PL215528B1

PL215528B1 - Estry di-(4-metoksy)fenylowe pochodne kwasów 1-izotiocyjano-metanofosfonowych, sposób ich wytwarzania i zastosowanie

Info

Publication number: PL215528B1
Application number: PL399049A
Authority: PL
Inventors: Mateusz Psurski; Łukasz Winiarski; Marta Piguła; Józef Oleksyszyn; Joanna Wietrzyk
Original assignee: Politechnika Wroclawska
Priority date: 2012-04-30
Filing date: 2012-04-30
Publication date: 2013-12-31
Also published as: PL399049A1

Description

Przedmiotem wynalazku są estry di-(4-metoksy)fenylowe pochodne kwasów 1-izotiocyjano-metanofosfonowych, sposób ich wytwarzania oraz zastosowanie przeciwnowotworowe.

W literaturze przedmiotu, (m.in. w Psurski i współ. „Synthesis and antiproliferative activity of novel a- and e-dialkoxyphosphonylated isothiocyanates” Bioorg. and Medicinal Chemistry Letters 21 (2011) 4572 - 4576), opisane zostały estry dialkilowe kwasów 1-izotiocyjanometanofosfonowych, które ze względu na wysoką reaktywność grupy izotiocyjanianowej znalazły zastosowanie w szeregu transformacji syntetycznych. Dla przykładu znalazły zastosowanie w reakcjach prowadzących do uzyskania tiomocznikowych pochodnych peptydów (m.in. Jing-Zi i współ., „Synthesis and in vitro study of pseudo-peptide thioureas containing a-aminophosphonate moiety as potential antitumor agents” Eur. Journal of Med. Chemistry 45 (2010) 5108-5112), które mogą być wartościowymi związkami wykazującymi aktywność biologiczną, w szczególności przeciwnowotworową. W literaturze opisano również syntezę szeregu Cbz (benzyloksykarbonylo)-zablokowanych, fosfonowych pochodnych aminokwasów, które jednakże nie wykazały aktywności antyproliferacyjnej (przeciwnowotworowej) w warunkach in vitro (Sieńczyk i współ. „Simple phosphonic inhibitors of human neutrophil elastase” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 21 (2011) 1310-1314).

Ze stanu techniki wiadomo, iż grupa izotiocyjanianowa odpowiedzialna jest za szybką akumulację związków w komórkach eukariotycznych na drodze dyfuzji biernej (opisane m.in. w Zhang Y. Molecular mechanism of rapid cellular accumulation of anticarcinogenic isothiocyanates. Carcinogenesis.

2001; 22(3): 425-31) i szereg aktywności biologicznych (opisane m.in. w pracy przeglądowej Zhang Y. The molecular basis that unifies the metabolism, cellular uptake and chemopreventive activities of dietary isothiocyanates. Carcinogenesis. 2012; 33(1): 2-9).

Ze stanu techniki wiadomo jest, iż estry difenylowe fosfonianów odpowiedzialne są za aktywność inhibitorową przeciwko proteazom serynowym opisane m.in. w Sieńczyk i współ. „Simple phosphonic inhibitors of human neutrophil elastase” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 21 (2011) 1310-1314.

Z publikacji Psurski i współ. Synthesis and antiproliferative activity of novel a- and e-dialkoxyphosphonylated isothiocyanates ” Bioorg. and Medicinal Chemistry Letters 21 (2011) 4572-4576 znany jest sposób wytwarzania estrów dialkilowych 1-izotiocyjano-aralkilofosfonianów, polegający na tym, że jako substratu użyto chlorowodorków estrów dialkilowych kwasów 1-amino-aralkilofosfonowych, który z wykorzystaniem disiarczku węgla w obecności aminy i tetrafluoroboran 2-(1H-benzotriazolo-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametyloaminiowy (TBTU) przekształcany jest w docelowy związek - ester dialkilowy kwasu 1-izotiocyjano-aralkilofosfonowego.

W literaturze naukowej i patentowej nie są znane estry di-(4-metoksy)fenylowe pochodne kwasów 1-izotiocyjano-metanofosfonowych, jak również sposoby ich wytwarzania oraz zastosowanie.

Wynalazek dotyczy estrów di-(4-metoksy)fenylowych pochodnych kwasów 1-izotiocyjanometanofosfonowych o wzorze ogólnym 1, w którym R1 oznacza podstawniki: propylowy, izopropylowy, sec-butylowy, benzylowy, 4-metoksyfenylowy, 3,5-dimetoksyfenylowy.

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania estrów di-(4-metoksy)fenylowych pochodnych kwasów 1-izotiocyjano-metanofosfonowych o wzorze ogólnym 1, w którym R1 oznacza podstawniki: propylowy, izopropylowy, sec-butylowy, benzylowy, 4-metoksyfenylowy, 3,5-dimetoksyfenylowy, polegający na tym, że otrzymany w wyniku reakcji trójchlorku fosforu z 4-metoksyfenolem w acetonitrylu w temperaturze wrzenia przez 2-4 godzin fosforyn tri-(4-metoksy)fenylowy poddaje się reakcji z odpowiednim aldehydem oraz karbaminianem benzylu i otrzymuje się N-(benzyloksykarbonylo) zablokowaną pochodną estru di-(4-metoksy)fenylowego pochodną kwasu 1-amino-metanofosfonowego, którą w kolejnym etapie poddaje się standardowej deprotekcji z użyciem 3-5 ekwiwalentów molowych 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym i otrzymuje się bromowodorek estru di-(4-metoksy)fenylowego pochodną kwasu 1-amino-metanofosfonowego, którą poddaje się reakcji z 10-15 ekwiwalentami molowymi disiarczku węgla w obecności 1,1-1,5 ekwiwalentów molowych trójetyloaminy w N,N-dimetyloformamidzie w temperaturze pokojowej, a następnie po 15-20 minutach mieszaninę reakcyjną schładza się do temperatury 5-15°C i powstały produkt pośredni rozkłada się do izotiocyjanianu, przy czym w reakcji wykorzystuje się 3-4 równoważniki molowe 30% wody utlenionej w wodzie.

Korzystnie jako aldehyd stosuje się aldehyd butylowy, izo-masłowy, 2-metylobutylowy, fenylooctowy, 4-metoksybenzaldehyd, 3,5-dimetoksybenzaldehyd.

PL 215 528 B1

Wynalazek zapewnia również zastosowanie estrów di-(4-metoksy)fenylowych pochodnych kwasów 1-izotiocyjano-metanofosfonowych o wzorze ogólnym 1, w którym R1 oznacza podstawniki: propylowy, izopropylowy, sec-butylowy, benzylowy, 4-metoksyfenylowy, 3,5-dimetoksyfenylowy w preparacie farmaceutycznym przeznaczonym do leczenia nowotworów płuc, piersi, jelita grubego ze szczególnym uwzględnieniem nowotworów opornych na doksorubicynę.

Podstawową zaletą wyróżniającą związki będące przedmiotem wynalazku spośród strukturalnie zbliżonych związków, jest obecność w jednej cząsteczce dwóch grup funkcyjnych wykazujących niezależnie od siebie aktywność biologiczną. Zaletą sposobu według wynalazku jest prostota procesu oczyszczania produktu, a także wysoka wydajność reakcji i wysoka czystość otrzymywanych produktów.

Wynalazek został bliżej przedstawiony we wzorach strukturalnych oraz w przykładach jego realizacji.

P r z y k ł a d 1

Sposób wytwarzania estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(propylo)metanofosfonowego związek o wzorze 2.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-4-metoksyfenylowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 4,46 g (36 mmola) 4-metylotiofenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 1,065 ml (12 mmola) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez 3,5 godziny w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio, bez oczyszczania w kolejnym etapie.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(propylo)metanofosfonowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-metoksyfenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,82 g (12 mmola) karbaminianu benzylu i 1,36 ml (15 mmola) aldehydu butylowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 25 ml acetonitrylu mieszaninę reakcyjną schładza się w łaźni lodowej do temperatury około 5°C i dodaje się 0,05 ekwiwalenta molowego kwasu tetrafluoroborowego. Po 50-60 minutach powstały produkt odsącza się, a pozostały roztwór odparowuję się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej i pozostałość rozpuszcza się w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 3,89 g surowego produktu (M=499,49 g/mol, wzór sumaryczny C26H30NO7P, wydajność 65%).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 500,1838/500,1907 [M+H]⁺.

Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(propylo)metanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej odważa się 2 g estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(propylo)metanofosfonowego (4 mmol) i dodaje się 10 ml 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2,5 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny reakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze - 20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 1,6 g (M=446,26 g/mol, wzór sumaryczny C18H25BrNO5P, wydajność 90%) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(propylo)metanofosfonowego.

Etap 4. Otrzymywanie estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(propylo)metanofosfonowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 1,5 g (3,35 mmola, M=446,26 g/mol) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(propylo)metanofosfonowego i rozpuszcza się ₃ w 10 cm³ N,N-dimetyloformamidu (DMF). Następnie do mieszaniny dodaje się 3,04 ml disiarczku węgla (15 eq, 50,25 mmola, M=76,14, d=1,26 g/ml) i 0,51 ml trójetyloaminy (1,1 eq, 3,69 mmola, M=101,19 g/mol, d=0,725 g/ml). Reakcję prowadzi się przez 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym schładza się ją w łaźni lodowej do temperatury 5-15°C i dodaje się powoli 1,14 ml 30% roztworu wody utlenionej w wodzie (3eq, 10,05 mmola, M=34,01, d=1,0 g/ml) i reakcję pozostawia się w łaźni na 15 minut. Następnie układ reakcyjny zakwasza się 2M kwasem solnym do pH=2 i dodaje się 30 ml toluenu. Mieszaninę ekstrahuje się dwukrotnie 20 ml porcjami toluenu, a następnie warstwę orga4

PL 215 528 B1 niczną (toluen) ekstrahuje się wodą, solanką i suszy nad siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka suszącego i odparowaniu lotnych składników mieszaniny związek oczyszcza się na silica żelu na kolumnie chromatograficznej z użyciem eluentu eter naftowy : octan etylu 5:1(v/v) uzyskując 1190 mg estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(propylo)metanofosfonowego w postaci klarownego oleju z wydajnością 87%. Wzór sumaryczny C19H22NO5PS. Masa cząsteczkowa 407,42 g/mol.

Rf (eter naftowy : octan etylu 5:1(v/v): 0.52.

Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 12.02 (s).

Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm], J [Hz]): 7.18 - 6.79 (m, 8H, Ar-H), 4.17-4.05 (m, 1H, CHP), 3.78 (s, 6H, 1xOCH3), 2.08 - 1.94 (m, 2H, CH2), 1.82 - 1.64 (m, 1H, CHA), 1.52 (m, 1H, CHB), 0.99 (t, J = 7.3 Hz, 3H, CH3).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 408,1035/408,1045 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 2

Sposób wytwarzania estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(izo-propylo)metanofosfonowego związek o wzorze 3.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-4-metoksyfenylowego.

Etap ten przebiega jak w przykładzie 1.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(izo-propylo)metanofosfonowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-metoksyfenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,82 g (12 mmola) karbaminianu benzylu i 1,36 ml (15 mmola) aldehydu izomasłowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 25 ml acetonitrylu mieszaninę reakcyjną schładza się w łaźni lodowej do temperatury około 5°C i dodaje się 0,05 ekwiwalenta molowego kwasu tetrafluoroborowego. Po 50-60 minutach powstały produkt odsącza się, a pozostały roztwór odparowuję się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej i pozostałość rozpuszcza się w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 5,09 g surowego produktu (M=499,49 g/mol, wzór sumaryczny C26H30NO7P, wydajność 85%).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 500,1838/500,1899[M+H]⁺.

Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(izo-propylo)metanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej odważa się 3 g estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(izo-propylo)metanofosfonowego (6 mmol) i dodaje się 15 ml 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny reakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze - 20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 2,54 g (M=446,26 g/mol, wzór sumaryczny C18H25BrNO5P, wydajność 95%) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(izo-propylo)metanofosfonowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 2 g (4,48 mmola, M=446,26 g/mol) bromowodorku ₃ estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(izo-propylo)metanofosfonowego i rozpuszcza się w 15 cm³N,N-dimetyloformamidu (DMF). Następnie do mieszaniny dodaje się 2,7 ml disiarczku węgla (10 eq,

44,8 mmola, M=76,14, d=1,26 g/ml) i 0,75 ml trójetyloaminy (1,2 eq, 5,38 mmola, M=101,19 g/mol, d=0,725 g/ml). Reakcję prowadzi się przez 20 minut w temperaturze pokojowej, po czym schładza się ją w łaźni lodowej do temperatury 5-15°C i dodaje się powoli 1,52 ml 30% roztworu wody utlenionej w wodzie (3eq, 13,44 mmola, M=34,01, d=1,0 g/ml) i reakcję pozostawia się w łaźni na 10 minut. Następnie układ reakcyjny zakwasza się 2M kwasem solnym do pH=2 i dodaje się 30 ml toluenu. Mieszaninę ekstrahuje się dwukrotnie 20 ml porcjami toluenu, a następnie warstwę organiczną (toluen) ekstrahuje się wodą, solanką i suszy nad siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka suszącego i odparowaniu lotnych składników mieszaniny związek oczyszcza się na silica żelu na kolumnie chromatograficznej z użyciem eluentu eter naftowy : octan etylu 1:1(v/v) uzyskując 1600 mg estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(propylo)metanofosfonowego w postaci klarownego oleju z wydajnością 88%. Wzór sumaryczny C19H22NO5PS. Masa cząsteczkowa 407,42 g/mol.

PL 215 528 B1

Rf (eter naftowy : octan etylu 1:1 (v/v)): 0.13.

Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 11.87 (s).

Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 7.22 - 6.70 (m, 8H, Ar-H), 4.01 (dd, J = 15.2, 3.6 Hz, 1H, CHP), 3.78 (s, 6H, 1xOCH3), 2.60 - 2.39 (m, 1H, CH), 1.24-1.16 (m, 6H, 2xCH3).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 408,1035/408,1068 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 3

Sposób wytwarzania estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(sec-butylo)metanofosfonowego związek o wzorze 4.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-4-metoksyfenylowego.

Etap ten przebiega jak w przykładzie 1.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino(sec-butylo)metanofosfonowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-metoksyfenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,82 g (12 mmola) karbaminianu benzylu i 1,6 ml (15 mmola) aldehydu 2-metylobutylowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 25 ml acetonitrylu mieszaninę reakcyjną schładza się w łaźni lodowej do temperatury około 5°C i dodaje się 0,05 ekwiwalenta molowego kwasu tetrafluoroborowego. Po 50-60 minutach powstały produkt odsącza się, a pozostały roztwór odparowuję się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej i pozostałość rozpuszcza się w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 4,6 g surowego produktu (M= 513,51 g/mol, wzór sumaryczny C27H32NO7P, wydajność 75%).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 514,1995/514,2014[M+H]⁺.

Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(sec-butylo)metanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej odważa się 3 g estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(sec-butylo)metanofosfonowego (5,84 mmol) i dodaje się 15 ml 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny reakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze - 20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 2,4 g (M=460,30 g/mol, wzór sumaryczny C19H27BrNO5P, wydajność 90%) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(sec-butylo)metanofosfonowego.

Etap 4. Otrzymywanie estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(sec-butylo)metanofosfonowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 2 g (4,34 mmola, M=460,30 g/mol) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(sec-butylo)metanofosfonowego i rozpuszcza się ₃ w 15 cm³ N,N-dimetyloformamidu (DMF). Następnie do mieszaniny dodaje się 2,7 ml disiarczku węgla (10,3 eq, 44,8 mmola, M=76,14, d=1,26 g/ml) i 0,75 ml trójetyloaminy (1,24 eq, 5,38 mmola, M=101,19 g/mol, d=0,725 g/ml). Reakcję prowadzi się przez 20 minut w temperaturze pokojowej, po czym schładza się ją w łaźni lodowej do temperatury 5-15°C i dodaje się powoli 1,97 ml 30% roztworu wody utlenionej w wodzie (4eq, 17,36 mmola, M=34,01, d=1,0 g/ml) i reakcję pozostawia się w łaźni na 15 minut. Następnie układ reakcyjny zakwasza się 2M kwasem solnym do pH=2 i dodaje się 25 ml toluenu. Mieszaninę ekstrahuje się dwukrotnie 20 ml porcjami toluenu, a następnie warstwę organiczną (toluen) ekstrahuje się wodą, solanką i suszy nad siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka suszącego i odparowaniu lotnych składników mieszaniny związek oczyszcza się na silica żelu na kolumnie chromatograficznej z użyciem eluentu eter naftowy : octan etylu 1:1(v/v) uzyskując 1530 mg estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(sec-buty]o)metanofosfonowego w postaci żółtawego, klarownego oleju z wydajnością 84%. Wzór sumaryczny C20H24NO5PS. Masa cząsteczkowa 421,45 g/mol.

Rf (eter naftowy : octan etylu 1:1(v/v)): 0.17.

Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 12.40 (s, 1P, 78%), 11.95 (s, 1P, 22%).

Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 7.18 - 6.73 (m, 8H, Ar-H), 4.25 - 3.96 (m, 1H, CHP), 3.78 (s, 6H, 2xOCH3), 2.22-2.1 (m, 1H, CHA), 1.66 - 1.31 (m, 2H, CH, CHB), 1.21 (d, J = 6.8 Hz, 3H, CHCH3), 0.95 (dd, J = 8.3, 6.5 Hz, 3H, CH2 CH3).

PL 215 528 B1

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 422,1191/422,1205 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 4

Sposób wytwarzania estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(benzylo)metanofosfonowego związek o wzorze 5.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-4-metoksyfenylowego.

Etap ten przebiega jak w przykładzie 1.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino(benzylo)metanofosfonowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-metoksyfenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,82 g (12 mmola) karbaminianu benzylu i 1,4 ml (15 mmola) aldehydu fenylooctowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 30 ml acetonitrylu mieszaninę reakcyjną schładza się w łaźni lodowej do temperatury około 5°C i dodaje się 0,05 ekwiwalenta molowego kwasu tetrafluoroborowego. Po 60-70 minutach powstały produkt odsącza się, a pozostały roztwór odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej i pozostałość rozpuszcza się w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 3,9 g surowego produktu (M=547,53 g/mol, wzór sumaryczny C30H30NO7P, wydajność 60%).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 548,1838/548,1901 [M+H]⁺.

Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(benzylo)metanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej odważa się 2,5 g estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(benzylo)metanofosfonowego (4,57 mmol) i dodaje się 10 ml 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez

3,5 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny reakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze - 20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 2,03 g (M= 494,31 g/mol, wzór sumaryczny C22H25BrNO5P, wydajność 90%) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(benzylo)metanofosfonowego.

Etap 4. Otrzymywanie estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(benzylo)metanofosfonowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 1,5 g (3,03 mmola, M=494,31 g/mol) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(benzylo)metanofosfonowego i rozpuszcza się ₂ w 10 cm² N,N-dimetyloformamidu (DMF). Następnie do mieszaniny dodaje się 2,75 ml disiarczku węgla (15 eq, 45,45 mmola, M=76,14, d=1,26 g/ml) i 0,63 ml trójetyloaminy (1,5 eq, 4,54 mmola, M=101,19 g/mol, d=0,725 g/ml). Reakcję prowadzi się przez 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym schładza się ją w łaźni lodowej do temperatury 5-15°C i dodaje się powoli 1,03 ml 30% roztworu wody utlenionej w wodzie (3eq, 9,09 mmola, M=34,01, d=1,0 g/ml) i reakcję pozostawia się w łaźni na 20 minut. Następnie układ reakcyjny zakwasza się 2M kwasem solnym do pH=2 i dodaje się 25 ml toluenu. Mieszaninę ekstrahuje się dwukrotnie 20 ml porcjami toluenu, a następnie warstwę organiczną (toluen) ekstrahuje się wodą, solanką i suszy nad siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka suszącego i odparowaniu lotnych składników mieszaniny związek oczyszcza się na silica żelu na kolumnie chromatograficznej z użyciem eluentu eter naftowy : octan etylu 5:1(v/v) uzyskując 1090 mg estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(benzylo)metanofosfonowego w postaci, żółtawego osadu z wydajnością 79%. Wzór sumaryczny C23H22NO5PS. Masa cząsteczkowa 455,0956 g/mol.

Rf (eter naftowy : octan etylu 5:1(v/v)): 0.52.

Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 11.66 (s).

Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 7.58 - 6.62 (m, 13H, Ar-H), 4.32 (ddd, J = 14.2 Hz, 11.3 Hz, 3.1 Hz, 1H, CHP), 3.78 (s, 6H, 1xOCH3), 3.48 - 3.37 (m, 1H, CHA), 3.2-3.12 (m, 1H, CHB).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 456,1034/456,1019 [M+H]⁺.

PL 215 528 B1

P r z y k ł a d 5

Sposób wytwarzania estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(4-metoksyfenylo)metanofosfonowego związek o wzorze 6.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-4-metoksyfenylowego.

Etap ten przebiega jak w przykładzie 1.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(4-metoksyfenylo)metanofosfonowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-metoksyfenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,82 g (12 mmola) karbaminianu benzylu i 1,82 ml (15 mmola) 4-metoksybenzaldehydu. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 30 ml acetonitrylu mieszaninę reakcyjną schładza się w łaźni lodowej do temperatury około 5°C i dodaje się 0,05 ekwiwalenta molowego kwasu tetrafluoroborowego. Po 50-60 minutach powstały produkt odsącza się, a pozostały roztwór odparowuję się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej i pozostałość rozpuszcza się w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 5,74 g surowego produktu (M=563,53 g/mol, wzór sumaryczny C30H30NO8P, wydajność 85%).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 564,1787/564,1789[M+H]⁺.

Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(4-metoksyfenylo)metanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej odważa się 3 g estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(4-metoksyfenylo)metanofosfonowego (5,3 mmol) i dodaje się 14 ml 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny reakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze - 20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 2,29 g (M= 510,3148 g/mol, wzór sumaryczny C22H25BrNO6P, wydajność 85%) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(4-metoksyfenylo)metanofosfonowego.

Etap 4. Otrzymywanie estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(4-metoksyfenylo)metanofosfonowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 2 g (3,92 mmola, M= 510,3148 g/mol) bromo

-wodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(4-metoksyfenylo)metanofosfonowego i roz₃ puszcza się w 15 cm³ N,N-dimetyloformamidu (DMF). Następnie do mieszaniny dodaje się 3,08 ml disiarczku węgla (13 eq, 50,96 mmola, M=76,14, d=1,26 g/ml) i 0,60 ml trójetyloaminy (1,1 eq, 4,3 mmola, M=101,19 g/mol, d=0,725 g/ml). Reakcję prowadzi się przez 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym schładza się ją w łaźni lodowej do temperatury 5-15°C i dodaje się powoli 1,78 ml 30% roztworu wody utlenionej w wodzie (4eq, 15,68 mmola, M=34,01, d=1,0 g/ml) i reakcję pozostawia się w łaźni lodowej na 15 minut. Następnie układ reakcyjny zakwasza się 2M kwasem solnym do pH=2 i dodaje się 25 ml toluenu. Mieszaninę ekstrahuje się dwukrotnie 20 ml porcjami toluenu, a następnie warstwę organiczną (toluen) ekstrahuje się wodą, solanką i suszy nad siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka suszącego i odparowaniu lotnych składników mieszaniny związek oczyszcza się na silica żelu na kolumnie chromatograficznej z użyciem eluentu eter naftowy : octan etylu 3:1(v/v) uzyskując 1530 mg estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(4-metoksyfenylo)metanofosfonowego w postaci pomarańczowego, klarownego oleju z wydajnością 83%. Wzór sumaryczny C23H22NO6PS. Masa cząsteczkowa 471,46 g/mol.

Rf (eter naftowy : octan etylu 3:1(v/v)): 0.1.

Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 8.88 (s).

Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm], J [Hz]): 7.17 - 7.09 (m, 6H, Ar-H), 6.95 - 6.76 (m, 4H, Ar-H), 4.70 (d, J= 18.3 Hz, 1H, CHP), 3.81 (s, 3H, OCH3), 3.78 (s, 6H, 2xOCH3).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 494,0803/494,0793 [M+Na]⁺.

P r z y k ł a d 6

Sposób wytwarzania estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(3,5-dimetoksyfenylo)metanofosfonowego związek o wzorze 7.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-4-metoksyfenylowego.

Etap ten przebiega jak w przykładzie 1.

PL 215 528 B1

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(3,5-dimetoksyfenylo)metanofosfonowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-metoksyfenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,82 g (12 mmola) karbaminianu benzylu i 2,49 g (15 mmola) 3,5-dimetoksybenzaldehydu. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 35 ml acetonitrylu mieszaninę reakcyjną schładza się w łaźni lodowej do temperatury około 5°C i dodaje się 0,05 ekwiwalenta molowego kwasu tetrafluoroborowego. Po 40-50 minutach powstały produkt odsącza się, a pozostały roztwór odparowuję się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej i pozostałość rozpuszcza się w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 5,69 g surowego produktu (M= 593,56 g/mol, wzór sumaryczny C31H32NO9P, wydajność 80%).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 594,1893/594,1909[M+H]⁺.

Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(3,5-dimetoksyfenylo)metanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej odważa się 3 g estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-(3,5-dimetoksyfenylo)metanofosfonowego (5,05 mmol) i dodaje się 15 ml 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3,5 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny reakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 2,45 g (M= 539,07 g/mol, wzór sumaryczny C23H27BrNO7P, wydajność 90%) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(3,5-dimetoksyfenylo)metanofosfonowego.

Etap 4. Otrzymywanie estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(3,5-dimetoksyfenylo)metanofosfonowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 2 g (3,71 mmola, M= 539,07 g/mol) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-(3,5-dimetoksyfenylo)metanofosfonowego i roz₃ puszcza się w 10 cm³ N,N-dimetyloformamidu (DMF). Następnie do mieszaniny dodaje się 2,24 ml disiarczku węgla (10 eq, 37,10 mmola, M=76,14, d=1,26 g/ml) i 0,29 ml trójetyloaminy (1,1 eq, 4,08 mmola, M=101,19 g/mol, d=0,725 g/ml). Reakcję prowadzi się przez 10 minut w temperaturze pokojowej, po czym schładza się ją w łaźni lodowej do temperatury 5-15°C i dodaje się powoli 1,26 ml 30% roztworu wody utlenionej w wodzie (3eq, 11,13 mmola, M=34,01, d=1,0 g/ml) i reakcję pozostawia się w łaźni lodowej na 10 minut. Następnie układ reakcyjny zakwasza się 2M kwasem solnym do pH=2 i dodaje się 25 ml toluenu. Mieszaninę ekstrahuje się dwukrotnie 20 ml porcjami toluenu, a następnie warstwę organiczną (toluen) ekstrahuje się wodą, solanką i suszy nad siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka suszącego i odparowaniu lotnych składników mieszaniny związek oczyszcza się na silica żelu na kolumnie chromatograficznej z użyciem eluentu eter naftowy : octan etylu 5:1(v/v) uzyskując 1360 mg estru di-(4-metoksy)fenylowego kwasu 1-izotiocyjano-(3,5-dimetoksyfenylo)metanowosfonowego w postaci, żółtego osadu z wydajnością 73%. Wzór sumaryczny C24H24NO7PS. Masa cząsteczkowa 501,49 g/mol.

Rf (eter naftowy : octan etylu 5:1(v/v)): 0.4.

Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 8.85 (s).

Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 7.13 - 6.39 (m, 11H, Ar-H), 5.24 (d, J = 18.2 Hz, 1H, CHP), 3.79 - 3.72 (m, 12H, 4xOCH3).

Widmo masowe (ESI, m/z): teoretyczna/znaleziona 502,1089/502,1143 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 7

Badanie aktywności antyproliferacyjnej estrów difenylowych kwasów 1-izotiocyjano-metanofosfonowych z wykorzystaniem linii nowotworowych ludzkiego raka płuc A549, gruczołu sutkowego MCF-7, jelita grubego LoVo oraz jelita grubego opornej na doksorubicynę LoVo/DX.

Roztwory wyjściowe testowanych związków przygotowane zostały jako 50 mM roztwory w dimetylosulfotlenku (DMSO). Linie komórkowe hodowane były w warunkach in vitro w odpowiednich dla danej linii medium hodowlanym: A549 - medium OptiMEM + RPMI 1640 + GlutaMAX medium suplementowane 5% surowicy wołowej, MCF-7 - medium Eagle z dodatkiem 2 mM roztworem L-glutaminy, 1,0 mM roztworem pirogronianu sodu, 10% surowicy wołowej i 0,8 mg/L insuliny, LoVo i LoVo/DX Opti-MEM + RPMI 1640 suplementowane 2 mM roztworem L-glutaminy, 1,5 g/L roztworem wodoroPL 215 528 B1

-węglanu sodu, 4,5 g/L glukozy, 1,0 mM pirogronianu sodu oraz 5% surowicą wołową i 100 μg/L doxorubicyny (tylko w medium dla linii LoVoDX). Ponadto wszystkie media hodowlane zawierały 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Do odklejenia komórek od płytek hodowlanych używano 0,25% roztworu Trypsyna-EDTA. Następnie policzone komórki posiano na płytki 96-dołkowe w ilości 10 komórek/dołek (100 μL zawiesiny komórkowej 10 komórek/mL na dołek). Po 24 godzinnej inkubacji na płytki nanoszono roztwory testowanych związków przygotowywane poprzez rozcieńczanie wyjściowego roztworu w medium hodowlanym OR. Robocze stężenia wynosiły 100 μΜ, 50 μΜ, 25 μΜ, 12,5 μΜ dając ostatecznie stężenia 50 μΜ, 25 μΜ, 12,5 μΜ, 6,25 μΜ w dołkach testowych. Każde stężenie naniesiono w trzech powtórzeniach. Płytki były następnie inkubowane przez kolejne 72 godziny w inkubatorze (wilgotność >90%, temperatura 37°C, 5% stężenie CO2). Po tym czasie wykonano test SRB: do każdego z dołków dodano po 50 μL 50% roztworu kwasu trichlorooctowego i płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 4°C. Następnie płytki wypłukano pod bieżącą wodą, osuszono i do każdego z dołków dodano po 50 μL 0,4% roztworu sulforodaminy B w 1% kwasie octowym i inkubowano w ciemności przez 30 minut. Po tym czasie płytki wypłukano w 1% kwasie octowym, osuszono i do każdego z dołków dodano po 150 μL. 10 mM roztworu Tris w wodzie dejonizowanej. Po 30 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej odczytano absorbancję przy długości fali 540 nm. Analizę wyników wykonano poprzez porównanie absorbancji dołków traktowanych związkami w odpowiednich stężeniach do dołków kontrolnych (nie traktowanych związkami). Następnie określono krzywą zależności procenta zahamowania proliferacji od stężenia i na jego podstawie określono wartość IC50 (stężenie powodujące zahamowanie wzrostu komórek w 50%). Test dla każdego ze związków powtórzony został co najmniej trzykrotnie.

	IC₅₀ (μΜ)
Wzór	A549	MCF-7	LoVo	LoVoDX
2	19	20,1	16	16,4
3	33,4	28,8	17,5	18,0
4	16,2	16,8	8,9	9,5
5	36,7	22,0	12,8	13,3
6	25,1	23,2	16,4	19,2
7	17,9	18,9	10,7	14,8

P r z y k ł a d 8

Aktywność inhibitorowa otrzymanych w przykładach 1-6 pochodnych wobec ludzkiej elastazy neutrofilowej.

Aktywność biologiczną przebadano pod kątem zdolności do hamowania proteolitycznej aktywności ludzkiej elastazy neutrofilowej. Wszystkie pomiary kinetyki enzymatycznej wykonano przy użyciu czytnika mikropłytek. Badania rozpoczęto od wyznaczania Km dla substratu w warunkach prowadzonych testów (temperatura 37°C, długość fali wzbudzenia 400 nm i emisji 505 nm, czas pomiaru 15 minut). Pomiaru dokonano przy różnych stężeniach substratu w zakresie stężeń od 10 μΜ do 500 μΜ przy stałym stężeniu enzymu 0,0025 U/ml (~4,5 nM). Wartość Km wynosiła 125 μΜ w podanych warunkach. Pomiary aktywności inhibitorowej wykonano przy różnych stężeniach inhibitorów w zakresie stężeń od 100 μΜ do 8,8 μΜ. W badaniach wykorzystano zsyntetyzowany przez autorów patentu substrat MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-AFC. Końcowe stężenie substratu wynosiło 40 μΜ. Wszystkie pomiary przeprowadzono w buforze o składzie: 0,1 M HEPES, 0,5 M NaCl, 0,03% Triton X-100 (pH 7,5). Do seryjnie rozcieńczonego badanego związku, w ilości 50 μl w każdym dołku, dodano 50 μl substratu i inkubowano tak przygotowaną płytkę w 37°C przez 30 minut. Po inkubacji reakcja została zainicjowana przez dodanie 100 μl enzymu. Płytkę umieszczono w spektrofluorymetrze i przeprowadzono pomiar. Na podstawie uzyskanych danych wyznaczono dla każdego rozcieńczenia badanego związku stałą pseudo pierwszego rzędu kobs.

[P] = v_st + ^Vi-Vs [1 - e^(- bs t) ] kobs

PL 215 528 B1

V, - prędkość początkowa v_s - prędkość w stanie ustalonym kobs - stała pseudo pierwszego rzędu

[P] - stężenie produktów t - czas

Następnie wyznaczono stalą drugiego rzędu kinact/KI kpbs _

[i] kinact/KI - stała drugiego rzędu

[S] - stężenie substratów

KM - stała Michaelis-Menten ^M -1 -1

Uzyskane wyniki przedstawiono w poniższej tabeli (wartości k2/Ki [M^-1s^-1]).

Wzór	k₂/K [M¹s¹]
2	1855
3	154
4	448
5	755
6	60
7	60

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Estry di-(4-metoksy)fenylowe pochodne kwasów 1-izotiocyjanometanofosfonowych o wzorze ogólnym 1, w którym R1 oznacza podstawniki: propylowy, izopropylowy, sec-butylowy, benzylowy, 4-metoksyfenylowy, 3,5-dimetoksyfenylowy.

2. Sposób wytwarzania estrów di-(4-metoksy)fenylowych pochodnych kwasów 1-izotiocyjanometanofosfonowych o wzorze ogólnym 1, w którym R1 oznacza podstawniki: propylowy, izopropylowy, sec-butylowy, benzylowy, 4-metoksyfenylowy, 3,5-dimetoksyfenylowy, znamienny tym, że otrzymany w wyniku reakcji trójchlorku fosforu z 4-metoksyfenolem w acetonitrylu w temperaturze wrzenia przez 2-4 godzin fosforyn tri-(4-metoksy)fenylowy poddaje się reakcji z odpowiednim aldehydem oraz karbaminianem benzylu i otrzymuje się N-(benzyloksykarbonylo) zablokowaną pochodną estru di-(4-metoksy)fenylowego pochodną kwasu 1-amino-metanofosfonowego, którą poddaje się standardowej deprotekcji z użyciem 3-5 ekwiwalentów molowych 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym i otrzymuje się bromowodorek estru di-(4-metoksy)fenylowego pochodną kwasu 1-aminometanofosfonowego, którą poddaje się reakcji z 10-15 ekwiwalentami molowymi disiarczku węgla w obecności 1,1-1,5 ekwiwalentów molowych trójetyloaminy w N,N-dimetyloformamidzie w temperaturze pokojowej, a następnie po 15-20 minutach powstały produkt pośredni rozkłada się do izotiocyjanianu, przy czym w reakcji wykorzystuje się 3-4 równoważniki molowe 30% wody utlenionej w wodzie i reakcję prowadzi się w temperaturze 5-15°C.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako aldehyd stosuje się aldehyd butylowy, izo-masłowy, 2-metylobutylowy, fenylooctowy, 4-metoksybenzaldehyd, 3,5-dimetoksybenzaldehyd.

4. Zastosowanie estrów di-(4-metoksy)fenylowych pochodnych kwasów 1-izotiocyjano-metanofosfonowych o wzorze ogólnym 1, w którym R1 oznacza podstawniki: propylowy, izopropylowy, sec-butylowy, benzylowy, 4-metoksyfenylowy, 3,5-dimetoksyfenylowy w preparacie farmaceutycznym przeznaczonym do leczenia nowotworów płuc, piersi, jelita grubego ze szczególnym uwzględnieniem nowotworów opornych na doksorubicynę.