisywano w celu otrzymania dobrych wyników i dlatego ten szczególny tryb podawania jest zwłaszcza korzystny.
Ponadto, kwas(y) nukleinowy(e) zastosowane jako czynnik do immunizacji mogą zawierać regiony kodujące 1szą, 2ga i/lub 3cią resztę, np. w postaci immunomodulujące j substancji, jak opisano powyżej takiej jak cytokiny jako użyteczne adiuwanty.
Korzystna wersja tego rozwiązania obejmuje region kodujący analog i kodujący region immunomodulatora w różnych ramkach odczytu lub przynajmniej pod kontrolą różnych promotorów. Dzięki temu unika się, aby analog lub epitop był uzyskiwany jako fuzyjny partner immunomodulatora. W innym rozwiązaniu, dwa rożne nukleotydowe fragmenty mogą być użyte, lecz jest to mniej korzystne, ponieważ korzyść zapewnienia wspólnej ekspresji, gdy oba kodujące regiony są wprowadzone do tej samej cząsteczki.
Zgodnie z powyższym, wynalazek również dotyczy kompozycji do indukowania wytwarzania przeciwciał przeciwko APP lub Αβ, która zawiera:
- fragment kwasu nukleinowego lub wektor wynalazku (patrz omówienie dotyczące wektorów poniżej) oraz
- farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalny nośnik i/lub nośnik i/lub adiuwant jak omówiono powyżej.
W normalnych warunkach, kwas nukleinowy kodujący wariant wprowadzono w postaci wektora, przy czym ekspresja jest pod kontrolą wirusowego promotora. Bardziej szczegółowy opis wektorów według wynalazku przedstawiono poniżej. Również, dostępne są opisane szczegółowo ujawnienia dotyczące preparatu i zastosowania szczepionki z kwasem nukleinowym, patrz Donnelly JJ i wsp., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 i Donnelly JJ i wsp., 1997, Life Sciences 60: 163-172.
Szczepionki żywe
Trzecią alternatywą przeprowadzenia prezentacji analogów, tak jak zdefiniowano w wariantach a-c, w układzie odpornościowym jest zastosowanie technologii szczepionki zawierającej atenuowane drobnoustroje. W szczepieniu, prezentację w układzie odpornościowym uzyskuje się przez podawanie zwierzęciu niepatogennego mikroorganizmu, który został transformowany fragmentem kwasu nukleinowego kodującego analog lub wektorem obejmującym taki fragment kwasu nukleinowego. Niepatogenny mikroorganizm może być dowolnym odpowiednim atenuowanym szczepem bakteryjnym (atenuowany za pośrednictwem pasażowania lub za pośrednictwem usunięcia patogennych produktów ekspresji rekombinacyjną techniką DNA), np. Mycobakterium bovis BCG., niepatogenny Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella, itp. Artykuły przeglądowe omawiające zgodne ze stanem techniki preparaty szczepionek zawierających atenuowane drobnoustroje mogą np. być znalezione w pracy Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 i Walker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990. W celu uzyskania szczegółów dotyczących fragmentów kwasów nukleinowych i wektorów zastosowanych w takich szczepionkach zawierających atenuowane drobnoustroje, patrz omówienie poniżej.
Jako alternatywę dla bakteryjnych szczepionek zawierających atenuowane drobnoustroje, fragment kwasu nukleinowego według wynalazku jak przedstawiono poniżej, może być włączony do
PL 215 125 B1 niezjadliwego wirusowego wektora szczepionki, takiego jak szczep szczepionki lub dowolny inny odpowiedni wirus ospy.
Normalnie, niepatogenny mikroorganizm lub wirus jest podawany tylko raz zwierzęciu, lecz w pewnych przypadkach może być konieczne, aby podawać mikroorganizm więcej niż raz w życiu w celu utrzymania odporności ochronnej. Uważa się, że schemat immunizacji, jak ten opisany szczegółowo powyżej dla polipeptydowego szczepienia, będzie użyteczny gdy stosuje się szczepionki zawierające atenuowane drobnoustroje i wirusowe szczepionki.
W innym rozwiązaniu, szczepienie atenuowanymi drobnoustrojami i wirusami jest połączone z wcześniejszym lub kolejnym polipeptydem i/lub szczepionką z kwasem nukleinowym. Na przykład, jest możliwe, aby pierwotnie immunizację prowadzić z zastosowaniem szczepionki zawierającej atenuowane drobnoustroje i wirusowej szczepionki, a następnie jako dawki przypominające stosować polipeptyd lub kwas nukleinowy.
Mikroorganizm lub wirus może być transformowany kwasem(ami) nukleinowym(i) zawierającymi regiony kodujące 1szą, 2ga i/lub 3cią resztę, np. w postaci immunomodulujących substancji jak opisano powyżej, takich jak cytokiny omówione jako użyteczne adiuwanty. W korzystnej wersji tej postaci wykonania region kodujący analog i region kodujący immunomodulator są w różnych ramkach odczytu lub przynajmniej pod kontrolą różnych promotorów. Dzięki temu zapobiega się uzyskiwaniu analogu lub epitopów jako fuzyjnych partnerów immunomodulatora. W innej postaci wykonania, dwa różne nukloeotydowe fragmenty mogą być użyte jako czynniki transformujące. Oczywiście, mając lszą i/lub 2gą i/lub 3cia resztę w tej samej ramce odczytu może dostarczyć analog według wynalazku jako produkt ekspresji i takie rozwiązanie jest szczególnie korzystne według obecnego wynalazku.
Zastosowanie sposobu według wynalazku w leczeniu chorób
Jak będzie można docenić z powyższego omówienia, dostarczenie rozwiązań tu opisanych umożliwia ograniczenie chorób charakteryzujących się złogami amyloidowymi. W odniesieniu do powyższego, AD jest kluczowym celem sposobu tu ujawnionego, lecz również inne choroby charakteryzujące się obecnością złogów amyloidowych Αβ stanowią dogodne jego cele. Zatem, obniżanie poziomu (regulacja w dół) aktywności amyloidu stanowi leczenie i/lub zapobieganie i/lub uzyskanie polepszenia AD lub innych chorób charakteryzujących się złogami amyloidu. Rozwiązania tu ujawnione obejmują obniżanie poziomu (regulacja w dół) APP lub Αβ do takiego zakresu, że ilość amyloidu jest znacząco obniżona.
Jest szczególnie korzystne, aby obniżenie amyloidu prowadziło do odwrócenia równowagi pomiędzy tworzeniem amyloidu i degradacją/usunięciem amyloidu, to jest że szybkość degradacji/usunięcia amyloidu była podnoszona, aby przekroczyć szybkość tworzenia amyloidu. Przez staranne kontrolowanie liczby i immunologicznego wpływu immunizacji osobnika, który tego potrzebuje, będzie możliwe otrzymanie równowagi w czasie, co prowadzi do wypadkowego obniżenia złogów amyloidowych bez nadmiernych szkodliwych działań ubocznych.
W innym rozwiązaniu, jeśli poszczególny sposób nie może usunąć lub obniżać występujących złogów amyloidowych, sposób tu ujawniony może być użyty do otrzymania klinicznie znaczącego obniżenia w tworzeniu nowego amyloidu, przez co znacząco przedłużyć czas, w którym stan chorobowy nie jest otępiający. Powinno to być możliwe, aby monitorować szybkość odkładania się amyloidu zarówno przez pomiar stężenia amyloidu w surowicy (który jest uważany, za będący w równowadze z osadzającym się materiałem), lub stosując skanningową tomografię pozytronowo-emisyjną (PET), Patrz Small GW, i wsp., 1996, Ann N Y Acad Sci 802: 70-78.
Inne choroby i stany, gdzie obecne środki i sposoby mogą być zastosowane w leczeniu lub łagodzeniu w analogiczny sposób wymieniono powyżej w „podstawie wynalazku lub są wymienione poniżej w drugim paragrafie zatytułowanym „inne amyloidowe choroby i białka z nimi związane.
Peptydy, polipeptydy i kompozycje według wynalazku
Jak będzie widoczne z powyższego, obecny wynalazek jest oparty na idei immunizacji osobnika przeciwko antygenowi APP lub Αβ, w celu otrzymania zmniejszonej ilości złogów amyloidowych związanych z chorobą. Korzystny sposób otrzymywania takiej immunizacji wykorzystuje analogi opisane w niniejszym opisie, dzięki temu dostarczono cząsteczki, które wcześniej nie były ujawnione w stanie techniki.
Uważa się, że analogi omówione tutaj mają poziom wynalazczy i dlatego ważna część wynalazku odnosi się do analogu jak opisano powyżej. Zatem, dowolne ujawnienie przedstawione tutaj dotyczące zmodyfikowanego APP lub Αβ odnosi się do celu opisującego amyloidogenne analogi według wynalazku i dowolne takie ujawnienia stosują się mutatis mutandis do opisu tych analogów.
PL 215 125 B1
Należy zauważyć, że korzystne zmodyfikowane cząsteczki APP lub Αβ zawierają modyfikacje, które prowadzą do polipeptydu mającego sekwencję o identyczności przynajmniej 70% z APP lub Αβ lub z jego podsekwencją o przynajmniej 10 aminokwasach długości. Wyższa identyczność sekwencji jest korzystna, np. przynajmniej 75% lub nawet przynajmniej 80, 85, 90, lub 95%. Identyczność sekwencji dla białek i kwasu nukleinowego może być obliczona jako (Nref - Ndif) · 100/Nref, gdzie Ndlf oznacza całkowitą liczbę nieidentycznych reszt w dwóch sekwencjach, gdzie przyrównane i gdzie Nref oznacza liczbę reszt w jednej z sekwencji. Zatem, sekwencja DNA AGTCAGTC będzie miała identyczność sekwencji 75% z sekwencją AATCAATC (Ndif=2 i Nref=8).
Wynalazek również odnosi się do kompozycji użytecznych w praktykowaniu sposobu tu opisanego. Zatem, wynalazek również dotyczy immunogennej kompozycji zawierającej immunogennie skuteczne ilości analogu, jak opisano powyżej, oraz farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalny rozpuszczalnik i/iub nośnik i/lub nośnik i/lub zaróbkę i ewentualnie adiuwant. Innymi słowy, ta część wynalazku dotyczy preparatów analogów, zasadniczo jak opisano powyżej. Wybór adiuwantów, nośników i zaróbek jest zgodny z powyższym w odniesieniu do tego, co omówiono powyżej, gdy odnoszą się do preparatu zmodyfikowanego i niezmodyfikowanego amyloidogennego polipeptydu do zastosowania w sposobie obniżania poziomu (regulacja w dół) APP lub Αβ.
Polipeptyd wytworzono według sposobów dobrze znanych w dziedzinie. Dłuższy polipeptyd normalnie wytworzono z zastosowaniem technologii zrekombinowanego genu obejmującej wprowadzenie sekwencji kwasu nukleinowego kodującego analog do odpowiedniego wektora, transformacji odpowiedniej komórki gospodarza wektorem, ekspresji w komórce gospodarza sekwencji kwasu nukleinowego, odzyskanie produktu ekspresji z komórek gospodarza lub supernatantu z ich hodowli, a następnie oczyszczanie i ewentualnie dalszą modyfikację, np. powtórne składanie lub utworzenie pochodnej.
Krótsze peptydy korzystnie wytworzono za pośrednictwem dobrze znanych technik syntezy peptydu w stałej lub ciekłej fazie. Jednakże, obecne postępy w tej technologii uczyniły możliwymi produkcję pełnej długości polipeptydu i białek tymi środkami i dlatego jest również zakresem obecnego wynalazku wytwarzanie długich konstruktów środkami syntetycznymi.
Fragmenty kwasów nukleinowych i wektory według wynalazku
Będzie zrozumiałe z powyższego ujawnienia, że poliaminokwasowe analogi mogą być wytworzone za pośrednictwem technologii rekombinowanego genu, lecz również za pośrednictwem chemicznej syntezy lub semisyntezy; te ostatnie dwie opcje są szczególnie stosowne, gdy modyfikacja obejmuje sprzęganie z nośnikami białka (takimi jak KLH, anatoksyna błonicy, anatoksyna tężca i BSA) i niebiałkowe cząsteczki, takie jak węglowodanowe polimery i oczywiście również gdy modyfikacja zawiera przyłączenie bocznych łańcuchów lub grup bocznych łańcucha peptydowego pochodzącego z APP lub Αβ.
Dla celów technologii zrekombinowanego genu i oczywiście również w celu immunizacji kwasem nukleinowym, fragmenty kwasów nukleinowych kodujących analogi są ważnymi chemicznymi produktami. Zatem, ważna część wynalazku odnosi się do fragmentu kwasu nukleinowego, który koduje analog według wynalazku, to jest polipeptyd pochodzący z APP lub Αβ, który bądź zawiera naturalną sekwencję do której został dodany lub wprowadzony fuzyjny partner lub, korzystnie polipeptyd pochodzący z APP lub Αβ, gdzie został wprowadzony obcy epitop limfocytu T za pośrednictwem insercji i/lub przyłączenia, korzystnie za pośrednictwem podstawienia i/lub delecji. Fragmenty kwasów nukleinowych według wynalazku są fragmentami DNA lub RNA.
Fragmenty kwasów nukleinowych według wynalazku będzą normalnie wprowadzane do odpowiednich wektorów, aby utworzyć klonujące lub ekspresyjne wektory niosące fragmenty kwasów nukleinowych według wynalazku; takie nowe wektory są również częścią wynalazku. Szczegóły dotyczące konstrukcji takich wektorów według wynalazku będą omówione w kontekście transformowanych komórek i mikroorganizmów poniżej. Wektory mogą, w zależności od celu i rodzaju zastosowania, być w postaci plazmidów, fagów, kosmidów, mini-chromosomów, lub wirusów, lecz również nagiego DNA, który jedynie ulega ekspresji przejściowo w pewnych komórkach i jest ważnym wektorem. Korzystnie wektory do klonowania i ekspresji według wynalazku są zdolne do autonomicznej replikacji, przez co otrzymuje się wysokie liczby kopii do uzyskania wysokiego poziomu ekspresji lub wysokiego poziomu replikacji do następnego klonowania.
Ogólne zarysowanie wektora według wynalazku zawiera poniższe właściwości w kierunku 5'^3' i w funkcjonalnym połączeniu: promotor kierujący ekspresją fragmentu kwasu nukleinowego według wynalazku, ewentualnie sekwencja kwasu nukleinowego kodująca peptyd wiodący umożliwiający wyPL 215 125 B1 dzielanie (do fazy zewnątrzkomórkowej lub, tam gdzie to może być stosowane do peryplazmy) lub integrację z błoną fragmentu polipeptydowego, fragmentu kwasu nukleinowego według wynalazku i ewentualnie sekwencji kwasu nukleinowego kodujących terminator. Gdy ekspresyjne wektory są stosowane do szczepów wytwarzających lub linii komórkowych, korzystne jest, aby wektor był wbudowany do genomu komórki gospodarza w celu uzyskania genetycznej stabilności transformowanej komórki. Przeciwnie, gdy pracuje się z wektorami, które mają być użyte do uzyskiwania ekspresji in vivo u zwierzęcia (tj. gdy stosuje się wektor w szczepieniu DNA) dla celów bezpieczeństwa jest korzystne, aby wektor był niezdolny do wbudowywania do genomu komórki gospodarza. Typowo, nagie DNA Iub nieintegrujące się wirusowe wektory są stosowane, których szereg jest znanych specjaliście w dziedzinie.
Wektory według wynalazku są stosowane do transformacji komórek gospodarza w celu uzyskania analogu według wynalazku. Takie transformowane komórki stanowią komórki hodowane lub komórki w liniach komórkowych zastosowanych do powielania fragmentów kwasów nukleinowych i wektorów według wynalazku, lub zastosowane do rekombinacyjnej produkcji analogów według wynalazku. W innym rozwiązaniu, transformowane komórki mogą być odpowiednie dla szczepów do szczepionki z atenuowanymi mikroorganizmami, przy czym fragment kwasu nukleinowego (jedna pojedyncza lub wielokrotne kopie) został wprowadzony tak, aby uzyskać wydzielanie lub integrację analogu z błoną bakteryjną lub ścianą komórkową.
Korzystne transformowane komórki według wynalazku stanowią mikroorganizmy, takie jak bakterie (takie jak gatunki Escherichia [np. E. coli], Bacillus [np. Bacillus subtilis], Salmonella lub Mycobacteria [korzystnie niepatogenne, np. M. bovis BCG]), drożdże (takie jak Saccharomyces cerevisiae) i pierwotniaki. W innym rozwiązaniu, transformowane komórki pochodzą z wielokomórkowych organizmów takich jak grzyby, komórki owadzie, komórki roślinne, lub komórki ssaka. Najkorzystniejsze są komórki pochodzące z istoty ludzkiej, patrz omówienie linii komórkowych i wektorów poniżej. Obecne wyniki były bardzo obiecujące w zastosowaniu komercyjnie dostępnej linii komórkowej z Drosophila melanogaster (linia komórkowa Schneider 2 (S2) i układ wektorowy dostępny z Invitrogen) do rekombinacyjnej produkcji polipeptydu i dlatego ten układ ekspresji jest szczególnie korzystny.
W celu klonowania i/lub optymalizacji ekspresji korzystnie jest, aby transformowana komórka była zdolna do replikacji fragmentu kwasu nukleinowego według wynalazku. Komórki prowadzące ekspresję fragmentu kwasu nukleinowego są użytecznymi rozwiązaniami; mogą one być użyte do wytwarzania na małą skalę lub dużą skalę analogu według wynalazku lub, w przypadku niepatogennych bakterii, jako składniki szczepionki w szczepionce zawierającej atenuowane drobnoustroje.
Gdy wytwarzane są analogi według wynalazku za pośrednictwem transformowanych komórek, jest dogodnie, pomimo, że nie tak istotne, aby produkt ekspresji był bądź transportowany do pożywki hodowlanej lub wynoszony na powierzchnię transformowanej komórki.
Gdy komórka skutecznie produkująca jest zidentyfikowana korzystnie jest, na jej podstawie, założyć stabilną linię komórkową, która niesie wektor według wynalazku i która prowadzi ekspresję fragmentu kwasu nukleinowego kodującego zmodyfikowany amyloidogenny polipeptyd. Korzystnie, ta stabilna linia komórkowa wydziela lub niesie analog według wynalazku, dzięki czemu ułatwia jego oczyszczanie.
Ogólnie, wektor plazmidowy zawierający replikon i kontrolne sekwencje, które pochodzą z gatunków kompatybilnych z komórką gospodarza zastosowano w połączeniu z gospodarzem. Wektor zwykle niesie miejsce replikacji, jak również znakujące sekwencje, które są zdolne do dostarczenia fenotypowej selekcji transformowanych komórek. Na przykład, E. coli typowo transformowana jest stosując pBR322, plazmid pochodzący z gatunku E. coli (patrz, np., Bolivar i wsp., 1977). Plazmid pBR322 zawiera geny oporności na ampicylinę i tetracyklinę, a zatem dostarcza łatwych środków do identyfikacji transformowanych komórek. Plazmid pBR, lub inny bakteryjny plazmid lub fag musi również zawierać, lub być zmodyfikowany, aby zawierał, promotory które mogą być użyte przez prokariotyczny mikroorganizm do ekspresji.
Te promotory najczęściej zastosowane w rekombinacyjnym konstrukcie DNA obejmują B-Iaktamazy (penicylinaza) i układy laktozowych promotorów (Chang i wsp., 1978; Itakura i wsp., 1977; Goeddel i wsp., 1979) i układ promotora tryptofanu (trp) (Goeddel i wsp., 1979; EP-A-0 036 776). Podczas gdy, te są najczęściej stosowane, inne bakteryjne promotory zostały ujawnione i zastosowane, a szczegóły dotyczące ich sekwencji nukleotydowych zostały opublikowane, umożliwiając wykwalifikowanemu technikowi ligować je funkcjonalnie z plazmidowymi wektorami (Siebwenlist i wsp., 1980). Pewne geny prokariotyczne mogą ulegać ekspresji skutecznie w E. coli z wykorzysta28
PL 215 125 B1 niem ich własnych promotorowych sekwencji, zapobiegając potrzebie przyłączenia drugiego promotora dzięki sztucznym środkom.
Oprócz prokariotów, eukariotyczne mikroorganizmy, takie jak drożdżowe hodowle, mogą również być użyte i tutaj promotor powinien być zdolny do kierowania ekspresją. Saccharomyces cerevisiase, lub typowe drożdże piekarskie są najczęściej stosowane z eukariotycznych mikroorganizmów, pomimo, że pewna liczba innych szczepów jest ogólnie dostępna. W celu ekspresji w Saccharomyces, plazmid YRp7, na przykład, jest ogólnie stosowany (Stinchcomb i wsp., 1979; Kingsman i wsp., 1979; Tschemper i wsp., 1980). Plazmid ten już zawiera gen trpl, który dostarcza marker selekcyjny szczepowi mutanta drożdży pozbawionych zdolności do wzrostu w tryptofanie na przykład ATCC No. 44076 lub PEP4-1 (Jones, 1977). Obecność uszkodzenia trpl jako charakterystyka genomu drożdżowej komórki gospodarza następnie dostarcza skutecznego narzędzia do wykrywania transformantów przez wzrost przy braku tryptofanu.
Odpowiednie sekwencje promotorowe w wektorach drożdżowych obejmują promotory kinazy 3-fosfoglicerynowej (Hitzman i wsp., 1980) lub innych glikolitycznych enzymów (Hess i wsp., 1968; Holland i wsp., 1978), takich jak enolaza, dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanu, heksokinaza, dekarboksylaza pirogronianu, fosfofruktokinaza, izomeraza glukozo-6-fosforanu, mutaza 3-fosforoglicerynianu, kinaza pirogronianu, izomeraza triozofosforanu, izomeraza fosfoglukozy i glukokinaza. W konstrukcji odpowiednich ekspresyjnych plazmidów, sekwencje terminacji związane z tymi genami są również ligowane z ekspresyjnym wektorem 3' od sekwencji pożądanej, która ma ulegać ekspresji, aby zapewnić poliadenylację mRNA i zakończenie.
Inne promotory, które mają dodatkową zaletę transkrypcji kontrolowanej przez warunki wzrostu stanowią promotorowy region alkoholowej dehydrogenazy 2, izocytochrom C, fosfataza kwasowa, enzymy degradujące, związane z metabolizmem azotu i wymienione powyżej dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanu i enzymy odpowiedzialne za wykorzystanie maltozy i galaktozy. Dowolny plazmidowy wektor zawierający kompatybilny drożdżowy promotor, miejsce inicjacji replikacji i sekwencje terminacji jest odpowiedni.
Oprócz mikroorganizmów, hodowle komórkowe pochodzące z wielokomórkowych organizmów mogą również być użyte jako gospodarz. Zasadniczo, dowolna taka hodowla komórkowa może być użyta, zarówno hodowla komórek kręgowców, jak i bezkręgowców. Jednakże, największe zainteresowanie stanowią komórki kręgowców i rozmnażanie komórek kręgowców w hodowli (hodowla tkankowa) stało się rutynową procedurą w obecnych latach (Tissue Culture, 1973). Przykłady takich użytecznych linii komórek gospodarza obejmują komórki VERO i HeLa, linie komórkowe jajnika chomika syryjskiego (CHO) i W138, BHK, COS-7293, komórki Spodoptera frugiperda (SF) (komercyjnie dostępne jako pełny układ ekspresji z między innymi Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, U.S.A. i z Invitrogen) i linie komórkowe MDCK. W obecnym wynalazku, zwłaszcza korzystną linią komórkową jest S2 dostępną z Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, Holandia.
Ekspresyjne wektory do takich komórek typowo obejmują (jeśli to konieczne) miejsce inicjacji replikacji, promotor zlokalizowany na początku genu, który ma być eksprymowany, wraz z dowolnym koniecznym miejscem wiązania rybosomu, miejscem przyłączenia RNA, miejscem poliadenylacji i sekwencjami terminacji transkrypcji.
Do zastosowania w komórkach ssaczych, kontrolne funkcje w ekspresyjnych wektorach są często dostarczane przez materiał wirusowy. Na przykład, ogólnie stosowane promotory pochodzą z poliomy Adenowirusa 2 i najczęściej małpiego wirusa 40 (SV40). Wczesny i późny promotor wirusa SV40 są szczególnie użyteczne, ponieważ oba są otrzymane łatwo z wirusa jako fragment, który również zawiera miejsce inicjacji replikacji wirusa SV40 (Fiers i wsp., 1978). Mniejsze lub większe fragmenty SV40 mogą również być użyte, pod warunkiem, że włączone zostanie w przybliżeniu 250 par zasad sekwencji rozciągającej się od miejsca HindIII w kierunku BglI zlokalizowanej w wirusowym miejscu inicjacji replikacji. Ponadto, jest również możliwe i często pożądane, aby wykorzystać promotor lub sekwencje kontrolne normalnie związane z pożądaną sekwencją genu, pod warunkiem, że takie sekwencje kontrolne są kompatybilne z układami komórki gospodarza.
Miejsce inicjacji replikacji może być dostarczone zarówno w wyniku konstrukcji wektora, obejmującego egzogenne miejsce inicjacji, takie jak pochodzące z SV40 lub innego wirusa (np., Polioma, Adeno, VSV, BPV) lub może być dostarczone przez chromosomowy mechanizm replikacji komórki gospodarza. Jeśli wektor jest wbudowywany do chromosomu komórki gospodarza, ten ostatni jest często wystarczający.
PL 215 125 B1
Identyfikacja użytecznych analogów
Będzie zrozumiałe dla specjalisty w dziedzinie, że nie wszystkie możliwe warianty lub modyfikacje naturalnie występujących APP lub Αβ będą wykazywać zdolność do wywoływania u zwierzęcia przeciwciał krzyżowo reagujących z naturalną postacią. Jednakże nie jest trudne ustawienie skutecznego standardowego przeszukiwania pod kątem zmodyfikowanej amyloidogennej cząsteczki, która spełnia minimalne wymagania immunologicznej reaktywności tu omówionej. Zatem, jest możliwe zastosowanie sposobu identyfikacji zmodyfikowanego amyloidogennego polipeptydu, który jest zdolny do indukowania przeciwciał przeciwko niezmodyfikowanemu amyloidogennemu polipeptydowi u gatunków zwierząt, u których niezmodyfikowany amyloidogenny polipeptyd jest (nieimmunogennym) własnym białkiem, który to sposób obejmuje
- wytwarzanie, za pośrednictwem syntezy peptydu lub technikami inżynierii genetycznej, zestawu wzajemnie odmiennych analogów według wynalazku, do którego zostały dodane aminokwasy, wprowadzone do, usunięte z, lub podstawione do sekwencji aminokwasowej APP lub Αβ gatunków zwierząt dzięki czemu powstają sekwencje aminokwasowe w zestawie, które zawierają epitopy limfocytów T, które są obce gatunkom zwierząt, lub wytwarzanie zestawu fragmentów kwasów nukleinowych kodujących zestaw wzajemnie odmiennych analogów,
- testowanie elementów zestawu analogów lub fragmentów kwasów nukleinowych pod kątem ich zdolności do indukowania wytwarzania przeciwciał przez gatunek zwierzęcia przeciwko niezmodyfikowanym APP lub Αβ oraz
- identyfikacja i ewentualnie wyodrębnienie elementu(ów) zestawu analogów, które znacząco indukują wytwarzanie przeciwciała przeciwko niezmodyfikowanemu APP lub Αβ u gatunku lub identyfikacja i ewentualnie wyodrębnienie polipeptydowych produktów ekspresji kodowanych przez elementy z zestawu fragmentów kwasów nukleinowych, które znacząco indukują produkcję przeciwciał przeciwko niezmodyfikowanym APP lub Αβ u gatunków zwierząt.
W tym kontekście, „zestaw wzajemnie odmiennych zmodyfikowanych amyloidogennych polipeptydów stanowi zbiór nieidentycznych analogów, które np. wybrano na podstawie kryteriów omówionych powyżej (np. w połączeniu z badaniem dychroizmem kołowym, widmami NMR, i/lub obrazami dyfrakcyjnymi promieniowania X). Zestaw może składać się tylko z kilku elementów, lecz jest rozważane, aby zestaw mógł zawierać kilka tysięcy elementów.
Test elementów zestawu może ostatecznie być wykonany in vivo, lecz pewną liczbę testów in vitro można zastosować, które ograniczą liczbę zmodyfikowanych cząsteczek, które będą służyć celom wynalazku.
Ponieważ celem wprowadzenia obcych epitopów limfocytów T jest wsparcie odpowiedzi limfocytów B przez pomocnicze limfocyty T, warunek wstępny jest taki, że proliferacja limfocytów T jest indukowana przez analog. Proliferacja limfocytów T może być testowana przez standaryzowane testy proliferacji in vitro. Po krótce, próbka o zwiększonej liczbie limfocytów T została otrzymana od osobnika a następnie utrzymywana w hodowli. Hodowane limfocyty T są kontaktowane z komórkami APC osobnika, które wcześniej pobrały zmodyfikowaną cząsteczkę i poddały obróbce aby prezentować epitopy limfocytów T. Proliferacja limfocytów T jest monitorowana i porównana z odpowiednią kontrolą (np. limfocyty T w hodowli kontaktowanej z komórkami APC, które wytwarzały nietknięty, natywny amyloidogenny polipeptyd). W innym rozwiązaniu, proliferacja może być mierzona przez wyznaczanie stężenia istotnych cytokin uwolnionych przez limfocyty T w odpowiedzi na rozpoznanie obcych limfocytów T.
Przy określeniu, że bardzo prawdopodobne jest to, że przynajmniej jeden analog dowolnego typu z zestawu jest zdolny do indukowania wytwarzania przeciwciała przeciwko APP lub Αβ, jest możliwe wytwarzanie immunogennej kompozycji zawierającej przynajmniej jeden analog, który jest zdolny do indukowania przeciwciał przeciwko niezmodyfikowanemu APP lub Αβ u gatunków zwierząt, u których niezmodyfikowany APP lub Αβ jest własnym białkiem, sposób obejmujący zmieszanie elementu(ów) zestawu, który znacząco indukuje wytwarzanie przeciwciał u gatunków zwierząt, które są reaktywne z APP lub Αβ z farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub podłożem i/lub rozcieńczalnikiem i/lub zaróbką, ewentualnie w połączeniu z przynajmniej jednym farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalnym adiuwantem.
Powyżej opisane testy zestawów polipeptydów są dogodnie przeprowadzone przez początkowe wytwarzanie pewnej liczby wzajemnie odmiennych sekwencji kwasu nukleinowego lub wektorów według wynalazku, wprowadzenie ich do odpowiednich ekspresyjnych wektorów, transformowanie odpowiednich komórek gospodarza (lub zwierząt będących gospodarzami) wektorami i uzyskanie eks30
PL 215 125 B1 presji sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku. Po etapach tych może nastąpić wyodrębnienie produktów ekspresji. Korzystnie jest, aby sekwencje kwasu nukleinowego i/lub wektory były wytworzone sposobami zawierającymi przeprowadzenie techniki amplifikacji molekularnej takiej jak PCR lub syntezę z pomocą kwasu nukleinowego.
Specyficzne amyloidogenne cele
Oprócz białek najczęściej związanych z chorobą Alzheimera, APP, ApoE4 i Tau, istnieje długa lista innych białek, które w pewien sposób są połączone z AD, zarówno przez ich bezpośrednią obecność w płytkach lub splotach w mózgach chorych na chorobę Alzheimera lub przez ich oczywiste genetyczne powiązanie ze zwiększonym ryzykiem rozwoju AD. Większość, jeśli nie wszystkie, z tych antygenów są razem z powyżej omówionymi Αβ, APP, preseniliną i ApoE4, możliwymi docelowymi białkami w pewnych rozwiązaniach według obecnego wynalazku. Te możliwe cele zostały już szeroko przedstawione w opisie WO 01/62284. Zatem, te możliwe cele będą tutaj tylko wymienione pokrótce, podczas gdy bardziej szerokie omówienie można znaleźć w opisie WO 01/62282:
Alfa1-antychymotrypsyna (ACT); Alfa 2-makroglobulina; ABAD (Αβ-peptyd wiążący alkoholową dehydrogenazę); APLP1 i -2(amyloidowe prekursorowe typu białka 1 i 2); AMY117; Bax; Bcl-2; hydrolaza bleomycyny; BRI/ABRI; Chromogranina A; Klusteryna/apoJ; białko wiążące CRF (czynnik uwalniający kortykotropinę, ang. corticotropin releasing factor); EDTF (czynnik toksyczny pochodzenia endotelialnego, ang. endothelial-derived zoxic factor); heparano siarczanowe proteoglikany; ludzki białkowy mediator odpowiedzi kolapsyny-2 (ang. human collapsin response mediator protein - 2); Huntyngtyna (białko choroby Huntingtona); ICAM-I; IL-6; antygen zasocjowany z lizosomem CD68; P21 ras; PLC-delta 1 (fosfolipaza C izoenzymu delta 1); składnik P surowiczego amyloidu (SAP, ang. serum amyloid P component); Synaptofizyna; Synukleina (alfa-synukleina lub NACP); i TGF-b1 (transformujący czynnik wzrostu b1).
Obecnie opisane środki i sposoby obniżania poziomu (regulacji w dół) APP lub Αβ mogą być połączone z terapiami, np. aktywną specyficzną immunoterapią, przeciwko dowolnemu z tych innych amyloidogennych polipeptydów.
Niezależnie od choroby Alzheimera, również mózgowa amyloidowa angiopatia jest chorobą, która może być odpowiednia jako cel obecnie ujawnionej technologii.
Jest rozważane, że najwięcej sposobów immunizacji przeciwko APP lub Αβ powinno być ograniczonych do immunizacji dających początek przeciwciałom reaktywn ym krzyżowo z natywnym APP lub Αβ. Jednakże, w pewnych przypadkach przedmiotem zainteresowania będzie indukowanie komórkowej odporności w postaci odpowiedzi CTL przeciwko komórkom, które prezentują epitopy MHC klasy I z amyloidogennego polipeptydu - może to być dogodne w tych przypadkach, w których obniżenie liczby komórek wytwarzających APP lub Αβ nie stanowi poważnego szkodliwego działania ubocznego. W takich przypadkach, gdzie odpowiedzi CTL są pożądane, korzystnie jest zastosować wskazówki zgłaszającego z opisu WO 00/20027.
Nośniki immunogenne
Cząsteczki zawierające epitop pomocniczy T i peptydy APP lub Αβ reprezentujące lub obejmujące epitopy limfocytów B połączone kowalencyjnie z nieimmunogenną polimerową cząsteczką działającą jako nośnik, np. multiwalentny aktywowany poli-hydroksypolimer, będą, jak wskazano powyżej, funkcjonowały jako cząsteczka szczepionki, która tylko zawiera immunologicznie istotne części, które mogą być otrzymane i są interesującym rozwiązaniem w wariantach d i e ujawnionych powyżej. Wspólne lub tak zwane uniwersalne epitopy T pomocnicze mogą być użyte jeśli, np., celem szczepionki jest własny antygen, taki jak APP lub Αβ. Ponadto, elementy, które wzmacniają immunologiczną odpowiedź mogą być również współsprzężone z nośnikiem i dzięki temu działać jako adiuwant. Takimi elementami może być mannoza, tuftsyna, dipeptyd muramylowy, motywy CpG itp. W tym przypadku, kolejny adiuwantowy preparat szczepionkowego produktu może nie być konieczny i produkt może być podawany w czystej wodzie lub roztworze soli w wodzie.
Przez sprzęganie epitopów cytotoksycznych limfocytów T (CTL) razem z pomocniczymi epitopami T, będzie również możliwe wytworzenie CTL specyficznych dla antygenu, z którego epitop CTL będzie pochodził. Elementy, które zwiększają pobieranie produktów do cytozolu, takie jak mannoza, komórki APC, np. makrofag, mogą również być współsprzężone z nośnikiem razem z epitopem CTL i pomocniczym T oraz wzmacniać odpowiedź CTL.
Stosunek epitopów limfocytów B i pomocniczych epitopów T (P2 i P30) w końcowym produkcie może być zmienna poprzez zmieniające się stężenie tych peptydów na etapie syntezy. Jak wskazano powyżej, immunogenna cząsteczka może być znakowana np. mannozą, tuftsyną, motywami CpG lub
PL 215 125 B1 innymi stymulującymi odporność substancjami (opisanymi tutaj) przez ich dodanie, jeśli to konieczne stosując np. aminowane pochodne substancji, w buforze węglanowym w etapie syntezy.
Jeśli nierozpuszczalny aktywowany polimer polihydroksylowy jest zastosowany do połączenia peptydów zawierających epitop APP lub Αβ limfocytów B i epitopu pomocniczego T, to może on, jak wymieniono powyżej być uzyskany w syntezie w fazie stałej i końcowy produkt może być zebrany i oczyszczony przez przemycie i odsączenie. Elementy które będą sprzężone z aktywowanym trezylem polihydroksypolimerem (peptydy, znaczniki itp.) mogą być dodane do polihydroksypolimeru w niskim pH, np. pH 4-5 i pozostawione, aby były równo rozmieszczone w „żelu w wyniku biernej dyfuzji. Następnie, pH może zostać zwiększone do pH 9-10, aby rozpocząć reakcję pierwszorzędowej aminowej grupy w peptydach i znacznikach z grupami trezylowymi na poli-hydroksypolimerze. Po sprzęganiu peptydów z, np. stymulującymi odporność elementami, żel mielono, aby utworzyć cząsteczki o odpowiedniej wielkości do immunizacji.
Dlatego taki immunogen obejmuje
a) przynajmniej jedną pierwszą aminokwasową sekwencję pochodzącą z APP lub Αβ, przy czym przynajmniej jedna, pierwsza aminokwasowa sekwencja zawiera przynajmniej jeden epitop limfocytu B i/lub przynajmniej jeden epitop CTL oraz
b) przynajmniej jedną drugą aminokwasową sekwencję, która obejmuje obcy epitop pomocniczych limfocytów T, przy czym każda z przynajmniej pierwszej i przynajmniej drugiej sekwencji aminokwasowej jest sprzężona z farmaceutycznie dopuszczalnym aktywowanym polihydroksypolimerowym nośnikiem.
W celu sprzęgania sekwencji aminokwasowej z polihydroksypolimerem zazwyczaj jest konieczne „aktywowanie polihydroksypolimeru odpowiednią reaktywną grupą, która może tworzyć konieczne wiązanie z sekwencjami aminokwasowymi.
Termin „poli-hydroksypolimer ma mieć takie same znaczenie jak w opisie WO 00/05316, to jest poli-hydroksypolimer może mieć dokładnie taką samą charakterystykę, jak specyficznie określono w w/w zgłoszeniu. Zatem, poli-hydroksypolimer może być rozpuszczalny lub nierozpuszczalny w wodzie (zatem wymagane są różne etapy syntezy w czasie wytwarzania immunogenu). Poli-hydroksypolimer może być wybrany z naturalnie występujących poli-hydroksylowych związków i syntetycznych polihydroksylowych związków.
Specyficzne i korzystne poli-hydroksypolimery stanowią polisacharydy wybrane spośród acetanu, amylopektyny, gumy agar-agar, agarozy, alginianów, gumy arabskiej, karrageniny, celulozy, cyklodekstryn, dekstranu, furcelaranu, galaktomannanu, żelatyny, ghatti, glukanu, glikogenu, guar, karaya, konjac/A, gumy locust bean, mannanu, pektyny, psyllium, pullulanu, skrobi, tamaryny, tragakantu, ksantanu, ksylanu i ksyloglukanu. Dekstran jest szczególnie korzystny.
Jednakże, polihydroksypolimer może również być wybrany spośród wysoce rozgałęzionych poli(etylenoiminy) (PEI), tetratienylenowinylenu, Kevlaru (długo łańcuchowego poliparafenylotereftalamidu), poli(uretanów), poli(siloksanów), polidimetylosiloksanu, silikonu, poli(metakrylanu metylu) (PMMA), poli(alkoholu winylowego), poli(winylopirolidonu), poli(2-hydroksyetylometakrylanu), poli(N-winylopirolidonu), poli(alkoholu winylowego), poli(kwasu akrylowego), politetrafluoroetylenu (PTFE), poliakrylamidu, poli(octanu etyleno-ko-winylowego), poli(glikolu etylenowego) i pochodnych, poli(kwasu metakrylowego), polilaktydów (PLA), poliglikolidów (PGA), poli(mleczano-ko-glikolidów) (PLGA), polibezwodników i poliortoesterów.
Średnia masa cząsteczkowa (ważona) rozpatrywanego poli-hydroksypolimeru (to jest przed aktywacją) wynosi typowo przynajmniej 1000, przynajmniej 2000, korzystnie w zakresie od 2500-2000 000, korzystniej w zakresie od 3000-1000000, w szczególności w zakresie od 5000-500000. Przedstawiono jako przykłady, że polihydroksypolimery mające średnią masę cząsteczkową w zakresie od 10,000-200,000 są szczególnie korzystne.
Polihydroksypolimer korzystnie jest rozpuszczalny w wodzie w zakresie przynajmniej 10 mg/ml, korzystnie przynajmniej 25 mg/ml, przynajmniej 50 mg/ml, w szczególności przynajmniej 100 mg/ml, przynajmniej 150 mg/ml w temperaturze pokojowej. Wiadomo, że dekstran, nawet gdy jest aktywowany jak opisano w niniejszym opisie, spełnia wymagania w odniesieniu do rozpuszczalności w wodzie.
W przypadku pewnych najbardziej interesujących poli-hydroksypolimerów, stosunek pomiędzy
C (atomy węgla) i OH grupy (hydroksylowe grupy) nieaktywowanych poli-hydroksypolimerów (to jest natywnych poli-hydroksypolimerów przed aktywacją) jest w zakresie od 1,3 do 2,5, takim jak 1,5-2,3, korzystnie 1,6-2,1, w szczególności 1,85-2,05. Nie wiążąc się z żadną specyficzną teorią, uważa się, że stosunek taki jak C/OH nieaktywowanego polihydroksypolimeru przedstawia wysoce korzystny
PL 215 125 B1 poziom hydrofilowości. Poliwinyloalkohol i polisacharydy są przykładami polihydroksypolimerów, które spełniają ten wymóg. Uważa się, że powyżej wymieniony stosunek powinien być z grubsza taki sam dla aktywowanych polihydroksypolimerów, ponieważ poziom aktywacji powinien być raczej niski.
Termin „nośnik poli-hydroksypolimerowy ma oznaczać część immunogenu, który niesie sekwencje aminokwasowe. Jako ogólna zasada, poli-hydroksypolimerowy nośnik ma zewnętrzne ograniczenia, tam gdzie sekwencje aminokwasowe mogą być cięte przez peptydazę, np., w komórce prezentującej antygen, która prowadzi obróbkę immunogenu. Zatem, poli-hydroksypolimerowy nośnik może być poli-hydroksypolimerem z aktywującą grupą, przy czym wiązanie pomiędzy grupą aktywowaną i aminokwasową sekwencją ulega cięciu przez peptydazę w komórce APC, lub polihydroksypolimerowy nośnik może być polihydroksypolimerem z grupą aktywacyjną i np. Iinkerem takim jak pojedynczy L-aminokwas lub pewną liczbą D-aminokwasów, przy czym ostatnia część linkera może wiązać się z sekwencją aminokwasową i być cięta przez peptydazę w komórce APC.
Jak wskazano powyżej, polihydroksypolimery niosą funkcjonalne grupy (grupy aktywacji), co ułatwia zakotwiczenie peptydów w nośniku. Szeroki zakres stosowanych funkcjonalnych grup jest znany w stanie techniki, np. grupy trezylowa (trifluoroetylosulfonyl), maleimidowa, p-nitrofenylo chloromrówczanowa, bromocyjanowa, tosylowa (p-toluenosulfonyl), triflilowa (trifluorometanosulfonyl), pentafluorobenzenosulfonylowa i winylosulfonowa. Korzystne przykłady funkcjonalnych grup w obecnym wynalazku stanowią grupy tresylowa, maleimidowa, tosylowa, triflilowa, pentafluorobenzenosulfonylowa, p-nitrofenylo chloromrówczanowa i winylosulfunowa, z których grupy tresylowa, maleimidowa i tosylowa są szczególnie ważne.
Aktywowane trezylem polihydroksypolimery mogą być wytworzone stosując chlorek trezylu, jak opisano dla aktywacji dekstranu w przykładzie 1 w opisie WO 00/05316 lub jak opisano w pracy Gregoriusa i wsp., J. Immunol. Met. 181 (1995) 65-73.
Aktywowane maleimidem polihydroksypolimery mogą być wytworzone stosując p-maleimidofenylo izocyjanian, jak opisano dla aktywacji dekstranu w przykładzie 3 opisu WO 00/05316. W innym rozwiązaniu, maleimidowe grupy mogą być wprowadzone do polihydroksypolimeru, takie jak dekstran, przez tworzenie pochodnych aktywowanego trezylem polihydroksypolimeru (takiego jak aktywowanym trezylem dekstranu (TAD)) z diaminowym związkiem (ogólnie H2N-CnH2n-NH2, gdzie n oznacza 1-20, korzystnie 1-8), np. 1,3-diaminopropan, w nadmiarze i kolejnej reakcji aminowych grup wprowadzonych do TAD z odczynnikami, takimi jak 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan sukcynoimidylowy (SMCC), 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan sulfosukcynoimidylowy (sulfoSMCC), 4-(p-maleimidofenylo)maślan sukcynoimidylowy (SMPB), 4-(p-maleimidofenylo)maślan sulfosukcynoimidylowy (sulfo - SMPB), ester sukcynoimidylowy Ν-γ-maleimidomaślanu - (GMBS) lub ester sulfosukcynoimidylowy Ν-γ-maleimidomaślanu. Pomimo, że różne odczynniki i tryby aktywacji zasadniczo prowadzą do nieco różnych produktów aktywowanych maleimidem, w odniesieniu do wiązania pomiędzy maleimidowymi grupami funkcyjnymi i pozostałością wyjściowej grupy hydroksyowej, w której następuje aktywacja, wszystkie i każdy jest rozważany jako „polihydroksypolimery aktywowane maleimidem.
Tosylem aktywowane polihydroksypolimery mogą być wytworzone stosując chlorek tosylu, jak opisano dla aktywacji dekstranu w przykładzie 2 w opisie WO 00/05316. Polihydroksypolimery aktywowane triflilem i pentafluorobenzenosulfonylem wytworzono jak analogi aktywowane tosylem lub trezylem, np. stosując odpowiadające im kwasowe chlorki.
Polihydroksypolimer aktywowany bromocyjanem może być wytworzony przez reakcję polihydroksypolimeru z bromocyjanem stosując tradycyjne sposoby. Otrzymane funkcyjne grupy obejmują normalnie estry cyjanianu z dwoma hydroksylowymi grupami polihydroksypolimeru.
Stopień aktywacji może być wyrażony jako stosunek pomiędzy wolnymi grupami hydroksylowymi a grupami aktywacji (to jest funkcjonalizowanymi grupami hydroksylowymi). Uważa się, że stosunek pomiędzy wolnymi hydroksylowymi grupami polihydroksypolimeru i grupami aktywacji powinny być pomiędzy 250:1 a 4:1 w celu otrzymania korzystnej równowagi pomiędzy hydrofilowością i reaktywnością polihydroksypolimeru. Korzystnie stosunek wynosi od 100:1 do 6:1, korzystniej od 60:1 do 8:1, w szczególności od 40:1 do 10:1.
Zwłaszcza interesujące aktywowane polihydroksypolimery do zastosowania w sposobie wytwarzania ogólnie stosowanych immunogenów według wynalazku obejmują trezyl, tosyl i polisacharydy aktywowane maleimidem, zwłaszcza dekstran aktywowany tresylem (TAD), dekstran aktywowany tosylem (TosAD) i dekstran aktywowany maleimidem (MAD).
PL 215 125 B1
Korzystnie wiązanie pomiędzy polihydroksypolimerowym nośnikiem a sekwencjami aminokwasowymi do niego przyłączonymi mogły być odcinane przez peptydazę, np. jako aktywne wobec peptydazy w obróbce antygenów w komórkach APC. Dlatego korzystnie przynajmniej pierwsza i przynajmniej druga sekwencja aminokwasowa były sprzężone z aktywowanym polihydroksypolimerowym nośnikiem przez wiązanie amidowe lub wiązanie peptydowe. Jest zwłaszcza korzystne, aby przynajmniej pierwsza i przynajmniej druga sekwencja aminokwasowa każda dostarczała resztę azotową odpowiedniego wiązania amidowego.
Polihydroksypolimerowy nośnik może być zasadniczo wolny od reszt aminokwasowych, czyniąc koniecznym, aby aktywacyjna grupa dostarczyła część z wiązań, które mogą być cięte przez peptydazę, lecz jak wskazano powyżej, nośnik może również po prostu obejmować łącznik obejmujący przynajmniej jeden L-aminokwas. W każdym razie, przynajmniej pierwsza i przynajmniej druga sekwencja aminokwasowa są normalnie związane z aktywowaną wersją polihydroksypolimeru przez azot na N-końcu sekwencji aminokwasowej.
Powyżej opisany ogólnie stosowany immunogen według wynalazku może być użyty w sposobach immunizacji zasadniczo jak tutaj opisano dla polipeptydowej szczepionki. To jest, wszystkie ujawnienia dotyczące dawkowania, sposobu podawania i preparatu polipeptydowej szczepionki do obniżania poziomu (regulacji w dół) amyloidogennego polipeptydu omówione tutaj stosują się mutatis mutandis do ogólnie stosowanych immunogenów.
Ogólnie dopuszczalna bezpieczna technologia szczepień
Jak omówiono powyżej, jedna korzystna postać wykonania według wynalazku pociąga za sobą zastosowanie wariantów amyloidogennego polipeptydu, które nie są zdolne do dostarczenia epitopów TH własnego pochodzenia, które mogą kierować odpowiedzi odpornościowe przeciwko amyloidogennemu polipeptydowi.
Jednakże, obecni twórcy uważają, że ta strategia do projektowania anty-własnej szczepionki i do uzyskania anty-własnej odporności, jest ogólnie stosowaną technologią, która sama z siebie ma poziom wynalazczy. Powinno to być szczególnie odpowiednie w przypadkach, w których własny antygen mający na celu obniżenie, występuje w organizmie w wystarczającej obfitości, tak że samostymulacja odpowiedzi odpornościowej może zaistnieć. Zatem, wszystkie powyższe ujawnienia rozwiązania jak do tej pory dotyczą dostarczenia anty-własnej odpowiedzi odpornościowej przeciwko APP lub Αβ stosują się mutatis mutandis do immunizacji przeciwko innym własnym polipeptydom, zwłaszcza tym, które są obecne w wystarczającej ilości, co pozwala na utrzymanie odpowiedzi odpornościowej w postaci niekontrolowanych autoimmunizacyjnych warunków, ponieważ autologiczne epitopy TH istotnego własnego polipeptydu kierują odpowiedzią odpornościową.
P r z y k ł a d 1
Rozwiązanie obejmujące autoszczepienie w celu immunizacji przeciwko AD
Fakt, że mysz z nokautem genu kodującego białko Αβ nie wykazuje żadnych anormalnych lub szkodliwych efektów ubocznych, sugeruje, że usunięcie lub obniżenie ilości Αβ będzie bezpieczne, Zheng H. (1996).
Opublikowane doświadczenia, w których transgeniczne zwierzęta są immunizowane przeciwko transgenicznemu ludzkiemu białku Αβ, sugerują że jeśli było możliwe przełamanie autotolerancji, obniżanie poziomu (regulacja w dół) Αβ może być otrzymana przez autoreaktywne przeciwciała. Te doświadczenia ponadto sugerują, takie obniżenie Αβ potencjalnie mogłoby zarówno zapobiegać tworzeniu płytek a nawet usuwać już utworzone płytki Αβ z mózgu, porównaj Schenk i wsp. (1999). Lecz, tradycyjnie nie jest możliwe uzyskanie przeciwciał przeciwko własnym białkom.
Opublikowane dane zatem nie dostarczają środków do przełamania rzeczywistej autotolerancji przeciwko rzeczywistym własnym białkom. Również dane nie dostarczają informacji jak spowodować, aby odpornościowa reakcja była skierowana tylko lub przede wszystkim przeciwko złogom Αβ, a nie przeciwko błonie komórkowej, z którą związane jest prekursorowe białko Αβ (APP), jeśli jest to uważane za konieczne. Odpowiedzi odpornościowe wytworzone stosując istniejącą technologię mogą przypuszczalnie wytwarzać odpowiedzi odpornościowe na własne białka w nieregulowany sposób, tak że niepożądana i nadmierna autoreaktywność przeciwko części białka Αβ może być wytworzona. Zatem, stosując istniejące strategie immunizacji najprawdopodobniej będzie niemożliwe, aby wytworzyć silne odpowiedzi odpornościowe przeciwko własnym białkom, a ponadto będzie to niebezpieczne ze względu na potencjalną silną reaktywność krzyżową ze związanym z błoną APP, który jest obecny w dużej liczbie komórek w CNS (ośrodkowym układzie nerwowym).
PL 215 125 B1
Obecny wynalazek dostarcza środki skutecznego wytwarzania silnej regulowanej odpowiedzi odpornościowej na rzeczywiste własne białka, które potencjalnie mogą tworzyć płytki i powodują poważne choroby CNS (ośrodkowego układu nerwowego) lub w innych obszarach ciała. Bezpieczna i wydajna terapeutyczna szczepionka z ludzkiego białka Αβ będzie opracowana, dzięki zastosowaniu tej technologii do leczenia choroby Alzheimera.
W świetle powyższego opisu, jest możliwe przypuszczać, że AD, choroba jak się przewiduje, która osłabi system opieki zdrowotnej w następnym wieku, może być uleczalna, lub takie szczepionki jak opisano mogłyby przynajmniej stanowić skuteczne terapeutyczne podejście do leczenia objawów i postępu tej choroby. Technika ta przedstawia całkiem nowe immunologiczne podejście do blokowania amyloidowych złogów w chorobie Alzheimera jak i innych neurologicznych chorób.
W poniższej tabeli, przedstawiono 35 rozważanych konstruktów. Wszystkie pozycje podane w tabeli odnoszą się do wyjściowej metioniny z APP (pierwszy aminokwas w SEK NR ID: 2) i obejmują zarówno rozpoczynający jak i końcowy aminokwas, np. fragment 672 - 714 obejmuje zarówno aminokwas 672 jak i 714. Rozpoczynająca jak i końcowa pozycja dla P2 i P30 wskazuje, że epitop podstawia część fragmentu APP w pozycjach wskazanych (obie pozycje objęte zostały podstawieniem) w większości konstruktów, wprowadzone epitopy podstawiają fragment o długości epitopu. Gwiazdki w tabeli mają poniższe znaczenie:
*) Tylko jedna pozycja dla P2 i P30 wskazuje, że epitop został wprowadzony do pochodnej APP w pozycji wskazanej (epitop rozpoczyna się w aminokwasie przyległym C-końcowo do danej pozycji).
**) Konstrukt 34 zawiera trzy identyczne fragmenty APP rozdzielone odpowiednio przez P30 i P2.
***) Konstrukt 35 zawiera dziewięć identycznych fragmentów APP rozdzielonych przez przemienne epitopy P30 i P2.
PL 215 125 B1
PL 215 125 B1
Część APP, przeciwko której wytworzenie odpowiedzi jest najbardziej interesujące, stanowi rdzeń 43 aminokwasów peptydu Αβ (Αβ-43, odpowiadający SEK NR ID: 2, reszty 672-714), który jest głównym składnikiem płytki amyloidowej w mózgach w chorobie Alzheimera. Ten fragment APP stanowi część wszystkich konstruktów wymienionych powyżej.
Warianty 1 i 2 zawierają część APP w górę od Αβ-43, w której modelowe epitopy P2 i P30 zostały umieszczone. Warianty 1 i 3-8 wszystkie zawierają fragment C-100, który jak wykazano jest neurotoksyczny - fragment C-100 odpowiada resztom aminokwasowym 714-770 z SEK NR ID: 2. W wariantach 3-5 epitopy podstawiają część fragmentu C-100 podczas gdy w wariantach 6-8 zostały wprowadzone do C-100.
Warianty 9-35 zawierają tylko rdzeniowe białko Αβ-43. W wariantach 9-13, P2 i P30 sprzęgano z każdym końcem Αβ-43; w 14-21 P2 i P30 podstawiają część Αβ-43; w 22-33 P2 i P30 wprowadzono do Αβ-43; 34 zawiera trzy identyczne Αβ-43 fragmenty rozdzielone przez odpowiednio P30 i P2, 35 zawiera 9 powtórzeń Αβ-43 rozdzielonych przez przemienne epitopy P2 i P30.
Skrócone części omówionego powyżej białka Αβ-43 mogą również być stosowane w immunogennych analogach według wynalazku. Zwłaszcza korzystne są obcięte Αβ(1-42), Αβ(1-40), Αβ(1-39), Αβ(1-35), Αβ(1-34), Αβ(1-34), Αβ(1-28), Αβ(1-12), Αβ(1-5), Αβ(13-28), Αβ(13-35), Αβ(17-28), Αβ(25-35), Αβ(35-40), Αβ(36-42) i Αβ(35-42) (w których liczby w nawiasach wskazują aminokwasowe obszary z Αβ-43, które stanowią istotny fragment - Αβ(35-40) jest np. identyczny z aminokwasami 706-711 z SEK NR ID: 2). Wszystkie te warianty ze skróconymi częściami Αβ-43 mogą być wytworzone z fragmentów Αβ opisanych w niniejszym opisie, w szczególności z wariantów 9, 10, 11, 12 i 13.
W pewnych przypadkach, korzystnie jest, aby Αβ-43 lub ich fragmenty były zmutowane. Zwłaszcza korzystne są podstawione warianty, w których metionina w pozycji 35 w Αβ-43 została podstawiona, korzystnie leucyną lub izoieucyną, lub po prostu usunięta. Zwłaszcza korzystne analogi zawierają jedną pojedynczą metioninę, która jest zlokalizowana na C-końcu, zarówno ponieważ występuje ona naturalnie w amyloidogennym polipeptydzie lub obcym epitopie TH, lub ponieważ została wprowadzona lub dodana. Zatem, również korzystnie część analogu, która obejmuje obce epitopy TH jest wolna od metioniny, z wyjątkiem możliwej C-końcowej lokalizacji metioniny.
Rzeczywiście, jest ogólnie korzystne, aby wszystkie analogi APP lub Αβ, które są stosowane według obecnego wynalazku miały wspólną charakterystykę zasadniczo obejmującą jedną pojedynczą metioninę, która jest umiejscowiona jako C-końcowy aminokwas w analogu, przy czym inne metioniny zarówno w amyloidogennym polipeptydzie lub obcym epitopie TH usunięto lub podstawiono przez kolejne aminokwasy.
Ponadto jedna interesująca mutacja stanowi delecję lub podstawienie fenyolalaniny w pozycji 19 w Αβ-43 i jest szczególnie korzystne, aby ta mutacja była podstawieniem tej reszty fenyolalaniny proliną.
Poniższa tabela przedstawia grupę szczególnie korzystnych konstruktów, które działają z ciętymi lub mutacjami Αβ-43:
Wariant Nr Segment Λβ zastosowany w cząsteczce względem 1 aminokwasu Λβ (1-42/43) Pozycja segmentu Λβ względem 1 aminokwasu cząsteczki Pozycja epitopu P2 względem 1 aminokwasu cząsteczki Pozycja epitopu P30 względem 1 aminokwasu cząsteczki Całkowita długość cząsteczki (aa)
36 1-28 22-49 50-64 1-21 64
37 1-12 (a) + 13-28 (b) 1-12 (a) + 49-64 (b) 34-48 13-33 64
38 1-12 (x 3) 1-12, 34-45, 61-72 46-60 13-33 72
39 13-28 (x 3) 1-16, 38-53, 69-84 54-68 17-37 84
40 1-12 (a) + 13-35 (b) + 36-42 (c) 1-12 (a) + 34-56 (b) + 72-78 (c) 57-71 13-33 78
41 1-28 (x 3) 1-28, 50-77, 93-120 78-92 29-49 120
42 1-43 (F119P/M35K) 1-43 65-79 44-64 79
W tej tabeli, segment Αβ zastosowany w cząsteczce jest określony przez numery aminokwasów względem 1 aminokwasu cząsteczki Αβ(1-42/43), to jest 1-28 oznacza, że fragment 1-28 Αβ(1-42/43) jest zastosowany w cząsteczce. Jeśli dwa lub więcej różnych segmentów jest zastosowanych, oba są
PL 215 125 B1 wskazane w tabeli, to jest 1-12 (a) + 13-28 (b) oznaczają, że oba fragmenty: fragment 1-12 i fragment 13-28 Αβ(1-42/43) są zastosowane w cząsteczce.
Również, jeśli ten sam segment jest obecny w więcej niż jednej kopii w konstrukcie jest przedstawiony w tabeli, to jest 1-12 (x3) wykazuje, że fragment 1-12 Αβ(1-42/43) jest obecny w trzech kopiach w konstrukcie.
Ponadto, pozycja segmentu Αβ w cząsteczce jest wskazana przez aminokwasową pozycję względem pierwszego aminokwasu cząsteczki, to jest 22-49 wskazuje, że rozpatrywany fragment Αβ jest umiejscowiony od aminokwasu 22 do aminokwasu 49 w cząsteczce, obie pozycje są włączone. Pozycje epitopów P2 i P30 są wskazane równoważnie. Jeśli dwa lub więcej różnych fragmentów Αβ zastosowano w cząsteczce, ich pozycje są wszystkie przedstawione, to jest 1-12 (a) + 49-64 (b) oznacza, że fragment (a) jest umiejscowiony od aminokwasu 1-12 w cząsteczce i fragment (b) od aminokwasu 49-64.
Ponadto, jeśli więcej niż jedna kopia tego samego fragmentu jest obecna w cząsteczce, pozycje dla wszystkich kopii przedstawiono, jako 1-12, 34-45, 61-72 wykazując, że trzy kopie fragmentu Αβ są umieszczone w cząsteczce odpowiednio od pozycji 1-12, 34-45 i 61-72.
Na koniec, całkowita długość wskazania każdej cząsteczki obejmuje zarówno fragment(y) Αβ jak i epitopy P2 i P30.
Wariant 42 zawiera dwa aminokwasowe podstawienia w pozycjach 19 (phe do pro) i 35 (met do lys) jak wskazano w kolumnie przedstawiającej fragmenty Αβ.
Patrz Fig. 1 i tabele powyżej, w celu uzyskania szczegółów odnośnie poszczególnych miejsc wprowadzenia obcych epitopów limfocytów T.
Jeden kolejny typ konstruktu jest zwłaszcza korzystny. Ponieważ celem obecnego wynalazku jest uniknięcie zniszczenia komórek wytwarzających APP, podczas gdy usunięcie Αβ jest pożądane, wydaje się osiągalne wytworzenie konstruktów autoszczepionkowych obejmujących tylko te części Αβ, które nie są odsłonięte do fazy zewnątrz komórkowej, gdy są obecne w APP. Zatem, takie konstrukty potrzebowałyby zawierać przynajmniej jeden epitop limfocytów B pochodzący z aminokwasowego fragmentu zdefiniowanego przez aminokwasy 700-714 z SEK NR ID: 2. Ponieważ przewiduje się, że taki krótko polipeptydowy fragment będzie tylko słabo immunogenny, korzystnie taki konstrukt autoszczepionki obejmuje kilka kopii epitopu limfocytów B, np. w postaci konstruktu mającego strukturę przedstawioną jako wzór I w opisanym szczegółowo ujawnieniu według wynalazku, porównaj powyżej. W tej wersji wzoru I, określenia amyloide1-amyloidex są epitopem x limfocytów B zawierającym sekwencje aminokwasowe pochodzące z aminokwasów 700-714 z SEK NR ID: 2. Korzystną alternatywą jest powyżej opisana szczegółowo możliwość sprzęgania amyloidogennego (poli)peptydu i wybranego obcego epitopu T pomocniczego przez wiązanie amidowe do wielocukrowej cząsteczki nośnika w ten sposób wielokrotne prezentacje „słabego epitopu utworzonego przez aminokwasy 700-714 z SEK NR ID: 2 stają się możliwe i również możliwy staje się dobór optymalnego stosunku epitopów limfocytów B i epitopów limfocytów T.
P r z y k ł a d 2
Immunizacja transgenicznych myszy Ae i zmodyfikowane białka według wynalazku
Konstrukcja DNA kodującego hAB43+-34. Gen hAB43+-34 skonstruowano w kilku etapach. Po pierwsze fragment PCR wytworzono z użyciem starterów ME#801 (SEK NR ID: 10) i ME#802 (SEK NR ID: 11) stosując starter ME#800 (SEK NR ID: 9) jako matrycę. ME#800 koduje ludzki fragment abeta-43 z optymalizowanymi kodonami E. coli. ME#801 i 802 dodaje odpowiednie miejsca restrykcyjne do fragmentu.
Fragment PCR oczyszczano, trawiono NcoI i HindIII, oczyszczono ponownie i klonowano w miejsce po trawieniu NcoI-HindIII i oczyszczono wektor ekspresyjny pET28b+ E. coli. Otrzymany plazmid kodujący ludzki Ae-43 typu dzikiego nazwano pAB1.
W następnym etapie epitop pomocniczy T, P2, dodano do końca C cząsteczki. Starter ME#806 (SEK NR ID: 12) zawiera sekwencję kodującą epitop P2, tak utworzono fuzyjne połączenie pomiędzy P2 i Abeta-43 w wyniku reakcji PCR.
Klonowanie przeprowadzono przez wytworzenie fragmentu z PCR stosując startery ME#178 (SEK NR ID: 8) i ME#806 stosując pAB1 jako matrycę. Fragment oczyszczano, trawiono NcoI i HindIII, oczyszczono ponownie i klonowano w miejsce trawione NcoI-HindIII i oczyszczono wektor pET28b+. Otrzymany plazmid nazwano pAB2.
PL 215 125 B1
W analogiczny sposób, drugi plazmid wytworzono przenosząc kodującą sekwencję Αβ-43 innym epitopem pomocniczym T, P30, dodanym na N-końcu. To wykonano przez wytworzenie fragmentu PCR stosując startery ME#105 (SEK NR ID: 7) i ME#807 (SEK NR ID: 13) stosując pAB1 jako matrycę.
Fragment oczyszczano, trawiono NcoI i HindIII, oczyszczono ponownie i klonowano w miejsce trawione NcoI-HindIII i oczyszczono wektor pET28b+. Otrzymany plazmid nazwano pAB3.
W trzecim etapie, drugie powtórzenie Αβ-43 dodano do końca C do epitopu P2 plazmidu pAB2 stosując starter ME#809 (SEK NR ID: 14). ME#809 w tym samym czasie wytwarza miejsce BamHI tuż po powtórzeniu Αβ-43. Fragment PCR wytworzono stosując startery ME#178 i ME#809 i pAB2 jako matrycę. Fragment trawiono NcoI i HindIII, oczyszczono i klonowano w miejsce trawione NcoI-HindIII i oczyszczono wektor pET28b+. Plazmid ten nazwano pAB4.
Na koniec, powtórzona sekwencja epitop P30 - Αβ-43 z pAB3 była klonowana do plazmidu pAB4. Przeprowadzono to przez wytworzenie fragmentu PCR stosując startery ME#811 (SEK NR ID: 16) i ME#105 stosując pAB3 jako matrycę. Fragment oczyszczano i zastosowano jako starter w kolejnej PCR z ME#810 (SEK NR ID: 15) stosując pAB3 jako matrycę. Otrzymany fragment oczyszczano, trawiono BamHI i HindIII i klonowano w miejsce trawione BamHI-HindIII i oczyszczono plazmid pAB4. Otrzymany plazmid, pAB5, koduje cząsteczkę hAB43+-34.
Wszystkie procedury PCR i procedury klonowania przeprowadzono zasadniczo jak opisano w pracy Sambrooka, J., Fritscha, E.F. & Maniatisa, T. 1989 „Molecular Cloning: a laboratory manual, wyd. 2. Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.
We wszystkich procedurach klonowania zastosowano komórki E. coli K-12, szczep Top-10 F' (Stratagene, USA). Wektor pET28b+ zakupiono w Novagen, USA. Wszystkie startery zsyntetyzowano w DNA Technology, Dania.
Ekspresja i oczyszczanie hAB43H+-34. Białko hAB43+-34 kodowane przez pAB5 wyrażano w komórkach BL21-Gold (Novagen) E. coli, jak opisał producent układu pET28b+ (Novagen).
Wyrażane białko hAB43+-34 oczyszczano do poziomu czystości powyżej 85% przez przemycie ciałek inkluzyjnych, a następnie chromatografię kationowo wymienną stosując urządzenie do oczyszczania BioCad (PerSeptive Biosystems, USA) w obecności 6 M mocznika. Mocznik następnie usuwano przez stopniową dializę wobec roztworu zawierającego obniżające się ilości mocznika. Końcowy bufor był 10 mM Tris, pH 8,5.
Badanie immunizacyjne. Do badania zastosowano myszy transgeniczne pod kątem ludzkiego APP (prekursorowe białko Alzheimera). Myszy te, nazwane TgRND8+, prowadzą ekspresję zmutowanej formy APP, która prowadzi do wysokiego stężenia Αβ-40 i Αβ-42 w mózgach myszy (Janus, C. i wsp.).
Myszy (8-10 myszy na grupę) immunizowano bądź Abeta-42 (SEK NR ID: 2, reszty 673-714, zsyntetyzowany za pomocą standardowej strategii Fmoc) lub wariantem hAB43+-34 (konstrukt 34 w tabeli w przykładzie 1, uzyskiwany rekombinacyjnie) cztery razy w dwu tygodniowych odstępach. Dawki wynosiły bądź 100 mg dla Αβ bądź 50 mg dla hAB43+-34. Myszy skrwawiono w dniu 43 (po trzech iniekcjach) i po dniu 52 (po czterech iniekcjach) i surowice zastosowano do wyznaczenia poziomu specyficznych mian anty-Ae-42 stosując bezpośrednie oznaczenie ELISA Αβ-42.
Poniższa tabela wykazuje średnią względem mian anty-Abeta-42.
Immunogen Dzień 43 (po 3 Immunizacjach) Dzień 52 (po 4 Immunizacjach)
Λβ-42 4000 3000
hAB43+-34 16000 23000
Jak będzie zrozumiałe, miana przeciwciał otrzymane przy immunizacji wariantem hAB43+-34 Αβ były w przybliżeniu 4 razy i 7,5 razy wyższe po 3 i 4 immunizacjach, odpowiednio, niż miana otrzymane przy zastosowaniu jako immunogenu niezmienionego Αβ-42 typu dzikiego. Fakt ten jest przekładany dalej w perspektywie, gdy bierze się pod uwagę fakt, że ilość wariantu zastosowanego do immunizacji wynosił tylko 50% ilości sekwencji typu dzikiego zastosowanej do immunizacji.
P r z y k ł a d 3
Synteza szczepionki peptydu Αβ z kopolimerem stosując aktywowany poli-hydroksypolimer jako czynnik sieciujący
Wprowadzenie. Tradycyjna sprzężona szczepionka obejmuje polipeptyd sprzężony kowalencyjnie z białkiem nośnika. Peptyd zawiera epitop limfocytów B i nośnikowe białko dostarcza epitopy pomocnicze T. Jednakże, większość nośnika białka będzie zazwyczaj nieistotna jako źródło epitopów pomocniczych T, gdyż jedynie mniejsza część całkowitej sekwencji zawiera istotne epitopy pomocniPL 215 125 B1 cze T. Takie epitopy mogą być zdefiniowane i zsyntetyzowane jako peptydy o np. 12-15 aminokwasach. Jeśli te peptydy połączone są kowalencyjnie z peptydami zawierającymi epitopy limfocytów B, np. poprzez multiwalentne aktywowane poli-hydroksypolimery, cząsteczka szczepionki, która tylko zawiera istotne części może być otrzymana. Jest ponadto możliwe dostarczenie sprzężonej szczepionki, która zawiera optymalizowany stosunek pomiędzy epitopami limfocytów B, a epitopami limfocytów T.
Synteza aktywowanego poli-hydroksypolimeru. Poli-hydroksypolimery, takie jak dekstran, skrobia, agaroza itp. mogą być aktywowane chlorkiem 2,2,2-trifluoroetanosulfonylu (chlorek trezylu), zarówno za pośrednictwem homogennej syntezy (dekstran) w N-metylopirolidynonie (NMP) lub za pośrednictwem heterogennej syntezy (skrobia, agaroza, usieciowany dekstran) w np. acetonie.
225 ml suchego N-metylopirolidynonu (NMP) dodano w warunkach suchych do wysuszonego przez liofilizację, rozpuszczalnego w wodzie dekstranu (4,5 g, 83 mmoli, stopień czystości kliniczny, masa cząst. (średnia) 78000) w 500 ml okrągłodennej kolbie wyposażonej w mieszadło magnetyczne. Kolbę umieszczono w 60°C łaźni olejowej z mieszadłem magnetycznym. Temperaturę podniesiono do 92°C w czasie 20 min. Gdy dekstran się rozpuścił, kolbę natychmiast usunięto z łaźni olejowej i temperaturę w łaźni obniżono do 40°C. Kolbę umieszczono w łaźni olejowej ponownie, nadal z mieszadłem magnetycznym i wkroplono chlorek trezylu (2,764 ml, 25 mmoli). Po 15 min, wkroplono suchą pirydynę (bezwodna, 2,020 ml, 25 mmoli). Kolbę usunięto z łaźni olejowej i mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Produkt (Dekstran Aktywowany Tresylem, TAD) wytrącono w 1200 ml zimnego etanolu (99,9%). Supernatant zdekantowano i wytrącony osad zebrano do 50 ml polipropylenowych probówek wirując przy 2000 rpm. Wytrącony osad rozpuszczono w 50 ml 0,5% kwasu octowego, dializowano 2 razy wobec 5000 ml 0,5% kwasu octowego i liofilizowano. TAD może być przechowywany jako proszek po liofilizacji w temp. -20°C.
Nierozpuszczalny polihydroksypolimer, taki jak agaroza lub usieciowany dekstran może być aktywowany trezylem przez wytworzenie zawiesiny polihydroksypolimeru w np. acetonie i przeprowadzenia syntezy w fazie stałej. Aktywowany polihydroksypolimer może być zebrany przez sączenie. Odpowiednie sposoby opisano w pracy np. Nilssona K i Mosbacha K (1987), Methods in Enzymology 135, str. 67 i w Hermansson GT i wsp. (1992), w „Immobilizowany Affinity Ligand Techniques, Academic Press, Inc., str. 87.
Synteza szczepionki kopolimerów peptydu ABeta. TAD (10 mg) jest rozpuszczony w 100 μI H2O i 1000 μl buforu węglanowego, pH 9,6, zawierającego 5 mg Αβ-42 (SEK NR ID: 2, reszty 673-714), dodano 2,5 mg P2 (SEK NR ID: 4) i 2,5 mg P30 (SEK NR ID: 6). Wszystkie peptydy Αβ-42 i P2 i P30 zawierają chronione grupy lizynowe: są one w postaci grup lizyny chronionych 1-(4,4-Dimetylo-2,6-dioksocykloheks-1-ylideno)etylu (Dde). Peptydy wytworzono za pośrednictwem standardowej strategii Fmoc, przy czym tradycyjny Fmoc-Lys(Boc)-OH został podstawiony Fmoc-Lys(Dde)-OH (otrzymanym z Novabiochem, nr kat. 04-12-1121), to jest ε-aminowa grupa w lizynie jest chroniona Dde zamiast Boc.
Wartość pH mierzono i dostosowano do wartości 9,6 stosując 1 M HCl. Po 2,5 godzinach w temperaturze pokojowej, hydrazyna z 80% roztworu została dodana do końcowego stężenia hydrazyny 8% i roztwór inkubowano przez kolejne 30 min. w temperaturze pokojowej i liofilizowano natychmiast po zakończeniu. Produkt liofilizacji rozpuszczono w H2O i dializowano obficie wobec H2O przed końcowym suszeniem sublimacyjnym.
Proporcje pomiędzy epitopami limfocytów B (Αβ) a epitopami pomocniczymi T (P2 i P30) w końcowym produkcie mogą być różne, stosując różne stężenia tych peptydów w etapie syntezy. Ponadto, końcowy produkt może być znakowany np. mannozą (tak aby ukierunkować koniugat na komórki APC) przez dodanie aminowanej mannozy do buforu węglanowego w etapie syntezy.
Jeśli nierozpuszczalny aktywowany polihydroksypolimer zastosowano do połączenia peptydów zawierających epitop limfocytów B i epitopy pomocnicze T, sprzęganie z polimerem może być przeprowadzone jako synteza w fazie stałej i końcowy produkt zbierano i oczyszczono przez przemycie i filtrację.
Jak wymieniono w ogólnym opisie, obecnie opisane podejście do wytwarzania szczepionki opartej na peptydzie może być zastosowane do dowolnego innego polipeptydowego antygenu, przy czym byłoby dogodne do wytwarzania czysto syntetycznej peptydowej szczepionki, w której rozpatrywany polipeptydowy antygen dostarcza wystarczającą immunogenność w jednym pojedynczym peptydzie:
PL 215 125 B1
P r z y k ł a d 4
Synteza kopolimerowej szczepionki peptydowej
TAD (10 mg) rozpuszczono w 100 μΙ H2O i 1000 μΙ buforu węglanowego, pH 9,6, zawierającego 1-5 mg peptydu A (dowolny immunogenny peptyd będący przedmiotem zainteresowania), dodano 1-5 mg P2 (epitop anatoksyny błonicy P2) i 1-5 mg P30 (epitopu anatoksyny błonicy P30). Wartość pH mierzono i dostosowano do 9,6 stosując 0,1 M HCl. Po 2,5 godzinach w temperaturze pokojowej roztwór liofilizowano natychmiast. Produkt liofilizacji rozpuszczono w H2O i dializowano obficie w obecności H2O lub odsalano w kolumnie z żelem filtracyjnym przed końcowym suszeniem sublimacyjnym. W przypadku peptydów mających lizynę w sekwencji ε-amina w lizynowym łańcuchu powinna być zabezpieczona przez Dde stosując pochodną Fmoc-Lys(Dde)-OH w syntezie (Gregorius i Theisen 2001, wysłane). Po sprzęganiu, hydrazynę z 80% roztworu dodano do końcowego stężenia hydrazyny pomiędzy 1-20% i roztwór inkubowano przez kolejne 30 min. w temperaturze pokojowej, liofilizowano natychmiast i dializowano obficie wobec H2O lub odsalano w kolumnie z żelem filtracyjnym przed końcowym suszeniem sublimacyjnym. Zasadę przedstawiono schematyczne na Fig. 2.
Takie immunogeny wykorzystane przez twórców z krótkim C-końcowym fragmentem białka OspC Borrelia burgdorferi oznaczono jako „peptyd A i epitopem anatoksyny błonicy (P2 lub P30) jako peptyd B. Wyniki badania immunizacji tym antygenem ujawniły, że tylko immunogen obejmujący fragment OspC i obcy epitop błonicy odpowiadające haplotypowi MHC szczepionych myszy były zdolne do indukowania przeciwciał reaktywnych z OspC u tych myszy. Przeciwnie, cząsteczka zawierająca tylko peptyd OspC była niezdolna do indukowania wytwarzania przeciwciał i to samo było prawdziwe dla mieszaniny 2 immunogenów, przy czym jeden zawierał OspC a drugi epitop. Uważa się zatem, że objęcie w tym samym polihydroksypolimerowym nośniku jest nadrzędne, jeśli nie niezbędne, w celu indukowania przeciwciał przeciwko krótkiemu peptydowemu haptenowi, takiemu jak OspC.
Literatura
Brookmeyer, R.; Gray, S.; Kawas, C. (1998). Projections of Alzheimer's Disease in the United States and the Public Health Impact of Delaying Disease Onset. American Journal of Public Health, 88(9), 1337-1342.
Buttini, M.; Orth, M.; Bellosta, S.; Akeefe, H.; Pitas, R.E.; Wyss-Coray, T.; Mucke, L.; Mahley, R.W. (1999). Expression of Human Apolipoprotein E3 or E4 in the Brains of Apoe-/- Mice: Isoform-Specific Effects on Neurodegeneration. Journal of Neuroscience, 19, 4867-4880.
Clark, L.N.; Poorkaj, P.; Wszolek, Z.; Geschwind, D.H.; Nasreddine, Z.S.; Miller, B.; Li, D.; Payami, H.; Awert, F. ; Markopoulou, K.; Andreadis, A.; D'Souza, I.; Lee, V.M.; Reed, L.; Trojanowski, J.Q.; Zhukareva, V.; Bird, T.; Schellenberg, G.; Wilhelmsen, K.C. (1998). Pathogenic Implications of Mutations in the Tau Gene in Pallido-Ponto-Nigral Degeneration and Related Neurodegenerative Disorders Linked to Chromosome 17. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 95(22), 13103-13107.
Gupta, R. K. et. al. (1998), Dev Biol Stand. 92: 63-78.
Hsiao K. i wsp. (1998) Transgenic mice expressing Alzheimer amyloid precursor proteins, Exp. Gerontol. 33 (7-8), 883-889 Hutton, M.; Lendon, C.L.; Rizzu, P.; Baker, M.; Froelich, S.; Houlden, H.; Pickering-Brown, S.; Chakraverty, S.; Isaacs, A.; Grover, A.; Hackett, J.; Adamson, J.; Lincoln, S.; Dickson, D.; Davies, P.; Petersen, R.C.; Stevens, M.; de Graaff, E.; Wauters, E.; van Baren, J.; Hillebrand, M.; Joosse, M.; Kwon, J.M.; Nowotny, P.; Che, L.K.; Norton, J.; Morris, J.C.; Reed, L.E.; Trojanowski, J.; Basun, H.; Lannfelt, L.; Neystat, M.; Fahn, S.; Dark, F.; Tannenberg, T.; Dodd, P.; Hayward, N.; Kwok, J.B.J.; Schofield, P.R.; Andreadis, A.; Snowden, J.; Craufurd, D.; Neary, D.; Owen, F.; Oostra, B.A.; Hardy, J.; Goate, A.; van Swieten, J.; Mann, D.; Lynch, T.; Heutink, P. (1998). Association of Missense and 5'-Splice-Site Mutations in Tau with the Inherited Dementia FTDP-17. Nature, 393, 702-705.
Janus, C. et. al. (2000), Nature 408: 979-982.
Kas, H.S. (1997) J Microencapsul 14: 689-711
Leon, J.; Cheng, C.K.; Neumann, P.J. (1998). Alzheimer's Disease Care: Costs and Potential Savings. Health Affairs, 17(6), 206-216.
Lippa C. F. i wsp. (1998) Ab-42 deposition precedes other changes in PS-1 Alzheimer's disease. Lancet 352, 1117-1118 Luo, J.-J.; Wallace, W.; Riccioni, T.; Ingram, D.K.; Roth, G.S.; Kusiak,
J.W. (1999). Death of PC12 Cells and Hippocampal Neurons Induced by Adenoviral-Mediated FAD Human Amyloid Precursor Protein Gene Expression. Journal of Neuroscience Research, 55(5), 629-642.
PL 215 125 B1
Naruse, S.; Thinakaran, G.; Luo, J.-J.; Kusiak, J.W.; Tomita, T.; Iwatsubo, T.; Qian, X.; Ginty, D.D.; Price, D.L.; Borchelt, D.R.; Wong, P.C.; Sisodia, S.S. (1998). Effects of PS1 Deficiency on Membrane Protein Trafficking in Neurons. Neuron, 21(5), 1213-1231.
National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999, NIH Publication No. 99-4664.
Pietrobon, P.J. (1995), Pharm Biotechnol. 6: 347-61Poorkaj, P.; Bird, T.D.; Wijsman, E.; Nemens, E.; Garruto, R.M.; Anderson, L.; Andreadis, A.; Wiederhold, W.C.; Raskind, M.; Schellenberg, G.D. (1998). Tau Is a Candidate Gene for Chromosome 17 Frontotemporal Dementia. Annals of Neurology, 43, 815-825.
Schenk, D.; Barbour, R.; Dunn, W.; Gordon, G.; Grajeda, H.; Guido, T.; Hu, K.; Huang, J.; Johnson-Wood, K.; Khan, K. ; Kholodenko, D.; Lee, M.; Liao, Z.; Lieberburg, I.; Motter, R.; Mutter, L.; Soriano, F.; Shopp, G.; Vasquez, N.; Vandevert, C.; Walker, S.; Wogulis, M.; Yednock, T.; Games, D.; Seubert, P. (1999). Immunization with A-beta Attenuates Alzheimer's Disease-Like Pathology in the PDAPP Mouse. Nature, 400(6740), 173-177.
Shekunov, B. et. al. (1999), J. Crystal Growth 198/199: 1345-1351.
Spillantini, M.G.; Murrell, J.R.; Goedert, M.; Farlow, M.R.; Klug, A.; Ghetti, B. (1998). Mutation in the Tau Gene in Familial Multiple System Tauopathy with Presenile Dementia. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 95(13), 7737-7741.
Strittmatter, W.J.; Saunders, A.M.; Schmechel, D.; Pericak-Vance, M.; Enghild, J.; Salvesen, G.S.; Roses, A.D. (1993). Apolipoprotein E: High-Avidity Binding to Αβ and Increased Frequency of Type 4 Allele in Late-Onset Familial Alzheimer Disease. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 90,1977-1981.
Vidal, R.; Frangione, B.; Rostagno, A.; Mead, S.; Revesz, T.; Plant, G.; Ghiso, J. (1999). A StopCodon Mutation in the BRI Gene Associated with Familial British Dementia. Nature, 399: 776-781.
Zheng H. (1996) Mice deficient for the amyloid precursor protein gene. Ann. N Y Acad. Sci., 777, 421-426.
York, P. (1999), PSTT 11: 430-440.
PL 215 125 B1
LISTA SISKWISNCJI <110> Pharmexa A/S <120> Nowy sposób obniżenia poziomu amyloidu <130> P1014PC1 <140>
<141>
<160> 16 <170> Wersja Patentln 3.1 <210> 1 <211> 2313 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1) . .(2313) <220>
<22l> cecha_dowolna <222> (2098)..(2169) <223? nukleotydy kodujące region transmembranowy <220>
<221> cecha_dowolna <222> (2014}..(2313) <223> Nukleotydy kodujące C-100 <220>
<221> cecha_dowolna <222> (2016)..(2144) <223> Abeta 42/43 <220>
<2 2l> cecha_dowolna <222> (2014)..(2142) <223> Abeta 42/43 <400> 1
atg Met 1 ctg Leu ccc Pro ggt Gly ttg Leu 5 ges Ala ctg ctc ctg ctg gcc gcc tgg Trp acg Thr gct Ala 15 cgg Arg 48
Leu Leu Leu Leu Ala 10 Alei
gcg ctg gag gta ccc act gat ggt aat gct ggc ctg ctg gct gaa ccc 96
Al a Leu Glu val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro
20 25 30
cag att gcc atg ttc tgt ggc aga ctg aac atg cac atg aat gtc cag 144
Gin Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gin
35 40 45
aat ggg aag tgg gat tea gat cca tea ggg acc aaa acc tgc att g^a. t 192
Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp
50 55 60
PL 215 125 B1
240
acc aag gaa ggc atc ctg cag tat tgc caa gaa gtc tac cct gaa ctg
Thr 65 tys Glu Gly Ile Leu 70 Gin Tyr Cys Gin Glu 75 Val Tyr Pro Glu Leu 8Q
cag atc acc aat gtg gta gaa gcc aac caa cca gtg acc atc cag aac
Gin Ile Thr Asn Val 85 Val Glu Ala Asn Gin 90 Pro Val Thr Ile Gin 95 Asn
tgg tgc aag cgg ggc cgc aag cag tgc aag acc cat ccc cac ttt gtg
Trp Cys Lys Arg 100 Gly Arg Lys Gin Cys 105 Lys Thr His Pro His 110 Phe Val
att ccc tac cgc tgc tta gtt ggt gag ttt gta agt gat gcc ctt ctc
Ile Pro Tyr 115 Arg Cys Leu val Gly 120 Glu Phe Val Ser Asp 125 Ala Leu Leu
gtt cct gac aag tgc aaa ttc tta cac cag gag agg atg gat gtt tgc
Val Pro 130 Asp Lys Cys Lys Phe 135 Leu His Gin Glu Arg 140 Met Asp val Cys
gaa act cat C *t- fc> cac tgg cac acc gtc gcc aaa gag aca tgc agt gag
Glu 145 Thr His Leu His Trp 150 His Thr Val Ala Lys 155 Glu Thr cys Ser Glu 160
SclCj* agt acc aac ttg cat gac tac ggc atg ttg ctg ccc tgc gga att
Lys Ser Thr Asn Leu 165 His Asp Tyr Gly Met 170 Leu Leu Pro Cys ciy 175 Ile
gac aag ttc ega ggg gta gag ttt gtg tgt tgc cca ctg gct ęjćicL gaa
Asp Lys Phe Arg 180 Gly Vał Glu Phe Val 185 Cys Cys Pro Leu Ala 190 GXv Glu
agt gac aat gtg gat tct gct gat gcg gag gag gat gac teg gat gtc
Ser Asp Asn 195 Val Asp Ser Ala Asp 200 Ala Glu Glu Asp Asp 205 Ser Asp Val
tgg tgg ggc gga gca gac aca gac tat gca gat ggg agt gaa gac aaa
Trp Trp 210 Gly Gly Ala Asp Thr 215 Asp Tyr Ala Asp Gly 22 0 Ser Glu Asp Lys
gta gta gaa gta gca gag gag gaa gaa gtg gct gag gtg gaa gaa gaa
Val 225 Val Glu val Ala Glu 230 Glu Glu Glu Val Ala 235 Glu Val Glu Glu Glu 240
gaa gcc gat gat gac gag gac gat gag gat ggt gat gag gta gag gaa
Glu Ala Asp Asp Asp 245 Glu Asp Asp Glu Asp 250 Gly Asp Glu Val Glu 255 Glu
gag gct gag gaa ccc tac gaa gaa gcc aca gag aga acc acc agc att
Glu Ala Glu Glu 260 Pro Tyr Glu Glu Ala 265 Thr Glu Arg Thr Thr 270 Ser Ile
gcc acc acc acc acc acc acc aca gag tct gtg gaa gag gtg gtt ega
Ala Thr Thr 275 Thr Thr Thr Thr Thr 280 Glu Ser Val Glu Glu 285 Val Val Arg
gag gtg tgc tct gaa caa gcc gag acg ggg ccg tgc ega gca atg atc
Glu Val 290 Cys Ser Glu Gin Ala 295 Glu Thr Gly Pro Cys 300 Arg Ala Met Ile
tcc cgc tgg tac ttt gat gtg act gaa ggg aag tgt gcc cca ttc ttt
Ser 305 Arg Trp Tyr Phe Asp 310 Val Thr Glu Gly Lys 315 cys Ala Pro Phe Phe 320
288
336
384
432
480
528
576
624
672
720
768
816
864
912
960
PL 215 125 B1
tac ggc gga tgt ggc ggc Gly Gly 325 a. sic Asn cgg aac aac Asn ttt gac aca gaa gag tac 1008
Tyr Gly Gly Cys Arg Asn Phe Asp Thr Glu Glu 335 Tyr
tgc atg gcc gtg tgt ggc age gcc atg tcc caa agt tta ctc aag act 1056
Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gin Ser Leu Leu Lys Thr
340 345 350
acc cag gaa cct ctt gcc ega gat cct gtt aaa ctt cct aca 5.C H gca 1104
Thr Gin Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala
355 360 3S5
gcc agt 3CC cct gat gcc gtt gac aag tat ctc gag aca cct ggg gat 1152
Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp
370 375 380
gag aat gaa Glu cat gcc His Ala cat ttc cag aaa gcc aaa gag agg ctt gag gcc 1200
Glu 385 Asn His 390 Phe Gin Lys Ala Lys 395 Glu Arg Leu Gin Al a 400
aag cac ega gag aga atg tcc cag gtc atg aga gaa tgg gaa gag gca 1248
Lys His Arg Glu Arg 405 Met Ser Gin Val Met 410 Arg Glu Trp Glu Glu 415 Ala
gaa cgt caa gca aag aac ttg cct aaa get gat aag aag gca gtt atc 1296
Glu Arg Gin Ala Lye 420 Asn Leu Pro Lys 425 Ala Asp Lys Lys Ala 430 Val Ile
cag cat ttc cag gag aaa gtg gaa tct ttg gaa cag gaa gca gcc aac 1344
Gin. His Phe 435 Gin Glu Lys Yal Glu 440 Ser Li C Glu Gin Glu 445 Al a Ala Asn
gag aga cag cag ctg gtg gag aca cac atg gcc aga gtg gaa gcc atg 1392
Glu Arg 450 Gin Gin Leu Val Glu 455 Thr His Met Ala Arg 460 Val Glu Ala Met
ctc aat gac cgc cgc cgc ctg gcc ctg gag aac tac atc acc get ctg 1440
Leu 4S5 Asn Asp Arg Arg Arg 470 Leu Al Leu Glu Asn 475 Tyr Ile Thr Ala Leu 480
cag get gtt cct cct cgg cct cgt cac gtg 11 c cłSt atg eta aag aag 1483
Gin Ala Val Pro Pro 485 Arg Pro Arg His Yal 4 90 Phe Asn Met Leu Lys 4 95 Lys
tat gtc cgc gca gaa cag aag gac cag cac acc eta aag cat ttc 153 6
Tyr Val Arg Ala Glu 500 Gin Lys Asp Arg 505 Gin His Thr Leu Lys 510 His Phe
gag cat gtg cgc atg gtg gat ccc aag gcc get cag atc cgg tcc 1584
Glu His Val 515 Arg Met Val Asp Pro 520 Lys Lys Ala Ala Gin 525 Ile Arg Ser
cag gtt atg s.ca esc ctc cgt gtg att tat gag cgc atg aat cag tct 1632
Gin Val 530 Met Thr His Leu Arg 535 val lis Tyr Glu Arg 540 Met Asn Gin Ser
ctc tcc ctg ctc tac aac gtg cct gca gtg gcc gag gag att cag gat 1680
Leu 545 Ser Leu Leu Tyr Asn 550 Val Pro Ala Val Ala 555 Glu Glu Ile Gin. Asp 560
gaa gtt gat gag ctg ctt cag aaa gag caa aac tat tea gat gac gtc 172 8
Glu Val Asp Glu Leu Leu Gin Lye Glu Gin Asn Tyr Ser Asp Asp Val
PL 215 125 B1
565 570 575
ttg gcc aac atg att agt gaa cca agg atc agt tac gga aac gat get 1776
Leu Ala Asn Met ile Ser Glu Pro Arg He Ser Tyr Gly Asn Asp Ala
580 585 590
ctc atg cca tet ttg acc gaa acg aaa acc 3CC gtg gag ctc ctt ccc 1824
Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro
S95 600 605
gtg aat gga gag ttc agc ctg gac gat ctc cag c ocj tgg cat tet ttt 1872
Val Asn Gly GlU Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gin Pro Trp His Ser Phe
610 615 62 0
939 get gac tet gtg cca gcc aac aca gaa aac gaa gtt gag cct gtt 1920
Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn. Glu Val Glu Pro Val
625 630 635 640
gat gcc ege cct get gcc gac ega gga ctg acc act ega cca ggt tet 1968
Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser
645 650 655
ggg ttg aca aat atc aag acg 5&g gag atc tet gaa gtg aag atg gat 2016
Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp
660 665 670
gca gaa ttc c9® cat gac tC 3. gga t at gaa gtt cat cat caa aaa ttg 2064
Ala Glu Phe Arg Hl. EJ Asp Ser Gly Tyr Glu val His His G1 n Lys Leu
675 680 685
gtg ttc ttt gca gaa gat gtg ggt tea aac aaa ggt gca atc att gga 2112
Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly
690 695 700
ctc atg gtg ggc ggt p 11 gtc ata gcg aca gtg atc gtc atc acc ttg 2160
Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu
705 710 715 720
gtg atg ctg aag aag aaa cag· tac aca tcc att cat cat ggt gtg gtg 2208
Val Met Leu Lys Lys Lys Gin Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val
725 730 735
gag gtt gac gcc get gtc acc cca gag gag ege cac ctg tcc aag atg 22 56
Glu Vał Asp Al a Al a Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met
740 745 750
cag cag aac ggc tac gaa aat cca acc tac aag ttc ttt gag cag atg 2304
Gin Gin Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gin Met
755 760 765
cag aac tag 2313
Gin Asn 770 <210? 2 <211? 770 <212? PRT <213? Homo sapiens <400? 2
Met Den Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Ara 15 10 15
PL 215 125 B1
Ala Leu Glu Val 20 Pro Thr Asp Gly Asn 25 Ala Gly Leu Leu Ala 30 Glu Pro
Gin Ile Ala 35 Met Phe Cys Gly Arg 40 Leu Asa Met His Met 45 Asn Val Gin
Asn Gly 50 Lys Trp Asp Ser Asp 55 Pro Ser Gly Thr Lys 60 Thr Cys Ile Asp
Thr 65 Lys Glu Gly Ile Leu 70 Gin Tyr Cys Gin Glu 75 Val Tyr Pro Glu Leu 80
Gin Ile Thr Asn Val 85 Val Glu Ala Asn Gin 90 Pro Val Thr Ile Gin 95 Asn
Trp Cys Lys Arg 100 Gly Arg Lys Gin Cys 105 Lys Thr His Pro His 110 Phe Val
Ile Pro Tyr 115 Arg Cys Leu Val Gly 120 Glu Phe Val Ser Asp 125 Ala Leu Leu
Val Pro 130 Asp Lys Cys Lys Phe 13 5 Leu His Gin Glu Arg 14 0 Met Asp val Cys
Gin 145 Thr His Leu His Trp 150 His Thr Val Ala Lys 155 Glu Thr Cys Ser Glu 160
Lys Ser Thr Asn Leu 165 His Asp Tyr Gly Met 170 Leu Leu Pro Cys Gly 175 Ile
Asp Lys Phe Arg ISO Gly Val Glu Phe Val 185 Cys Cys Pro Leu Ala 190 Glu Glu
Ser Asp Asn 195 Val Asp Ser Ala Asp 200 Ala Glu Glu Asp Asp 205 Ser ASp Val
Trp Trp 210 Gly Gly Ala Asp Thr 215 Asp Tyr Ala Asp Gly 220 Ser Glu Asp Lys
Val 225 Val Glu Val Ala Glu 230 Glu Glu Glu Val Ala 235 Glu Val Glu Glu Glu 240
Glu Ala Asp Asp Asp 245 Glu Asp Asp Glu Asp 250 Gly Asp Glu Val Glu 255 Glu
Glu Ala Glu Glu 260 Pro Tyr Glu Glu Ala 265 Thr Glu Arg Thr Thr 270 Ser Ile
Ala Thr Thr 275 Thr Thr Thr Thr Thr 2S0 Glu Ser Val Glu Glu 2S5 Val Val Arg
Glu val 290 Cys Ser Glu Gin Ala 295 Glu Thr Gly Pro cys 300 Arg Ala Met Ile
Ser 305 Arg Trp Tyr Phe Asp 310 Val Thr Glu Gly Lys 315 Cys Al. ci Pro Phe Phe 320
Tyr Gly Gly Cys Gly 325 GlY Asn Arg Asn Asn 330 Phe Asp Thr Glu Glu 335 Tyr
Cys Met Ala Val 340 Cys Gly Ser Ala Met 345 Ser Gin Ser Leu Leu 350 Lys Thr
PL 215 125 B1
Thr Gin Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Yal Lys Leu Pro Thr Thr Ala 3SS 360 365
Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380
Glu Asn Glu His Ala His Phe Gin Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala
385 390 395 400
Lya His Arg Glu Arg Met Ser Gin Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala
405 410 415
Glu Arg Gin Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430
Gin His Phe Gin Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gin Glu Ala Ala Asn 435 440 445
Glu Arg Gin Gin Leu val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460
Len Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu
465 470 475 480
Gin Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys
485 490 435
Tyr Val Arg Ala Glu Gin Lys Asp Arg Gin His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510
Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gin Ile Arg Ser 515 520 525
Gin Yal Met Thr His Leu Arg Yal Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gin Ser 530 535 540
Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Yal Pro Ala Yal Ala Glu Glu Ile Gin Asp
545 550 555 560
Glu Val Asp Glu Leu Leu Gin Lys Glu Gin Asn Tyr Ser Asp Asp Yal
565 570 575
Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590
Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Yal Glu Leu Leu Pro 595 600 605
Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gin Pro Trp His Ser Phe 610 615 620
Gly Ala Asp Ser Yal pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Yal Glu Pro Val
625 630 635 640
Agp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser
645 650 655
Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Yal Lys Met Asp 660 665 670
Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu 675 6S0 685
Yal Phe Phe Ala Glu Asp Yal Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly
PL 215 125 B1
690 695 700
Leu 705 Net Val Gly Gly Val 710 Val Ile Ala Thr Val 715 Ile Val Ile Thr Leu 720
Val Met Leu Lys Lys 725 Lys Gin Tyr Thr Ser 730 Tle His His Gly Val 73S Val
Glu Vał Asp Ala 740 Ala Val Thr Pro Glu 745 Glu Arg His Leu Ser 750 Lys Met
Gin Gin Asn 755 Gly Tyr Glu Asn Pro 760 Thr Tyr Lys Phe Phe 7S5 Glu Gin Met
Gin Asn 770 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Clostridlum tetani <220>
<221> CDS <222> il)..(45) <223 > DNA kodujący epitop P2 <400> 3 cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg 45
Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridlum tetani <400> 4
Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 15 10 15 <210> 5 <211> 63 <212> DNA <213s· Clostridlum tetani <220>
<221> CDS <222> (1)..(63) <223> DNA kodujący epitop P30 <400> 5 ttc aac aac ttc acc gta age ttc tgg ctg cgt gtt ccg aaa gtt age 48
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
10 15 gct age cac ctg gaa 63
Ala Ser His Leu Glu
PL 215 125 B1 <210? 6 <211? 21 <212? ΡΕΤ <213? Clostridium tetani <400? 6
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Yal Ser 15 10 15
Ala Ser His Leu Glu 20 <210? 7 <211> 21 <212?
<213?
DNA
Syntetyczny <223? Syntetyczny starter PCR <400? 7 caactcagct tcctttcggg c <210? S <211? 21 <212? DNA <213? syntetyczny <223? Syntetyczny starter PCR <400? 8 agatctcgat cccgcgaaat t <210?
<211?
<212?
135
DNA <213? Syntetyczny <223? Syntetyczny starter PCR <400? 9 atggatgcag aattccgtca cgactecggt tacgaagttc accaccagaa actggttttc 60 ttcgcagaag atgttggttc caacaaaggt gcaatcatcg gtctgatggt tggcggtgtt 120 gttatcgcga cctag 135
<210? 10
<211? 31
<212? CNA
<213? Syntetyczny
<223? Syntetyczny starter PCR
<400? 10
gccggccatg gatgcagaat tccgtcacga c <210?
<212? <213 >
DNA
Syntetyczny <223> Syntetyczny starter PCR <400? 11 gccggaagct tctaggtcgc gataacaaca ccgccaacc <210?
<211?
<212?
<213?
S4
DNA
Syntetyczny
PL 215 125 B1 <223> Syntetyczny starter PCR <400> 12 ccggcaagct tctacagctc ggtgataccg atgaatttgg agttagcttt gatgtactgg 60 gtcgcgataa caacaccgcc aacc 84 <210> 13 <211> 101 <212> DNA <213> Syntetyczny <22 3 > Syntetyczny starter PCR <400> 13 gccggccatg ggtttcaaca acttcaccgt tagcttctgg ctgcgtgttc cgcgagccac ctggaagatg cagaattccg tcacgactcc g cgaaagttag
101 <210> 14 <211» 172 <212» DNA <213» Syntetyczny <223> Syntetyczny starter PCR <400» 14 gggccaagct tggatccggt cgcgataaca acaccgccaa ccatcagacc gatgattgca 60 cctttgttgg aaccaacatc ttctgcgaag aaaaccagtt tctggtggtg aacttcgtaa 120 ccggagtcgt gacggaactc tgcatccagc tcggtgatac cgatgaattt gg 172 <210» 15 <211» 30 <212» DNA <213» Syntetyczny <223> Syntetyczny starter PCR <400» 15 ctggaagatg cagagttccg tcacgactcc <210» 16 <211» 35 <212» DNA <213» Syntetyczny <223> Syntetyczny starter PCR <400> 16 gcgccggatc cttcaacaac ttcaccgtta gcttc <210» 17 <211» 13 <212» PRT <213» Syntetyczny <223> Syntetyczna sekwencja HLA wiąźąca DR <400> 17
Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 15 10
PL 215 125 B1

Claims (26)

1. Zastosowanie immunogenu, który
a) jest poliaminokwasem składającym się z przynajmniej jednej kopii podsekwencji reszt 672-714 z SEK NR ID: 2, przy czym co najmniej jeden obcy epitop pomocniczy T (epitop TH) jest włączony poprzez addycję aminokwasu i/lub insercję i/lub delecję i/lub podstawienie, podsekwencja jest wybrana z grupy składającej się z reszt 1-40, reszt 1-39, reszt 1-35, reszt 1-34, reszt 1-28, reszt 1-12, reszt 1-5, reszt 13-28, reszt 13-35, reszt 17-28, reszt 25-35, reszt 35-40, reszt 36-42 i reszt 35-42 sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych 673-714 z SEK NR ID: 2, a Phe w pozycji 19 reszt aminokwasowych 673-714 z SEK NR ID: 2 może być ewentualnie podstawiona, korzystnie Pro; lub
b) jest koniugatem zawierającym szkielet polihydroksypolimerowy, z którym oddzielnie jest sprzężony poliaminokwas określony w a); lub
c) jest kwasem nukleinowym kodującym poliaminokwas określony a); lub
d) jest niepatogennym mikroorganizmem lub wirusem niosącym fragment kwasu nukleinowego, który koduje i umożliwia ekspresję poliaminokwasu określonego w a), do wytwarzania preparatu farmaceutycznego zawierającego immunogen do leczenia, zapobiegania lub polepszania stanu zwierzęcia cierpiącego na chorobę Alzheimera lub inne choroby charakteryzujące się złogami amyloidowymi.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że poliaminokwas lub koniugat obejmuje:
- przynajmniej jedno pierwsze ugrupowanie cząsteczkowe, które powoduje skierowanie poliaminokwasu do komórek prezentujących antygen (APC) lub limfocytu B, i/lub
- przynajmniej jedno drugie ugrupowanie cząsteczkowe, które stymuluje układ odpornościowy, i/lub
- przynajmniej jedno trzecie ugrupowanie cząsteczkowe, które optymalizuje prezentację poliaminokwasu układowi odpornościowemu.
3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że pierwsze i/lub drugie i/lub trzecie ugrupowanie cząsteczkowe jest/są przyłączone jako grupa boczna, kowalencyjnym lub niekowalencyjnym wiązaniem, do odpowiednich chemicznych grup w sekwencji APP lub Αβ.
4. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-3, znamienne tym, że poliaminokwas lub koniugat zawiera polipeptyd fuzyjny.
5. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-4, znamienne tym, że poliaminokwas lub koniugat obejmuje podwojenie przynajmniej jednego epitopu APP lub Αβ limfocytów B i/lub wprowadzenie haptenu.
6. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-5, znamienne tym, że obcy epitop limfocytu T jest immunodominujący u zwierzęcia.
7. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-6, znamienne tym, że obcy epitop limfocytu T jest wspólny, tak jak obcy epitop limfocytu T, który jest wybrany spośród naturalnego wspólnego epitopu limfocytu T i sztucznej sekwencji peptydu wiążącego MHC-II.
8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że naturalny epitop limfocytu T jest wybrany spośród epitopu anatoksyny tężca, takiego jak P2 lub P30, epitopu anatoksyny błonicy, epitopu hemaglutyniny wirusa grypy i epitopu CS P. falciparum.
9. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-8, znamienne tym, że poliaminokwas lub koniugat obejmuje epitopy limfocytów B, które nie są eksponowane do fazy zewnątrzkomórkowej, gdy są obecne w związanej z komórką postaci prekursora polipeptydu Αβ.
10. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-9, znamienne tym, że poliaminokwas lub koniugat nie ma przynajmniej jednego epitopu limfocytu B, który jest eksponowany do fazy zewnątrzkomórkowej, gdy jest obecny w związanej z komórką postaci prekursora polipeptydu Αβ.
11. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-10, przy czym immunogen z punktu (a) obejmuje lub składa się z poliaminokwasu wybranego z grupy składającej się z:
- reszt aminokwasowych epitopu P2 anatoksyny tężca, po których następują reszty aminokwasowe 1-28 Αβ, a następnie reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca;
- reszt aminokwasowych 1-12 Αβ, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe epitopu P2 anatoksyny tężca oraz reszty aminokwasowe 13-28 Αβ;
PL 215 125 B1
- reszt aminokwasowych 1-12 Αβ, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe 1-12 Αβ, reszty aminokwasowe epitopu P2 anatoksyny tężca oraz reszty aminokwasowe 1-12 Αβ;
- reszt aminokwasowych 13-28 Αβ, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe 13-28 Αβ, reszty aminokwasowe epitopu P2 anatoksyny tężca oraz reszty aminokwasowe 13-28 Αβ;
- reszt aminokwasowych 1-12 Αβ, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe 13-35 Αβ, reszty aminokwasowe epitopu P2 anatoksyny tężca oraz reszty aminokwasowe 36-42 Αβ;
- reszt aminokwasowych 1-28 Αβ, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a nastepnie reszty aminokwasowe 1-28 Αβ, reszty aminokwasowe epitopu P2 anatoksyny tężca oraz reszty aminokwasowe 1-28 Αβ; i
- reszt aminokwasowych 1-43 Αβ, przy czym Phe 19 została zastąpiona Pro, a Met 35 została zastąpiona Lys, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe epitopu P2, przy czym wszystkie sekwencje aminokwasowe są wyszczególnione w kierunku od końca N do C.
12. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-11, znamienne tym, że przynajmniej dwie kopie poliaminokwasu lub koniugatu są połączone kowalencyjnie lub niekowalencyjnie z cząsteczką nośnika zdolną do przeprowadzenia prezentacji wielokrotnych kopii determinant antygenowych.
13. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-12, przy czym zgodnie z punktem (b) poliaminokwas jest połączony do polihydroksypolimeru za pośrednictwem wiązania amidowego.
14. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-13, przy czym zgodnie z punktem (b) polihydroksypolimer jest wielocukrem.
15. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-14, znamienne tym, że poliaminokwas lub koniugat przygotowano w formie z adiuwantem, co ułatwia przełamanie autotolerancji na autoantygeny.
16. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-15, znamienne tym, że preparat farmaceutyczny jest przeznaczony do podawania drogą wybraną spośród podawania pozajelitowego, takiego jak podawanie śródskórne, podskórne i domięśniowe; podawania dootrzewnowego; podawania doustnego; podawania dopoliczkowego; podawania podjęzykowego; podawania nadtwardówkowego; podawania dordzeniowego; podawania doodbytniczego i podawania wewnątrzczaszkowego.
17. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-16, znamienne tym, że preparat farmaceutyczny zawiera skuteczną ilość poliaminokwasu lub koniugatu wynoszącą od 0,5 μg do 2000 μg.
18. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-11, znamienne tym, że preparat farmaceutyczny obejmujący kwas(y) nukleinowy(e) kodujący(e) poliaminokwas lub koniugat zgodnie z punktem (c) jest przeznaczony do wprowadzenia tego kwasu nukleinowego do komórek zwierzęcia i w ten sposób otrzymywania in vivo ekspresji w komórkach, do których wprowadzono kwas(y) nukleinowy(e).
19. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że wprowadzony(e) kwas(y) nukleinowy(e) jest/są wybrane spośród nagiego DNA, DNA przygotowanego z naładowanymi lub nienaładowanymi lipidami, DNA przygotowanego w liposomach, DNA włączonego do wektora wirusowego, DNA przygotowanego z ułatwiającym transfekcję białkiem lub polipeptydem, DNA przygotowanego z ukierunkowującym białkiem lub polipeptydem, DNA przygotowanego z wapniowymi środkami strącającymi, DNA sprzężonego z obojętną cząsteczką nośnika, DNA kapsułkowanego w chitynie lub chitozanie i DNA przygotowanego z adiuwantem.
20. Zastosowanie według jednego z zastrz. 16-19, znamienne tym, że preparat farmaceutyczny jest przeznaczony do podawania przynajmniej w jednym, przynajmniej 2, przynajmniej 3, przynajmniej 4, przynajmniej 6 i przynajmniej 12 podaniach/wprowadzeniach na rok.
21. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-20, znamienne tym, że preparat farmaceutyczny jest przeznaczony do obniżenia poziomu APP lub Αβ w takim stopniu, aby całkowita ilość amyloidu była obniżona lub aby szybkość tworzenia amyloidu była obniżona w stopniu klinicznie istotnym.
22. Poliaminokwas lub koniugat pochodzący ze zwierzęcego APP lub Αβ, do którego wprowadzono modyfikację, w wyniku której immunizacja zwierzęcia poliaminokwasem lub koniugatem indukuje wytwarzanie przeciwciał przeciwko autologicznym APP lub Αβ zwierzęcia, przy czym poliaminokwas jest poliaminokwasem który składa się z przynajmniej jednej kopii podsekwencji reszt 672-714 z SEK NR ID: 2, przy czym co najmniej jeden obcy epitop pomocniczy T (epitop TH) jest włączony poprzez addycję aminokwasu i/lub insercję i/lub delecję i/lub podstawienie, podsekwencja jest wybrana z grupy składającej się z reszt 1-40, reszt 1-39, reszt 1-35, reszt 1-34, reszt 1-28, reszt 1-12, reszt
PL 215 125 B1
1-5, reszt 13-28, reszt 13-35, reszt 17-28, reszt 25-35, reszt 35-40, reszt 36-42 i reszt 35-42 sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych 673-714 z SEK NR ID: 2, a Phe w pozycji 19 reszt aminokwasowych 673-714 z SEK NR ID: 2 może być ewentualnie podstawiona, korzystnie Pro, a koniugat jest koniugatem zawierającym szkielet polihydroksypolimerowy, z którym oddzielnie jest sprzężony określony powyżej poliaminokwas.
23. Immunogenna kompozycja, znamienna tym, że zawiera immunogennie skuteczną ilość poliaminokwasu lub koniugatu określonego w zastrz. 22, przy czym kompozycja zawiera ponadto farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalny nośnik i/lub zaróbkę oraz ewentualnie adiuwant.
24. Fragment kwasu nukleinowego, który koduje poliaminokwas lub koniugat określony w zastrz. 22.
25. Wektor niosący fragment kwasu nukleinowego określony w zastrz. 24, przy czym wektor ten jest zdolny do autonomicznej replikacji.
26. Wektor według zastrz. 25, znamiennym tym, że jest wybrany z grupy składającej się plazmidu, faga, kosmidu, mini-chromosomu i wirusa.
PL369099A 2001-08-20 2002-08-20 Zastosowanie immunogenu, poliaminokwas lub koniugat pochodzacy ze zwierzecego APP lub Abeta, immunogenna kompozycja, fragment kwasu nukleinowego i wektor PL215125B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200101231 2001-08-20
US33754301P 2001-10-22 2001-10-22
US37302702P 2002-04-16 2002-04-16
DKPA200200558 2002-04-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL369099A1 PL369099A1 (pl) 2005-04-18
PL215125B1 true PL215125B1 (pl) 2013-10-31

Family

ID=32870659

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL369099A PL215125B1 (pl) 2001-08-20 2002-08-20 Zastosowanie immunogenu, poliaminokwas lub koniugat pochodzacy ze zwierzecego APP lub Abeta, immunogenna kompozycja, fragment kwasu nukleinowego i wektor

Country Status (29)

Country Link
US (3) US20030157117A1 (pl)
EP (3) EP1685847A1 (pl)
JP (2) JP2004538332A (pl)
KR (3) KR101057488B1 (pl)
CN (1) CN101675992B (pl)
AR (1) AR036270A1 (pl)
AT (1) ATE334698T1 (pl)
AU (3) AU2002325199B2 (pl)
BR (1) BR0212047A (pl)
CA (1) CA2457140C (pl)
CO (1) CO5560581A2 (pl)
CY (1) CY1105737T1 (pl)
DE (1) DE60213615T3 (pl)
DK (1) DK1420815T3 (pl)
EA (2) EA011610B1 (pl)
ES (1) ES2269749T5 (pl)
HR (2) HRP20040218A2 (pl)
HU (1) HUP0400669A3 (pl)
IL (2) IL159964A0 (pl)
IS (1) IS7133A (pl)
ME (1) MEP43208A (pl)
MX (1) MXPA04001467A (pl)
MY (1) MY144532A (pl)
NZ (2) NZ530940A (pl)
PL (1) PL215125B1 (pl)
PT (1) PT1420815E (pl)
RS (1) RS51699B (pl)
SI (1) SI1420815T1 (pl)
WO (1) WO2003015812A2 (pl)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5025871B2 (ja) * 2000-02-21 2012-09-12 エイチ．リュンドベック エイ／エス アミロイドの新規なダウン−レギュレート方法
AU783144B2 (en) * 2000-02-21 2005-09-29 H. Lundbeck A/S Novel method for down-regulation of amyloid
US7264810B2 (en) 2001-01-19 2007-09-04 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
US8697082B2 (en) * 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
TW200509968A (en) * 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US20080014194A1 (en) * 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US9034337B2 (en) * 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8506959B2 (en) * 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US8663650B2 (en) 2003-02-21 2014-03-04 Ac Immune Sa Methods and compositions comprising supramolecular constructs
KR100546066B1 (ko) * 2003-03-21 2006-01-26 한국생명공학연구원 베타아밀로이드 유전자의 다중 연결체를 발현하는 형질전환 식물 세포 및 이로부터 배양된 식물
US7358331B2 (en) 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
US7807171B2 (en) 2003-07-25 2010-10-05 Ac Immune Sa Therapeutic vaccine targeted against P-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers
US20070184023A1 (en) * 2003-10-30 2007-08-09 Pharmexa A/S Method for down-regulation of vegf
WO2005047860A2 (en) 2003-11-08 2005-05-26 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein
EP1711208A2 (en) * 2004-01-28 2006-10-18 Curix APS Conjugates of amyloid proteins as vaccines for amyloid-related diseases
KR100639397B1 (ko) * 2004-03-18 2006-10-26 (주)에스제이바이오메드 항비만용 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드 및 이를포함하는 항비만 백신 조성물
GB0424563D0 (en) * 2004-11-05 2004-12-08 Novartis Ag Organic compounds
EP1879613B1 (en) * 2005-05-05 2011-11-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Peptide conjugate compositions and methods for the prevention and treatment of alzheimer's disease
US8691224B2 (en) 2005-11-30 2014-04-08 Abbvie Inc. Anti-Aβ globulomer 5F7 antibodies
HRP20140240T4 (hr) 2005-11-30 2017-02-24 Abbvie Inc. Monoklonalna antitijela protiv amiloidnih beta proteina i njihova upotreba
JP5097695B2 (ja) 2006-02-22 2012-12-12 株式会社林原 抗アミロイドβペプチド抗体産生誘導用のペプチドワクチン
US8188046B2 (en) 2006-10-16 2012-05-29 University Of South Florida Amyloid beta peptides and methods of use
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
PL2583978T3 (pl) * 2007-02-23 2016-07-29 Prothena Biosciences Ltd Co Profilaktyka i leczenie chorób synukleinopatycznych i amyloidogennych
US8147833B2 (en) * 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8895004B2 (en) 2007-02-27 2014-11-25 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
US7618944B2 (en) 2007-03-01 2009-11-17 Intezyne Technologies, Inc. Encapsulated amyloid-beta peptides
WO2008124646A2 (en) * 2007-04-06 2008-10-16 The Government Of The U.S.A, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Use of amyloid proteins as vaccine scaffolds
ES2655868T3 (es) 2007-04-20 2018-02-22 The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Método para aumentar la respuesta inmunitaria con un péptido
AU2009268808A1 (en) * 2008-07-08 2010-01-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Vaccine for the treatment of Alzheimer's disease
US8512709B2 (en) * 2008-10-16 2013-08-20 The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institue Modified amyloid β peptide
US8987419B2 (en) 2010-04-15 2015-03-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
WO2012020124A1 (en) 2010-08-12 2012-02-16 Ac Immune S.A. Vaccine engineering
EP3533803B1 (en) 2010-08-14 2021-10-27 AbbVie Inc. Anti-amyloid-beta antibodies
JP6027011B2 (ja) 2010-10-26 2016-11-16 エーシー イミューン ソシエテ アノニム 疎水性部分によって修飾されたペプチドを含むリポソームベースの構築物
US20120328605A1 (en) * 2010-10-27 2012-12-27 Daniel Larocque Compositions and uses
EP2887955B1 (en) * 2012-08-21 2020-08-19 Institute for Molecular Medicine, Inc. Compositions and methods related to diseases associated with deposits of amyloid, tau, and alpha-synuclein
US10195257B2 (en) 2013-07-28 2019-02-05 Qantu Therapeutics, Inc. Vaccine formulations comprising quillaja desacylsaponins and beta amyloid peptides or tau protein to induce a Th2 immune response
US20160220649A1 (en) * 2013-09-13 2016-08-04 Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud Combinations of aggregating proteins and molecular chaperone proteins for the treatment of proteinopathies or conformational diseases
EP3116893B1 (en) * 2014-03-11 2019-08-28 Jacques Fantini A chimeric peptide that interacts with cell membrane gangliosides
US10441649B2 (en) * 2015-02-02 2019-10-15 The University Of Birmingham Targeting moiety peptide epitope complexes having a plurality of T-cell epitopes
JO3627B1 (ar) 2015-04-30 2020-08-27 H Lundbeck As إيميدازو بيرازينونات على هيئة مثبطات pde1
CN104880441B (zh) * 2015-05-14 2017-12-22 上海皓拓生物技术有限公司 β‑分泌酶特异性抑制剂的筛选方法及其筛选系统
US10034861B2 (en) 2016-07-04 2018-07-31 H. Lundbeck A/S 1H-pyrazolo[4,3-b]pyridines as PDE1 inhibitors
AU2017350473A1 (en) 2016-10-28 2019-04-18 H. Lundbeck A/S Combination treatments comprising imidazopyrazinones for the treatment of psychiatric and/or cognitive disorders
WO2018078042A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 H. Lundbeck A/S Combination treatments comprising administration of imidazopyrazinones
WO2018132768A1 (en) * 2017-01-13 2018-07-19 Sanna Pietro P Methods and compositions for treating hpa hyperactivity
CN108187038B (zh) * 2017-05-25 2020-05-01 成都安特金生物技术有限公司 一种狂犬病结合疫苗
AR113926A1 (es) 2017-12-14 2020-07-01 H Lundbeck As Derivados de 1h-pirazolo[4,3-b]piridinas
EP3723807B1 (en) 2017-12-14 2021-10-20 H. Lundbeck A/S Combination treatments comprising administration of 1h-pyrazolo[4,3-b]pyridines
WO2019121840A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 H. Lundbeck A/S Pyrazolo[3,4-b]pyridines and imidazo[1,5-b]pyridazines as pde1 inhibitors
CN112165956A (zh) * 2018-04-10 2021-01-01 Ac免疫有限公司 抗Aβ治疗性疫苗
AU2019253193B2 (en) 2018-04-10 2026-02-05 Ac Immune Sa Anti-abeta therapeutic vaccines
WO2020210843A2 (en) 2019-04-12 2020-10-15 The Johns Hopkins University Tolerogenic artificial antigen-presenting cells
EP3952913A4 (en) * 2019-04-12 2023-05-10 The Johns Hopkins University Tolerogenic artificial antigen-presenting cells
GB202008250D0 (en) * 2020-06-02 2020-07-15 Emergex Vaccines Holding Ltd Diagnosis, prevention and treatment of coronavirus infection
JP2024504194A (ja) * 2021-01-29 2024-01-30 エランコ アニマル ヘルス ゲー・エム・ベー・ハー 自己寛容を破壊するためのワクチン組成物
WO2023159970A1 (zh) * 2022-02-28 2023-08-31 安域生物科技杭州有限公司 基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽及其应用
CN117700525B (zh) * 2024-02-05 2024-06-18 上海良润生物医药科技有限公司 一种多肽改造体及其应用

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
US4596792A (en) 1981-09-04 1986-06-24 The Regents Of The University Of California Safe vaccine for hepatitis containing polymerized serum albumin
JPS5938877A (ja) 1982-08-30 1984-03-02 Musashi Eng Kk 紙葉判別方法
US4599231A (en) 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4599230A (en) 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4608251A (en) 1984-11-09 1986-08-26 Pitman-Moore, Inc. LHRH analogues useful in stimulating anti-LHRH antibodies and vaccines containing such analogues
US4601903A (en) 1985-05-01 1986-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease
US5223482A (en) * 1986-11-17 1993-06-29 Scios Nova Inc. Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use
US5278056A (en) * 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
US5192688A (en) * 1988-08-15 1993-03-09 Switzer Iii Robert C Histological analysis method
US5753624A (en) * 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
US5200339A (en) * 1990-08-17 1993-04-06 Abraham Carmela R Proteases causing abnormal degradation of amyloid β-protein precursor
US5780587A (en) * 1990-08-24 1998-07-14 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity
US5780036A (en) * 1991-08-26 1998-07-14 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepattis B virus
ES2204900T3 (es) 1992-02-11 2004-05-01 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Estructura inmuinogena de doble vector.
AU678152B2 (en) 1992-03-27 1997-05-22 Whitehead Institute For Biomedical Research Non-infectious HIV particles and uses therefor
US5851787A (en) 1992-04-20 1998-12-22 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding amyloid precursor-like protein and uses thereof
WO1993023076A1 (en) 1992-05-20 1993-11-25 The Johns-Hopkins University Alternative receptor therapy
DK100592D0 (da) 1992-08-10 1992-08-10 Mouritsen & Elsner Aps Metode til kemisk kobling paa faste faser
US5958883A (en) * 1992-09-23 1999-09-28 Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology Animal models of human amyloidoses
US5747323A (en) * 1992-12-31 1998-05-05 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Retroviral vectors comprising a VL30-derived psi region
DK96493D0 (da) 1993-08-26 1993-08-26 Mouritsen Og Elsner Aps Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden
AU707083B2 (en) 1993-08-26 1999-07-01 Bavarian Nordic Inc. Inducing antibody response against self-proteins with the aid of foreign T-cell epitopes
DE69435171D1 (de) 1993-09-14 2009-01-08 Pharmexa Inc Pan dr-bindeproteinen zur erhöhung der immunantwort
AUPM411994A0 (en) 1994-02-25 1994-03-24 Deakin Research Limited Epitopes
US5709995A (en) * 1994-03-17 1998-01-20 The Scripps Research Institute Hepatitis C virus-derived peptides capable of inducing cytotoxic T lymphocyte responses
US5573916A (en) * 1994-05-19 1996-11-12 Coretech, Inc. Immunogenic constructs comprising b-cell and t-cell epitopes on common carrier
IL115743A0 (en) 1994-10-28 1996-01-19 American Nat Red Cross A mammal with cells containing a transgene and its production
US5589154A (en) * 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
US5854204A (en) * 1995-03-14 1998-12-29 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Aβ peptides that modulate β-amyloid aggregation
PT832093E (pt) 1995-06-07 2006-12-29 Sanofi Pasteur Inc Expressão de lipoproteínas
US5874469A (en) 1996-01-05 1999-02-23 Alcon Laboratories, Inc. Fluoroalkyl hydrocarbons for administering water insoluble or unstable drugs
US5985581A (en) 1996-07-25 1999-11-16 The Mclean Hospital Corporation Use of presenilin-1 for diagnosis of alzheimers disease
AUPO390396A0 (en) 1996-11-29 1996-12-19 Csl Limited Novel promiscuous T helper cell epitopes
AU724294B2 (en) 1997-01-22 2000-09-14 Eisai Inc. Microparticles for delivery of nucleic acid
AU1388899A (en) 1997-11-11 1999-05-31 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma, The An alzheimer-related, endothelium-derived toxic factor and methods for its use
US6913745B1 (en) * 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6787523B1 (en) * 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20040062802A1 (en) * 1998-04-02 2004-04-01 Hermelin Victor M. Maximizing effectiveness of substances used to improve health and well being
NO314086B1 (no) * 1998-05-08 2003-01-27 Gemvax As Peptider og farmasöytiske sammensetninger inneholdende disse, nukleinsyresekvenser som koder for slike peptider, plasmider og virusvektoreromfattende slike DNA-sekvenser samt anvendelse av disse for fremstilling avfarmasöytiske preparater til
JP2002521651A (ja) 1998-07-21 2002-07-16 ファーメクサ エイ／エス 活性ポリヒドロキシポリマーでの固体表面の被覆
HUP0103578A3 (en) * 1998-09-15 2005-11-28 Pharmexa As Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity
SK4272001A3 (en) * 1998-10-05 2003-02-04 Pharmexa As Methods for therapeutic vaccination
GB2361948B (en) † 1998-11-06 2003-04-16 Baker Hughes Inc Drilling fluid systems with improved fluid loss properties
WO2000040741A2 (en) 1999-01-07 2000-07-13 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, The National Institutes Of Health Lentivirus vector system
PT1187629E (pt) * 1999-04-19 2005-02-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicao adjuvante que compreende saponina e um oligonucleotido imunoestimulador
US6787637B1 (en) * 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
PE20010212A1 (es) 1999-06-01 2001-02-22 Neuralab Ltd Composiciones del peptido a-beta y procesos para producir las mismas
MXPA02005576A (es) 1999-11-29 2002-12-13 Neurochem Inc Vacuna para la prevencion y tratamiento de la enfermedad de alzheimer y otras enfermedades relacionadas con amiloides.
EP1237930B1 (en) * 1999-12-08 2006-11-08 Intellect Neurosciences, Inc. Chimeric amyloid beta peptides
JP5025871B2 (ja) 2000-02-21 2012-09-12 エイチ．リュンドベック エイ／エス アミロイドの新規なダウン−レギュレート方法
AU783144B2 (en) * 2000-02-21 2005-09-29 H. Lundbeck A/S Novel method for down-regulation of amyloid
GB0004530D0 (en) 2000-02-25 2000-04-19 Univ Nottingham Adjuvants
AU2001274873B2 (en) * 2000-05-22 2006-10-05 New York University Synthetic immunogenic but non-amyloidogenic peptides homologous to amyloid beta for induction of an immune response to amyloid beta and amyloid deposits
IL155690A0 (en) 2000-11-10 2003-11-23 Wyeth Corp Adjuvant combination formulations
US7097837B2 (en) * 2001-02-19 2006-08-29 Pharmexa A/S Synthetic vaccine agents
JP2002273199A (ja) * 2001-03-15 2002-09-24 Idemitsu Petrochem Co Ltd ガス状流体の抜き出し方法
US6906169B2 (en) * 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
US20030185845A1 (en) * 2001-11-16 2003-10-02 Steen Klysner Novel immunogenic mimetics of multimer proteins
WO2003059379A2 (en) 2002-01-17 2003-07-24 Pharmexa A/S Immunogenic carcinoembryonic antigen (cea)
WO2003075951A2 (en) * 2002-03-11 2003-09-18 Pharmexa A/S Novel application of vaccination against tnf-alpha
US20040091945A1 (en) * 2002-07-17 2004-05-13 Cheryl Fitzer-Attas Peptides and methods of screening immunogenic peptide vaccines against Alzheimer's Disease

Also Published As

Publication number Publication date
CA2457140A1 (en) 2004-02-27
KR101057488B1 (ko) 2011-08-19
WO2003015812A3 (en) 2004-03-25
AU2007249087B2 (en) 2010-05-20
EA007533B1 (ru) 2006-10-27
IS7133A (is) 2004-01-29
CN101675992B (zh) 2014-05-21
CY1105737T1 (el) 2010-12-22
AU2010212381B2 (en) 2012-01-19
DE60213615T3 (de) 2017-11-23
IL159964A0 (en) 2004-06-20
CO5560581A2 (es) 2005-09-30
HRP20040218A2 (en) 2004-08-31
KR20090074830A (ko) 2009-07-07
KR20040044465A (ko) 2004-05-28
HUP0400669A2 (hu) 2005-01-28
NZ530940A (en) 2007-11-30
EP1685847A1 (en) 2006-08-02
ES2269749T5 (es) 2017-12-04
AU2007249087A1 (en) 2008-01-10
EP1420815B1 (en) 2006-08-02
KR20100086520A (ko) 2010-07-30
PL369099A1 (pl) 2005-04-18
US8871212B2 (en) 2014-10-28
HRP20120283A2 (hr) 2012-06-30
CN101675992A (zh) 2010-03-24
US20050163744A1 (en) 2005-07-28
SI1420815T1 (sl) 2006-12-31
ES2269749T3 (es) 2007-04-01
PT1420815E (pt) 2006-12-29
DE60213615D1 (de) 2006-09-14
HUP0400669A3 (en) 2011-07-28
AU2002325199B2 (en) 2007-09-20
YU13304A (sh) 2006-08-17
JP2004538332A (ja) 2004-12-24
NZ547224A (en) 2008-06-30
IL188506A (en) 2017-08-31
EA200600974A1 (ru) 2006-10-27
US20100047262A1 (en) 2010-02-25
CA2457140C (en) 2014-08-05
US20030157117A1 (en) 2003-08-21
MXPA04001467A (es) 2005-02-17
MEP43208A (bs) 2011-02-10
EP1420815B2 (en) 2017-08-09
JP5114455B2 (ja) 2013-01-09
EP3299029A1 (en) 2018-03-28
EA200400332A1 (ru) 2004-08-26
WO2003015812A2 (en) 2003-02-27
AR036270A1 (es) 2004-08-25
ATE334698T1 (de) 2006-08-15
HK1064934A1 (en) 2005-02-08
BR0212047A (pt) 2004-08-17
EP1420815A2 (en) 2004-05-26
RS51699B (sr) 2011-10-31
DE60213615T2 (de) 2007-08-09
MY144532A (en) 2011-09-30
EA011610B1 (ru) 2009-04-28
JP2009280582A (ja) 2009-12-03
AU2010212381A1 (en) 2010-09-09
DK1420815T3 (da) 2006-12-04
IL188506A0 (en) 2008-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1420815B1 (en) Beta-amyloid-analogue - t-cell epitop vaccine
CA2400838C (en) Novel method for down-regulation of amyloid
EP1259251B1 (en) Novel method for down-regulation of amyloid
AU2002325199A1 (en) Beta-amyloid-analogue-T-cell epitop vaccine
CN100562338C (zh) β-淀粉样蛋白-类似物-T-细胞表位疫苗
HK1247081A1 (en) Novel method for down-regulation of amyloid
HK1096288A (en) Beta-amyloid-analogue-t-cell epitop vaccine
HK1064934B (en) Beta-amyloid-analogue - t-cell epitop vaccine