PL224219B1 - Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka PSA, sposób ich wytwarzania oraz zastosowanie - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy specyficzne wobec epitopu II białka PSA. Są one izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatów peptydów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji epitopowej przedstawionej wzorem 1 znajdujące zastosowanie w medycynie, zwłaszcza w diagnostyce nowotworu gruczołu krokowego. Wynalazek ujawnia także sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu II białka PSA charakteryzujący się tym, że immunizuje się drób białkowym antygenem w postaci koniugatów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji epitopowej przedstawionej wzorem 1. Immunizację prowadzi się w trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 100-160 mg/jajko i czystością 85-95%. Wynalazek dotyczy również zastosowania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu II białka PSA do wytwarzania testów diagnostycznych do detekcji białka PSA oraz jego fragmentu epitopowego.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu II białka PSA znajdujących zastosowanie w medycynie, zwłaszcza w diagnostyce nowotworu gruczołu krokowego. Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu II białka PSA oraz zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu II białka PSA.

Ewaluacja stężenia białek markerowych, na przykład CEA, AFP pozwala na diagnostykę chorób nowotworowych. Określenie stężenia białka PSA w surowicy stanowi wrażliwą i wysoce specyficzną metodę diagnostyki nowotworu prostaty. Białko PSA produkowane jest przez komórki nabłonkowe gruczołu krokowego. Dystrybucja białka PSA w komórkach zmienionych nowotworowo ulega reorganizacji poprzez zwiększenie przepuszczalności ściany komórkowej i większe ilości białka transportowane są do krwi. Za wartość graniczną stężenia białka PSA we krwi przyjęto stężenie 4 ng/ml. Przekroczenie tej wartości jest przesłanką do wykonania biopsji. Powyżej wartości 10 ng/ml specyficzność testów diagnostycznych znacznie wzrasta [Roddam A, Use of Prostate-Specific Antigen (PSA) Isoforms for the Detection of Prostate Cancer in Men with a PSA level of 2-10 ng/ml: Systematic Review and Meta-Analysis. Eur Urol 2005, 48:386-399].

Antygen specyficzny dla prostaty wykazuje aktywność proteazy serynowej i należy do rodziny kallikrein. W organizmie mężczyzny aktywność proteolityczna PSA odpowiedzialna jest za upłynnianie nasienia. Aktywność białka PSA może zostać zahamowana przez dwa białka inhibitorowe - α-1-antychymotrypsynę oraz α-2-makroglobuIinę [Becker C, Individual prostate-specific antigen (PSA) forms as prostate tumor markers. CCA 1997, 257(1):117-132].

Przeciwciała IgY mogą znaleźć zastosowanie terapeutyczne i diagnostyczne [Spiliner E, Avian IgY antibodies and their recombinant equivalents in research, diagnostics and theraphy. Biologicals 2012, 40:313-322].

Izolacja ptasich przeciwciał klasy IgY nie wymaga skrwawiania zwierząt w przeciwieństwie do izolacji ssaczych przeciwciał IgG. Dodatkowo, izolacja przeciwciał z żółtek kurzych jaj umożliwia otrzymanie większej ilości przeciwciał w przeliczeniu na zwierzę. Istnieje znaczący dystans ewolucyjny pomiędzy antygenami ludzkimi używanymi do immunizacji a immunizowanym zwierzęciem, dlatego odpowiedź organizmu kurczęcia w postaci produkcji specyficznych przeciwciał jest wzmocniona. Ptasie przeciwciała IgY strukturalnie różnią się od ssaczych przeciwciał IgG. IgY charakteryzują się większą masą cząsteczkową, ponieważ posiadają dodatkową domenę w regionie FC łańcucha ciężkiego. Przeciwciała IgY nie posiadają regionu zawiasowego (ang. hinge region) przez co charakteryzują się mniejszą giętkością w porównaniu z przeciwciałami IgG. Nie obserwuje się reaktywności krzyżowej przeciwciał IgY wobec ssaczych IgG oraz ludzkiego systemu dopełniacza oraz wobec czynnika reumatoidalnego.

Istotą wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu II białka PSA są izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatów peptydów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji epitopowej przedstawionej wzorem 1.

Korzystnie przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.

Wynalazek zapewnia także sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu II białka PSA charakteryzujący się tym, że immunizuje się drób białkowym antygenem w postaci koniugatów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji epitopowej przedstawionej wzorem 1, przy czym immunizację prowadzi się w trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 100-160 mg/jajko i czystością 85-95%.

Korzystnie immunizuje się kury ras hodowlanych.

Istotą wynalazku jest również zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu II białka PSA do wytwarzania testów diagnostycznych do detekcji białka PSA oraz jego fragmentu epitopowego in vitro.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach jego wykonania oraz wzorem 1.

P r z y k ł a d 1.

1.1 Przygotowanie antygenu do immunizacji

Koniugaty peptydu z hemocyjaniną rozpuszcza się tuż przed wykonaniem iniekcji w mieszaninie pełnego Adiuwantu Freund'a oraz soli fizjologicznej w stosunku 1:1 (v/v).

PL 224 219 B1

1.2 Immunizacja kurcząt

Kury hodowlane rasy White Leghorn immunizuje się, poprzez podanie domięśniowe antygenu w ilości 100 gg/zwierzę (300 gl). Immunizację powtarza się po 4 i 8 tygodniach. Stosuje się 50 gg/zwierzę. Grupę kontrolną stanowią kurczęta otrzymujące iniekcję roztworu pełnego adiuwantu Freund'a w soli fizjologicznej w stosunku 1:1 (v/v).

1.3 Pobieranie i przechowywanie materiału biologicznego

Jaja kolekcjonuje się codziennie od następnego dnia po immunizacji przez 21 tygodni. Jaja przechowywane są w temperaturze 4°C do momentu izolacji przeciwciał.

1.4 Izolacja przeciwciał IgY

Jaja przemywa się 50% roztworem izopropanolu. Rozdziela się żółtko od białka, a następnie usuwa się błonę białkową otaczającą worek żółtkowy. Płynną zawartość żółtka rozcieńcza się pięciokrotnie buforem fosforanowym (pH 7,4). Do mieszaniny dodaje się glikol polietylenowy 6000 (PEG 6000) tak, aby końcowe stężenie wynosiło 3,5%. Po dokładnym wymieszaniu, całość wiruje się przez 15 min przy 11000 rpm w 4°C. Otrzymany supernatant filtruje się przez sączek bibułowy, a następnie do przesączu dodaje się PEG 6000 do końcowego stężenia wynoszącego 12%. Po dokładnym wymieszaniu wytrącony osad odwirowuje się przy 11 000 rmp przez 15 min w 4°C. Supernatant odrzuca się, pozostały osad rozpuszcza się w 10 ml buforu fosforanowego (pH 7,4). Do mieszaniny dodaje się glikol polietylenowy do końcowego stężenia 12%. Po dokładnym wymieszaniu, całość wiruje się przy 11 000 rpm przez 15 min w 4°C. Supernatant odrzuca się, a osad zawierający przeciwciała klasy IgY rozpuszcza się w 5 ml buforu fosforanowego. Po wykonaniu analiz biochemicznych przeciwciała przechowuje się w temperaturze -20°C.

1.1 Analiza czystości i stężenia przeciwciał

Stężenie otrzymanych białek oznacza się spektrofotometrycznie (A₂₈₀). Czystość otrzymanych przeciwciał sprawdza się poprzez wykonanie analizy elektroforetycznej SDS-PAGE (4-12%) w warunkach nieredukujących. Czystość otrzymanych przeciwciał zawiera się w zakresie 86-95%. (Fig. 1) - Analiza elektroforet (SDS-PAGE, 4-12%) w warunkach nieredukujących otrzymanych przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu II białka PSA. Barwienie wykonano przy użyciu barwnika Coomassie R 250.

P r z y k ł a d 2.

Analiza odpowiedzi immunologicznej na podany antygen w teście ELISA w czasie procesu immunizacji.

W celu wykonania analizy odpowiedzi immunologicznej immunizowanych zwierząt na podany antygen zastosowano test immunoenzymatyczny fazy stałej ELISA, 96-cio dołkowe płytki mikrotitracyjne pokryto antygenem (50 ng/100 gl) rozpuszczonym w buforze węglanowym (50 mM, pH 9,6) i inkubowano przez 12 godzin w temperaturze 4°C. Wolne miejsca zablokowano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym (pH 7,4) zawierającym 0,05% Tween-20 (v/v) w temperaturze 37°C przez 60 min. Po odmyciu czynnika blokującego na płytkę mikrotitracyjną naniesiono przeciwciała specyficzne oraz kontrolne w stukrotnym rozcieńczeniu w 0,5% roztworze odtłuszczonego mleka w buforze fosforanowym (pH 7,4) z dodatkiem 0,05% Tween-20 i inkubowano przez 60 min w temperaturze 37°C. Detekcję kompleksów epitopu II białka PSA ze specyficznymi przeciwciałami IgY prowadzono z wykorzystaniem króliczych przeciwciał detekcyjnych anty-IgY sprzężonych z peroksydazą chrzanową. Jako chromogenicznego substratu użyto O-fenylodiaminy. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek (Fig. 2) - Wykres przedstawiający odpowiedź w postaci produkcji specyficznych wobec epitopu II białka PSA przeciwciał IgY. Strzałkami oznaczono czas immunizacji.

P r z y k ł a d 3.

Analiza specyficzności przeciwciał IgY anty-PSA epitop II w teście western blottingu w czasie immunizacji.

W celu potwierdzenia specyficzności otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec epitopu II wykonano analizę western blotting. Po rozdziale elektroforetycznym w warunkach denaturujących (SDS-PAGE, 4%-12%) wobec epitopu II (Rys. 3) w obecności czynnika redukującego (100 ng białka na studzienkę) przeprowadzono elektrotransfer na membranę nitrocelulozową. Blokowanie wolnych miejsc wiążących na membranie nitrocelulozowej wykonano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym (pH 7,4) z 0,05% (v/v) dodatkiem detergentu Tween-20 przez 12 h w temperaturze 4°C. Kolejnym etapem była inkubacja membran w roztworach przeciwciał specyficznych wobec fragmentów epitopowych oraz kontrolnych w stosunku 1:100 do 0,5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym (pH 7,4) z 0,05% (v/v) dodatkiem detergentu Tween-20

PL 224 219 B1 przez 1 h w temperaturze 37°C. Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY sprzężonego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 3) - Detekcja epitopu I białka PSA przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY (western blotting).

P r z y k ł a d 4.

Limit detekcji epitopu II białka PSA w teście ELISA.

W celu określenia limitu detekcji koniugatów BSA z epitopem II białka PSA przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY wykorzystano enzymatyczny test immunosorpcyjny fazy stałej (ELISA) w sposób opisany powyżej. W tym celu 96-cio dołkową płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatami w różnych stężeniach w przedziale od 1000 ng/ml do 15 ng/ml (100 μl/studzienkę). Następnie inkubowano z roztworem specyficznego wobec epitopu II białka PSA przeciwciała rozcieńczonego 500-krotnie roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20. Detekcję kompleksów epitop II - specyficzne IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 4) - Wykres przedstawiający zdolność przeciwciał IgY do wykrywania epitopu II białka PSA.

P r z y k ł a d 5.

Miano przeciwciał - test ELISA.

Miano przeciwciał specyficznych wobec epitopu II białka PSA określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatami BSA z fragmentami peptydowymi odpowiadającymi epitopowi II w ilości 25 ng na studzienkę. Następnie inkubowano z roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20. Detekcję kompleksów koniugatów z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 5) - Wykres mianowania przeciwciał IgY do detekcji epitopu II białka PSA (25 ng).

P r z y k ł a d 6.

Miano przeciwciał specyficznych wobec epitopu II białka PSA i ich reaktywność z albuminą wołową.

Miano oraz reaktywność z albuminą wołową (BSA) otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec epitopu II białka PSA określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę opłaszczono antygenem w ilości 50 ng/studzienkę. Przygotowano następnie serię rozcieńczeń przeciwciał IgY (specyficznych wobec epitopu II białka PSA oraz przeciwciał kontrolnych) w zakresie od 1:100 do 1:10 000 i inkubowano z opłaszczoną antygenami płytką mikrotitracyjną. Detekcję kompleksów epitopu II oraz specyficznych i kontrolnych przeciwciał IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 6) - Miano przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu II białka PSA oraz ich reaktywność z albuminą wołową (BSA). Przeciwciała kontrolne wykazały brak reaktywności z epitopem II białka PSA oraz przeciwciała specyficzne wobec epitopu II nie wykazywały reaktywności z albuminą wołową.

P r z y k ł a d 7.

Określenie limitu detekcji epitopu II białka PSA techniką western blott

W celu określenia limitu detekcji fragmentu epitopowego białka PSA w technice western blotting w pierwszym etapie wykonano rozdział elektroforetyczny (SDS PAGE, 4%-12%) koniugatów BSA-PSA epitop II w warunkach redukujących w zakresie od 100 ng do 125 pg/studzienkę. Następnie wykonano transfer białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST membranę inkubowano z roztworem otrzymanego specyficznego wobec epitopu II przeciwciała IgY w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% mleko/PBST). Detekcję kompleksów epitopów białka PSA z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-lgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaPL 224 219 B1 niu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 7) - Zdolność detekcji epitopu II białka PSA przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY.

P r z y k ł a d 8.

Miano przeciwciał specyficznych wobec epitopu II białka PSA.

W celu określenia zakresu stężeń otrzymanych przeciwciał klasy IgY w technice western blotting niezbędnego do detekcji epitopu II białka PSA wykonano analizę techniką western blotting (50 ng koniugatu BSA-PSA epitop II). Po transferze białek na membranę nitrocelulozową i blokowaniu wolnych miejsc paski membrany inkubowano z roztworami specyficznego wobec epitopu II białka PSA przeciwciała IgY rozcieńczonego w zakresie od 1:100 do 1:25000. Po wypłukaniu pasków membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 8) - Miano przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu II białka PSA (50 ng białka).

P r z y k ł a d 9.

Określenie zdolności przeciwciał IgY w detekcji zdenaturowanego epitopu II białka PSA.

W celu określenia zdolności otrzymanych przeciwciał IgY do detekcji zdenaturowanego fragmentu epitopowego II białka PSA wykorzystano test ELISA. W tym celu studzienki płytki mikrotitracyjnej opłaszczono natywnym koniugatem albuminy z epitopem I oraz koniugatem albuminy z epitopem II po poddaniu wcześniejszej denaturacji termicznej (białko zagotowano przez 10 minut w temperaturze 100°C) w ilości 50 ng/studzienkę. Po inkubacji (12 h, 4°C) i zablokowaniu wolnych miejsc (5% mleko w buforze PBS-T) inkubowano z roztworem specyficznego wobec epitopu II białka PSA przeciwciała IgY lub przeciwciała kontrolnego (1:100). Detekcję kompleksów epitopów z IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 9) - Zdolność detekcji natywnej i zdenaturowanej formy epitopu II białka PSA przez przeciwciała IgY.

P r z y k ł a d 10.

Awidność przeciwciał anty-PSA epitop II IgY

W celu określenia awidności otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec epitopu II białka PSA wykorzystano test ELISA. W tym celu studzienki płytki mikrotitracyjnej opłaszczono koniugatem albuminy z epitopem II w ilości 50 ng/studzienkę. Po inkubacji (12 h, 4°C) i zablokowaniu wolnych miejsc (5% mleko w buforze PBS-T) inkubowano z roztworem specyficznych wobec epitopu II białka PSA przeciwciał IgY lub przeciwciał kontrolnych (1:100). Następnie część próbek inkubowano 10 min z 6 M roztworem mocznika w PBS-T. Detekcję kompleksów epitopów z IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (Fig. 10) - Awidność przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu II białka PSA (50 ng białka).

P r z y k ł a d 11.

Zdolność przeciwciał specyficznych wobec epitopu II białka PSA do rozpoznawania białka PSA

Zdolność przeciwciał specyficznych w stosunku do epitopu II białka PSA do rozpoznawania białka PSA potwierdzono testem western blotting. W tym celu przeprowadzono rozdział elektroforetyczny (SDS-PAGE, 4%-12%) białka PSA oraz koniugatów epitopu II z białkiem nośnikowym w warunkach redukujących. Następnie wykonano elektrotransfer białek na nitrocelulozową membranę. Zablokowano wolne miejsca wiążące przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST (pH 7,4) membranę inkubowano z roztworami przeciwciał specyficznych wobec epitopu II białka PSA w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% mleko odtłuszczone w PBST pH 7,4). Detekcję kompleksów białka PSA z przeciwciałami IgY specyficznymi wobec fragmentów epitopowych prowadzono z wykorzystaniem przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 11) - Zdolność krzyżowej detekcji białka PSA przez otrzymane przeciwciała IgY specyficzne wobec epitopu II białka PSA.

PL 224 219 B1

P r z y k ł a d 12.

Określenie limitu detekcji białka PSA z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych wobec epitopu II białka PSA techniką western blott

W celu określenia limitu detekcji białka PSA w technice western blotting w pierwszym etapie wykonano rozdział elektroforetyczny (SDS PAGE, 4%-12) białka PSA w warunkach redukujących w zakresie od 200 ng do 125 pg/studzienkę. Następnie wykonano transfer białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST membranę inkubowano z roztworem otrzymanego specyficznego wobec epitopu II przeciwciała IgY w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% mleko/PBST). Detekcję kompleksów białka PSA z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (Fig. 12) - Zdolność krzyżowej detekcji białka PSA przez otrzymane przeciwciała IgY specyficzne wobec epitopu II białka PSA.

Claims (5)

1. Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu II białka PSA izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatów peptydów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji epitopowej przedstawionej wzorem 1.

2. Przeciwciała według zastrz. 1, znamienne tym, że mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.

3. Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu II białka PSA, znamienny tym, że immunizuje się drób białkowym antygenem w postaci koniugatów z białkiem nośnikowym hemocyjaniną o sekwencji epitopowej przedstawionej wzorem 1, przy czym immunizację prowadzi się trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 100-160 mg/jajko i czystością 85-95%.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że immunizuje się kury ras hodowlanych.

5. Zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec epitopu II białka PSA do wytwarzania testów diagnostycznych do detekcji białka PSA oraz jego fragmentu epitopowego in vitro.