PL223729B1 - Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec białka gp120 wirusa HIV-1, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec białka gp 120 pochodzącego z wirusa HIV- 1 IIIB izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci rekombinowanego białka gp120 pochodzącego z wirusa HIV-1 IIIB o określonej sekwencji. Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka gp120 pochodzącego z wirusa HIV- 1 IIIB polega na tym, że immunizuje się drób białkowym antygenem w postaci, rekombinowanego białka gp120 pochodzącego z wirusa HIV-1 IIIB o określonej sekwencji, przy czym immunizację prowadzi się w trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 100-150 mg/jajko i czystością 85-95%. Przedmiotem zgłoszenia jest też zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka gp120 do wykrywania wirusa HIV- 1 IIIB.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec białka gp120 wirusa HIV-1, sposób ich wytwarzania oraz zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY spec yficznych wobec białka gp120 w diagnostyce infekcji wirusem HIV-1 oraz immunoterapii infekcji wirusem HIV-1 i zastosowań w profilaktyce zakażeń wirusem HIV-1 w formie dodatku do prezerwatyw czy preparatów używanych podczas stosunków płciowych.

Białko gp120 jest powierzchniowym białkiem wirusa ludzkiego niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), które odpowiedzialne jest za wnikanie cząstek wirusowych do komórek ludzkiego układu immunologicznego. Specyficzne oddziaływanie białka gp120 z receptorem CD4 obecnym na powierzchni komórek układu immunologicznego zmienia konformację białka gp120 co otwiera miejsca dodatkowego wiązania gp120 z koreceptorem CCR5 lub CXCR4. Prowadzi to do zbliżenia cząsteczki wirusa do błony komórki oraz fuzji wirusa z komórką docelową. Po wniknięciu do wnętrza komórki wirus ulega replikacji co prowadzi do rozwoju infekcji. Zahamowanie któregokolwiek z etapów wejścia wirusa do komórki może zapobiegać rozwojowi infekcji HIV-1 w organizmie [Tomaras GD, Greenberg ML, Mechanisms for HIV-1 Entry: Current Strategies to Interfere with This Step, Curr Infect Dis Rep. 2001, 3:93-99; Sierra-Aragón S, Walter H, Targets for inhibition of HIV replication: entry, enzyme action, release and maturation, Intervirology, 2012, 55:84-97]. Diagnostyka infekcji wirusem HIV-1 polega bądź na oznaczeniu obecności i miana specyficznych przeciwciał w surowicy chorego, bądź na określeniu ilości specyficznych białek wirusowych w surowicy pacjenta. Głównymi białkami markerowymi, których obecność w organizmie świadczy o infekcji wirusem HIV-1 są zewnątrzkomórkowe białko gp41 oraz białko gp120. Zwiększony poziom obu białek koreluje z aktywną infekcją wirusa.

Opisane w literaturze i używane w diagnostyce infekcji HIV-1 przeciwciała (zarówno poliklonalne i monoklonalne) pochodzą głównie z myszy, królika, owcy oraz kozy. Brak jest doniesień literaturowych i patentowych dotyczących wytwarzania i zastosowania przeciwciał ptasich (IgY) specyficznych wobec białka gp120 pochodzącego z wirusa HIV-1 zarówno w celach diagnostycznych i terapeutycznych. Znane są jedynie przeciwciała IgY skierowane wobec białka tat wirusa HIV-1 [produkty firm Novus Biologicals czy Acris].

U ptaków, gadów oraz płazów funkcje obronne układu odpornościowego (humoralnej odpowiedzi układu odpornościowego) pełnią przeciwciała klasy IgY, które są ewolucyjnym przodkiem ssaczych przeciwciał klas IgG oraz IgE. Przeciwciała IgY funkcjonalnie najbardziej zbliżone są do przeciwciał IgG ssaków, natomiast strukturalnie przypominają przeciwciała IgE. Oprócz tego, że występują we krwi ptaków, w dużych ilościach (około 100-150 mg) transportowane są z krwi i magazynowane w żółtku jaj. Stanowi to swoisty mechanizm pasywnej ochrony młodych piskląt przed patogenami. Zaletę tę wykorzystuje się przy produkcji specyficznych przeciwciał IgY, co pozwala w krótkim czasie otrzymać duże ilości przeciwciał do zastosowań diagnostycznych lub terapeutycznych. Technologia oparta na przeciwciałach IgY ma szereg zalet - nie ma potrzeby skrwawiania zwierząt w celu pozyskania przeciwciał; wysoka odpowiedź na podany antygen utrzymuje się do końca życia zwierzęcia; ze względu na dużą odległość filogenetyczną między ssakami a ptakami możliwe jest otrzymanie sp ecyficznych przeciwciał skierowanych wobec konserwatywnym białkom ssaków. Dodatkowo stosunk owa łatwość izolacji przeciwciał, a także ilość jaką można uzyskać z jednego jaja sprawiają, iż coraz częściej wykorzystuje się immunoglobuliny Y. Analiza biochemiczna i funkcjonalna przeciwciał klasy IgY ujawniła szereg zalet ich stosowania w diagnostyce chorób. W przeciwieństwie do ssaczych przeciwciał klasy IgG przeciwciała kurze nie aktywują ludzkiego systemu dopełniacza, nie reagują z ludzkim czynnikiem reumatoidalnym czy przeciwciałami HAMA co prowadzi do znacznego zmniejszenia fałszywie pozytywnych wyników uzyskiwanych w testach serologicznych.

Dotychczas nie opisano w literaturze przeciwciał IgY specyficznych wobec białka gp120 wirusa

HIV-1.

Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec białka gp120 są izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci rekombinowanego białka gp120 pochodzącego z wirusa HIV-1 podtypu B (HIV-1 IIIB) o sekwencji przedstawionej wzorem 1.

Korzystnie przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.

Istotą wynalazku jest sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka gp120 polega na tym, że immunizuje się drób, korzystnie kury ras hodowlanych, białkowym antygenem w postaci rekombinowanego białka gp120 pochodzącego z wirusa HIV-1 podtypu B (IIIB) o sekwencji przedstawionej wzorem 1, przy czym immunizację prowadzi się w trzech osobnych

PL 223 729 B1 dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 100-150 mg/jajko i czystością 85-95%.

Korzystnie roztwór przeciwciał IgY specyficznych wobec białka gp120 poddaje się dializie wobec buforu węglanowego, równolegle peroksydazę chrzanową w buforze węglanowym miesza się z chlorkiem cyjanurowym, po czym mieszaninę reakcyjną poddaje się dializie wobec buforu węglanowego, w kolejnym etapie otrzymany po dializie roztwór peroksydazy chrzanowej miesza się z roztworem przeciwciała IgY otrzymanym w pierwszym etapie przez 4 godziny w temperaturze 37°C, pH mieszaniny reakcyjnej doprowadza się do wartości 7,2-7,4 przy użyciu 1M roztworu kwasu cytrynowego, dodaje się równą objętość glicerolu i otrzymuje się koniugaty IgY-HRP.

Istotą rozwiązania według wynalazku jest także zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka gp120 do wykrywania antygenu wirusa HIV-1 (IIIB).

Wyizolowane przeciwciała poddaje się analizie biochemicznej w celu określenia ich czystości, miana przeciwciał, specyficzności antygenowej stężenia. W trakcie procesu immunizacji analizę przeciwciał przeprowadzano dla każdego pobranego jaja w okresie 21 tygodni. Odpowiedź organizmu w postaci produkcji specyficznych przeciwciał IgY pojawiła się po 5 tygodniu od momentu immunizacji.

Sposób według wynalazku cechuje niska inwazyjność, ponieważ nie wymaga skrwawiania zwierząt w określonych odstępach czasu w celu izolacji przeciwciał oraz dużych ilości izolowanych przeciwciał.

Zaletą otrzymanych przeciwciał anty-gp120 IgY jest również to, że nie reagują one z albuminą co zmniejsza ryzyko uzyskania fałszywie pozytywnych wyników na obecność białek wirusa HIV. D odatkowo otrzymane specyficzne wobec białka gp120 przeciwciała IgY rozpoznają zarówno natywne białko wirusowe jak i białko zdenaturowane co pozwala uzyskać informację o całkowitej ilości białka gp120 w analizowanym materiale.

Diagnostyczne wykorzystanie otrzymanych przeciwciał anty-gp120 IgY polega na ich zdolności do specyficznego wiązania z docelowym antygenem. Dzięki związaniu przeciwciał IgY możliwa jest pośrednia detekcja białka gp1 20 przy użyciu handlowo dostępnych drugorzędowych przeciwciał antyIgY (np. królicze przeciwciała IgG anty-IgY) zawierających dowolny znacznik (peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna, biotyna, fluoresceina).

Otrzymano także koniugaty specyficznych przeciwciał IgY anty-gp120 i peroksydazy chrzanowej (anty-gp120 IgY-HRP) do zastosowań w immunodiagnostycznych testach bezpośredniej detekcji (ELISA, western blotting).

Korzystnie roztwór przeciwciał IgY specyficznych wobec białka gp1 20 poddaje się dializie wobec buforu węglanowego, równolegle peroksydazę chrzanową w buforze węglanowym miesza się z chlorkiem cyjanurowym, po czym mieszaninę reakcyjną poddaje się dializie wobec buforu węglanowego, w kolejnym etapie otrzymany po dializie roztwór peroksydazy chrzanowej miesza się z roztworem przeciwciała IgY otrzymanym w pierwszym etapie przez 4 godziny w temperaturze 37°C, pH mieszaniny reakcyjnej doprowadza się do wartości 7,2-7,4 przy użyciu 1M roztworu kwasu cytrynowego, dodaje się równą objętość glicerolu i otrzymuje się koniugaty IgY-HRP.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach jego wykonania oraz wzorem 1.

P r z y k ł a d 1

1.1 Przygotowanie antygenu do immunizacji

Białko gp120 (rekombinowane, system ekspresji bakulowirusa, 120kDa o sekwencji przedstawionej wzorem 1) rozpuszcza się tuż przed wykonaniem iniekcji w mieszaninie sterylnego roztworu soli fizjologicznej i pełnego adiuwantu Freund'a w stosunku 1:1 (v/v).

1.2 Immunizacja zwierząt

Kury hodowlane, rasy White Leghorn immunizuje się przez podanie domięśniowe antygenu, w ilości 1000 μg/zwierzę (300 μβ. Immunizację powtarza się następnie po 4 i 8 tygodniach stosując antygen, w ilości 50 μg na zwierzę. Grupa kontrolna otrzymuje iniekcję roztworu soli fizjologicznej zawierającej jedynie pełny adiuwant Freund'a (1:1, v/V, 300 μl/zwierzę).

1.3 Pobieranie i przechowywanie materiału biologicznego

Jaja kolekcjonuje się codziennie od następnego dnia po immunizacji przez 21 tygodni i przechowuje w temperaturze 4°C do czasu izolacji przeciwciał.

1.4 Izolacja przeciwciał IgY

Jaja przemywa się 50% roztworem izopropanolu, a następnie rozdziela żółtko od białka. Po usunięciu błony białkowej otaczającej worek żółtkowy, płynną zawartość rozcieńcza się pięciokrotnie buforem fosforanowym (10 mM, pH 7,4), a następnie dodaje glikol polietylenowy 6000 (PEG 6000)

PL 223 729 B1 do końcowego stężenia 3.5%. Po dokładnym wymieszaniu całość wiruje się przy 11 000 rpm przez 15 min w 4°C a otrzymany supernatant filtruje przez sączek bibułowy. Do supernatantu dodaje się następnie PEG 6000 do końcowego stężenia 12%. Po dokładnym wymieszaniu wytrącony osad odwirowuje się (11 000 rpm przez 15 min w 4°C). Supernatant odrzuca się, a osad zawierający przeciwciała klasy IgY rozpuszcza dokładnie w buforze fosforanowym (pH 7,4) w objętości 10 ml i dodaje PEG 6000 do końcowego stężenia 12%. Wytrącony osad zawierający czyste przeciwciała IgY odwirowuje się i rozpuszcza w 5 ml bufory PBS. Po wykonaniu analiz biochemicznych roztwory przeciwciał przechowuje się w temperaturze -20°C. Stężenie otrzymanych białek określa się spektrofotometrycznie (A₂₈₀). Czystość wyizolowanych przeciwciał zawiera się w zakresie 85-95% (Fig. 1) - Analiza elektroforetyczna (SDS-PAGE, 4-12%) w warunkach nieredukujących otrzymanych przeciwciał IgY specyficznych wobec białka gp120. Barwienie wykonano przy użyciu barwnika Coomassie R 250.

P r z y k ł a d 2

Analiza odpowiedzi immunologicznej na podany antygen gp120 w czasie procesu immunizacji

Do analizy odpowiedzi immunologicznej immunizowanych zwierząt i określenia miana produkowanych przeciwciał zastosowano test ELISA. Płytki mikrotitracyjne 96-cio dołkowe pokryto antygenem gp120 (25 ng/100 gL) rozpuszczonym w buforze węglanowym (50 mM, pH 9,6) i inkubowano w temperaturze 4°C przez 12 godzin. Wolne miejsca zablokowano następnie przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20 w temperaturze 37°C w czasie 120 minut. Po odmyciu czynnika blokującego specyficzne oraz kontrolne przeciwciała rozcieńczone w 0,5% roztworze mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Twen-20 (10 mM, pH 7,4) naniesiono na opłaszczoną antygenem płytkę mikrotitracyjną (1:100) i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C. Detekcję kompleksów białko gp120-przeciwciało IgY wykonano przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY sprzężonego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 2) - Wykres przedstawiający odpowiedź w postaci produkcji specyficznych wobec białka gp120 przeciwciał IgY. Strzałkami oznaczono czas immunizacji.

P r z y k ł a d 3

Analiza specyficzności przeciwciał IgY anty-gp120 w teście western blotting w czasie immunizacji

W celu potwierdzenia specyficzności otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec białka gpl20 wykonano analizę western blotting. Po rozdziale elektroforetycznym w warunkach denaturujących (SDS PAGE, 4%-12%) białka gp120 w obecności czynnika redukującego (10 ng białka na studzienkę) przeprowadzono elektrotransfer na membranę nitrocelulozową. Blokowanie wolnych miejsc wiążących na membranie nitrocelulozowej wykonano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% Tween-20 (v/v) przez 12h w temperaturze 4°C. Następnie specyficzne wobec białka gp120 przeciwciała rozcieńczono (1:100) w 0,5% roztworze mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% Tween-20 (v/v) i inkubowano z membraną w czasie 2 h w temperaturze 37°C. Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY sprzężonego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD, Fig. 3 - Detekcja białka gp1 20 przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY (western blotting).

P r z y k ł a d 4

Limit detekcji białka gp120 w teście ELISA

W celu określenia limitu detekcji białka gpl20 przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY w ykorzystano enzymatyczny test immunosorpcyjny fazy stałej (ELISA) w sposób opisany powyżej. W tym celu 96-cio dołkową płytkę mikrotitracyjną opłaszczono białkiem gp120 w różnych stężeniach w przedziale od 1000 ng/ml do 10 ng/ml (100 gl/studzienkę). Następnie inkubowano z roztworem specyficznego wobec białka gp1 20 przeciwciała rozcieńczonego 500-krotnie roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0.05% (v/v) Tween-20. Detekcję kompleksów gp120IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch

PL 223 729 B1 powtórzeniach (Fig. 4) - Wykres przedstawiający zdolność przeciwciał IgY do wykrywania białka gp120.

P r z y k ł a d 5

Miano przeciwciał - test ELISA

Miano otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec wirusowego antygenu gp120 określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę opłaszczono białkiem gp120 w ilości 25 ng/studzienkę. Przygotowano następnie serię rozcieńczeń przeciwciał IgY w zakresie od 1:100 do 1:25000 i inkubowano z opłas zczoną antygenem płytką. Detekcję kompleksów gp120-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 5) - Wykres mianowania przeciwciał IgY do detekcji białka gp120.

P r z y k ł a d 6

Miano przeciwciał anty-gp120 IgY i ich reaktywność z BSA

Miano oraz reaktywność z albuminą wołową (BSA) otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec antygenu gp120 określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę opłaszczono antygenem (białkiem gp120 lub albuminą wołową) w ilości 100 ng/studzienkę. Przygotowano następnie serię rozcieńczeń przeciwciał IgY (specyficznych wobec białka gp120 oraz przeciwciał kontrolnych) w zakresie od 1:100 do 1:10 000 i inkubowano z opłaszczoną antygenami płytką mikrotitracyjną. Detekcję kompleksów gp120-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 6) - Miano przeciwciał anty-gp120 IgY oraz ich reaktywność z albuminą wołową (BSA).

Przeciwciała kontrolne wykazały brak reaktywności z białkiem gp120 oraz przeciwciała specyficzne wobec białka gp1 20 nie wykazywały reaktywności z albuminą wołową.

P r z y k ł a d 7

Określenie zdolności przeciwciał IgY w detekcji zdenaturowanego białka gp120

W celu określenia zdolności otrzymanych przeciwciał IgY do detekcji zdenaturowanego białka gp120 wykorzystano test ELISA. W tym celu studzienki płytki mikrotitracyjnej opłaszczono natywnym białkiem gp120 (kontrola) oraz białkiem gp120 poddanemu wcześniejszej denaturacji termicznej (białko zagotowano przez 10 minut w temperaturze 100°C) w ilości 50 ng/studzienkę. Po inkubacji (12 h, 4°C) i zablokowaniu wolnych miejsc (5% mleko w buforze PBS-T) inkubowano z roztworem specyficznego wobec białka gp120 przeciwciała IgY lub przeciwciała kontrolnego (1:100). Detekcję kompleksów gp120-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 7) - Zdolność detekcji natywnej i zdenaturowanej formy białka gp120 przez przeciwciała IgY.

P r z y k ł a d 8

Limit detekcji białka gp120 - western blotting

W celu określenia limitu detekcji białka gp120 w technice western blotting w pierwszym etapie wykonano rozdział elektroforetyczny (SDS PAGE, 4%-12%) białka gp120 w warunkach redukujących w ilości mieszczącej się w zakresie od 25 ng do 62,5 pg/studzienkę a następnie transfer białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST membranę inkubowano z roztworem otrzymanego specyfic znego wobec białka gp120 przeciwciała IgY (1:100, 0,5% mleko/PBST). Detekcję kompleksów gp120-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD Fig. 8 Zdolność detekcji białka gp120 przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY (western blotting).

P r z y k ł a d 9

Miano przeciwciał - western blotting

W celu określenia zakresu stężeń otrzymanych przeciwciał klasy IgY w technice western blotting niezbędnego do detekcji białka gp120 wykonano analizę techniką western blotting (10 ng białka gp1 20/studzienkę). Po transferze białek na membranę nitrocelulozową i blokowaniu wolnych miejsc

PL 223 729 B1 paski membrany inkubowano z roztworami specyficznego wobec białka gp120 przeciwciała IgY rozcieńczonego w zakresie od 1:100 do 1:25000. Po wypłukaniu pasków membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD Fig. 9 - Detekcja białka gp120 przez specyficzne przeciwciała IgY (western blotting).

P r z y k ł a d 10

Otrzymywanie koniugatów IgY-HRP

W pierwszym etapie roztwór specyficznych wobec białka gp120 przeciwciał IgY poddaje się dializie wobec buforu węglanowego (50 mM, pH 9,6) i rozcieńcza do stężenia 5 mg/ml. W drugim etapie do probówki odważa się peroksydazę chrzanową w ilości 2.4 mg (stężenie 6 mg/ml) i rozpuszcza w zimnym (4°C) buforze węglanowym (50 mM, pH 9,6) i przenosi do probówki zawierającej 1340 μg chlorku cyjanurowego. Całość delikatnie miesza się w temperaturze pokojowej przez 6 h po czym mieszaninę reakcyjną poddaje się dializie wobec buforu węglanowego (50 mM, pH 9,6). W kolejnym etapie cały otrzymany po dializie roztwór peroksydazy chrzanowej miesza się z 180 pl roztworu przeciwciała IgY otrzymanym w pierwszym etapie i delikatnie miesza przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Po tym czasie doprowadza się pH mieszaniny reakcyjnej do wartości 7,2-7,4 przy użyciu 1M roztworu kwasu cytrynowego, a następnie dodaje się równą objętość glicerolu i przechowuje w temperaturze -20°C.

W celu potwierdzenia obecności koniugatów IgY-HRP wykonuje się test ELISA. Studzienki 96-cio dołkowej płytki mikrotitracyjnej pokryto króliczym przeciwciałem IgG anty-IgY rozpuszczonym w buforze węglanowym (50 mM, pH 9,6) w rozcieńczeniu 1:5000 i inkubowano w temperaturze 4°C przez 12 godzin. Po odmyciu niezwiązanego przeciwciała wolne miejsca zablokowano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0.05% (v/v) Tween-20. Blokowanie wykonuje się w temperaturze 37°C w czasie 60-120 minut. Po odmyciu czynnika blokującego otrzymany koniugat IgY-HRP rozcieńczony w 0,5% roztworze mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20 (v/v) (10 mM, pH 7,4) naniesiono na opłaszczoną antygenem płytkę mikrotitracyjną (100 pl) i inkubowano w czasie 1-2 godzin w temperaturze 37°C. Detekcję kompleksów IgG-IgY-HRP wykonano przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach. Fig. 10 - Wykres przedstawiający detekcję koniugatów IgY-HRP przez królicze przeciwciała IgG anty-IgY.

P r z y k ł a d 11

Bezpośrednia detekcja białka gp120 przy zastosowaniu koniugatu IgY-HRP - western blotting

W celu potwierdzenia specyficzności oraz zdolności rozpoznania białka gp120 przez otrzymane koniugaty IgY-HRP wykorzystano technikę western blotting stosując białko gp120 w ilości 100 ng/studzienkę. Detekcję białka gp120 przeprowadzono roztworem przeciwciał anty-gp120 IgY-HRP w rozcieńczeniu 1:100 przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD, Fig. 11 - Bezpośrednia detekcja białka gp120 przez przeciwciała IgY sprzężone z peroksydazą chrzanową (IgY-HRP).

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec białka gp1 20 izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci rekombinowanego białka gp120 pochodzącego z wirusa HIV-1 IIIB o sekwencji przedstawionej wzorem 1.
2. 2. Przeciwciała według zastrz. 1, znamienne tym, że mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.
3. 3. Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka gp120, znamienny tym, że immunizuje się drób białkowym antygenem w postaci rekombinowanego białka gp120 pochodzącego z wirusa HIV-1 IIIB o sekwencji przedstawionej wzorem 1, przy czym immunizację prowadzi się w trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 100-150 mg/jajko i czystością 85-95%.

   PL 223 729 B1
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że immunizuje się kury ras hodowlanych.
5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że roztwór przeciwciał IgY specyficznych wobec białka gp120 poddaje się dializie wobec buforu węglanowego, równolegle prowadzi się peroksydazę chrzanową w buforze węglanowym miesza się z chlorkiem cyjanurowym, po czym mieszaninę reakcyjną poddaje się dializie wobec buforu węglanowego, w kolejnym etapie otrzymany po dializie ro ztwór peroksydazy chrzanowej miesza się z roztworem przeciwciała IgY otrzymanym w pierwszym etapie przez 4 godziny w temperaturze 37°C, pH mieszaniny reakcyjnej doprowadza się do wartości 7,2-7,4 przy użyciu 1M roztworu kwasu cytrynowego, dodaje się równą objętość glicerolu i otrzymuje się koniugaty IgY-HRP.
6. 6. Zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka gp120 do detekcji in vitro wirusa HIV-1 IIIB.