PL216373B1 - Zastosowanie selektywnego agonisty receptora α 2B adrenergicznego lub α 2B/2C adrenergicznego - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy nowego zastosowania selektywnego agonisty receptora a2B adrenergicznego lub a2B/2C adrenergicznego do zapobiegania uszkodzeniu i śmierci komórek nerwowych, takiej jak obserwowana w chorobie Parkinsona i chorobie Alzheimera.

Ludzkie receptory adrenergiczne, będące integralnymi białkami błon komórkowych, dzieli się na dwie szerokie grupy: receptory α i β adrenergiczne. Oba typy receptorów, po związaniu katecholamin, norepinefryny i epinefryny, pośredniczą w działaniu obwodowego współczulnego układu nerwowego.

Norepinefryna jest wytwarzana przez zakończenia nerwów adrenergicznych, natomiast epinefryna jest wytwarzana przez rdzeń nadnerczy. Jedną podstawę klasyfikacji receptorów adrenergicznych stanowi powinowactwo wiązania tych związków: receptory α wykazują tendencję do silniejszego wiązania norepinefryny niż epinefryny i znacznie silniejszego wiązania norepinefryny od wiązania syntetycznego związku izoproterenolu.

Korzystne powinowactwo wiązania tych hormonów ulega odwróceniu w przypadku receptorów β. W wielu tkankach odpowiedzi czynnościowe, takie jak skurcz mięśni gładkich, wywoływane przez aktywację receptorów α są przeciwne do odpowiedzi wywoływanych przez związanie agonisty przez receptor β.

Następnie dodatkowo określono i scharakteryzowano szczegółowo czynnościowe różnice między receptorami α i β, charakteryzując farmakologicznie te receptory pochodzące od różnych zwierząt i różnych tkanek. W efekcie receptory α i β adrenergiczne podzielono dodatkowo na podtypy α 1, α 2, β 1 i β 2.

Ponadto ustalono, że każdy z tych receptorów posiada wiele podtypów; i tak ludzki receptor α 2 można dodatkowo podzielić na podtypy α2A, α2B i α2^

Ustalono różnice czynnościowe między receptorami α 1 i α 2 oraz opisano związki, które wykazują selektywne wiązanie z jednym z tych dwóch podtypów receptorów.

W WO 92/00073 opisano np. zdolność R-(+) enancjomeru terazosyny do selektywnego wiązania się z podtypem α 1 receptorów adrenergicznych. Ujawniono, że selektywność α1/α2, jaką wykazuje ten związek, jest istotna, gdyż wskazano, że pobudzenie receptorów α 2 przez agonistę hamuje wydzielanie epinefryny i norepinefryny, oraz podano, że antagonizm receptora α 2 zwiększa wydzielanie tych hormonów. Dlatego podano, że zastosowanie nieselektywnych blokerów receptorów α adrenergicznych, takich jak fenoksybenzamina i fentolamina, jest ograniczone przez pośredniczone przez receptory α 2 adrenergiczne wywołanie wzrostu osoczowego stężenia katecholamin i związanych z tym konsekwencji fizjologicznych (przyspieszenie rytmu serca i skurcz mięśni gładkich).

Co istotne, selektywność związków nazywanych „selektywnymi względem receptorów α 1” lub „selektywnymi względem receptorów α 2” tradycyjnie opierano na danych dotyczących KD, które ograniczają się do porównania powinowactwa wiązania z receptorami i nie porównują rzeczywistych aktywności biologicznych będących efektem oddziaływania z porównywanymi receptorami.

W przeciwieństwie do tego, sposób pomiaru selektywności agonisty receptora α obejmuje test RSAT (Receptor Selection and Amplification Technology) opisany w Messier i in., High Throughput Assays Of Cloned Adrenergic, Muscarinic, Neurokinin And Neurotrophin Receptors In Living Mammalian Cells, Pharmacol. Toxicol. 76: 308-11 (1995), który został przystosowany do zastosowania dla receptorów α 2. Ta publikacja jest włączona do opisu jako pozycja literaturowa. W teście tym mierzy się pośredniczoną przez receptor utratę hamowania kontaktowego, która prowadzi do selektywnej proliferacji komórek zawierających receptor w mieszanej populacji komórek w stanie konfluencji. Wzrost liczby komórek ocenia się odpowiednim transfekowanym genem wskaźnikowym, takim jak gen b-galaktozydazy, którego aktywność można z łatwością zmierzyć w formacie 96-studzienkowym. Odpowiedź tę wywołują receptory, które aktywują białko G, Gq. Receptory α 2, które normalnie są sprzężone z białkiem Gi, aktywują odpowiedź RSAT, gdy ulegają współekspresji z hybrydowym białkiem Gq, które posiada domenę rozpoznającą receptor G_i, zwaną G_q/i₅₂Patrz Conklin i in., Substitution Of Three Amino Acids Switches Receptor Specificity Of Gqa To That Of Gia, Nature 363: 274-6 (1993). Ta pozycja literaturowa jest włączona do opisu przez odniesienie.

Opisywano, że różni agoniści receptora α adrenergicznego są użyteczni do leczenia szeregu stanów i zaburzeń. I tak opisano agonistów receptora adrenergicznego α, takich jak klonidyna i stosowano jako środki obniżające ciśnienie układowe i wewnątrzgałkowe, jako środki użyteczne w leczeniu odstawienia z uzależniających zachowań, takich jak palenie i nadużywanie leków oraz jako leki zapobiegające bolesnemu miesiączkowaniu. Inny agonista receptora α adrenergicznego, tizanidyna, został

PL 216 373 B1 zastosowany w leczeniu objawów spastyczności przez zmniejszenie napięcia mięśniowego u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym. Podawano, że środki te posiadają także pewne działania przeciwbólowe.

Powyższe środki, pomimo swojej użyteczności, są często obciążone poważnymi działaniami ubocznymi, w tym sedacją, działania na układ sercowo-naczyniowy, takie jak niedociśnienie i zwolnienie rytmu serca oraz zawroty głowy, które ograniczają ich zastosowanie w niektórych wskazaniach. W szczególności środki te mają tendencję do tego, że ich krzywe dawka-odpowiedź dla działań terapeutycznych i sedatywnych zachodzą na siebie, tak że działanie sedatywne zaczyna być zauważalne przy takich samych dawkach, jak działanie terapeutyczne (np. hipotensyjne lub przeciwbólowe) w warunkach in vivo.

Związki takie, jak, bez ograniczenia, klonidyna, tizanidyna i deksmedetomidyna, charakteryzowano w literaturze jako „agonistów receptora α 2 adrenergicznego” w oparciu głównie o badania wiązania. Patrz także Hieble i in., J. Med. Chem. 38: 1415 (1 wrzesień, 1995); Ruffolo i in., J. Med. Chem. 38: 3681 (15 wrzesień, 1995); oba powyższe są włączone do opisu jako pozycje literaturowe. Chociaż prawdą jest, że te związki są agonistami receptora α 2 adrenergicznego, ogólnie nie dostrzega się, że związki te wykazują także istotne działanie agonistyczne względem receptora α 1. Ogólnie wpływ takiego oddziaływania na receptor α 1 na aktywność α 2 adrenergiczną nie został poznany ani doceniony.

W przeciwieństwie do tego związek brimonidyna i jej czynnościowo podobne pochodne 2-imidazolin-2-yloiminowe (jak opisano poniżej) są α 2 agonistami, którzy wykazują znacznie silniejsze działanie agonistyczne na receptory α 2, niż na podtypu receptora α 1.

Dodatkowo związki te znane są pod nazwą „panagoniści α 2, co oznacza, że wykazują niewielką lub nie wykazują żadnej czynnościowej selektywności w pobudzaniu podtypów receptora a2A, a2B i α2Ο

Ostatnio związki selektywne lub specyficzne względem podtypów receptora α2B i/lub α2C i niektóre zalety takich związków, zostały ujawnione. I tak np. opisy US nr 6329369 i 6313172 oraz będące w trakcie rozpatrywania zgłoszenia patentowe nr US 09/778975, 09/794874 i 10/153328, których niniejszy zgłaszający jest współwłaścicielem, ujawniają takie związki i ich zastosowanie w stanach obejmujących ból, spastyczność mięśni, ból, choroby neurodegeneracyjne, niedokrwienie rdzenia kręgowego i udar, upośledzenie pamięci i funkcji poznawczych, psychozy, lęk i depresję, nadciśnienie, zastoinową niewydolność serca, niedokrwienie mięśnia sercowego i przekrwienie nosa. Te pozycje literaturowe są wszystkie włączone w całości do opisu przez odniesienie. W tych opisach i zgłoszeniach patentowych związki uważa się za selektywnych agonistów α2B lub α2B/2C, jeżeli różnica skuteczności danego związku jako agonisty podtypu(ów) receptora α2B lub α2B/2C w porównaniu z podtypem receptora 2A jest wyższa od 0,3 i jego skuteczność względem podtypu receptora α2A jest co najmniej około 10 razy słabsza niż względem podtypu receptora α2B i/lub α2Ο

Zaburzenia OUN stanowią rodzaj zaburzeń neurologicznych. Szereg zaburzeń OUN można przypisać niedoczynności przekaźnictwa cholinergicznego, niedoczynności przekaźnictwa dopaminergicznego, niedoczynności przekaźnictwa adrenergicznego i/lub niedoczynności przekaźnictwa serotoninergicznego. Względnie często występujące zaburzenia OUN obejmują otępienie przedstarcze (chorobę Alzheimera o wczesnym początku), otępienie starcze (otępienie typu choroby Alzheimera) i parkinsonizm obejmujący chorobę Parkinsona.

Podstawa obecnego pojmowania choroby Alzheimera opiera się na obserwacji, że niektóre obszary mózgu osób dotkniętych tą chorobą, takie jak hipokamp i kora mózgowa, wykazują cechy utraty komórek nerwowych. Od lat 70-ych XX-wieku wiadomo, że niektóre z tych umierających neuronów są neuronami cholinergicznymi, to znaczy, że komunikują się przy użyciu neuroprzekaźnika acetylocholiny, który ostatecznie jest rozkładany przez enzym o nazwie acetylocholinesteraza. Patrz Jones i in., Intern. J. Neurosci. 50: 147 (1990); Perry, Br. Med. Bull. 42: 63 (1986) i Sitaram i in., Science 201: 274 (1978).

Leki, które pojawiły się w ostatnim dziesięcioleciu, takie jak takryna i donepezyl, są inhibitorami acetylocholinesterazy. Zapobiegając rozkładowi acetylocholiny związki te zwalniają rozwój wczesnych stadiów choroby Alzheimera. Jednakże, gdy dojdzie do pełnej degeneracji neuronów cholinergicznych i gdy komórki te nie będą już w stanie wytwarzać neuroprzekaźnika acetylocholiny, leki te stają się bezużyteczne.

Zauważono, że poza utratą komórek nerwowych mózgi pacjentów chorujących na chorobę

Alzheimera charakterystycznie zawierają zbitki białek. Te nagromadzenia białek występują w dwóch postaciach: występującej wewnątrz neuronów i występującej w przestrzeni międzykomórkowej. Zbitki

PL 216 373 B1 wewnątrzkomórkowe mają nazwę splotów neurofibrylarnych i wyglądają jak pary włókien owiniętych wokół siebie w heliksę. Analizy pokazały, że sploty składają się z białka tau. Tau jest ważnym białkiem, ponieważ wiąże się z tubuliną, która jest odpowiedzialna za tworzenie mikrotubuli. Wydaje się, że liczba splotów neurofibrylarnych koreluje z ostrością choroby.

Zbitki lub płytki białek międzykomórkowych składają się ze złogów białka β-amyloidu. Sąsiednie neurony często mają wygląd obrzękniętych i zniekształconych, a płytkom amyloidu zazwyczaj towarzyszy mikroglej zapalny. Mikroglej, który stanowi część układu odpornościowego mózgu, może pojawiać się, próbując rozłożyć i usunąć uszkodzone neurony lub być może same płytki.

Nie jest jasne, czy neurony wewnątrz tych płytek lub w ich pobliżu funkcjonują prawidłowo, gdyż gęstość płytek jedynie słabo koreluje z ostrością otępienia. Ponadto takie płytki występują u większości ludzi w podeszłym wieku, bez względu na to czy chorują na chorobę Alzheimera, czy nie. Mimo tego obecność dużej liczby takich płytek w hipokampie i korze mózgowej jest specyficzna dla pacjentów z chorobą Alzheimera i pojawiają się na długo przed wystąpieniem splotów neurofibrylarnych.

Płytki β-amyloidu zawierają 42-aminokwasowy fragment integralnego białka błonowego o nazwie białko prekursorowe β-amyloidu (BAPP). Ten fragment jest wytwarzany przez dwuetapowe proteolityczne rozszczepienie białka BAPP, na początku przez proteazę o nazwie β sekretaza, a następnie przez γ sekretazę. Normalnym produktem rozszczepiania przez β sekretazę i γ sekretazę jest 40-aminokwasowy peptyd, który, jak się okazało, w przeciwieństwie do 42-aminokwasowej pochodnej nie bierze udziału w zapoczątkowaniu ani postępie choroby Alzheimera.

Choroba Parkinsona (PD) jest wyniszczającą chorobą neurodegeneracyjną, obecnie o nieznanej etiologii, dla której charakterystyczne są drżenia i sztywność mięśniowa. Wydaje się, że charakterystyczna cecha tej choroby obejmuje degenerację neuronów dopaminergicznych (tj. wydzielających dopaminę), w szczególności w istocie czarnej i obszarach brzusznej nakrywki śródmózgowia. Patrz Rinne i in., Brain Res. 54: 167 (1991) i Clark i in., Br. J. Pharm. 85: 827 (1985). Istota czarna bierze udział w koordynacji sygnałów nerwowych dotyczących ruchów i postawy. Obszar brzusznej nakrywki (VTA) śródmózgowia zawiera neurony, które wystają do miejsc obejmujących korę przedczołową, obszar mózgu związany z wyższymi funkcjami poznawczymi.

Czyniono pewne próby leczenia PD. Jednym proponowanym leczeniem PD jest SINEMET®, który jest tabletką o przedłużonym uwalnianiu zawierającą mieszaninę karbidopy i lewodopy, dostępną z The DuPont Merck Pharmaceutical Co. Innym proponowanym środkiem do leczenia PD jest ELDEPRYL®, który jest tabletką zawierającą chlorowodorek selefiliny, dostępny z Somerset Pharmaceuticals, Inc. Innym proponowanym środkiem do leczenia PD jest PARLODEL®, który jest tabletką zawierającą mesylan bromokryptyny, dostępny z Sandoz Pharmaceuticals Corporation. W US nr 5210076, Berliner i in., proponowano inny sposób leczenia PD i szeregu innych chorób neurodegeneracyjnych w postaci terapii melaniną. Jednakże wydaje się, że żaden z powyższych sposobów leczenia nie chroni przed śmiercią neuronów.

Chociaż wiadomo, że niektóre związki, obejmujące niektórych agonistów α adrenergicznych, takich jak brimonidyna, mogą wywierać działanie neuroprotekcyjne na komórki wzrokowe lub komórki siatkówki i komórki nerwowe rdzenia kręgowego przy stosowaniu miejscowym lub wstrzyknięciu w miejsce uszkodzenia nerwu, dotychczas nie sądzono, że takie środki mogą być skutecznymi środkami w leczeniu stanów neurodegeneracyjnych mózgu, takich jak choroba Alzheimera i choroba Parkinsona, gdyż wcześniej nie sądzono, że receptory α2B i/lub α2C występują w dużej liczbie w tych obszarach mózgu. Dodatkowo, choć wykazano, że agoniści receptora α adrenergicznego wywierają użyteczne działanie neuroochronne przy podawaniu w leczeniu miejscowym, działania sedatywne tych związków, obserwowane przy dawkach terapeutycznych, w poważnym stopniu ograniczały ich użyteczność w praktyce jako środków podawanych nie miejscowo lub układowo.

Niespodziewanie stwierdzono, że niektóre środki α adrenergiczne, podawane układowo, mogą chronić komórki nerwowe istoty czarnej i obszaru brzusznej nakrywki mózgu. Ponadto środki te posiadają znacznie szersze okno terapeutyczne między działaniem neuroprotekcyjnym, a działaniem sedatywnym niż większość wcześniej scharakteryzowanych agonistów α adrenergicznych.

W tej grupie leków znajdują się różne pochodne chinoksaliny, wykazujące działanie agonistyczne na receptory α 2, których zastosowanie jako środków terapeutycznych oryginalnie zasugerowali Danielewicz i in. w US nr 3890319 i 4029792.

PL 216 373 B1

W opisach tych ujawniono związki, jako regulatory czynności układu sercowo-naczyniowego o wzorze:

w którym grupa 2-imidazolin-2-yloaminowa może być w dowolnej spośród pozycji 5-, 6-, 7i 8- pierścienia chinoksalinowego, x, y i z mogą występować w dowolnej spośród pozycji 5-, 6-, 7i 8- oraz mogą być wybrane grupy obejmującej atom wodoru, atom chlorowca, C1-5 alkil, C1-5 alkoksyl i trifluorometyl, a R jest ewentualnym podstawnikiem w pozycji 2- lub 3- pierścienia chinoksalinowego i może oznaczać atom wodoru, C1-5 alkil lub C1-5 alkoksyl. Obecnie użyteczne związki można wytwarzać sposobami opisanymi w US nr 3890319 i 4029792.

W Ocular Effects of a Relatively Selective Alpha-2 Agonist (UK-14, 304-18) in Cats, Rabbits and Monkeys, J. A. Burke i in., Current Eye Rsrch., 5, (9), str. 665-676 (1986) pokazano, że przedstawiona niżej pochodna chinoksaliny o nazwie generycznej brimonidyna, jest skuteczna w zmniejszaniu ciśnienia wewnątrzgałkowego u królików, kotów i małp. W tym badaniu związki podawano miejscowo na rogówkę badanych zwierząt.

Wiadomo, że brimonidyna, agonista receptora α 2, przy podawaniu miejscowym lub układowym, może chronić komórki nerwowe siatkówki, także fotoreceptory i komórki zwojowe siatkówki, przed uszkodzeniem w stanach takich, jak jaskra, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki i związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej.

Wynalazek dotyczy zastosowania selektywnego agonisty receptora a2B adrenergicznego lub a2B/2C adrenergicznego, którym jest związek wybrany z grupy obejmującej pochodną imidazoliny o wzorze:

pochodną tiomocznika o wzorze

HO

N ri

PL 216 373 B1 i brimonidynę, do wytwarzania leku do leczenia stanu neurodegeneracyjnego mózgu powodującego uszkodzenie neuronów wystających do lub z istoty czarnej, który to stan neurodegeneracyjny stanowi choroba Parkinsona lub Alzheimera.

Korzystne jest zastosowanie, charakterystyczne tym, że lek zawierający selektywnego agonistę receptora α2Β adrenergicznego lub a2B/2C adrenergicznego podaje się do mózgu ssaka przez dostarczanie układowe.

Korzystne jest zastosowanie, charakterystyczne tym, że podawanie leku jest skuteczne w zapobieganiu śmierci lub degeneracji neuronów wystających do lub z brzusznego obszaru nakrywki.

Korzystne jest zastosowanie, charakterystyczne tym, że nasilenie sedacji towarzyszącej podaniu tego leku przy danym stopniu skuteczności terapeutycznej jest mniejsze niż towarzyszące podaniu dawki deksmedatomidyny przy takim samym stopniu skuteczności terapeutycznej.

Wynalazek dotyczy także zastosowania selektywnego agonisty receptora α2Β lub 2B/2C adrenergicznego, którym jest związek wybrany z grupy obejmującej pochodną imidazoliny o wzorze:

pochodną tiomocznika o wzorze

i brimonidynę, do wytwarzania leku do leczenia stanu obejmującego neurodegenerację tkanki mózgu, który to stan stanowi choroba Parkinsona lub Alzheimera.

Wynalazek umożliwia zatem leczenie stanu neurodegeneracyjnego mózgu, polegające na podawaniu do mózgu ssaka tego potrzebującego, terapeutycznie skutecznej ilości selektywnego agonisty receptora α 2 adrenergicznego.

Stosowane w opisie określenia „selektywny agonista receptora α 2 adrenergicznego” lub „selektywny α 2 agonista” będą oznaczały środek o stosunku działania na receptor α 2 do działania na receptor α 1 wyższym, niż w przypadku środka deksmedatomidyny.

Korzystnie takie działanie na receptor α 2 jest co najmniej 12-krotnie silniejsze niż na receptor α 1, jeszcze korzystniej działanie na receptor(y) α 2 jest co najmniej 25-krotnie silniejsze niż na receptor α 1.

W jednej postaci selektywnym α 2 agonistą jest związek 2-imidazolin-2-yloaminowy.

W korzystnej postaci selektywnym α 2 agonistą jest brimonidyna lub jej sole.

W innej postaci selektywnym α 2 agonistą jest także selektywny α2B agonista lub selektywny α2B/2C agonista. Stosowane w opisie określenia „selektywny α2B lub 2B/2C agonista” lub „selektywny agonista receptora α2B lub 2B/2C adrenergicznego” oznaczają związek wykazujący co najmniej 10-krotnie (korzystnie co najmniej 50-krotnie, jeszcze korzystniej co najmniej 100-krotnie) silniejsze działanie na receptor α2B lub zarówno na podtypy receptora α2B, jak i α23 od działania na podtyp receptora α2A.

Korzystnie związek „selektywny” jest „specyficzny”, co oznacza, że związek wykazuje co najmniej 100-krotnie (korzystnie co najmniej 500-krotnie, jeszcze korzystniej co najmniej 1000-krotnie, a jeszcze korzystniej co najmniej 5000-krotnie) silniejsze działanie na dany receptor(y) lub podtyp(y) receptora(ów), niż na receptor(y) lub podtyp(y) receptora(ów), z którym się go porównuje.

Działanie na dany receptor lub podtyp receptora zgodnie z wynalazkiem określa się stosując procedurę testu RSAT, jak opisano powyżej.

PL 216 373 B1

Selektywni α2B i α2B/2C agoniści są szczególnie użyteczni w leczeniu. Selektywni α 2 agoniści wykazują ulepszony wskaźnik terapeutyczny ze względu na obniżenie EC50 takich związków (co prowadzi do osiągnięcia działania terapeutycznego przy niższym stężeniu leku) w porównaniu z podobnymi związkami wykazującymi silniejsze działanie na receptor α 1, natomiast bez zmiany krzywej dawka - odpowiedź dla sedacji. Selektywni α2B i α2B/2C agoniści dodatkowo wykazują zmniejszone działanie sedatywne dzięki zmniejszonemu działaniu na receptor α2A, co jak to odkryto, odpowiada za sedację i działania na układ sercowo-naczyniowy, takie jak zwolnienie rytmu serca i obniżenie ciśnienia krwi. Działania te są szczególnie silne, gdy związki są specyficzne, a nie jedynie selektywne w stosunku do ich określonego celu działania.

Wynalazek umożliwia zapobieganie śmierci lub degeneracji komórek nerwowych wystających do lub z obszaru mózgu wybranego z grupy obejmującej istotę czarną, miejsce sinawe i obszar brzusznej nakrywki, polegających na podawaniu selektywnego agonisty receptora α 2 adrenergicznego do tych komórek. W jednej postaci selektywny α agonista jest także seIektywnym α2Β lub α2B/2C agonistą.

Korzystnie środki są specyficzne dla swoich określonych celów działania.

Wynalazek umożliwia leczenie stanu neurodegeneracyjnego mózgu, polegającego na podawaniu do mózgu potrzebującego tego ssaka terapeutycznie skutecznej ilości agonisty receptora α 2 adrenergicznego i antagonisty α 1 receptora. Zastosowanie antagonisty receptora α w połączeniu z agonistą receptora α 2 doprowadzi do uzyskania leku złożonego wykazującego selektywne działanie na receptory α 2, i w ten sposób uzyskanie zalety związanej z zastosowaniem pojedynczego selektywnego α 2 agonisty. Patrz zgłoszenie patentowe US 10/152424.

Ten nowy sposób jest szczególnie skuteczny przy stosowaniu postępowania profilaktycznego, tj. zanim dojdzie do uszkodzenia nerwu lub przed wystąpieniem długoterminowego postępu stanu chorobowego, takiego jak choroba Alzheimera lub choroba Parkinsona. Bez wskazywania konkretnej teorii dotyczącej roli, jaką związki stosowane zgodnie z wynalazkiem odgrywają w neuroprotekcji, zakłada się, że opisane związki i sposoby mogą pobudzać wytwarzanie niektórych czynników z rodziny bcl-2; zwiększoną ekspresję takich czynników mierzono wzrostem ekspresji mRNA kodującego ich wytwarzanie; te czynniki (bcl-2 i bcl-XL) mogą tłumić program apoptozy. Czynniki te mogą neutralizować obecność lub indukcję czynników proapoptotycznych bcl-2, takich jak bad i bax, które mogą być wytwarzane w wyniku zadziałania szkodliwych czynników na komórki nerwowe. Dlatego dodatkowo uważa się, że związki stosowane zgodnie z wynalazkiem, które dostarczają do nerwu sygnały przeżycia komórki, mogą korzystnie być stosowane w połączeniu ze związkami, które hamują śmierć komórek. Takie związki hamujące śmierć komórek obejmują antagonistów NMDA, w szczególności memantynę, którzy blokują toksyczne efekty wynikające z nadmiernego pobudzenia szlaku glutaminergicznego, inhibitory syntetazy tlenku azotu, akceptory wolnych rodników i blokery kanałów wapniowych.

Można zastosować dowolny odpowiedni sposób podawania leczonemu ssakowi użytecznego związku lub związków stosowanych zgodnie z wynalazkiem. We wszystkich sposobach korzystnym ssakiem jest człowiek. Korzystnie konkretnym wybranym sposobem podawania jest sposób, który umożliwia wywieranie pożądanego działania terapeutycznego przez użyteczny związek lub związki stosowane zgodnie z wynalazkiem w sposób skuteczny, np. przy zastosowaniu niskiego skutecznego stężenia i uzyskaniu małej częstości działań ubocznych.

Podawanie użytecznych związków do stosowania według wynalazku może obejmować, lecz nie wyłącznie, podawanie doustne, pozajelitowe, dożylne, podskórne i inne sposoby podawania układowego. Związki są podawane w terapeutycznie skutecznej ilości, same albo w połączeniu z odpowiednim farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub zaróbką.

W zależności od zamierzonego sposobu podawania użyteczny związek lub związki stosowane zgodnie z wynalazkiem mogą być umieszczone w dowolnej farmaceutycznie dopuszczalnej postaci dawkowanej, takiej jak, np. tabletki, czopki, pigułki, kapsułki, proszki, ciecze, roztwory, wlewy, zawiesiny, emulsje, aerozole lub tym podobne, korzystnie w postaciach dawkowanych odpowiednich do pojedynczego podania dokładnych dawek lub postaciach dawkowanych o przedłużonym uwalnianiu do ciągłego kontrolowanego podawania.

Korzystnie postać dawkowana będzie zawierała farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę i użyteczny związek lub związki stosowane zgodnie z wynalazkiem oraz, dodatkowo, może zawierać inne środki lecznicze, środki farmaceutyczne, nośniki, substancje pomocnicze itp.

PL 216 373 B1

W przypadku stałych postaci dawkowanych do nietoksycznych stałych nośników należą, lecz nie wyłącznie, mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sacharyna sodowa, glikole polialkilenowe, talk, celuloza, glukoza, sacharoza i węglan magnezu, o czystości farmaceutycznej. Przykładem stałej postaci dawkowanej dla realizacji wynalazku jest czopek zawierający glikol propylenowy, jako nośnik.

Ciekłe farmaceutyczne postacie dawkowane mogą np. zawierać roztwór lub zawiesinę jednego lub większej liczby użytecznych związków stosowane zgodnie z wynalazkiem i ewentualnie farmaceutycznych substancji pomocniczych w nośniku, takim jak na przykład, woda, sól fizjologiczna, wodny roztwór dekstrozy, gliceryna, etanol itp., z wytworzeniem roztworu lub zawiesiny. Jeżeli jest to konieczne, podawana kompozycja farmaceutyczna może także zawierać niewielkie ilości nietoksycznych substancji pomocniczych, takich jak środki zwilżające lub emulgujące, środki buforujące pH i tym podobne. Typowymi przykładami takich środków pomocniczych są octan sodu, monolaurynian sorbitanu, trietanoloamina, octan sodu, oleinian trietanolaminy itp. Fachowcom znane są lub będą dla nich oczywiste konkretne sposoby wytwarzania takich postaci dawkowanych; patrz np. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA, 16 wydanie, 1980, włączona do opisu jako pozycja literaturowa. Podawana kompozycja preparatu w każdym przypadku zawiera ilość jednego lub większej liczby aktualnie użytecznych związków, skuteczną do wywierania pożądanego działania terapeutycznego.

Ogólnie dla podawania pozajelitowego stosuje się wstrzykiwanie podskórne, domięśniowe lub dożylne. Preparaty do wstrzykiwań można wytwarzać w znanych postaciach, jako ciekłe roztwory lub zawiesiny, stałe postacie odpowiednie dla wytworzenia roztworu lub zawiesiny w cieczy przed wstrzyknięciem lub jako emulsje lub wlewy. Odpowiednimi zaróbkami są na przykład woda, sól fizjologiczna, dekstroza, gliceryna, etanol itp. Dodatkowo, jeżeli jest to konieczne, podawane środki farmaceutyczne do wstrzykiwań lub wlewów mogą także zawierać niewielkie ilości nietoksycznych substancji pomocniczych, takich jak środki zwilżające lub emulgujące, środki buforujące pH itp.

Ilość podawanego aktualnie użytecznego związku lub związków stosowanych zgodnie z wynalazkiem oczywiście zależy od pożądanego działania lub działań terapeutycznych, konkretnego leczonego ssaka, ostrości i charakteru stanu ssaka, sposobu podawania, siły i farmakodynamiki wykorzystywanego konkretnego związku lub związków oraz oceny zlecającego lekarza. Ogólnie terapeutycznie skuteczna dawka użytecznego związku lub związków stosowanych zgodnie z wynalazkiem korzystnie wynosi od około 0,5 lub 1 do około 100 mg/kg/dobę.

Wynalazek umożliwia leczenie neurodegeneracyjnego stanu mózgu, polegające na podawaniu do mózgu ssaka tego potrzebującego terapeutycznie skutecznej ilości selektywnego agonisty receptora α 2 adrenergicznego.

W nawiązaniu do tego stwierdzono, że selektywni lub specyficzni agoniści receptora α 2 wykazują nieoczekiwanie silniejsze działanie w porównaniu ze związkami, które wykazują działanie agonistyczne na receptor α 1. Sądzi się, że pobudzenie receptora α 1 adrenergicznego prowadzi do zaburzenia neuroprotekcyjnego działania takich środków, gdy działanie sedatywne, które taki środek może wywierać, wykazuje EC50 podobne lub mieszczące się w zakresie trzykrotnego przedziału neuroprotekcyjnego działania dla takiego związku. Dlatego każde działanie neuroprotekcyjne zapewniane przez takie nieselektywne środki jest obserwowane w stężeniach, które mają tendencję do wywierania działania sedatywnego lub toksycznego u pacjenta. W części z tego powodu ogólnie nie stosowano w przeszłości środków α adrenergicznych jako środków neuroprotekcyjnych, poza zastosowaniami lokalnymi lub miejscowymi (takimi jak zastosowania okulistyczne), w których środek ogólnie nie jest podawany układowo.

Dodatkowo poza związkami opisanymi bezpośrednio lub za pośrednictwem opisanych w niniejszym opisie ujawnień, inne typy związków wykazujące selektywne lub specyficzne działanie na receptory α 2B lub α 2B/2C opisane są w zgłoszeniach patentowych US 09/794874 i 10/153328, których niniejszy zgłaszający jest współwłaścicielem.

Nie ograniczając się do żadnej konkretnej teorii sądzi się, że większość lub całe działanie neuroprotekcyjne tych środków wywierane jest przez pobudzenie receptorów α 2B i/lub α 2C. Ogólnie nie sądzono, że w mózgu znajduje się dużo receptorów α 2B lub 2C. Jednakże stwierdzono, że środki i sposoby zgodne z wynalazkiem mogą zapewniać działanie neuroprotekcyjne neuronom wystającym z lub do istoty czarnej i obszaru brzusznej nakrywki mózgu oraz sądzi się, że te działania mogą także być obserwowane w neuronach miejsca sinawego, które sięgają kory. Dlatego opisane środki są użyteczne w leczeniu stanów takich jak choroba Alzheimera i choroba Parkinsona.

PL 216 373 B1

P r z y k ł a d 1

Metody

Test otwartego pola

Każde zwierzę jest umieszczane w przezroczystym pudełku z tworzywa sztucznego z otwartym polem, posiadającym dwa rzędy wiązek świetlnych, umieszczonych po bokach dla odróżnienia ruchów poziomych (tj. odległości przebytej) i pionowych (tj. „stania na tylnych łapach”). Warunki otoczenia to niski poziom hałasu i przyciemnione światło. Ruchy zwierzęcia w pudełku mierzy się przez 5 minut i obliczane na podstawie zapisów liczby i rodzaju „przerwań wiązki” lub przekroczeń wiązek świetlnych. W ostatnim teście otwartego pola liczone są jedynie ruchy stania na tylnych łapach i klasyfikowane jako albo „podparte”, albo „niepodparte”. Podparte stanie na tylnych łapach występuje wtedy, gdy zwierzę umieszcza co najmniej jedną kończynę przednią na bocznej ścianie pudełka w momencie gdy rejestrowane jest stanie na tylnych łapach. W niepodpartym staniu na tylnych łapach mysz opiera się wyłącznie na tylnych łapach. Stanie na tylnych łapach wyróżniono przez nagranie wideo. Liczba niepodpartych epizodów stania na tylnych łapach jest najbardziej wiarygodną miarą utraty neuronów dopaminergicznych w tym teście.

Test wieszania za ogon

Myszy są wieszane za ogony, trzykrotnie każda, każdorazowo przez około 10 sekund. Każdą mysz wiesza się za podstawę ogona około 30 cm powyżej powierzchni stołu, dopóki mysz nie skręci się albo w lewo, albo w prawo.

Za skręt w lewo przydzielany jest wskaźnik 0, za skręt w prawo wskaźnik 1.

W czasie wieszania za ogon odnotowywane jest także położenie przednich łap. Za położenie łap przydzielany jest wskaźnik na 4-punktowej skali. Za wyprostowane łapy lub umieszczone nad głową przydzielany jest wskaźnik 0. Za łapy zaciśnięte lub przywiedzione do ciała przydzielany jest wskaźnik 3. Wskaźniki 1 lub 2 są przyznawane za pośrednie stadia między tymi dwoma skrajnymi stadiami. Umieszczenie kończyn tylnych jest także oceniane jak poniżej.

Budowanie gniazda myszy tej samej płci z jednej grupy umieszcza się w wanience z tworzywa sztucznego. Przed tą wanienką umieszczanych jest osiem skrawków papierowego ręcznika na równej kupce. Budowanie gniazda z tego ręcznika papierowego ocenia się po 24 godzinach, 48 godzinach, 72 godzinach i 96 godzinach od rozpoczęcia traktowania. Wskaźniki są przydzielane w sposób następujący: 0 = papier podarty na strzępy i uformowany w pełne gniazdo z przykryciem nad głową; 1 = papier podarty na strzępy i uformowany w pełne gniazdo bez przykrycia nad głową; 2 = papier trochę podarty na strzępy lub przeżuty i luźno ułożony na jednym obszarze; 3 = papier lekko przeżuty bez wyraźnego gromadzenia w jednym miejscu i 4 = brak wyraźnego gromadzenia w jednym miejscu.

Zliczanie neuronów

Między 55 a 60 dniem po wstrzyknięciu MPTP myszy są uśmiercane nembutalem sodu. Mózgi myszy są perfundowane solą fizjologiczną buforowaną fosforanem a następnie środkiem utrwalającym Lana (paraformaldehydem i kwasem pikrynowym). Mózgi są usuwane i umieszczane w środku utrwalającym Lana na 7-10 dni. Następnie mózgi są przecinane w płaszczyźnie wieńcowej na skrawki o grubości 50 μm przy użyciu wibratomu. Skrawki są wybarwiane przeciwciałem przeciw hydroksylazie tyrozynowej, enzymem ograniczającym szybkość w syntezie dopaminy. Skrawek następnie badano pod mikroskopem przy powiększeniu 100x. Do liczenia komórek w istocie czarnej i obszarze brzusznej nakrywki wybierano skrawki tkanek (-2,9 mm i -3,6 mm do tyłu od punktu bregma). Te preparaty pochodzą odpowiednio z części środkowej głowowej połowy i z części środkowej ogonowej połowy istoty czarnej. Każda komórka wybarwiająca się na obecność hydroksylazy tyrozynowej, która jest wyraźnie widoczna, i która zawiera 2-6 neurytów jest uważana za neuron. Z czterech przekrojów (z części głowowej i ogonowej, lewej i prawej) obliczana jest całkowita średnia liczba neuronów dla każdego zwierzęcia. Obliczana jest średnia z czterech przekrojów. Osobne analizy są wykonywane dla liczby neuronów z istoty czarnej i obszaru brzusznej nakrywki. Liczby te są analizowane przy użyciu testu ANOVA dla powtórek, a następnie testów oceniających różnicę między grupami przy użyciu metody HSB Fishera.

Procedura eksperymentalna

U myszy, które otrzymały układowe wstrzyknięcia toksyny pirydynowej 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP), w sposób selektywny dochodzi do utraty dużej liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej (SN) i obszarze brzusznej nakrywki (VTA). Utrata komórek dopaminergicznych w SN naśladuje stan kliniczny obserwowany w chorobie Parkinsona. Utrata takich

PL 216 373 B1 komórek w VTA może przyczyniać się do upośledzenia funkcji poznawczych, obserwowanego w chorobie Parkinsona i chorobie Alzheimera, ze względu na projekcje tych neuronów do kory czołowej.

Grupie 50 myszy typu C57B1/B6 (w wieku 8-12 tygodni) umożliwiono aklimatyzację przez 12-14 dni przed użyciem w eksperymencie. Następnie myszy w sposób losowy przydzielono do następujących grup: MPTP plus nośnik DMSO, sam nośnik, MPTP plus brimonidyna (3 mg/kg/dobę), MPTP plus AGN 197075 (3 mg/kg/dobę) i MPTP plus AGN 196923 (3 mg/kg/dobę).

197075 ma następującą budowę:

a informacje dotyczące syntezy tego związku można znaleźć w US nr 6313172. 196923 ma następującą budowę:

a informacje dotyczące syntezy tego związku można znaleźć w zgłoszeniu patentowym US nr 09/815362, którego niniejszy zgłaszający jest współwłaścicielem. Zarówno opis patentowy nr 6313172, jak i zgłoszenie patentowe 09/815362 są włączone do opisu przez odniesienie jako część zgłoszenia.

Następnie, w opisywanych testach, u każdej myszy wykonywany jest początkowo test otwartego pola i test wieszania za ogon. Test otwartego pola jest najczęściej stosowanym testem behawioralnym myszy traktowanych MPTP i wydaje się, że jest czuły na utratę sygnałów dopaminergicznych z istoty czarnej. Test wieszania za ogon jest czuły na bezpośrednie uszkodzenie prążkowia; test budowania gniazda jest czuły na utratę sygnałów prążkowia w korze czołowej.

Cztery z 5 grup myszy otrzymują wlew badanego związku (lub nośnika nie zawierającego żadnego związku). Wlewy te są podawane przez wszczepioną pod skórę osmotyczną minipompę przez 14 dni przy przepływie 0,25 μΐ/godzinę. Trzy dni po wszczepieniu pompy u myszy wykonywany jest test otwartego pola i test wieszania za ogon, także w grupie kontrolnych myszy, którym nie wszczepia się minipomp. Bezpośrednio po przeprowadzeniu testów myszom z wszczepionymi pompami podskórnie wstrzyknięto 40 mg/kg MPTP. Następnie we wszystkich grupach wykonywany jest test otwartego pola i test wieszania za ogon 10-12 dni i 30-40 dni po traktowaniu MPTP. Test otwartego pola i test wieszania za ogon wykonywane są 50-55 dni po traktowaniu MPTP.

We wszystkich testach behawioralnych wyniki są najpierw analizowane przy użyciu testu ANOVA dla powtórzonych prób, a następnie testów oceniających różnicę między grupami przy użyciu metody HSB Fishera.

Test otwartego pola

Przed traktowaniem MPTP nie występowały istotne różnice między 5 grupami pod względem przebytej odległości ani liczby epizodów stania na tylnych łapach.

Grupa otrzymująca nośnik jest istotnie bardziej aktywna niż kontrole w 10 i 30 dni po traktowaniu MPTP. Myszy traktowane brimonidyną nie wykazują zmiany tej nasilonej aktywności; zatem nie ma istotnej różnicy między tą grupą a grupą otrzymującą nośnik. AGN 196923 istotnie zmniejsza aktywność (w porównaniu do nośnika) i myszy te nie odróżniają się od grupy kontrolnej. Grupa AGN 197075 wykazuje podobną tendencję w tym samym kierunku. Żaden ze związków AGN nie jest istotnie różny od nośnika 30 dni po MPTP.

PL 216 373 B1

Wydaje się, że traktowanie MPTP powoduje zmniejszenie całkowitej liczby epizodów stania na tylnych łapach w 10 dni po traktowaniu MPTP. Po 30 dniach nie obserwuje się żadnego wpływu MPTP na całkowitą liczbę epizodów stania na tylnych łapach (w porównaniu z grupą nośnika) i jedynie nieznacznie zmniejszenie całkowitej liczby epizodów stania na tylnych łapach w porównaniu z grupą kontrolną.

Po 50-60 dniach od traktowania MPTP myszy otrzymujące AGN 197075 mają mniej epizodów nie podpieranego stania na tylnych łapach niż myszy, które otrzymują nośnik. W grupie nośnika występuje mniej epizodów nie podpieranego stania na tylnych łapach niż u normalnych myszy. MPTP ani powyższe związki nie wpływają na epizody podpieranego stania na tylnych łapach.

Test wieszania za ogon

Nie obserwowano żadnych istotnych różnic między grupami w teście wieszania za ogon przed traktowaniem MPTP ani po traktowaniu MPTP pod względem tylnych łap. MPTP istotnie upośledza wyprost przednich łap we wszystkich trzech punktach czasowych po zaistnieniu uszkodzenia. Dlatego nie dochodzi do ustąpienia tego upośledzenia wraz z upływem czasu. AGN 197075 istotnie zmniejsza to upośledzenie w okresie, w którym podawany jest ten związek. AGN 196923 i brimonidyna nie wykazują takich cech. Jednakże wszystkie trzy związki wykazują tendencję do zmniejszenia upośledzenia mierzonego po ich podaniu (tj. po 14 dni od podania związku).

Liczba neuronów

Zwierzęta traktowane MPTP mają w istocie czarnej o 58% mniej neuronów niż zwierzęta nie traktowane tym związkiem. Jednakże zwierzęta otrzymujące brimonidynę, AGN 196923 lub AGN 197075 miały istotnie mniejszą utratę neuronów.

Grupa traktowana	Średnia liczba neuronów (błąd statystyczny)
Kontrola	60 (± 5)
Nośnik + MPTP	25 (± 2)
AGN 196923 + MPTP	35 (± 2)
AGN 197075 + MPTP	37 (± 2)
Brimonidyna	32 (± 1)

Stwierdzono, że w obszarze brzusznej nakrywki MPTP prowadzi do średniego spadku liczby neuronów o 28% w porównaniu z grupą kontrolną. Każdy z badanych związków (AGN 197075, AGN 196923 i brimonidyna) zmniejszał tę utratę średnio o około 10%.

Claims (5)

1. Zastosowanie selektywnego agonisty receptora α2B adrenergicznego lub α2B/2C adrenergicznego, którym jest związek wybrany z grupy obejmującej pochodną imidazoliny o wzorze:

pochodną tiomocznika o wzorze:

PL 216 373 B1 i brimonidynę, do wytwarzania leku do leczenia stanu neurodegeneracyjnego mózgu powodującego uszkodzenie neuronów wystających do lub z istoty czarnej, który to stan neurodegeneracyjny stanowi choroba Parkinsona lub Alzheimera.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek zawierający selektywnego agonistę receptora α2B adrenergicznego lub α2B/2C adrenergicznego podaje się do mózgu ssaka przez dostarczanie układowe.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że podawanie leku jest skuteczne w zapobieganiu śmierci lub degeneracji neuronów wystających do lub z brzusznego obszaru nakrywki.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że nasilenie sedacji towarzyszącej podaniu tego leku przy danym stopniu skuteczności terapeutycznej jest mniejsze niż towarzyszące podaniu dawki deksmedetomidyny przy takim samym stopniu skuteczności terapeutycznej.

5. Zastosowanie selektywnego agonisty receptora α 2B lub 2B/2C adrenergicznego, którym jest związek wybrany z grupy obejmującej pochodną imidazoliny o wzorze:

pochodną tiomocznika o wzorze:

i brimonidynę, do wytwarzania leku do leczenia stanu obejmującego neurodegenerację tkanki mózgu, który to stan stanowi choroba Parkinsona lub Alzheimera.