PL224234B1 - Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu I białka PSA sposób ich wytwarzania oraz zastosowanie - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu I białka PSA są izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatów peptydów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji epitopowej przedstawionej wzorem 1 znajdujące zastosowanie w medycynie, zwłaszcza w diagnostyce nowotworu gruczołu krokowego. Wynalazek zapewnia również sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu I białka PSA charakteryzujący się tym, że immunizuje się drób białkowym antygenem w postaci koniugatów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji epitopowej przedstawionej wzorem 1, przy czym immunizację prowadzi się trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 100-160 mg/jajko i czystością 85-95%. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu I białka PSA do detekcji białka PSA oraz jego fragmentu epitopowego.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu I białka PSA znajdujące zastosowanie w medycynie, zwłaszcza w diagnostyce nowotworu gruczołu krokowego.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu I białka PSA oraz zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu I białka PSA.

Pomiar stężenia białka PSA w surowicy pacjentów jest jedną z najbardziej wrażliwych i specyficznych metod detekcji nowotworu prostaty, nawet w jego początkowych stadiach. Służy także do monitorowania przebiegu terapii pacjentów ze zdiagnozowanym nowotworem. Antygen PSA jest wydzielany zarówno przez zdrowe, jak i nowotworowe komórki gruczołu krokowego. W wyniku procesu nowotworzenia komórek dystrybucja PSA w wydzielinie gruczołu krokowego zmienia się - większa ilość PSA trafia do krwioobiegu przedostając się przez komórki nabłonkowe, równocześnie zmniejsza się ilość PSA wydzielana do moczu chorych [Bolduc S, Urinary PSA: a potential useful marker when serum PSA is between 2,5 ng/ml and 10 ng/ml. CUAJ 2007, 1(4):377-381]. Za graniczną wartość dla nowotworu prostaty przyjmuje się 4 ng/ml PSA we krwi.

Antygen specyficzny dla prostaty należy do rodziny kalikrein, proteaz serynowych o specyficzności chymotrypsynowej. Odpowiada za proteolizę semenogeliny I oraz II, co skutkuje upłynnieniem nasienia. Masa cząsteczkowa pojedynczego łańcucha peptydowego cząsteczki PSA wraz z obecnymi w jego strukturze resztami cukrowymi wynosi 28,430 kDa, masa ta w zależności od wariantu glikozylacji może ulegać zmianie. Istnieją różne miejsca glikozylacji białka PSA - Asp45 (wiązanie N-glikozydowe) oraz Ser69, Thr70, Ser71 (wiązanie O-glikozydowe) [Watt KWK, Human prostate-specific antigen: Structural and functional similarity with serine proteases. Proc. Natl. Acad. Sci. 1986,

83:3166-3170). Metoda analizy elektroforetycznej białka PSA wykazuje zawyżoną masę białka wynoszącą 34 kDa [Belanger A, Molecular Mass and Carbohydrate Structure of Prostatę Specific Antigen: Studies for Establishment of an International PSA Standard, The Prostate 1995, 27:187-197],

Epitop I został wybrany ze względu na potencjalnie wysoką immunogenność. Charakteryzuje się heliakalną strukturą drugorzędową, którą może przyjmować w roztworze. Obejmuje aminokwasy 96-114 obecne w strukturze natywnego białka PSA o sekwencji: FPHPLYDMSLLKNRFLRPG.

Ptasie przeciwciała klasy IgY stanowią nowoczesne narzędzie diagnostyczne, ze względu na korzystne właściwości odróżniające je od klasycznie stosowanych w diagnostyce ssaczych przeciwciał IgG. Immunoglobuliny Y są głównymi przeciwciałami wytwarzanymi u zwierząt jajorodnych dzięki czemu duża odległość filogenetyczna między ssakami a ptakami umożliwia otrzymanie przeciwciał specyficznych wobec konserwatywnych ssaczych antygenów. Znaczące ilości specyficznych przeciwciał transportowane są do żółtek kurzych jaj umożliwiając nieinwazyjną izolację przeciwciał w porównaniu do klasycznej metody izolacji z surowicy ssaków. Przeciwciała klasy IgY nie wykazują reaktywności z czynnikiem reumatoidalnym oraz nie aktywują ludzkiego systemu dopełniacza, dzięki czemu możliwość uzyskania fałszywie pozytywnych wyników w testach immunoenzymatycznych ulega znacznej redukcji.

Istotą wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu I białka PSA są izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatów peptydów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji epitopowej przedstawionej wzorem 1.

Korzystnie przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.

Wynalazek zapewnia również sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu I białka PSA polegający na tym, że immunizuje się drób białkowym antygenem w postaci koniugatów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji epitopowej przedstawionej wzorem 1 przy czym immunizację prowadzi się w trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 100-160 mg/jajko i czystością 85-95%.

Korzystnie immunizuje się kury ras hodowlanych.

Istotą wynalazku jest również zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu I białka PSA do detekcji białka PSA oraz jego fragmentu epitopowego in vitro.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach jego wykonania oraz wzorem 1.

PL 224 234 B1

Pr zyk ła d 1

1.1 Przygotowanie antygenu do immunizacji

Koniugaty peptydu z hemocyjaniną rozpuszcza się tuż przed wykonaniem iniekcji w mieszaninie pełnego Adjuwantu Freund'a oraz soli fizjologicznej w stosunku 1:1 (v/v).

1.2 Immunizacja kurcząt

Kury hodowlane rasy White Leghorn immunizuje się, poprzez podanie domięśniowe antygenu w ilości 100 μg/zwierzę (300 μΐ). Immunizację powtarza się po 4 i 8 tygodniach. Stosuje się 50 μg/zwierzę. Grupę kontrolną stanowią kurczęta otrzymujące iniekcję roztworu pełnego adjuwantu Freund'a w soli fizjologicznej w stosunku 1:1 (v/v).

1.3 Pobieranie i przechowywanie materiału biologicznego

Jaja kolekcjonuje się codziennie od następnego dnia po immunizacji przez 21 tygodni. Jaja przechowywane są w temperaturze 4°C do momentu izolacji przeciwciał.

1.4 Izolacja przeciwciał IgY

Jaja przemywa się 50% roztworem izopropanolu. Rozdziela się żółtko od białka, a następnie usuwa się błonę białkową otaczającą worek żółtkowy. Płynną zawartość żółtka rozcieńcza się pięciokrotnie buforem fosforanowym (pH 7,4). Do mieszaniny dodaje się glikol polietylenowy 6000 (PEG 6000) tak, aby końcowe stężenie wynosiło 3,5%. Po dokładnym wymieszaniu, całość wiruje się przez 15 min przy 11 000 rpm w 4°C. Otrzymany supernatant filtruje się przez sączek bibułowy, a następnie do przesączu dodaje się PEG 6000 do końcowego stężenia wynoszącego 12%. Po dokładnym wymieszaniu wytrącony osad odwirowuje się przy 11 000 rmp przez 15 min w 4°C. Supernatant odrzuca się, pozostały osad rozpuszcza się w 10 ml buforu fosforanowego (pH 7,4). Do mieszaniny dodaje się glikol polietylenowy do końcowego stężenia 12%. Po dokładnym wymieszaniu, całość wiruje się przy 11 000 rpm przez 15 min w 4°C. Supernatant odrzuca się, a osad zawierający przeciwciała klasy IgY rozpuszcza się w 5 ml buforu fosforanowego. Po wykonaniu analiz biochemicznych przeciwciała przechowuje się w temperaturze -20°C.

1.5 Analiza czystości i stężenia przeciwciał

Stężenie otrzymanych białek oznacza się spektrofotometrycznie (A280) . Czystość otrzymanych przeciwciał sprawdza się poprzez wykonanie analizy elektroforetycznej SDS-PAGE (4-12%) w warunkach nieredukujących (Fig. 1) - Analiza elektroforetyczna (SDS-PAGE, 4-12%) w warunkach nieredukujących otrzymanych przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu I białka PSA. Barwienie wykonano przy użyciu barwnika Coomassie R 250. Czystość otrzymanych przeciwciał zawiera się w zakresie 86-95%.

Przykła d 2

Analiza odpowiedzi immunologicznej na podany antygen w teście ELISA w czasie procesu immunizacji

W celu wykonania analizy odpowiedzi immunologicznej immunizowanych zwierząt na podany antygen zastosowano test immunoenzymatyczny fazy stałej ELISA. 96-dołkowe płytki mikrotitracyjne pokryto antygenem (50 ng/100 μΐ) rozpuszczonym w buforze węglanowym (50 mM, pH 9,6) i inkubowano przez 12 godzin w temperaturze 4°C. Wolne miejsca zablokowano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym (pH 7,4) zawierającym 0,05% Tween-20 (v/v) w temperaturze 37°C przez 60 min. Po odmyciu czynnika blokującego na płytkę mikrotitracyjną naniesiono przeciwciała specyficzne oraz kontrolne w stukrotnym rozcieńczeniu w 0,5% roztworze odtłuszczonego mleka w buforze fosforanowym (pH 7,4) z dodatkiem 0,05% Tween-20 i inkubowano przez 60 min w temperaturze 37°C.

Detekcję kompleksów epitopu 1 białka PSA ze specyficznymi przeciwciałami IgY prowadzono z wykorzystaniem króliczych przeciwciał detekcyjnych anty-IgY sprzężonych z peroksydazą chrzanową. Jako chromogenicznego substratu użyto O-fenylodiaminy. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek (Fig. 2) - Wykres przedstawiający odpowiedź w postaci produkcji specyficznych wobec epitopu I białka PSA przeciwciał IgY. Strzałkami oznaczono czas immunizacji.

Przykła d 3

Analiza specyficzności przeciwciał IgY anty-PSA epitop I w eksperymencie western blottingu w czasie immunizacji,

W celu potwierdzenia specyficzności otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec epitopu I wykonano analizę western blotting. Po rozdziale elektroforetycznym w warunkach denaturujących (SDS-PAGE, 4-12%) wobec epitopu I (Fig. 3) w obecności czynnika redukującego (100 ng białka na

PL 224 234 B1 studzienkę) przeprowadzono elektrotransfer na membranę nitrocelulozową. Blokowanie wolnych miejsc wiążących na membranie nitrocelulozowej wykonano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym (pH 7,4) z 0,05% (v/v) dodatkiem detergentu Tween-20 przez 12h w temperaturze 4°C. Kolejnym etapem była inkubacja membran w roztworach przeciwciał specyficznych wobec fragmentów epitopowych oraz kontrolnych w stosunku 1:100 do 0,5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym (pH 7,4) z 0,05% (v/v) dodatkiem detergentu Tween-20 przez 1 h w temperaturze 37°C. Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY sprzężonego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 3) - Detekcja epitopu I białka PSA przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY (western blotting).

Przykład 4

Limit detekcji epitopu I białka PSA w teście ELISA

W celu określenia limitu detekcji epitopu I białka PSA przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY wykorzystano enzymatyczny test immunosorpcyjny fazy stałej (ELISA) w sposób opisany powyżej. W tym celu 96-dołkową płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatami w różnych stężeniach w przedziale od 1000 ng/ml do 2,5 ng/ml (100 μΙ/studzienkę). Następnie inkubowano z roztworem specyficznego wobec białka BSA-PSA-epitop I przeciwciała rozcieńczonego 100-krotnie roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20. Detekcję kompleksów epitop I białka PSA - specyficzne IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 4) - Wykres przedstawiający zdolność przeciwciał IgY do wykrywania epitopu I białka PSA.

Przykład 5

Miano przeciwciał - test ELISA

Miano przeciwciał specyficznych wobec epitopu I białka PSA określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatami BSA z fragmentami peptydowymi odpowiadającymi epitopowi I w ilości 25 ng na studzienkę. Następnie inkubowano z roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20. Detekcję kompleksów koniugatów z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy, jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 5) - Wykres mianowania przeciwciał IgY do detekcji epitopu I białka PSA (25 ng).

Przykład 6

Miano przeciwciał specyficznych wobec epitopu I białka PSA i ich reaktywność z albuminą wołową

Miano oraz reaktywność z albuminą wołową (BSA) otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec epitopu I białka PSA określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę opłaszczono antygenem w ilości 50 ng/studzienkę. Przygotowano następnie serię rozcieńczeń przeciwciał IgY (specyficznych wobec epitopu I białka PSA oraz przeciwciał kontrolnych) w zakresie od 1:100 do 1:10 000 i inkubowano z opłaszczoną antygenami płytką mikrotitracyjną. Detekcję kompleksów epitopu I z przeciwciałami specyficznymi oraz kontrolnymi IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 6) - Miano przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu I białka PSA oraz ich reaktywność z albuminą wołową (BSA). Przeciwciała kontrolne wykazały brak reaktywności z epitopem I PSA oraz przeciwciała specyficzne wobec epitopu I nie wykazywały reaktywności z albuminą wołową.

PL 224 234 B1

Pr zyk ła d 7

Określenie limitu detekcji epitopu I białka PSA techniką western blott

W celu określenia limitu detekcji fragmentu epitopowego białka PSA w technice western blotting w pierwszym etapie wykonano rozdział elektroforetyczny (SDS PAGE, 4-12%) koniugatów BSA-PSA epitop I w warunkach redukujących w zakresie od 100 ng do 125 pg/studzienkę. Następnie wykonano transfer białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST membranę inkubowano z roztworem otrzymanego specyficznego wobec epitopu I przeciwciała IgY w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% mleko/PBST). Detekcję kompleksów epitopów białka PSA z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 7) - Zdolność detekcji epitopu I białka PSA przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY.

Przykład 8

Miano przeciwciał specyficznych wobec epitopu I białka PSA

W celu określenia zakresu stężeń otrzymanych przeciwciał klasy IgY w technice western blotting niezbędnego do detekcji epitopu I białka PSA wykonano analizę techniką western blotting (50 ng koniugatu BSA-PSA epitop I). Po transferze białek na membranę nitrocelulozową i blokowaniu wolnych miejsc paski membrany inkubowano z roztworami specyficznego wobec epitopu I białka PSA przeciwciała IgY rozcieńczonego w zakresie od 1:100 do 1:25000. Po wypłukaniu pasków membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 8) - Miano przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu I białka PSA (50 ng białka.

Przykład 9

Określenie zdolności przeciwciał IgY w detekcji zdenaturowanego epitopu I białka PSA

W celu określenia zdolności otrzymanych przeciwciał IgY do detekcji zdenaturowanego fragmentu epitopowego I białka PSA wykorzystano test ELISA. W tym celu studzienki płytki mikrotitracyjnej opłaszczono natywnym koniugatem albuminy z epitopem I oraz koniugatem albuminy z epitopem I po poddaniu wcześniejszej denaturacji termicznej (białko zagotowano przez 10 minut w temperaturze 100°C) w ilości 50 ng/studzienkę. Po inkubacji (12h, 4°C) i zablokowaniu wolnych miejsc (5% mleko w buforze PBS-T) inkubowano z roztworem specyficznego wobec epitopu I białka PSA przeciwciała IgY lub przeciwciała kontrolnego (1:100). Detekcję kompleksów epitopów z IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 9) - Zdolność detekcji natywnej i zdenaturowanej formy epitopu I białka PSA przez przeciwciała IgY.

Przykład 10

Awidność przeciwciał anty-PSA epitop I IgY

W celu określenia awidności otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec epitopu I białka PSA wykorzystano test ELISA. W tym celu studzienki płytki mikrotitracyjnej opłaszczono koniugatem albuminy z epitopem I w ilości 50 ng/studzienkę. Po inkubacji (12h, 4°C) i zablokowaniu wolnych miejsc (5% mleko w buforze PBS-T) inkubowano z roztworem specyficznych wobec epitopu I białka PSA przeciwciał IgY lub przeciwciał kontrolnych (1:100). Następnie część próbek inkubowano z 6M roztworem mocznika w PBS-T. Detekcję kompleksów epitopów z IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 10) - Awidność przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu I białka PSA (50 ng białka).

Przykład 11

Zdolność przeciwciał specyficznych wobec epitopu I białka PSA do rozpoznawania białka PSA

Zdolność przeciwciał specyficznych w stosunku do epitopu I białka PSA do rozpoznawania białka PSA potwierdzono testem western blotting. W tym celu przeprowadzono rozdział elektroforetyczny (SDS-PAGE, 4-12%) białka PSA oraz koniugatów epitopu I z białkiem nośnikowym w warunkach

PL 224 234 B1 redukujących. Następnie wykonano elektrotransfer białek na nitrocelulozową membranę. Zablokowano wolne miejsca wiążące przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST (pH 7,4) membranę inkubowano z roztworami przeciwciał specyficznych wobec epitopu I białka PSA w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% mleko odtłuszczone w PBST pH 7,4). Detekcję kompleksów białka PSA z przeciwciałami IgY specyficznymi wobec fragmentu epitopowego prowadzono z wykorzystaniem przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 11) - Zdolność krzyżowej detekcji białka PSA przez otrzymane przeciwciała IgY specyficzne wobec epitopu I białka PSA.

P r z yk ł a d 1 2

Detekcja białka PSA z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych wobec epitopu I białka PSA w teście ELISA

W celu określenia limitu detekcji białka PSA przez otrzymane przeciwciała IgY specyficzne wobec epitopu I białka PSA opłaszczono białkiem PSA płytkę mikrotitracyjną w ilości 100 ng na studzienkę. Następnie inkubowano z roztworem przeciwciał specyficznych wobec epitopu I oraz przeciwciał kontrolnych rozcieńczonych 500-krotnie roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20. Detekcję kompleksów PSA-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach (Fig. 12) - Detekcja białka PSA przez przeciwciała specyficzne wobec epitopu I białka PSA.

P r z yk ł a d 1 3

Określenie limitu detekcji białka PSA z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych wobec epitopu I białka PSA w teście ELISA

W celu określenia limitu detekcji białka PSA przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY płytkę mikrotitracyjną opłaszczono białkiem PSA w różnych stężeniach w przedziale od 2000 ng/ml do 2,5 ng/ml (100 μΙ/studzienkę). Następnie inkubowano z roztworem specyficznego wobec białka BSA-PSA-epitop I przeciwciała rozcieńczonego 100-krotnie roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20. Detekcję kompleksów białka PSA i przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu I przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 13) - Wykres przedstawiający zdolność przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu I białka PSA do wykrywania białka PSA.

P r z yk ł a d 1 4

Mianowanie przeciwciał specyficznych wobec epitopu I białka PSA do detekcji białka PSA

Miano przeciwciał specyficznych wobec epitopu I białka PSA do detekcji białka PSA określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę mikrotitracyjną opłaszczono białkiem PSA w ilości 50 ng na studzienkę. Następnie inkubowano z roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20. Detekcję kompleksów białka PSA z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 14)

- Wykres mianowania przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu I do detekcji białka PSA (50 ng).

P r z yk ł a d 1 5

Określenie limitu detekcji białka PSA z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych wobec epitopu I białka PSA techniką western blot

W celu określenia limitu detekcji białka PSA w technice western blotting w pierwszym etapie wykonano rozdział elektroforetyczny (SDS PAGE, 4-12%) białka PSA w warunkach redukujących w zakresie od 200 ng do 125 pg/studzienkę. Następnie wykonano transfer białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST membranę inkubowano z roztworem otrzymanego specyficznego wobec epitopu I przeciwciała IgY w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% mleko/PBST). Detekcję kompleksów białka PSA

PL 224 234 B1 z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 15) - Zdolność krzyżowej detekcji białka PSA przez otrzymane przeciwciała IgY specyficzne wobec epitopu I białka PSA.

P r z yk ł a d 1 6

Limit detekcji epitopu I białka PSA z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych wobec białka PSA w teście ELISA

W celu określenia limitu detekcji koniugatów BSA z epitopem I białka PSA przez przeciwciała IgY specyficzne wobec białka PSA 96-dołkową płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatami w różnych stężeniach w przedziale od 1000 ng/ml do 50 ng/ml ( 100 μΐ/studzienkę). Następnie inkubowano z roztworem specyficznego wobec białka BSA-PSA-epitop I przeciwciała rozcieńczonego 100-krotnie roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20. Detekcję kompleksów BSA-PSA-epitop I - IgY anty-PSA przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 16) - Wykres przedstawiający zdolność przeciwciał IgY specyficznych wobec białka PSA do wykrywania epitopu I białka PSA.

P r z yk ł a d 1 7

Mianowanie przeciwciał specyficznych wobec białka PSA do detekcji epitopu I białka PSA w teście ELISA

Miano przeciwciał specyficznych wobec białka PSA do detekcji epitopu I białka PSA określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatem epitopu I białka PSA w ilości 50 ng na studzienkę. Następnie inkubowano z roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20. Detekcję kompleksów białka PSA z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 17) - Wykres mianowania przeciwciał IgY specyficznych wobec białka PSA do detekcji epitopu I białka PSA (50ng).

P r z yk ł a d 1 8

Określenie limitu detekcji epitopu I białka PSA z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych wobec białka PSA techniką western blott

W celu określenia limitu detekcji epitopu I białka PSA w technice western blotting w pierwszym etapie wykonano rozdział elektroforetyczny (SDS PAGE, 4-12%) epitopu I białka PSA w warunkach redukujących w zakresie od 200 ng do 125 pg/studzienkę. Następnie wykonano transfer białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PB ST membranę inkubowano z roztworem otrzymanego specyficznego wobec białka PSA przeciwciała IgY w rozcieńczeniu 1:100 (0,5%mleko/PBST). Detekcję kompleksów epitopu I białka PSA z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 18) - Zdolność krzyżowej detekcji epitopu pierwszego białka PSA przez otrzymane przeciwciała IgY specyficzne wobec białka PSA.

Claims (5)

1. Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu I białka PSA izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatów peptydów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji epitopowej przedstawionej wzorem 1.

2. Przeciwciała według zastrz. 1, znamienne tym, że mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.

PL 224 234 B1

3. Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu I białka PSA, znamienny tym, że immunizuje się drób białkowym antygenem w postaci koniugatów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji epitopowej przedstawionej wzorem 1, przy czym immunizację prowadzi się w trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 100-160 mg/jajko i czystością 85-95%.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że immunizuje się kury ras hodowlanych.

5. Zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu I białka PSA do detekcji białka PSA oraz jego fragmentu epitopowego in vitro.