PL218170B1 - Sposób wytwarzania preparatu kontrolnego do sprawdzania poprawności badań serologicznych - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania preparatu kontrolnego do sprawdzania poprawności badań serologicznych, zwłaszcza grup krwi człowieka.

Celem badań kontrolnych jest sprawdzenie czy stosowane przez laboratoria medyczne metody badań zapewniają bezpieczne leczenie krwią.

Kontrola prawidłowości wykonywania badań serologicznych polega na przeprowadzeniu w osoczu kontrolnych oznaczeń grup: układu ABO, czynnika RhD, innych antygenów z układów Rh takich jak C, c, E, e oraz antygenów z układów: Kell, Kidd i Duffy.

Ponadto - w zakresie wymienionych układów grup krwi - podlegają kontroli badania czułości i swoistości przeciwciał w pośrednim teście antyglobulinowym PTA, PTA - LISS i w testach enzymatycznych (próba krzyżowa).

Dotychczas dla wykonywania wyrywkowej kontroli badań używano surowic od dawców immunizowanych lub biorców, względnie osocza odpadowego po oznaczeniu. Ponieważ taki materiał kontrolny bywał nietrwały - stabilizowano go przez zamrażanie.

Dostarczanie zamrożonego materiału kontrolnego do dużej liczby placówek leczniczych na terenie całego kraju było trudne, kosztowne z uwagi na konieczność utrzymania reżimu temperatury na poziomie -18°C.

Ponadto zgodnie z wymogami - badania kontrolne należało wykonać w terminie do 2 tygodni od daty otrzymania materiału kontrolnego, przy czym po rozmrożeniu termin ważności materiału był krótki i wynosił kilka godzin. Często po rozmrożeniu okazywało się, że materiał kontrolny zawiera straty i jest bezużyteczny. W efekcie porównywalność wyników wykonywanych badań budziła wątpliwości.

Znany jest z polskiego opisu patentowego nr 62789 sposób otrzymywania trwałych roztworów surowic wzorcowych przeznaczonych do określania grupy krwi i innych badań serologicznych. Sposób polega na tym, że surowicę poddaje się w znany sposób liofilizacji, po czym uzyskany produkt rozpuszcza się w glicerynie, a ilość gliceryny dobiera się tak, aby na suchą pozostałość z 1 ml surowicy przypadało 0,33 ml gliceryny.

Sposób wytwarzania surowic wzorcowych układu ABO przedstawiono też w polskim opisie patentowym nr 134342. Według tego sposobu - osocze krwi o mianie niższym od 1: 32 po odwłóknieniu poddaje się parokrotnie naprzemiennie zamrożeniu w temperaturze poniżej -5°C i powolnemu rozmrożeniu w temperaturze 4°C aż do uzyskania wyraźnego rozdziału surowicy na dwie frakcje. Rozwarstwioną surowicę rozdziela się; frakcję dolną surowicy wzbogaconą w przeciwciała o mianie co najmniej 1:32 sączy się przez filtr bakteriologiczny i dodaje środek konserwujący.

Ponadto z polskiego opisu patentowego nr 184903 znany jest sposób wytwarzania standaryzowanego odczynnika zawierającego immunoglobuliny ludzkie klasy G o swoistości anty - D, zwłaszcza do badań serologicznych grup krwi człowieka. Sposób polega na tym, że uzyskuje się roztwór o zawartości przeciwciał anty - D klasy IgG od 0,05 - 0,06 ąg/ml przez rozcieńczenie substancji wyjściowej zawierającej immunoglobuliny, dogodnie za pomocą zbuforowanej soli fizjologicznej o odczynie pH 6,9 - 7,2 korzystnie 7. Bezpośrednio po tym roztwór stabilizuje się ludzką surowicą grupy krwi AB bądź albuminą: ludzką, bydlęcą w ilości 1% objętościowego, konserwuje dogodnie azydkiem sodu w ilości 0,1% wagowego, po czym chłodzi w temperaturze od 2 do 8°C.

Standaryzowanego odczynnika używa się do kontroli prawidłowości wykonania pojedynczego badania serologicznego: grup krwi człowieka, pośredniego testu anty globulinowego PTA i testu enzymatycznego LEN.

Celem i zadaniem wynalazku jest sposób opracowania preparatu kontrolnego z osocza jednorodnego o długim okresie stabilności, umożliwiającego ujednolicenie wykonywania kontrolnych badań serologicznych gwarantujących uzyskanie takiego samego wyniku w różnych placówkach leczniczych na terenie całego kraju.

Okazało się, że można otrzymać stabilny preparat kontrolny dodając odpowiednio albuminę wraz z azydkiem sodu.

Zgodnie z wynalazkiem sposób wytwarzania preparatu kontrolnego do sprawdzania poprawności badań serologicznych zwłaszcza grup krwi człowieka polega na tym, że oznaczoną surowicę rozcieńcza się do uzyskania wymaganej ilości przeciwciał, konserwuje się za pomocą azydku sodu i po sprawdzeniu zawartości i swoistości przeciwciał, poziomu białka całkowitego oraz albuminy koryguje się za pomocą odpowiedniej surowicy i stabilizuje albuminą do jej stężenia, co najmniej 20 mg/dl. Gotowy preparat przechowuje się w temperaturze 2 - 8°C, korzystnie 4°C.

PL 218 170 B1

Jako oznaczoną surowicę stosuje się surowicę otrzymaną z osocza natywnego po oznaczeniu swoistości, poziomu przeciwciał i poziomu białka całkowitego oraz albuminy po procesie wykrzepiania dla oddzielenia fibryny. W procesie wykrzepiania najpierw do osocza dodaje się roztworu chlorku wapna, korzystnie 1 M-wego następnie prowadzi się dwuetapową inkubację: w pierwszym etapie w temperaturze 35 - 40°C a w drugim - w temperaturze 2 - 8°C, korzystnie 4°C.

Do rozcieńczenia surowicy stosuje się zbuforowaną sól fizjologiczną i/lub odpowiednie osocze. Azydek sodu o stężeniu około 0,2% wagowych stosuje się w postaci: korzystnie 1%-wego roztworu. Stabilizację albuminą prowadzi się do jej końcowego stężenia w wysokości najwyżej 45% wagowych. Po procesie wykrzepienia usuwa się fibrynę przez wirowanie i ewentualną filtrację. W przypadku wystąpienia niepożądanych przeciwciał prowadzi się ich absorpcję dogodnie za pomocą krwinek zawierających odpowiedni antygen.

Jest rzeczą zrozumiałą, że do wytworzenia preparatu kontrolnego można stosować gotową oznaczoną surowicę.

Preparat kontrolny do sprawdzania poprawności badań serologicznych wytworzony zgodnie z wynalazkiem jest jednorodny - pozbawiony strąceń, stabilny w dłuższym okresie czasu, dogodnie 8 miesięcy. Stosowanie preparatu umożliwia ujednolicenie metody badań i gwarantuje powtarzalność wyników badań wykonywanych w różnych laboratoriach. Ponadto transport jego jest łatwiejszy i tańszy.

P r z y k ł a d 1.

220 ml osocza o grupie „A”, w którym oznaczono przeciwciała anty - Bo mianie 1/16 według metody probówkowej w PBS i przeciwciała anty - K o mianie 1/128 w PTA LISS 1/256 w PTA klasycznym, 1/1024 w PTA kolumnowym Dia Med i 1/4 w teście enzymatycznym Dia Med poddaje się procesowi wykrzepiania. Najpierw dodaje się 3 ml 1 M-wego roztworu chlorku wapnia następnie prowadzi się dwuetapową inkubację: przez 4 godziny w temperaturze 37°C, a w drugim etapie przez 24 godziny w temperaturze 4°C. Z zawiesiny usuwa się fibrynę przez wirowanie. Do 100 ml otrzymanej surowicy dodaje się - dla rozcieńczenia - 900 ml zbuforowanej soli fizjologicznej PBS i 5 ml środka konserwującego - 1%-wego roztworu azydku sodu.

W surowicy ponownie sprawdza się zawartość i swoistość przeciwciał oraz albuminy. Uzyskane wyniki wykazały obecność śladowych przeciwciał anty - B a miano przeciwciał anty - K wyniosło odpowiednio: 1/16 1/128 i 1/4 w PTA LISS, PTA Dia Med i teście enzymatycznym kolumnowym Dia Med i zawartość albuminy 10 g/ml. Dla uzupełnienia zawartości przeciwciał anty - B i albuminy dodaje się 100 ml surowicy grupy „A” z przeciwciałami anty - B i 10 ml 60%-wego roztworu albuminy. Otrzymano 1100 ml preparatu kontrolnego o następujących parametrach: miano przeciwciał anty - B 1/4 w PBS, anty - K 1/8 w PTA LISS, 1/2 w PTA klasycznym 1/32 w PTA kolumnowym Dia Med, 1/8 w teście enzymatycznym kolumnowym Dia Med.

Preparat kontrolny przechowywany w temperaturze 4°C jest stabilny w zakresie przeciwciał anty - B i anty - K w czasie 8 miesięcy.

P r z y k ł a d 2.

Do 220 ml osocza grupy AB zawierającego przeciwciała anty - Fya aktywne w technice PTA o mianie wynoszącym 1/2 w PTA LISS, 1/4 w PTA klasycznym, 1/32 w PTA kolumnowym Dia Med dodaje się 3 ml 1 M-wego roztworu chlorku wapna i prowadzi dalej proces wykrzepiania - inkubując przez 4 godziny w temperaturze 37°C w pierwszym etapie następnie w celu retracji skrzepu - przez 24 godziny w temperaturze 4°C. Po usunięciu skrzepu przez wirowanie i filtrację otrzymuje się 100 ml surowicy o mianie identycznym z wyjściowym. Do oczyszczonej surowicy dodaje się dla rozcieńczenia 100 ml zbuforowanej soli fizjologicznej PBS i 5 ml 1% azydku sodu - dla konserwacji. Po ponownym skontrolowaniu poziomu przeciwciał miano wyniosło 1/2 w PTA LISS, 1/2 w PTA klasycznym i 1/4 w PTA kolumnowym Dia Med. Dodatkowo też pojawiły się przeciwciała anty - E o mianie 1/1 w PTA LISS. Należało zatem dodać 5 ml 30%-wego roztworu albuminy. Otrzymano 1000 ml preparatu kontrolnego stabilnego w zakresie przeciwciał anty - Fya i anty - E. Potwierdziły to badania kontrolne wykonane po 2, 4, 8 tygodniach a następnie po 6 miesiącach od wytworzenia. Preparat kontrolny przechowywano w temperaturze 5°C.

Claims (8)

1. Sposób wytwarzania preparatu kontrolnego do sprawdzania poprawności badań serologicznych, zwłaszcza grup krwi człowieka, znamienny tym, że oznaczoną surowicę rozcieńcza się do

PL 218 170 B1 uzyskania wymaganej ilości przeciwciał, konserwuje się za pomocą azydku sodu i po sprawdzeniu zawartości i swoistości przeciwciał, poziomu białka całkowitego oraz albuminy koryguje się za pomocą odpowiedniej surowicy i stabilizuje albuminą do jej stężenia co najmniej 20 mg/dl, następnie gotowy preparat przechowuje się w temperaturze 2 - 8°C, korzystnie 4°C.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako oznaczoną surowicę stosuje się surowicę otrzymaną z osocza natywnego po oznaczeniu swoistości, poziomu przeciwciał i poziomu białka całkowitego oraz albuminy po procesie wykrzepiania dla oddzielenia fibryny.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w procesie wykrzepiania najpierw do osocza dodaje się roztworu chlorku wapna, korzystnie 1 M-wego, następnie prowadzi się dwuetapową inkubację: w pierwszym etapie w temperaturze 35 - 40°C a w drugim - w temperaturze 2 - 8°C korzystnie 4°C.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do rozcieńczenia surowicy stosuje się zbuforowaną sól fizjologiczną i/lub odpowiednie osocze.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się azydek sodu o stężeniu około 0,2% wagowych w postaci korzystnie 1%-wego roztworu.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stabilizację albuminą prowadzi się do jej końcowego stężenia, najwyżej 45% wagowych.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po procesie wykrzepienia usuwa się fibrynę przez wirowanie i ewentualną filtrację.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wystąpienia niepożądanych przeciwciał prowadzi się ich absorpcję dogodnie za pomocą krwinek zawierających odpowiedni