PL215528B1

PL215528B1 - Di-(4-methoxy)phenyl esters, derivatives of 1- isothiocyane-methanphosphorous acids, processes for the preparation and use thereof

Info

Publication number: PL215528B1
Application number: PL399049A
Authority: PL
Inventors: Mateusz Psurski; Łukasz Winiarski; Marta Piguła; Józef Oleksyszyn; Joanna Wietrzyk
Original assignee: Politechnika Wroclawska
Priority date: 2012-04-30
Filing date: 2012-04-30
Publication date: 2013-12-31
Also published as: PL399049A1

Description

Przedmiotem wynalazku są estry di-(4-metoksy)fenylowe pochodne kwasów 1-izotiocyjano-metanofosfonowych, sposób ich wytwarzania oraz zastosowanie przeciwnowotworowe.The subject of the invention is di- (4-methoxy) phenyl esters of 1-isothiocyanato-methanophosphonic acids, their preparation and anti-cancer application.

W literaturze przedmiotu, (m.in. w Psurski i współ. „Synthesis and antiproliferative activity of novel a- and e-dialkoxyphosphonylated isothiocyanates” Bioorg. and Medicinal Chemistry Letters 21 (2011) 4572 - 4576), opisane zostały estry dialkilowe kwasów 1-izotiocyjanometanofosfonowych, które ze względu na wysoką reaktywność grupy izotiocyjanianowej znalazły zastosowanie w szeregu transformacji syntetycznych. Dla przykładu znalazły zastosowanie w reakcjach prowadzących do uzyskania tiomocznikowych pochodnych peptydów (m.in. Jing-Zi i współ., „Synthesis and in vitro study of pseudo-peptide thioureas containing a-aminophosphonate moiety as potential antitumor agents” Eur. Journal of Med. Chemistry 45 (2010) 5108-5112), które mogą być wartościowymi związkami wykazującymi aktywność biologiczną, w szczególności przeciwnowotworową. W literaturze opisano również syntezę szeregu Cbz (benzyloksykarbonylo)-zablokowanych, fosfonowych pochodnych aminokwasów, które jednakże nie wykazały aktywności antyproliferacyjnej (przeciwnowotworowej) w warunkach in vitro (Sieńczyk i współ. „Simple phosphonic inhibitors of human neutrophil elastase” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 21 (2011) 1310-1314).In the literature on the subject (including in Psurski et al. "Synthesis and antiproliferative activity of novel a- and e-dialkoxyphosphonylated isothiocyanates" Bioorg. And Medicinal Chemistry Letters 21 (2011) 4572 - 4576), dialkyl esters of 1 acids have been described - isothiocyanomethanophosphonic compounds, which, due to the high reactivity of the isothiocyanate group, have been used in a number of synthetic transformations. For example, they have been used in reactions leading to the production of thiourea peptide derivatives (including Jing-Zi et al., "Synthesis and in vitro study of pseudo-peptide thioureas containing a-aminophosphonate moiety as potential antitumor agents" Eur. Journal of Med Chemistry 45 (2010) 5108-5112), which may be valuable compounds with biological, in particular anti-tumor activity. The literature also describes the synthesis of a series of Cbz (benzyloxycarbonyl) -blocked phosphonic derivatives of amino acids, which, however, did not show antiproliferative (antitumor) activity in vitro (Sieńczyk et al. "Simple phosphonic inhibitors of human neutrophil elastase" Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 21 (2011) 1310-1314).

Ze stanu techniki wiadomo, iż grupa izotiocyjanianowa odpowiedzialna jest za szybką akumulację związków w komórkach eukariotycznych na drodze dyfuzji biernej (opisane m.in. w Zhang Y. Molecular mechanism of rapid cellular accumulation of anticarcinogenic isothiocyanates. Carcinogenesis.It is known in the art that the isothiocyanate group is responsible for the rapid accumulation of compounds in eukaryotic cells by passive diffusion (described, inter alia, in Zhang Y. Molecular mechanism of rapid cellular accumulation of anticarcinogenic isothiocyanates. Carcinogenesis.

2001; 22(3): 425-31) i szereg aktywności biologicznych (opisane m.in. w pracy przeglądowej Zhang Y. The molecular basis that unifies the metabolism, cellular uptake and chemopreventive activities of dietary isothiocyanates. Carcinogenesis. 2012; 33(1): 2-9).2001; 22 (3): 425-31) and a number of biological activities (described e.g. in the review by Zhang Y. The molecular basis that unifies the metabolism, cellular uptake and chemopreventive activities of dietary isothiocyanates. Carcinogenesis. 2012; 33 (1) : 2-9).

Ze stanu techniki wiadomo jest, iż estry difenylowe fosfonianów odpowiedzialne są za aktywność inhibitorową przeciwko proteazom serynowym opisane m.in. w Sieńczyk i współ. „Simple phosphonic inhibitors of human neutrophil elastase” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 21 (2011) 1310-1314.It is known from the state of the art that diphenyl esters of phosphonates are responsible for the inhibitory activity against serine proteases, described e.g. in Sieńczyk et al. "Simple phosphonic inhibitors of human neutrophil elastase" Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 21 (2011) 1310-1314.

Z publikacji Psurski i współ. Synthesis and antiproliferative activity of novel a- and e-dialkoxyphosphonylated isothiocyanates ” Bioorg. and Medicinal Chemistry Letters 21 (2011) 4572-4576 znany jest sposób wytwarzania estrów dialkilowych 1-izotiocyjano-aralkilofosfonianów, polegający na tym, że jako substratu użyto chlorowodorków estrów dialkilowych kwasów 1-amino-aralkilofosfonowych, który z wykorzystaniem disiarczku węgla w obecności aminy i tetrafluoroboran 2-(1H-benzotriazolo-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametyloaminiowy (TBTU) przekształcany jest w docelowy związek - ester dialkilowy kwasu 1-izotiocyjano-aralkilofosfonowego.From the publication by Psurski et al. Synthesis and antiproliferative activity of novel a- and e-dialkoxyphosphonylated isothiocyanates ”Bioorg. and Medicinal Chemistry Letters 21 (2011) 4572-4576, a method for the preparation of 1-isothiocyano-aralkylphosphonate dialkyl esters is known, whereby 1-amino-aralkylphosphonic acid dialkyl esters hydrochlorides were used as a substrate, which using carbon disulfide in the presence of amine and 2- (1H-Benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethylamino tetrafluoroborate (TBTU) is converted to the target compound 1-isothiocyano-aralkylphosphonic acid dialkyl ester.

W literaturze naukowej i patentowej nie są znane estry di-(4-metoksy)fenylowe pochodne kwasów 1-izotiocyjano-metanofosfonowych, jak również sposoby ich wytwarzania oraz zastosowanie.The di- (4-methoxy) phenyl esters of 1-isothiocyanato-methanophosphonic acids, as well as the methods of their preparation and use are not known in the scientific and patent literature.

Wynalazek dotyczy estrów di-(4-metoksy)fenylowych pochodnych kwasów 1-izotiocyjanometanofosfonowych o wzorze ogólnym 1, w którym R1 oznacza podstawniki: propylowy, izopropylowy, sec-butylowy, benzylowy, 4-metoksyfenylowy, 3,5-dimetoksyfenylowy.The invention relates to di- (4-methoxy) phenyl esters of 1-isothiocyanomethanophosphonic acid derivatives of the general formula I, in which R1 represents the following substituents: propyl, isopropyl, sec-butyl, benzyl, 4-methoxyphenyl, 3,5-dimethoxyphenyl.

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania estrów di-(4-metoksy)fenylowych pochodnych kwasów 1-izotiocyjano-metanofosfonowych o wzorze ogólnym 1, w którym R1 oznacza podstawniki: propylowy, izopropylowy, sec-butylowy, benzylowy, 4-metoksyfenylowy, 3,5-dimetoksyfenylowy, polegający na tym, że otrzymany w wyniku reakcji trójchlorku fosforu z 4-metoksyfenolem w acetonitrylu w temperaturze wrzenia przez 2-4 godzin fosforyn tri-(4-metoksy)fenylowy poddaje się reakcji z odpowiednim aldehydem oraz karbaminianem benzylu i otrzymuje się N-(benzyloksykarbonylo) zablokowaną pochodną estru di-(4-metoksy)fenylowego pochodną kwasu 1-amino-metanofosfonowego, którą w kolejnym etapie poddaje się standardowej deprotekcji z użyciem 3-5 ekwiwalentów molowych 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym i otrzymuje się bromowodorek estru di-(4-metoksy)fenylowego pochodną kwasu 1-amino-metanofosfonowego, którą poddaje się reakcji z 10-15 ekwiwalentami molowymi disiarczku węgla w obecności 1,1-1,5 ekwiwalentów molowych trójetyloaminy w N,N-dimetyloformamidzie w temperaturze pokojowej, a następnie po 15-20 minutach mieszaninę reakcyjną schładza się do temperatury 5-15°C i powstały produkt pośredni rozkłada się do izotiocyjanianu, przy czym w reakcji wykorzystuje się 3-4 równoważniki molowe 30% wody utlenionej w wodzie.The invention also relates to a process for the preparation of di- (4-methoxy) phenyl esters of 1-isothiocyanato-methanophosphonic acid derivatives of the general formula I, in which R1 represents the substituents: propyl, isopropyl, sec-butyl, benzyl, 4-methoxyphenyl, 3,5- dimethoxyphenyl, consisting in the fact that the tri (4-methoxy) phenyl phosphite obtained by reacting phosphorus trichloride with 4-methoxyphenol in acetonitrile at boiling temperature for 2-4 hours is reacted with the appropriate aldehyde and benzyl carbamate to obtain N- (benzyloxycarbonyl) blocked di- (4-methoxy) phenyl ester derivative with 1-amino-methanephosphonic acid, which in the next step is subjected to standard deprotection with 3-5 molar equivalents of 33% hydrobromic acid in acetic acid to give the hydrobromide of the ester di- (4-methoxy) phenyl derivative of 1-amino-methanophosphonic acid which is reacted with 10-15 molar equivalents of carbon disulfide in the presence of 1.1-1.5 molar equivalents of triethylamine in N, N-dimethylformamide at room temperature, and then after 15-20 minutes the reaction mixture is cooled to 5-15 ° C and the resulting intermediate is decomposed to isothiocyanate, with 3-4 equivalents used in the reaction 30 mole% of hydrogen peroxide in water.

Korzystnie jako aldehyd stosuje się aldehyd butylowy, izo-masłowy, 2-metylobutylowy, fenylooctowy, 4-metoksybenzaldehyd, 3,5-dimetoksybenzaldehyd.Preferably, butyl, isobutyric, 2-methylbutyl, phenylacetic, 4-methoxybenzaldehyde, 3,5-dimethoxybenzaldehyde are used as the aldehyde.

PL 215 528 B1PL 215 528 B1

Wynalazek zapewnia również zastosowanie estrów di-(4-metoksy)fenylowych pochodnych kwasów 1-izotiocyjano-metanofosfonowych o wzorze ogólnym 1, w którym R1 oznacza podstawniki: propylowy, izopropylowy, sec-butylowy, benzylowy, 4-metoksyfenylowy, 3,5-dimetoksyfenylowy w preparacie farmaceutycznym przeznaczonym do leczenia nowotworów płuc, piersi, jelita grubego ze szczególnym uwzględnieniem nowotworów opornych na doksorubicynę.The invention also provides the use of di- (4-methoxy) phenyl esters of 1-isothiocyanato-methanophosphonic acid derivatives of the general formula I, in which R1 represents the substituents: propyl, isopropyl, sec-butyl, benzyl, 4-methoxyphenyl, 3,5-dimethoxyphenyl. in a pharmaceutical preparation intended for the treatment of lung, breast and colorectal neoplasms, with particular emphasis on doxorubicin-resistant neoplasms.

Podstawową zaletą wyróżniającą związki będące przedmiotem wynalazku spośród strukturalnie zbliżonych związków, jest obecność w jednej cząsteczce dwóch grup funkcyjnych wykazujących niezależnie od siebie aktywność biologiczną. Zaletą sposobu według wynalazku jest prostota procesu oczyszczania produktu, a także wysoka wydajność reakcji i wysoka czystość otrzymywanych produktów.The main advantage that distinguishes the compounds, which are the subject of the invention from among structurally similar compounds, is the presence of two functional groups in one molecule which independently exhibit biological activity. The advantage of the process according to the invention is the simplicity of the product purification process, as well as high reaction efficiency and high purity of the products obtained.

Wynalazek został bliżej przedstawiony we wzorach strukturalnych oraz w przykładach jego realizacji.The invention is illustrated in more detail in the structural formulas and in the examples of its implementation.

P r z y k ł a d 1P r z k ł a d 1

Sposób wytwarzania estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(propylo)metanofosfonowego związek o wzorze 2.A method for producing 1-isothiocyano- (propyl) methanophosphonic acid di- (4-methoxy) phenyl ester compound of formula 2.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-4-metoksyfenylowego.Step 1. Preparation of tri-4-methoxyphenyl phosphite.

W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 4,46 g (36 mmola) 4-metylotiofenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 1,065 ml (12 mmola) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez 3,5 godziny w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio, bez oczyszczania w kolejnym etapie.To this end, 4.46 g (36 mmol) of 4-methylthiophenol and 20 ml of acetonitrile are added to a round bottom flask equipped with a magnetic stirrer. After dissolution, 1.065 ml (12 mmol) of phosphorus (III) chloride are added to the reaction mixture. The mixture is heated to reflux for 3.5 hours. The volatile components of the mixture are then removed under reduced pressure on a rotary evaporator. The resulting crude oil product is used directly without purification in the next step.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(propylo)metanofosfonowego.Step 2. Preparation of N- (benzyloxycarbonyl) -1-amino- (propyl) methanephosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester.

W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-metoksyfenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,82 g (12 mmola) karbaminianu benzylu i 1,36 ml (15 mmola) aldehydu butylowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 25 ml acetonitrylu mieszaninę reakcyjną schładza się w łaźni lodowej do temperatury około 5°C i dodaje się 0,05 ekwiwalenta molowego kwasu tetrafluoroborowego. Po 50-60 minutach powstały produkt odsącza się, a pozostały roztwór odparowuję się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej i pozostałość rozpuszcza się w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 3,89 g surowego produktu (M=499,49 g/mol, wzór sumaryczny C26H30NO7P, wydajność 65%).For this purpose, 1.82 g (12 mmol) of benzyl carbamate and 1.36 ml (15 mmol) of butylaldehyde are weighed into a round-bottom flask - containing the tri-4-methoxyphenyl phosphite formed directly in step 1 - and equipped with a magnetic stirrer. After all components are dissolved in 25 ml of acetonitrile, the reaction mixture is cooled in an ice bath to about 5 ° C and 0.05 molar equivalents of tetrafluoroboric acid are added. After 50-60 minutes, the product formed is filtered off, the remaining solution is evaporated under reduced pressure on a rotary evaporator and the residue is dissolved in 100-150 ml of methanol and placed at -20 ° C for 24 hours to crystallize the product. The resulting product was filtered off with suction and air dried to constant weight. 3.89 g of crude product are obtained (M = 499.49 g / mol, summarized formula C26H30NO7P, 65% yield).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 500,1838/500,1907 [M+H]⁺.Mass spectrum (ESI, m / z): theoretical / found 500.1838 / 500.1907 [M + H] ⁺ .

Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(propylo)metanofosfonowego.Step 3. Preparation of 1-Amino- (propyl) methanophosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester hydrobromide.

Do kolby okrągłodennej odważa się 2 g estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(propylo)metanofosfonowego (4 mmol) i dodaje się 10 ml 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2,5 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny reakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze - 20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 1,6 g (M=446,26 g/mol, wzór sumaryczny C18H25BrNO5P, wydajność 90%) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(propylo)metanofosfonowego.2 g of N- (benzyloxycarbonyl) -1-amino- (propyl) methanephosphonic acid (4 mmol) are weighed into a round bottom flask and 10 ml of a 33% solution of hydrobromic acid in acetic acid are added. The reaction is carried out at room temperature for 2.5 hours. The volatile components of the reaction mixture are then removed on a rotary evaporator and the resulting oil is dissolved in the minimum amount of methanol and diethyl ether is added to the first turbidity. The flask is placed at -20 ° C for 24 hours to crystallize the product, which is filtered under reduced pressure and air dried to constant weight. 1.6 g (M = 446.26 g / mol, total formula C18H25BrNO5P, 90% yield) of 1-amino- (propyl) methanophosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester hydrobromide are obtained.

Etap 4. Otrzymywanie estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(propylo)metanofosfonowego.Step 4. Preparation of 1-isothiocyano- (propyl) methanophosphonic acid di- (4-methoxy) phenyl ester.

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 1,5 g (3,35 mmola, M=446,26 g/mol) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(propylo)metanofosfonowego i rozpuszcza się ₃ w 10 cm³ N,N-dimetyloformamidu (DMF). Następnie do mieszaniny dodaje się 3,04 ml disiarczku węgla (15 eq, 50,25 mmola, M=76,14, d=1,26 g/ml) i 0,51 ml trójetyloaminy (1,1 eq, 3,69 mmola, M=101,19 g/mol, d=0,725 g/ml). Reakcję prowadzi się przez 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym schładza się ją w łaźni lodowej do temperatury 5-15°C i dodaje się powoli 1,14 ml 30% roztworu wody utlenionej w wodzie (3eq, 10,05 mmola, M=34,01, d=1,0 g/ml) i reakcję pozostawia się w łaźni na 15 minut. Następnie układ reakcyjny zakwasza się 2M kwasem solnym do pH=2 i dodaje się 30 ml toluenu. Mieszaninę ekstrahuje się dwukrotnie 20 ml porcjami toluenu, a następnie warstwę orga4For this, 1.5 g (3.35 mmol, M = 446.26 g / mol) of 1-amino- (propyl) methanophosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester hydrobromide are weighed into a round bottom flask and ₃ are dissolved in 10 cm3. ³ N, N-dimethylformamide (DMF). Then 3.04 ml of carbon disulfide (15 eq, 50.25 mmol, M = 76.14, d = 1.26 g / ml) and 0.51 ml of triethylamine (1.1 eq, 3.69 mmol, M = 101.19 g / mol, d = 0.725 g / ml). The reaction is carried out for 15 minutes at room temperature, then it is cooled in an ice bath to 5-15 ° C and 1.14 ml of a 30% hydrogen peroxide solution (3eq, 10.05 mmol, M = 34.01, d = 1.0 g / ml) and the reaction was left in the bath for 15 minutes. The reaction system is then acidified with 2M hydrochloric acid to pH = 2 and 30 ml of toluene are added. The mixture is extracted twice with 20 ml portions of toluene and then an organic layer

PL 215 528 B1 niczną (toluen) ekstrahuje się wodą, solanką i suszy nad siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka suszącego i odparowaniu lotnych składników mieszaniny związek oczyszcza się na silica żelu na kolumnie chromatograficznej z użyciem eluentu eter naftowy : octan etylu 5:1(v/v) uzyskując 1190 mg estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(propylo)metanofosfonowego w postaci klarownego oleju z wydajnością 87%. Wzór sumaryczny C19H22NO5PS. Masa cząsteczkowa 407,42 g/mol.The mixture (toluene) is extracted with water, brine and dried over magnesium sulfate. After filtering off the drying agent and evaporating the volatile components of the mixture, the compound is purified on a silica gel column chromatography with the eluent petroleum ether: ethyl acetate 5: 1 (v / v) to obtain 1190 mg of 1-isothiocyanate di- (4-methoxy) phenyl ester - (propyl) methanephosphonic acid as a clear oil with a yield of 87%. Summary formula C19H22NO5PS. Molecular weight 407.42 g / mol.

Rf (eter naftowy : octan etylu 5:1(v/v): 0.52.Rf (petroleum ether: ethyl acetate 5: 1 (v / v): 0.52.

Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 12.02 (s). ³¹ P NMR spectrum (solution in CDCl3, δ [ppm]): 12.02 (s).

Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm], J [Hz]): 7.18 - 6.79 (m, 8H, Ar-H), 4.17-4.05 (m, 1H, CHP), 3.78 (s, 6H, 1xOCH3), 2.08 - 1.94 (m, 2H, CH2), 1.82 - 1.64 (m, 1H, CHA), 1.52 (m, 1H, CHB), 0.99 (t, J = 7.3 Hz, 3H, CH3). ¹ H NMR spectrum (CDCl3 solution, δ [ppm], J [Hz]): 7.18 - 6.79 (m, 8H, Ar-H), 4.17-4.05 (m, 1 H, CHP), 3.78 (s, 6H, 1xOCH3), 2.08 - 1.94 (m, 2H, CH2), 1.82 - 1.64 (m, 1H, CHA), 1.52 (m, 1H, CHB), 0.99 (t, J = 7.3 Hz, 3H, CH3).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 408,1035/408,1045 [M+H]⁺.Mass spectrum (ESI, m / z): theoretical / found 408.1035 / 408.1045 [M + H] ⁺ .

P r z y k ł a d 2P r z k ł a d 2

Sposób wytwarzania estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(izo-propylo)metanofosfonowego związek o wzorze 3.A method for producing 1-isothiocyano- (iso-propyl) methanophosphonic acid di- (4-methoxy) phenyl ester of a compound of formula 3.

Etap ten przebiega jak w przykładzie 1.This step is as in example 1.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(izo-propylo)metanofosfonowego.Step 2. Preparation of N- (benzyloxycarbonyl) -1-amino- (iso-propyl) methanephosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester.

W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-metoksyfenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,82 g (12 mmola) karbaminianu benzylu i 1,36 ml (15 mmola) aldehydu izomasłowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 25 ml acetonitrylu mieszaninę reakcyjną schładza się w łaźni lodowej do temperatury około 5°C i dodaje się 0,05 ekwiwalenta molowego kwasu tetrafluoroborowego. Po 50-60 minutach powstały produkt odsącza się, a pozostały roztwór odparowuję się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej i pozostałość rozpuszcza się w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 5,09 g surowego produktu (M=499,49 g/mol, wzór sumaryczny C26H30NO7P, wydajność 85%).For this purpose, 1.82 g (12 mmol) of benzyl carbamate and 1.36 ml (15 mmol) of isobutyraldehyde are weighed into a round-bottom flask - containing the tri-4-methoxyphenyl phosphite formed directly in step 1 - and equipped with a magnetic stirrer. After all components are dissolved in 25 ml of acetonitrile, the reaction mixture is cooled in an ice bath to about 5 ° C and 0.05 molar equivalents of tetrafluoroboric acid are added. After 50-60 minutes, the product formed is filtered off, the remaining solution is evaporated under reduced pressure on a rotary evaporator and the residue is dissolved in 100-150 ml of methanol and placed at -20 ° C for 24 hours to crystallize the product. The resulting product was filtered off with suction and air dried to constant weight. This gives 5.09 g of crude product (M = 499.49 g / mol, summarized formula C26H30NO7P, 85% yield).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 500,1838/500,1899[M+H]⁺.Mass spectrum (ESI, m / z): theoretical / found 500.1838 / 500.1899 [M + H] ⁺ .

Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(izo-propylo)metanofosfonowego.Step 3. Preparation of 1-Amino- (iso-propyl) methanephosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester hydrobromide.

Do kolby okrągłodennej odważa się 3 g estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(izo-propylo)metanofosfonowego (6 mmol) i dodaje się 15 ml 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny reakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze - 20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 2,54 g (M=446,26 g/mol, wzór sumaryczny C18H25BrNO5P, wydajność 95%) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(izo-propylo)metanofosfonowego.3 g of N- (benzyloxycarbonyl) -1-amino- (iso-propyl) methanephosphonic acid (6 mmol) are weighed into a round bottom flask and 15 ml of a 33% solution of hydrobromic acid in acetic acid are added. The reaction is carried out at room temperature for 3 hours. The volatile components of the reaction mixture are then removed on a rotary evaporator and the resulting oil is dissolved in the minimum amount of methanol and diethyl ether is added to the first turbidity. The flask is placed at -20 ° C for 24 hours to crystallize the product, which is filtered under reduced pressure and air dried to constant weight. 2.54 g (M = 446.26 g / mol, total formula C18H25BrNO5P, 95% yield) of 1-amino- (iso-propyl) methanophosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester hydrobromide are obtained.

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 2 g (4,48 mmola, M=446,26 g/mol) bromowodorku ₃ estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(izo-propylo)metanofosfonowego i rozpuszcza się w 15 cm³N,N-dimetyloformamidu (DMF). Następnie do mieszaniny dodaje się 2,7 ml disiarczku węgla (10 eq,For this purpose, 2 g (4.48 mmol, M = 446.26 g / mol) of 1-amino- (iso-propyl) methanophosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester _{hydrobromide 3 are weighed into a round bottom flask and dissolved in 15 cm3.} ³ N, N-dimethylformamide (DMF). Then 2.7 ml of carbon disulfide (10 eq.

44,8 mmola, M=76,14, d=1,26 g/ml) i 0,75 ml trójetyloaminy (1,2 eq, 5,38 mmola, M=101,19 g/mol, d=0,725 g/ml). Reakcję prowadzi się przez 20 minut w temperaturze pokojowej, po czym schładza się ją w łaźni lodowej do temperatury 5-15°C i dodaje się powoli 1,52 ml 30% roztworu wody utlenionej w wodzie (3eq, 13,44 mmola, M=34,01, d=1,0 g/ml) i reakcję pozostawia się w łaźni na 10 minut. Następnie układ reakcyjny zakwasza się 2M kwasem solnym do pH=2 i dodaje się 30 ml toluenu. Mieszaninę ekstrahuje się dwukrotnie 20 ml porcjami toluenu, a następnie warstwę organiczną (toluen) ekstrahuje się wodą, solanką i suszy nad siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka suszącego i odparowaniu lotnych składników mieszaniny związek oczyszcza się na silica żelu na kolumnie chromatograficznej z użyciem eluentu eter naftowy : octan etylu 1:1(v/v) uzyskując 1600 mg estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(propylo)metanofosfonowego w postaci klarownego oleju z wydajnością 88%. Wzór sumaryczny C19H22NO5PS. Masa cząsteczkowa 407,42 g/mol.44.8 mmol, M = 76.14, d = 1.26 g / ml) and 0.75 ml of triethylamine (1.2 eq, 5.38 mmol, M = 101.19 g / mol, d = 0.725 g / ml). The reaction is carried out for 20 minutes at room temperature, then it is cooled in an ice bath to 5-15 ° C and 1.52 ml of a 30% hydrogen peroxide solution (3eq, 13.44 mmol, M = 34.01, d = 1.0 g / ml) and the reaction was left in the bath for 10 minutes. The reaction system is then acidified with 2M hydrochloric acid to pH = 2 and 30 ml of toluene are added. The mixture is extracted twice with 20 mL portions of toluene, then the organic layer (toluene) is extracted with water, brine and dried over magnesium sulfate. After filtering off the drying agent and evaporating the volatile components of the mixture, the compound is purified on a silica gel column chromatography with the eluent petroleum ether: ethyl acetate 1: 1 (v / v) to give 1600 mg of 1-isothiocyanin acid di- (4-methoxy) phenyl ester - (propyl) methanephosphonic acid as a clear oil with a yield of 88%. Summary formula C19H22NO5PS. Molecular weight 407.42 g / mol.

PL 215 528 B1PL 215 528 B1

Rf (eter naftowy : octan etylu 1:1 (v/v)): 0.13.Rf (petroleum ether: ethyl acetate 1: 1 (v / v)): 0.13.

Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 11.87 (s). ³¹ P NMR spectrum (solution in CDCl3, δ [ppm]): 11.87 (s).

Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 7.22 - 6.70 (m, 8H, Ar-H), 4.01 (dd, J = 15.2, 3.6 Hz, 1H, CHP), 3.78 (s, 6H, 1xOCH3), 2.60 - 2.39 (m, 1H, CH), 1.24-1.16 (m, 6H, 2xCH3). ¹ H NMR spectrum (solution in CDCl 3, δ [ppm]): 7.22 - 6.70 (m, 8H, Ar-H), 4.01 (dd, J = 15.2, 3.6 Hz, 1H, CHP), 3.78 (s, 6H, 1xOCH3), 2.60-239 (m, 1H, CH), 1.24-1.16 (m, 6H, 2xCH3).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 408,1035/408,1068 [M+H]⁺.Mass spectrum (ESI, m / z): theoretical / found 408.1035 / 408.1068 [M + H] ⁺ .

P r z y k ł a d 3P r z k ł a d 3

Sposób wytwarzania estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(sec-butylo)metanofosfonowego związek o wzorze 4.Preparation of 1-isothiocyano- (sec-butyl) methanophosphonic acid di- (4-methoxy) phenyl ester of the compound of formula 4.

Etap ten przebiega jak w przykładzie 1.This step is as in example 1.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino(sec-butylo)metanofosfonowego.Step 2. Preparation of N- (benzyloxycarbonyl) -1-amino (sec-butyl) methanephosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester.

W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-metoksyfenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,82 g (12 mmola) karbaminianu benzylu i 1,6 ml (15 mmola) aldehydu 2-metylobutylowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 25 ml acetonitrylu mieszaninę reakcyjną schładza się w łaźni lodowej do temperatury około 5°C i dodaje się 0,05 ekwiwalenta molowego kwasu tetrafluoroborowego. Po 50-60 minutach powstały produkt odsącza się, a pozostały roztwór odparowuję się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej i pozostałość rozpuszcza się w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 4,6 g surowego produktu (M= 513,51 g/mol, wzór sumaryczny C27H32NO7P, wydajność 75%).For this purpose, 1.82 g (12 mmol) of benzyl carbamate and 1.6 ml (15 mmol) of 2-methylbutylaldehyde are weighed into a round-bottom flask - containing the tri-4-methoxyphenyl phosphite formed directly in step 1 - and equipped with a magnetic stirrer. After all components are dissolved in 25 ml of acetonitrile, the reaction mixture is cooled in an ice bath to about 5 ° C and 0.05 molar equivalents of tetrafluoroboric acid are added. After 50-60 minutes, the product formed is filtered off, the remaining solution is evaporated under reduced pressure on a rotary evaporator and the residue is dissolved in 100-150 ml of methanol and placed at -20 ° C for 24 hours to crystallize the product. The resulting product was filtered off with suction and air dried to constant weight. 4.6 g of crude product are obtained (M = 513.51 g / mol, total formula C27H32NO7P, 75% yield).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 514,1995/514,2014[M+H]⁺.Mass spectrum (ESI, m / z): theoretical / found 514.1995 / 514.2014 [M + H] ⁺ .

Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(sec-butylo)metanofosfonowego.Step 3. Preparation of 1-Amino- (sec-butyl) methanephosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester hydrobromide.

Do kolby okrągłodennej odważa się 3 g estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(sec-butylo)metanofosfonowego (5,84 mmol) i dodaje się 15 ml 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny reakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze - 20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 2,4 g (M=460,30 g/mol, wzór sumaryczny C19H27BrNO5P, wydajność 90%) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(sec-butylo)metanofosfonowego.3 g of N- (benzyloxycarbonyl) -1-amino- (sec-butyl) methanephosphonic acid (5.84 mmol) are weighed into a round bottom flask and 15 ml of a 33% solution of hydrobromic acid in acetic acid are added. The reaction is carried out at room temperature for 3 hours. The volatile components of the reaction mixture are then removed on a rotary evaporator and the resulting oil is dissolved in the minimum amount of methanol and diethyl ether is added to the first turbidity. The flask is placed at -20 ° C for 24 hours to crystallize the product, which is filtered under reduced pressure and air dried to constant weight. 2.4 g (M = 460.30 g / mol, total formula C19H27BrNO5P, 90% yield) of 1-amino- (sec-butyl) methanophosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester hydrobromide are obtained.

Etap 4. Otrzymywanie estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(sec-butylo)metanofosfonowego.Step 4. Preparation of 1-isothiocyano- (sec-butyl) methanephosphonic acid di- (4-methoxy) phenyl ester.

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 2 g (4,34 mmola, M=460,30 g/mol) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(sec-butylo)metanofosfonowego i rozpuszcza się ₃ w 15 cm³ N,N-dimetyloformamidu (DMF). Następnie do mieszaniny dodaje się 2,7 ml disiarczku węgla (10,3 eq, 44,8 mmola, M=76,14, d=1,26 g/ml) i 0,75 ml trójetyloaminy (1,24 eq, 5,38 mmola, M=101,19 g/mol, d=0,725 g/ml). Reakcję prowadzi się przez 20 minut w temperaturze pokojowej, po czym schładza się ją w łaźni lodowej do temperatury 5-15°C i dodaje się powoli 1,97 ml 30% roztworu wody utlenionej w wodzie (4eq, 17,36 mmola, M=34,01, d=1,0 g/ml) i reakcję pozostawia się w łaźni na 15 minut. Następnie układ reakcyjny zakwasza się 2M kwasem solnym do pH=2 i dodaje się 25 ml toluenu. Mieszaninę ekstrahuje się dwukrotnie 20 ml porcjami toluenu, a następnie warstwę organiczną (toluen) ekstrahuje się wodą, solanką i suszy nad siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka suszącego i odparowaniu lotnych składników mieszaniny związek oczyszcza się na silica żelu na kolumnie chromatograficznej z użyciem eluentu eter naftowy : octan etylu 1:1(v/v) uzyskując 1530 mg estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(sec-buty]o)metanofosfonowego w postaci żółtawego, klarownego oleju z wydajnością 84%. Wzór sumaryczny C20H24NO5PS. Masa cząsteczkowa 421,45 g/mol.For this purpose, 2 g (4.34 mmol, M = 460.30 g / mol) of 1-amino- (sec-butyl) methanophosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester hydrobromide are weighed into a round bottom flask and ₃ are dissolved in 15 cm3. ³ N, N-dimethylformamide (DMF). Then 2.7 ml of carbon disulfide (10.3 eq, 44.8 mmol, M = 76.14, d = 1.26 g / ml) and 0.75 ml of triethylamine (1.24 eq, 5 , 38 mmol, M = 101.19 g / mol, d = 0.725 g / ml). The reaction is allowed to proceed for 20 minutes at room temperature, then it is cooled in an ice bath to 5-15 ° C and 1.97 ml of a 30% hydrogen peroxide solution (4eq, 17.36 mmol, M = 34.01, d = 1.0 g / ml) and the reaction was left in the bath for 15 minutes. The reaction system is then acidified with 2M hydrochloric acid to pH = 2, and 25 ml of toluene are added. The mixture is extracted twice with 20 mL portions of toluene, then the organic layer (toluene) is extracted with water, brine and dried over magnesium sulfate. After the drying agent was filtered off and the volatile components of the mixture were evaporated, the compound was purified on a silica gel column chromatography with the eluent petroleum ether: ethyl acetate 1: 1 (v / v) to obtain 1530 mg of 1-isothiocyano acid di- (4-methoxy) phenyl ester - (sec-buty] o) methanophosphonic acid in the form of a yellowish, clear oil with a yield of 84%. Summary formula C20H24NO5PS. Molecular weight 421.45 g / mol.

Rf (eter naftowy : octan etylu 1:1(v/v)): 0.17.Rf (petroleum ether: ethyl acetate 1: 1 (v / v)): 0.17.

Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 12.40 (s, 1P, 78%), 11.95 (s, 1P, 22%). ³¹ P NMR spectrum (CDCl3 solution, δ [ppm]): 12.40 (s, 1P, 78%), 11.95 (s, 1P, 22%).

Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 7.18 - 6.73 (m, 8H, Ar-H), 4.25 - 3.96 (m, 1H, CHP), 3.78 (s, 6H, 2xOCH3), 2.22-2.1 (m, 1H, CHA), 1.66 - 1.31 (m, 2H, CH, CHB), 1.21 (d, J = 6.8 Hz, 3H, CHCH3), 0.95 (dd, J = 8.3, 6.5 Hz, 3H, CH2 CH3). ¹ H NMR spectrum (CDCl3 solution, δ [ppm]): 7.18 - 6.73 (m, 8H, Ar-H), 4.25 - 3.96 (m, 1 H, CHP), 3.78 (s, 6H, 2xOCH3), 2.22- 2.1 (m, 1H, CHA), 1.66 - 1.31 (m, 2H, CH, CHB), 1.21 (d, J = 6.8 Hz, 3H, CHCH3), 0.95 (dd, J = 8.3, 6.5 Hz, 3H, CH2 CH3).

PL 215 528 B1PL 215 528 B1

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 422,1191/422,1205 [M+H]⁺.Mass spectrum (ESI, m / z): theoretical / found 422.1191 / 422.1205 [M + H] ⁺ .

P r z y k ł a d 4P r z k ł a d 4

Sposób wytwarzania estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(benzylo)metanofosfonowego związek o wzorze 5.Preparation of 1-isothiocyano- (benzyl) methanophosphonic acid di- (4-methoxy) phenyl ester of the compound of formula 5.

Etap ten przebiega jak w przykładzie 1.This step is as in example 1.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino(benzylo)metanofosfonowego.Step 2. Preparation of N- (benzyloxycarbonyl) -1-amino (benzyl) methanophosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester.

W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-metoksyfenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,82 g (12 mmola) karbaminianu benzylu i 1,4 ml (15 mmola) aldehydu fenylooctowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 30 ml acetonitrylu mieszaninę reakcyjną schładza się w łaźni lodowej do temperatury około 5°C i dodaje się 0,05 ekwiwalenta molowego kwasu tetrafluoroborowego. Po 60-70 minutach powstały produkt odsącza się, a pozostały roztwór odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej i pozostałość rozpuszcza się w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 3,9 g surowego produktu (M=547,53 g/mol, wzór sumaryczny C30H30NO7P, wydajność 60%).For this purpose, 1.82 g (12 mmol) of benzyl carbamate and 1.4 ml (15 mmol) of phenylacetaldehyde are weighed into a round-bottom flask - containing the tri-4-methoxyphenyl phosphite formed directly in step 1 - and equipped with a magnetic stirrer. After all components are dissolved in 30 ml of acetonitrile, the reaction mixture is cooled in an ice bath to about 5 ° C and 0.05 molar equivalents of tetrafluoroboric acid are added. After 60-70 minutes, the resulting product is filtered off, the remaining solution is evaporated under reduced pressure on a rotary evaporator and the residue is dissolved in 100-150 ml of methanol and placed at -20 ° C for 24 hours to crystallize the product. The resulting product was filtered off with suction and air dried to constant weight. 3.9 g of crude product are obtained (M = 547.53 g / mol, crude formula C30H30NO7P, 60% yield).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 548,1838/548,1901 [M+H]⁺.Mass spectrum (ESI, m / z): theoretical / found 548.1838 / 548.1901 [M + H] ⁺ .

Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(benzylo)metanofosfonowego.Step 3. Preparation of 1-Amino- (benzyl) methanophosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester hydrobromide.

Do kolby okrągłodennej odważa się 2,5 g estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(benzylo)metanofosfonowego (4,57 mmol) i dodaje się 10 ml 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez2.5 g of N- (benzyloxycarbonyl) -1-amino- (benzyl) methanephosphonic acid (4.57 mmol) are weighed into a round bottom flask and 10 ml of a 33% solution of hydrobromic acid in acetic acid are added. The reaction is carried out at room temperature for

3,5 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny reakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze - 20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 2,03 g (M= 494,31 g/mol, wzór sumaryczny C22H25BrNO5P, wydajność 90%) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(benzylo)metanofosfonowego.3.5 hours. The volatile components of the reaction mixture are then removed on a rotary evaporator and the resulting oil is dissolved in the minimum amount of methanol and diethyl ether is added to the first turbidity. The flask is placed at -20 ° C for 24 hours to crystallize the product, which is filtered under reduced pressure and air dried to constant weight. 2.03 g (M = 494.31 g / mol, total formula C22H25BrNO5P, 90% yield) of 1-amino- (benzyl) methanophosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester hydrobromide are obtained.

Etap 4. Otrzymywanie estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(benzylo)metanofosfonowego.Step 4. Preparation of 1-isothiocyano- (benzyl) methanophosphonic acid di- (4-methoxy) phenyl ester.

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 1,5 g (3,03 mmola, M=494,31 g/mol) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(benzylo)metanofosfonowego i rozpuszcza się ₂ w 10 cm² N,N-dimetyloformamidu (DMF). Następnie do mieszaniny dodaje się 2,75 ml disiarczku węgla (15 eq, 45,45 mmola, M=76,14, d=1,26 g/ml) i 0,63 ml trójetyloaminy (1,5 eq, 4,54 mmola, M=101,19 g/mol, d=0,725 g/ml). Reakcję prowadzi się przez 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym schładza się ją w łaźni lodowej do temperatury 5-15°C i dodaje się powoli 1,03 ml 30% roztworu wody utlenionej w wodzie (3eq, 9,09 mmola, M=34,01, d=1,0 g/ml) i reakcję pozostawia się w łaźni na 20 minut. Następnie układ reakcyjny zakwasza się 2M kwasem solnym do pH=2 i dodaje się 25 ml toluenu. Mieszaninę ekstrahuje się dwukrotnie 20 ml porcjami toluenu, a następnie warstwę organiczną (toluen) ekstrahuje się wodą, solanką i suszy nad siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka suszącego i odparowaniu lotnych składników mieszaniny związek oczyszcza się na silica żelu na kolumnie chromatograficznej z użyciem eluentu eter naftowy : octan etylu 5:1(v/v) uzyskując 1090 mg estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(benzylo)metanofosfonowego w postaci, żółtawego osadu z wydajnością 79%. Wzór sumaryczny C23H22NO5PS. Masa cząsteczkowa 455,0956 g/mol.For this purpose, 1.5 g (3.03 mmol, M = 494.31 g / mol) of 1-amino- (benzyl) methanophosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester hydrobromide are weighed into a round bottom flask and ₂ in 10 cm3 are dissolved. ² N, N-dimethylformamide (DMF). Then 2.75 ml of carbon disulfide (15 eq, 45.45 mmol, M = 76.14, d = 1.26 g / ml) and 0.63 ml of triethylamine (1.5 eq, 4.54 mmol, M = 101.19 g / mol, d = 0.725 g / ml). The reaction is allowed to proceed for 15 minutes at room temperature, then it is cooled in an ice bath to 5-15 ° C and 1.03 ml of a 30% hydrogen peroxide solution (3eq, 9.09 mmol, M = 34.01, d = 1.0 g / ml) and the reaction was left in the bath for 20 minutes. The reaction system is then acidified with 2M hydrochloric acid to pH = 2, and 25 ml of toluene are added. The mixture is extracted twice with 20 mL portions of toluene, then the organic layer (toluene) is extracted with water, brine and dried over magnesium sulfate. After the drying agent was filtered off and the volatile components of the mixture were evaporated, the compound was purified on a silica gel column chromatography with the eluent petroleum ether: ethyl acetate 5: 1 (v / v) to obtain 1090 mg of 1-isothiocyano acid di- (4-methoxy) phenyl ester - (benzyl) methanophosphonic acid in the form of a yellowish solid with a yield of 79%. Summary formula C23H22NO5PS. Molecular weight 455.0956 g / mol.

Rf (eter naftowy : octan etylu 5:1(v/v)): 0.52.Rf (petroleum ether: ethyl acetate 5: 1 (v / v)): 0.52.

Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 11.66 (s). ³¹ P NMR spectrum (solution in CDCl3, δ [ppm]): 11.66 (s).

Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 7.58 - 6.62 (m, 13H, Ar-H), 4.32 (ddd, J = 14.2 Hz, 11.3 Hz, 3.1 Hz, 1H, CHP), 3.78 (s, 6H, 1xOCH3), 3.48 - 3.37 (m, 1H, CHA), 3.2-3.12 (m, 1H, CHB). ¹ H NMR spectrum (solution in CDCl3, δ [ppm]): 7.58 - 6.62 (m, 13H, Ar-H), 4.32 (ddd, J = 14.2 Hz, 11.3 Hz, 3.1 Hz, 1 H, CHP), 3.78 ( s, 6H, 1xOCH3), 3.48-3.37 (m, 1H, CHA), 3.2-3.12 (m, 1H, CHB).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 456,1034/456,1019 [M+H]⁺.Mass spectrum (ESI, m / z): theoretical / found 456.1034 / 456.1019 [M + H] ⁺ .

PL 215 528 B1PL 215 528 B1

P r z y k ł a d 5P r z k ł a d 5

Sposób wytwarzania estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(4-metoksyfenylo)metanofosfonowego związek o wzorze 6.Preparation of 1-isothiocyano- (4-methoxyphenyl) methanophosphonic acid di- (4-methoxy) phenyl ester of the compound of formula 6.

Etap ten przebiega jak w przykładzie 1.This step is as in example 1.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(4-metoksyfenylo)metanofosfonowego.Step 2. Preparation of N- (benzyloxycarbonyl) -1-amino- (4-methoxyphenyl) methanophosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester.

W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-metoksyfenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,82 g (12 mmola) karbaminianu benzylu i 1,82 ml (15 mmola) 4-metoksybenzaldehydu. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 30 ml acetonitrylu mieszaninę reakcyjną schładza się w łaźni lodowej do temperatury około 5°C i dodaje się 0,05 ekwiwalenta molowego kwasu tetrafluoroborowego. Po 50-60 minutach powstały produkt odsącza się, a pozostały roztwór odparowuję się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej i pozostałość rozpuszcza się w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 5,74 g surowego produktu (M=563,53 g/mol, wzór sumaryczny C30H30NO8P, wydajność 85%).For this purpose, 1.82 g (12 mmol) of benzyl carbamate and 1.82 ml (15 mmol) of 4-methoxybenzaldehyde are weighed into a round-bottom flask - containing the tri-4-methoxyphenyl phosphite formed directly in step 1 - and equipped with a magnetic stirrer. After all components are dissolved in 30 ml of acetonitrile, the reaction mixture is cooled in an ice bath to about 5 ° C and 0.05 molar equivalents of tetrafluoroboric acid are added. After 50-60 minutes, the product formed is filtered off, the remaining solution is evaporated under reduced pressure on a rotary evaporator and the residue is dissolved in 100-150 ml of methanol and placed at -20 ° C for 24 hours to crystallize the product. The resulting product was filtered off with suction and air dried to constant weight. 5.74 g of crude product are obtained (M = 563.53 g / mol, total formula C30H30NO8P, 85% yield).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 564,1787/564,1789[M+H]⁺.Mass spectrum (ESI, m / z): theoretical / found 564.1787 / 564.1789 [M + H] ⁺ .

Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(4-metoksyfenylo)metanofosfonowego.Step 3. Preparation of 1-Amino- (4-methoxyphenyl) methanophosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester hydrobromide.

Do kolby okrągłodennej odważa się 3 g estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(4-metoksyfenylo)metanofosfonowego (5,3 mmol) i dodaje się 14 ml 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny reakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze - 20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 2,29 g (M= 510,3148 g/mol, wzór sumaryczny C22H25BrNO6P, wydajność 85%) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(4-metoksyfenylo)metanofosfonowego.3 g of N- (benzyloxycarbonyl) -1-amino- (4-methoxyphenyl) methanophosphonic acid (5.3 mmol) di-4-methoxyphenyl ester (5.3 mmol) are weighed into a round bottom flask and 14 ml of a 33% solution of hydrobromic acid in acetic acid are added. The reaction is carried out at room temperature for 3 hours. The volatile components of the reaction mixture are then removed on a rotary evaporator and the resulting oil is dissolved in the minimum amount of methanol and diethyl ether is added to the first turbidity. The flask is placed at -20 ° C for 24 hours to crystallize the product, which is filtered under reduced pressure and air dried to constant weight. 2.29 g (M = 510.3148 g / mol, total formula C22H25BrNO6P, 85% yield) of 1-amino- (4-methoxyphenyl) methanophosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester hydrobromide are obtained.

Etap 4. Otrzymywanie estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(4-metoksyfenylo)metanofosfonowego.Step 4. Preparation of 1-isothiocyano- (4-methoxyphenyl) methanophosphonic acid di- (4-methoxy) phenyl ester.

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 2 g (3,92 mmola, M= 510,3148 g/mol) bromoFor this purpose, 2 g (3.92 mmol, M = 510.3148 g / mol) of bromo are weighed into a round bottom flask.

-wodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(4-metoksyfenylo)metanofosfonowego i roz₃ puszcza się w 15 cm³ N,N-dimetyloformamidu (DMF). Następnie do mieszaniny dodaje się 3,08 ml disiarczku węgla (13 eq, 50,96 mmola, M=76,14, d=1,26 g/ml) i 0,60 ml trójetyloaminy (1,1 eq, 4,3 mmola, M=101,19 g/mol, d=0,725 g/ml). Reakcję prowadzi się przez 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym schładza się ją w łaźni lodowej do temperatury 5-15°C i dodaje się powoli 1,78 ml 30% roztworu wody utlenionej w wodzie (4eq, 15,68 mmola, M=34,01, d=1,0 g/ml) i reakcję pozostawia się w łaźni lodowej na 15 minut. Następnie układ reakcyjny zakwasza się 2M kwasem solnym do pH=2 i dodaje się 25 ml toluenu. Mieszaninę ekstrahuje się dwukrotnie 20 ml porcjami toluenu, a następnie warstwę organiczną (toluen) ekstrahuje się wodą, solanką i suszy nad siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka suszącego i odparowaniu lotnych składników mieszaniny związek oczyszcza się na silica żelu na kolumnie chromatograficznej z użyciem eluentu eter naftowy : octan etylu 3:1(v/v) uzyskując 1530 mg estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(4-metoksyfenylo)metanofosfonowego w postaci pomarańczowego, klarownego oleju z wydajnością 83%. Wzór sumaryczny C23H22NO6PS. Masa cząsteczkowa 471,46 g/mol.-wodorku acid di-4-methoxyphenyl-amino-1- (4-methoxyphenyl) methanephosphonic and disconnector ₃ is dissolved in 15 cm ^{3 of} N, N-dimethylformamide (DMF). Then 3.08 ml of carbon disulfide (13 eq, 50.96 mmol, M = 76.14, d = 1.26 g / ml) and 0.60 ml of triethylamine (1.1 eq, 4.3 mmol, M = 101.19 g / mol, d = 0.725 g / ml). The reaction is carried out for 15 minutes at room temperature, then it is cooled in an ice bath to 5-15 ° C and 1.78 ml of a 30% hydrogen peroxide solution (4eq, 15.68 mmol, M = 34.01, d = 1.0 g / ml) and the reaction was left in an ice bath for 15 minutes. The reaction system is then acidified with 2M hydrochloric acid to pH = 2 and 25 ml of toluene are added. The mixture is extracted twice with 20 mL portions of toluene, then the organic layer (toluene) is extracted with water, brine and dried over magnesium sulfate. After filtering off the drying agent and evaporating the volatile components of the mixture, the compound is purified on a silica gel column chromatography with the eluent petroleum ether: ethyl acetate 3: 1 (v / v) to obtain 1530 mg of 1-isothiocyanate di- (4-methoxy) phenyl ester - (4-methoxyphenyl) methanephosphonic acid as an orange, clear oil with a yield of 83%. Summary formula C23H22NO6PS. Molecular weight 471.46 g / mol.

Rf (eter naftowy : octan etylu 3:1(v/v)): 0.1.Rf (petroleum ether: ethyl acetate 3: 1 (v / v)): 0.1.

Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 8.88 (s). ³¹ P NMR spectrum (solution in CDCl 3, δ [ppm]): 8.88 (s).

Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm], J [Hz]): 7.17 - 7.09 (m, 6H, Ar-H), 6.95 - 6.76 (m, 4H, Ar-H), 4.70 (d, J= 18.3 Hz, 1H, CHP), 3.81 (s, 3H, OCH3), 3.78 (s, 6H, 2xOCH3). ¹ H NMR spectrum (solution in CDCl 3, δ [ppm], J [Hz]): 7.17 - 7.09 (m, 6H, Ar-H), 6.95 - 6.76 (m, 4H, Ar-H), 4.70 (d, J = 18.3 Hz, 1H, CHP), 3.81 (s, 3H, OCH3), 3.78 (s, 6H, 2xOCH3).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 494,0803/494,0793 [M+Na]⁺.Mass spectrum (ESI, m / z): theoretical / found 494.0803 / 494.0793 [M + Na] ⁺ .

P r z y k ł a d 6P r z k ł a d 6

Sposób wytwarzania estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(3,5-dimetoksyfenylo)metanofosfonowego związek o wzorze 7.Preparation of 1-isothiocyano- (3,5-dimethoxyphenyl) methanephosphonic acid di- (4-methoxy) phenyl ester of the compound of formula 7.

Etap ten przebiega jak w przykładzie 1.This step is as in example 1.

PL 215 528 B1PL 215 528 B1

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(3,5-dimetoksyfenylo)metanofosfonowego.Step 2. Preparation of N- (benzyloxycarbonyl) -1-amino- (3,5-dimethoxyphenyl) methanephosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester.

W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-metoksyfenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,82 g (12 mmola) karbaminianu benzylu i 2,49 g (15 mmola) 3,5-dimetoksybenzaldehydu. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 35 ml acetonitrylu mieszaninę reakcyjną schładza się w łaźni lodowej do temperatury około 5°C i dodaje się 0,05 ekwiwalenta molowego kwasu tetrafluoroborowego. Po 40-50 minutach powstały produkt odsącza się, a pozostały roztwór odparowuję się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej i pozostałość rozpuszcza się w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 5,69 g surowego produktu (M= 593,56 g/mol, wzór sumaryczny C31H32NO9P, wydajność 80%).For this purpose, 1.82 g (12 mmol) of benzyl carbamate and 2.49 g (15 mmol) of 3,5-dimethoxybenzaldehyde are weighed into a round-bottomed flask - containing the tri-4-methoxyphenyl phosphite formed directly in stage 1 - and equipped with a magnetic stirrer. . After all components are dissolved in 35 ml of acetonitrile, the reaction mixture is cooled in an ice bath to about 5 ° C and 0.05 molar equivalents of tetrafluoroboric acid are added. After 40-50 minutes, the product formed is filtered off, the remaining solution is evaporated under reduced pressure on a rotary evaporator and the residue is dissolved in 100-150 ml of methanol and placed at -20 ° C for 24 hours to crystallize the product. The resulting product was filtered off with suction and air dried to constant weight. The obtained crude product is 5.69 g (M = 593.56 g / mol, total formula C31H32NO9P, yield 80%).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 594,1893/594,1909[M+H]⁺.Mass spectrum (ESI, m / z): theoretical / found 594.1893 / 594.1909 [M + H] ⁺ .

Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(3,5-dimetoksyfenylo)metanofosfonowego.Step 3. Preparation of 1-Amino- (3,5-dimethoxyphenyl) methanophosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester hydrobromide.

Do kolby okrągłodennej odważa się 3 g estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(3,5-dimetoksyfenylo)metanofosfonowego (5,05 mmol) i dodaje się 15 ml 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3,5 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny reakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 2,45 g (M= 539,07 g/mol, wzór sumaryczny C23H27BrNO7P, wydajność 90%) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(3,5-dimetoksyfenylo)metanofosfonowego.3 g of N- (benzyloxycarbonyl) -1-amino- (3,5-dimethoxyphenyl) methanophosphonic acid (5.05 mmol) di-4-methoxyphenyl ester (5.05 mmol) are weighed into a round bottom flask and 15 ml of a 33% solution of hydrobromic acid in acid are added. vinegar. The reaction is carried out at room temperature for 3.5 hours. The volatile components of the reaction mixture are then removed on a rotary evaporator and the resulting oil is dissolved in the minimum amount of methanol and diethyl ether is added to the first turbidity. The flask was placed at -20 ° C for 24 hours to crystallize the product, which was filtered under reduced pressure and air dried to constant weight. 2.45 g (M = 539.07 g / mol, total formula C23H27BrNO7P, 90% yield) of 1-amino- (3,5-dimethoxyphenyl) methanophosphonic acid di-4-methoxyphenyl ester hydrobromide are obtained.

Etap 4. Otrzymywanie estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(3,5-dimetoksyfenylo)metanofosfonowego.Step 4. Preparation of 1-isothiocyano- (3,5-dimethoxyphenyl) methanophosphonic acid di- (4-methoxy) phenyl ester.

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 2 g (3,71 mmola, M= 539,07 g/mol) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(3,5-dimetoksyfenylo)metanofosfonowego i roz₃ puszcza się w 10 cm³ N,N-dimetyloformamidu (DMF). Następnie do mieszaniny dodaje się 2,24 ml disiarczku węgla (10 eq, 37,10 mmola, M=76,14, d=1,26 g/ml) i 0,29 ml trójetyloaminy (1,1 eq, 4,08 mmola, M=101,19 g/mol, d=0,725 g/ml). Reakcję prowadzi się przez 10 minut w temperaturze pokojowej, po czym schładza się ją w łaźni lodowej do temperatury 5-15°C i dodaje się powoli 1,26 ml 30% roztworu wody utlenionej w wodzie (3eq, 11,13 mmola, M=34,01, d=1,0 g/ml) i reakcję pozostawia się w łaźni lodowej na 10 minut. Następnie układ reakcyjny zakwasza się 2M kwasem solnym do pH=2 i dodaje się 25 ml toluenu. Mieszaninę ekstrahuje się dwukrotnie 20 ml porcjami toluenu, a następnie warstwę organiczną (toluen) ekstrahuje się wodą, solanką i suszy nad siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka suszącego i odparowaniu lotnych składników mieszaniny związek oczyszcza się na silica żelu na kolumnie chromatograficznej z użyciem eluentu eter naftowy : octan etylu 5:1(v/v) uzyskując 1360 mg estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(3,5-dimetoksyfenylo)metanowosfonowego w postaci, żółtego osadu z wydajnością 73%. Wzór sumaryczny C24H24NO7PS. Masa cząsteczkowa 501,49 g/mol.For this purpose the flask weighed 2 g (3.71 mmol, M = 539.07 g / mol) of hydrobromide acid di-4-methoxyphenyl-amino-1- (3,5-dimethoxyphenyl) -methanephosphonic and staggered dissolved ₃ in 10 cm ^{3 of} N, N-dimethylformamide (DMF). Then 2.24 ml of carbon disulfide (10 eq, 37.10 mmol, M = 76.14, d = 1.26 g / ml) and 0.29 ml of triethylamine (1.1 eq, 4.08 mmol, M = 101.19 g / mol, d = 0.725 g / ml). The reaction is carried out for 10 minutes at room temperature, then it is cooled in an ice bath to 5-15 ° C and 1.26 ml of a 30% hydrogen peroxide solution (3eq, 11.13 mmol, M = 34.01, d = 1.0 g / ml) and the reaction was left in an ice bath for 10 minutes. The reaction system is then acidified with 2M hydrochloric acid to pH = 2, and 25 ml of toluene are added. The mixture is extracted twice with 20 mL portions of toluene, then the organic layer (toluene) is extracted with water, brine and dried over magnesium sulfate. After filtering off the drying agent and evaporating the volatile components of the mixture, the compound is purified on a silica gel column chromatography with the eluent petroleum ether: ethyl acetate 5: 1 (v / v) to obtain 1360 mg of 1-isothiocyanate di- (4-methoxy) phenyl ester - (3,5-dimethoxyphenyl) methane phosphonic acid as a yellow solid with a yield of 73%. Summary formula C24H24NO7PS. Molecular weight 501.49 g / mol.

Rf (eter naftowy : octan etylu 5:1(v/v)): 0.4.Rf (petroleum ether: ethyl acetate 5: 1 (v / v)): 0.4.

Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 8.85 (s). ³¹ P NMR spectrum (solution in CDCl3, δ [ppm]): 8.85 (s).

Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 7.13 - 6.39 (m, 11H, Ar-H), 5.24 (d, J = 18.2 Hz, 1H, CHP), 3.79 - 3.72 (m, 12H, 4xOCH3). ¹ H NMR spectrum (solution in CDCl 3, δ [ppm]): 7.13 - 6.39 (m, 11H, Ar-H), 5.24 (d, J = 18.2 Hz, 1H, CHP), 3.79 - 3.72 (m, 12H, 4xOCH3).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 502,1089/502,1143 [M+H]⁺.Mass spectrum (ESI, m / z): theoretical / found 502.1089 / 502.1143 [M + H] ⁺ .

P r z y k ł a d 7P r z k ł a d 7

Badanie aktywności antyproliferacyjnej estrów difenylowych kwasów 1-izotiocyjano-metanofosfonowych z wykorzystaniem linii nowotworowych ludzkiego raka płuc A549, gruczołu sutkowego MCF-7, jelita grubego LoVo oraz jelita grubego opornej na doksorubicynę LoVo/DX.Study of the antiproliferative activity of 1-isothiocyanato-methanophosphonic acid diphenyl esters with the use of A549 human lung cancer, MCF-7 mammary gland, LoVo colon and LoVo / DX-resistant colon.

Roztwory wyjściowe testowanych związków przygotowane zostały jako 50 mM roztwory w dimetylosulfotlenku (DMSO). Linie komórkowe hodowane były w warunkach in vitro w odpowiednich dla danej linii medium hodowlanym: A549 - medium OptiMEM + RPMI 1640 + GlutaMAX medium suplementowane 5% surowicy wołowej, MCF-7 - medium Eagle z dodatkiem 2 mM roztworem L-glutaminy, 1,0 mM roztworem pirogronianu sodu, 10% surowicy wołowej i 0,8 mg/L insuliny, LoVo i LoVo/DX Opti-MEM + RPMI 1640 suplementowane 2 mM roztworem L-glutaminy, 1,5 g/L roztworem wodoroPL 215 528 B1Stock solutions of test compounds were prepared as 50 mM solutions in dimethylsulfoxide (DMSO). Cell lines were cultured in vitro in a culture medium appropriate for a given line: A549 - OptiMEM medium + RPMI 1640 + GlutaMAX medium supplemented with 5% bovine serum, MCF-7 - Eagle medium with the addition of 2 mM L-glutamine solution, 1.0 mM sodium pyruvate solution, 10% bovine serum and 0.8 mg / L insulin, LoVo and LoVo / DX Opti-MEM + RPMI 1640 supplemented with 2 mM L-glutamine solution, 1.5 g / L hydrogen solution PL 215 528 B1

-węglanu sodu, 4,5 g/L glukozy, 1,0 mM pirogronianu sodu oraz 5% surowicą wołową i 100 μg/L doxorubicyny (tylko w medium dla linii LoVoDX). Ponadto wszystkie media hodowlane zawierały 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Do odklejenia komórek od płytek hodowlanych używano 0,25% roztworu Trypsyna-EDTA. Następnie policzone komórki posiano na płytki 96-dołkowe w ilości 10 komórek/dołek (100 μL zawiesiny komórkowej 10 komórek/mL na dołek). Po 24 godzinnej inkubacji na płytki nanoszono roztwory testowanych związków przygotowywane poprzez rozcieńczanie wyjściowego roztworu w medium hodowlanym OR. Robocze stężenia wynosiły 100 μΜ, 50 μΜ, 25 μΜ, 12,5 μΜ dając ostatecznie stężenia 50 μΜ, 25 μΜ, 12,5 μΜ, 6,25 μΜ w dołkach testowych. Każde stężenie naniesiono w trzech powtórzeniach. Płytki były następnie inkubowane przez kolejne 72 godziny w inkubatorze (wilgotność >90%, temperatura 37°C, 5% stężenie CO2). Po tym czasie wykonano test SRB: do każdego z dołków dodano po 50 μL 50% roztworu kwasu trichlorooctowego i płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 4°C. Następnie płytki wypłukano pod bieżącą wodą, osuszono i do każdego z dołków dodano po 50 μL 0,4% roztworu sulforodaminy B w 1% kwasie octowym i inkubowano w ciemności przez 30 minut. Po tym czasie płytki wypłukano w 1% kwasie octowym, osuszono i do każdego z dołków dodano po 150 μL. 10 mM roztworu Tris w wodzie dejonizowanej. Po 30 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej odczytano absorbancję przy długości fali 540 nm. Analizę wyników wykonano poprzez porównanie absorbancji dołków traktowanych związkami w odpowiednich stężeniach do dołków kontrolnych (nie traktowanych związkami). Następnie określono krzywą zależności procenta zahamowania proliferacji od stężenia i na jego podstawie określono wartość IC50 (stężenie powodujące zahamowanie wzrostu komórek w 50%). Test dla każdego ze związków powtórzony został co najmniej trzykrotnie.-sodium carbonate, 4.5 g / L glucose, 1.0 mM sodium pyruvate and 5% bovine serum and 100 μg / L doxorubicin (only in the medium for the LoVoDX line). In addition, all culture media contained 100 units / ml penicillin and 100 µg / ml streptomycin. A 0.25% Trypsin-EDTA solution was used to detach the cells from the culture plates. The counted cells were then plated at 10 cells / well in 96-well plates (100 µL of 10 cells / mL cell suspension per well). After incubation for 24 hours, solutions of test compounds prepared by diluting the stock solution in OR culture medium were applied to the plates. The working concentrations were 100 μΜ, 50 μΜ, 25 μΜ, 12.5 μΜ resulting in final concentrations of 50 μΜ, 25 μΜ, 12.5 μΜ, 6.25 μΜ in the test wells. Each concentration was plotted in triplicate. The plates were then incubated for a further 72 hours in an incubator (> 90% humidity, 37 ° C temperature, 5% CO2 concentration). After this time, the SRB test was performed: 50 µL of 50% trichloroacetic acid solution was added to each of the wells and the plates were incubated for 1 hour at 4 ° C. The plates were then rinsed under running water, dried and 50 µL of 0.4% sulforhodamine B solution in 1% acetic acid was added to each well and incubated in the dark for 30 minutes. After this time, the plates were rinsed with 1% acetic acid, dried and 150 μL was added to each well. 10 mM Tris solution in deionized water. After incubation for 30 minutes at room temperature, the absorbance was read at 540 nm. Analysis of the results was done by comparing the absorbance of wells treated with compounds at the appropriate concentrations to control wells (untreated with compounds). The concentration-inhibition percentage curve was then determined and the IC50 value (the concentration causing 50% inhibition of cell growth) was determined from this. The test for each compound was repeated at least three times.

IC₅₀ (μΜ)IC ₅₀ (μΜ) Wzór Pattern A549 A549 MCF-7 MCF-7 LoVo LoVo LoVoDX LoVoDX 2 2 19 19 20,1 20.1 16 16 16,4 16.4 3 3 33,4 33.4 28,8 28.8 17,5 17.5 18,0 18.0 4 4 16,2 16.2 16,8 16.8 8,9 8.9 9,5 9.5 5 5 36,7 36.7 22,0 22.0 12,8 12.8 13,3 13.3 6 6 25,1 25.1 23,2 23.2 16,4 16.4 19,2 19.2 7 7 17,9 17.9 18,9 18.9 10,7 10.7 14,8 14.8

P r z y k ł a d 8P r z k ł a d 8

Aktywność inhibitorowa otrzymanych w przykładach 1-6 pochodnych wobec ludzkiej elastazy neutrofilowej.Inhibitory activity of the derivatives obtained in Examples 1-6 against human neutrophilic elastase.

Aktywność biologiczną przebadano pod kątem zdolności do hamowania proteolitycznej aktywności ludzkiej elastazy neutrofilowej. Wszystkie pomiary kinetyki enzymatycznej wykonano przy użyciu czytnika mikropłytek. Badania rozpoczęto od wyznaczania Km dla substratu w warunkach prowadzonych testów (temperatura 37°C, długość fali wzbudzenia 400 nm i emisji 505 nm, czas pomiaru 15 minut). Pomiaru dokonano przy różnych stężeniach substratu w zakresie stężeń od 10 μΜ do 500 μΜ przy stałym stężeniu enzymu 0,0025 U/ml (~4,5 nM). Wartość Km wynosiła 125 μΜ w podanych warunkach. Pomiary aktywności inhibitorowej wykonano przy różnych stężeniach inhibitorów w zakresie stężeń od 100 μΜ do 8,8 μΜ. W badaniach wykorzystano zsyntetyzowany przez autorów patentu substrat MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-AFC. Końcowe stężenie substratu wynosiło 40 μΜ. Wszystkie pomiary przeprowadzono w buforze o składzie: 0,1 M HEPES, 0,5 M NaCl, 0,03% Triton X-100 (pH 7,5). Do seryjnie rozcieńczonego badanego związku, w ilości 50 μl w każdym dołku, dodano 50 μl substratu i inkubowano tak przygotowaną płytkę w 37°C przez 30 minut. Po inkubacji reakcja została zainicjowana przez dodanie 100 μl enzymu. Płytkę umieszczono w spektrofluorymetrze i przeprowadzono pomiar. Na podstawie uzyskanych danych wyznaczono dla każdego rozcieńczenia badanego związku stałą pseudo pierwszego rzędu kobs.The biological activity was tested for the ability to inhibit the proteolytic activity of human neutrophilic elastase. All enzymatic kinetics measurements were performed using a microplate reader. The research began with determining the Km for the substrate under the test conditions (temperature 37 ° C, excitation wavelength 400 nm and emission 505 nm, measurement time 15 minutes). The measurement was performed at various substrate concentrations in the concentration range from 10 μΜ to 500 μΜ at a constant enzyme concentration of 0.0025 U / ml (~ 4.5 nM). The Km value was 125 µΜ under the stated conditions. Measurements of inhibitory activity were performed at various concentrations of inhibitors in the concentration range from 100 μΜ to 8.8 μΜ. The research used the MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-AFC substrate synthesized by the authors of the patent. Final substrate concentration was 40 µΜ. All measurements were performed in a buffer with the composition: 0.1 M HEPES, 0.5 M NaCl, 0.03% Triton X-100 (pH 7.5). To the serially diluted test compound, 50 µl in each well, 50 µl of the substrate was added and the prepared plate was incubated at 37 ° C for 30 minutes. After incubation, the reaction was initiated by adding 100 µl of enzyme. The plate was placed in a spectrofluorimeter and the measurement was performed. On the basis of the obtained data, the pseudo-first order constant kobs was determined for each dilution of the tested compound.

[P] = v_st + ^Vi-Vs [1 - e^(- bs t) ] kobs[P] = v _s t + ^Vi-Vs [1 - e ^(- bs t)] kobs

PL 215 528 B1PL 215 528 B1

V, - prędkość początkowa v_s - prędkość w stanie ustalonym kobs - stała pseudo pierwszego rzęduV, - initial speed v _s - steady state speed kobs - first order pseudo constant

[P] - stężenie produktów t - czas[P] - concentration of products t - time

Następnie wyznaczono stalą drugiego rzędu kinact/KI kpbs _Then the second order steel kinact / KI kpbs _ was determined

[i] kinact/KI - stała drugiego rzędu[i] kinact / KI - second order constant

[S] - stężenie substratów[S] - concentration of substrates

KM - stała Michaelis-Menten ^M -1 -1KM - the constant Michaelis-Menten ^M -1

Uzyskane wyniki przedstawiono w poniższej tabeli (wartości k2/Ki [M^-1s^-1]).The results obtained are presented in the table below (k2 / Ki [M ^-1 s ^-1 ] values).

Wzór Pattern k₂/K [M¹s¹]k ₂ / K [M ¹ s ¹ ] 2 2 1855 1855 3 3 154 154 4 4 448 448 5 5 755 755 6 6 60 60 7 7 60 60

Zastrzeżenia patentowePatent claims

Claims

Patent claims

1. Di- (4-methoxy) phenyl esters of 1-isothiocyanomethanophosphonic acids of the general formula I, in which R1 represents: propyl, isopropyl, sec-butyl, benzyl, 4-methoxyphenyl, 3,5-dimethoxyphenyl.

2. Process for the preparation of di- (4-methoxy) phenyl esters of 1-isothiocyanomethane-phosphonic acid derivatives of the general formula 1, in which R1 represents the following substituents: propyl, isopropyl, sec-butyl, benzyl, 4-methoxyphenyl, 3,5-dimethoxyphenyl, characterized by in that the tri (4-methoxy) phenyl phosphite obtained by reacting phosphorus trichloride with 4-methoxyphenol in acetonitrile at boiling temperature for 2-4 hours is reacted with the appropriate aldehyde and benzyl carbamate to give N- (benzyloxycarbonyl) blocked derivative of di- (4-methoxy) phenyl ester derivative of 1-amino-methanophosphonic acid, which is subjected to standard deprotection with 3-5 molar equivalents of a 33% solution of hydrobromic acid in acetic acid to give the di- (4-methoxy) ester hydrobromide a phenyl derivative of 1-aminomethanophosphonic acid, which is reacted with 10-15 mole equivalents of carbon disulfide in the presence of 1.1-1.5 mole equivalents of triethylamine in N, N-dimeth ylformamide at room temperature, and then, after 15-20 minutes, the resulting intermediate is decomposed to isothiocyanate, with 3-4 molar equivalents of 30% hydrogen peroxide in the reaction being used in the reaction and the reaction being carried out at 5-15 ° C.

3. The method according to p. The process of claim 2, wherein the aldehyde is butyl, isobutyric, 2-methylbutyl, phenylacetic, 4-methoxybenzaldehyde, 3,5-dimethoxybenzaldehyde.

4. The use of di- (4-methoxy) phenyl esters of 1-isothiocyanato-methanophosphonic acid derivatives of the general formula 1, in which R1 represents the following substituents: propyl, isopropyl, sec-butyl, benzyl, 4-methoxyphenyl, 3,5-dimethoxyphenyl in a pharmaceutical preparation intended for the treatment of lung, breast and colorectal neoplasms, with particular emphasis on doxorubicin-resistant neoplasms.