PL224388B1

PL224388B1 - Test diagnostyczny do detekcji białka Efb(127-140)

Info

Publication number: PL224388B1
Application number: PL403331A
Authority: PL
Inventors: Marcin Sieńczyk; Agnieszka Łupicka; Renata Grzywa; Maciej Walczak; Kamila Bobrek; Marcin Skoreński; Daria Nowak; Tadeusz Stefaniak; Andrzej Gaweł; Stephane Boivin
Original assignee: Politechnika Wroclawska
Priority date: 2013-03-27
Filing date: 2013-03-27
Publication date: 2016-12-30
Also published as: PL403331A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny do detekcji białka Efb(127-140) znajdujący zastosowanie w wykrywaniu białka Efb wydzielanego przez bakterie Staphylococcus aureus. Test diagnostyczny do detekcji białka Efb(127-140) zawiera jako czynnik detekcyjny przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka Efb(127-140) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatu fragmentu epitopowego białka E-Efb(127-140) o sekwencji CVSAHRK(ValP(OPh)2)AQK(ValP(OPh)2)AVNLV przedstawionej wzorem 1 z białkiem nośnikowym - hemocyjnaniną.

Description

Przedmiotem wynalazku test diagnostyczny do detekcji białka Efb(127-140) znajdujący zastosowanie w wykrywaniu białka Efb wydzielanego przez bakterie Staphylococcus aureus.

Stosowana obecnie diagnostyka infekcji bakterią Staphylococcus aureus w większości opiera się na technikach mikrobiologicznych z zastosowaniem podłoży różnicujących bądź na testach koag ulacyjnych wykorzystujących obecność produkowanej przez szczepy Staphylococcus aureus koagulazy. Niestety, często pobranie materiału do analizy jest utrudnione, bądź całkowicie niemożliwe (przykładowo ropnie narządów wewnętrznych). Ponadto u osób po antybiotykoterapii odnotowuje się zafałszowane wyniki [Colque-Navarro P, Soderquist B, Holmberg H, Blomqvist L, Olcen P, Mollby R. J. Med. Microbiol, 47, 1998, 217-25]. Dużo czulsze i dokładniejsze serologiczne metody diagnostyczne wykorzystują zdolność specyficznych przeciwciał do rozpoznawania określonych elementów strukturalnych komórek Staphylococcus aureus (białka powierzchniowe, enterotoksyny). W tym celu do pozyskania specyficznych przeciwciał wykorzystuje się całe komórki bakterii, którymi następnie immunizuje się zwierzęta. Technikami, w których stosuje się uzyskane specyficzne przeciwciała do detekcji S. aureus we krwi (bądź w produktach żywnościowych) są najczęściej testy ELISA bądź western blotting [Joost I, Jacob S, Utermohlen O, Schubert U, Patti JM, Ong MF, Gross J, Justinger C, Renno JH, Preissner K.T, Bischoff M, Hermann M., FEMS Immunol Med Microbiol. 2011,62(1):23-31; Kumar A, Ray P, Kanwar M, Sharma M, Varma S., Int J Med Sci. 2005, 2(4): 129-36; Fey H, Pfister H, Ruegg O., J Clin Microbiol. 1984, 19(1):34-8]. Inne metody diagnostyczne oparte są na wykrywaniu określonych genów specyficznych dla gatunku Staphylococcus aureus [Hussain M, von Eiff C, Sinha B, Joost I, Herrmann M, Peters G, Becker K., J Clin Microbiol. 2008, 46(2):470-6].

Białkiem stanowiącym obiecujący cel diagnostyczny jest zewnątrzkomórkowe białko Efb (ang. extracellular fibrinogen-binding protein) konstytutywnie produkowane przez bakterie Staphylococcus aureus. Białko Efb należy do grupy czynników wirulencji oraz wykazuje zdolność wiązania do składników ludzkiego systemu dopełniacza (białka C3b) oraz do fibrynogenu [Lee L.Y.L., Liang X., Hook, Brown E.L, Journal of Biological Chemistry, 2004, 279, 50710]. Wiązanie białka Efb do fibrynogenu ułatwia kolonizację bakterii w tkankach. Ponadto białko Efb poprzez wiązanie z białkiem C3 zdolne jest do blokowania funkcji ludzkiego systemu dopełniacza [Haviland D.L., Wetsel R.A., Encyclopedia of Molecular Biology, Wiley, 1999; Lambris J.D., Immunol Taday, 1988, 9, 387]. Białko Efb ma wysoki potencjał, z punktu widzenia diagnostyki infekcji bakterii S. aureus, w której kluczowym elementem może być detekcja konstytutywnego, gatunkowo specyficznego białka Elb w płynach ustrojowych organizmu gospodarza, co jest przedmiotem niniejszego wynalazku.

Epitop białka Efb(127-140) został wybrany ze względu na swą potencjalnie wysoką immunogenność. Epitop Efb(127-140) charakteryzuje się α-helikalną strukturą drugorzędową. Obejmuje aminokwasy od reszty 127 do 140, zgodnie z numeracją dla sekwencji gi: 21282769 zdeponowanej w bazie GenBank, o sekwencji CVSAHRK.AQKAVNLV. W celu zwiększenia immunogenności fragmentu Efb(127-140) wprowadzono do jego struktury pochodne kwasu aminofosfonowego - fosfonowego analogu waliny i uzyskano pochodną przedstawioną wzorem 1, w której E oznacza elektrofilowy, fosfonowy analog waliny.

Przeciwciała IgY są ewolucyjnym przodkiem ssaczych przeciwciał klas IgG oraz IgE. Z uwagi na pełnione funkcje, przeciwciała IgY najbardziej zbliżone są do przeciwciał IgG ssaków, natomiast strukturalnie przypominają przeciwciała klasy IgE ssaków. Przeciwciała IgY nie wykazują interakcji z czynnikiem reumatoidalnym, białkiem A oraz białkiem G, które prowadzą często do otrzymania fałszywie pozytywnych wyników w testach diagnostycznych opartych na ssaczych immunoglobulinach. Przeci wciała IgY są transportowane w dużych ilościach (100-160 mg) do żółtka jaja, gdzie funkcjonują jako swoisty mechanizm pasywnej ochrony młodych piskląt przed patogenami. Stwarza to możliwość ni einwazyjnej izolacji przeciwciał w dużych ilościach bez potrzeby skrwawiania zwierząt.

Test diagnostyczny na bazie immunoglobulin Y specyficznych wobec epitopu białka Efb (127-140) zawierającego wprowadzony elektrofilowy analog waliny umożliwiających detekcję antygenu specyficznego dla bakterii Staphylococcus aureus nie został dotychczas opisany w literaturze naukowej i patentowej, jak również nie jest dostępny handlowo. W literaturze naukowej opisane jest w ykorzystanie ssaczych przeciwciał IgG specyficznych wobec białka Efb, najczęściej w postaci antys urowicy, pochodzących z organizmów takich jak mysz, królik czy owca [Shannon O, Uekotter A, Flock JI., Scand J Immunol., 2006, 63, 184; Scarpa M, Piccinini R, Brun P, Grillo A, Palu G, Mengoli C,

PL 224 388 B1

Dapra V, Castagliuolo I, Zecconi A., J Dairy Res., 2010, 77, 159; Palma M, Wade D, Flock M, Flock JE, J Biol Chem., 1998, 273, 13177].

Istotą wynalazku jest test diagnostyczny do detekcji białka Efb(127-140), który zawiera jako czynnik detekcyjny przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka Efb(127-140) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatu fragmentu epitopowego białka E-Efb(127-140) o sekwencji CVSAHRK(Val^p(OPh)2)AQK(Val^p(OPh)2)AVNLV przedstawionej wzorem 1 z białkiem nośnikowym - hemocyjaniną.

Korzystnie przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.

Po etapie izolacji, przeciwciała poddaje się analizie biochemicznej, której celem jest określenie czystości przeciwciał, stężenia, awidności, mianowanie przeciwciał oraz określenie limitu detekcji epitopu białka Efb(127-140). W trakcie procesu immunizacji analizę biochemiczną przeciwciał przeprowadzono dla każdego zebranego jaja w trakcie 20 tygodni. Odpowiedź organizmu kurcząt w postaci produkcji specyficznych przeciwciał pojawiła się w 5 tygodniu od momentu rozpoczęcia immunizacji.

Sposób otrzymywania przeciwciał cechuje duża ilości izolowanych przeciwciał oraz niska inwazyjność procesu izolacji, ponieważ nie wymaga skrwawiania zwierząt w określonych odstępach czasu w celu izolacji przeciwciał.

Test diagnostyczny według wynalazku znajduje zastosowanie w diagnostyce infekcji wywołanych przez bakterie Staphylococcus aureus, które prowadzić mogą do poważnych stanów chorobowych, jak zakażenia skóry i tkanek podskórnych (np. czyraki, zakażenia ran pooperacyjnych), zakażenia układowe (np. zapalenia tchawicy, mięśnia sercowego, żył) jak również zakażenia związane z produkowanymi przez bakterię toksynami np. zespół wstrząsu toksycznego. Zastosowanie przeci wciał IgY specyficznych wobec epitopu białka Efb(127-140) w teście diagnostycznym polega na ich zdolności do specyficznego wiązania z antygenem, którym może być pełne białko Efb lub epitop białka Efb( 127-140). Dzięki związaniu przeciwciał IgY do antygenu możliwa jest pośrednia detekcja białka Efb przy użyciu dowolnych handlowo dostępnych drugorzędowych przeciwciał anty-IgY (np. królicze przeciwciała IgG anty-IgY) zawierających dowolny znacznik (peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna, biotyna, fluoresceina).

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach oraz na rysunku na którym:

Fig. 1 przedstawia analizę elektroforetyczną (SDS-PAGE, 4-12%) w warunkach nieredukujących otrzymanych przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu białka Efb(127-140). Barwienie wykonano przy użyciu barwnika Coomassie R 250.

Fig. 2 przedstawia wykres przedstawiający odpowiedź w postaci produkcji przeciwciał IgY specyficznych wobec Efb( 127-140). Strzałkami oznaczono czas immunizacji. Abs* - przedstawione wartości absorbancji po odjęciu wartości absorbancji otrzymanych dla kontrolnych przeciwciał IgY.

Fig. 3 przedstawia detekcję epitopu białka Efb(127-140) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY (western blotting).

Fig. 4 przedstawia wykres przedstawiający zdolność przeciwciał IgY do wykrywania epitopu białka Efb(127-140).

Fig. 5 przedstawia wykres mianowania przeciwciał IgY do detekcji epitopu białka Efb(127-140).

Fig. 6 przedstawia zdolność detekcji epitopu białka Efb (127-140) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY.

Fig. 7 przedstawia miano przeciwciał IgY specyficznych wobec epitopu białka Efb (127-140).

Fig. 8 przedstawia zdolność krzyżowej detekcji białka Efb przez otrzymane przeciwciała IgY specyficzne wobec epitopu białka Efb(127-140).

Fig. 9 przedstawia detekcję białka Efb przez przeciwciała specyficzne wobec epitopu białka Efb (127-140).

P r z y k ł a d 1

1.1 Synteza peptydu.

Peptyd o sekwencji CVSAHRK(Val^p(OPh)2)AQK(Val^p(OPh)2)AVNLV otrzymano wykorzystując technikę syntezy na podłożu stałym z użyciem żywicy H-L-Val-2-Cl-Trt (0,61 mmol/g). Etapy sprzęgania kolejnych aminokwasów prowadzono z wykorzystaniem strategii Fmoc/Boc. Sprzęganie aminokwasów prowadzono z użyciem HBTU jako czynnika sprzęgającego w obecności DIPEA. Fosfonowy analog aminokwasu otrzymano według sposobu opisanego w literaturze [Oleksyszyn J., Subotkowska L., Mastalerz P., Synthesis, 1979, 985-986]. Sprzęganie Val^p(OPh)₂ do peptydu przeprowadzono po jej uprzednim funkcjonalizowaniu resztą kwasu korkowego z terminalną grupą N-hydroksybursztynimidową. Do usunięcia grupy ochronnej Fmoc stosowano 20% roztwór piperydyny w DMF. W celu odłączenia pepty4

PL 224 388 B1 du od żywicy zastosowano mieszaninę TFA/TIPS/EDT/fenol w stosunku 92,5:2,5:2,5:2,5 Otrzymany peptyd oczyszczono przy użyciu techniki HPLC, a jego masę cząsteczkową potwierdzono przy pomocy wysokorozdzielczej spektrometrii mas.

1.2 Synteza koniugatu E-Efb( 127-140)-KLH

Do roztworu białka KLH w 10 mM buforze fosforanowym (PB, pH 7,0) powoli dodano roztwór GMBS w DMSO. Reakcję prowadzono 2h w temperaturze pokojowej delikatnie mieszając, po czym zaktywowane białko KLH-MB oczyszczono z wykorzystaniem chromatografii żelowej. Frakcje zawierające białko połączono, a następnie rozcieńczono acetonitrylem, aż jego końcowe stężenie wyniosło 25%. Do roztworu KLH-MB dodano powoli roztwór peptydu CVSAHRK(Val^p(OPh)2)AQK(Val^p(OPh)2)AVNLV w 50% acetonitrylu. Wartość pH mieszaniny reakcyjnej utrzymywano w zakresie 7,2-7,4 przy pomocy 1M wodnego roztworu NaOH. Postęp reakcji monitorowano przy użyciu chromatografii HPLC.

1.3 Synteza koniugatu Efb(127-140)-BSA

Do roztworu albuminy wołowej (BSA) w buforze PB powoli dodano roztwór GMBS w DMSO. Reakcję prowadzono 30 min w temperaturze pokojowej delikatnie mieszając, po czym zaktywowane białko BSA-MB oczyszczono z wykorzystaniem chromatografii żelowej. Frakcje zawierające białko połączono, a następnie rozcieńczono acetonitrylem, aż jego końcowe stężenie wyniosło 25%. Do ro ztworu BSA-MB dodano powoli roztwór peptydu CVSAHRKAQKAVNLV w 50% acetonitrylu. Wartość pH mieszaniny utrzymywano w granicach 7,0-7,4 przy pomocy 1M wodnego roztworu NaOH. Postęp reakcji monitorowano przy użyciu chromatografii HPLC.

P r z y k ł a d 2

2.1 Przygotowanie antygenu do immunizacji

Koniugat E-Efb(127-140)-KLH o sekwencji peptydu przedstawionej wzorem 1 rozpuszcza się tuż przed wykonaniem iniekcji w mieszaninie sterylnego roztworu soli fizjologicznej i pełnego adiuwantu Freund'a przy pierwszej immunizacji oraz niepełnego adiuwantu Freund'a przy dawkach przypom inających w stosunku 1:1 (v/v).

2.2 Immunizacja kurcząt

Kury hodowlane rasy White Leghorn immunizuje się poprzez podanie domięśniowe antygenu w ilości 100 pg/zwierzę (300 pl). Immunizację powtarza się po 4 i 8 tygodniach stosując antygen w dawce 50 pg/zwierzę. Grupę kontrolną stanowią kury otrzymujące iniekcję roztworu pełnego adiuwantu Freund'a w soli fizjologicznej w stosunku 1:1 (v/v).

2.3 Pobieranie i przechowywanie materiału biologicznego

Jaja kolekcjonuje się codziennie od następnego dnia po immunizacji przez 20 tygodni. Jaja przechowywane są w temperaturze 4°C do momentu izolacji przeciwciał.

2.4 Izolacja przeciwciał IgY

Jaja przemywa się 50% roztworem izopropanolu. Rozdziela się żółtko od białka, a następnie usuwa się błonę białkową otaczającą worek żółtkowy. Płynną zawartość żółtka rozcieńcza się czterokrotnie buforem fosforanowym (PBS, 10 mM, pH 7,4) z 4,75% dodatkiem glikolu polietylenowego 6000 (PEG 6000). Po dokładnym wymieszaniu, całość wiruje się przez 15 min przy 11 000 rpm w 4°C. Otrzymany supernatant filtruje się przez sączek bibułowy, a następnie do przesączu dodaje się PEG 6000 do końcowego stężenia wynoszącego 12%. Po dokładnym wymieszaniu wytrącony osad odwirowuje się przy 11 000 rmp przez 15 min w 4°C. Supernatant odrzuca się, pozostały osad rozpuszcza się w 10 ml buforu fosforanowego (pH 7,4). Do mieszaniny dodaje się glikol polietylenowy do końcowego stężenia 12%. Po dokładnym wymieszaniu, całość wiruje się przy 11 000 rmp przez 15 min w 4°C. Supernatant odrzuca się, a osad zawierający przeciwciała klasy IgY rozpuszcza się w 5 ml buforu fosforanowego. Po wykonaniu analiz biochemicznych przeciwciała przechowuje się w temperaturze -20°C.

2.5 Analiza czystości i stężenia przeciwciał

Stężenie otrzymanych białek oznacza się spektrofotometrycznie (A₂₈₀). Czystość otrzymanych przeciwciał sprawdza się poprzez wykonanie analizy elektroforetycznej SDS-PAGE (4-12%) w warunkach nieredukujących (fig. 1). Czystość otrzymanych przeciwciał zawiera się w zakresie 86-95%.

P r z y k ł a d 3. Analiza odpowiedzi immunologicznej na podany antygen oraz awidność przeciwciał anty-Efb(127-140) w czasie procesu immunizacji (test ELISA).

W celu wykonania analizy odpowiedzi immunologicznej immunizowanych zwierząt na podany antygen zastosowano test immunoenzymatyczny fazy stałej ELISA. 96 dołkowe płytki mikrotitracyjne pokryto antygenem w postaci koniugatu Efb(127-140)-BSA (50 ng peptydu/100 pl) rozpuszczonym w buforze węglanowym (50 mM, pH 9,6) i inkubowano przez 12 godzin w temperaturze 4°C. Wolne

PL 224 388 B1 miejsca zablokowano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym (pH 7,4) zawierającym 0,05% Tween-20 (PBS-T, v/v) w temperaturze 37°C przez 60 min. Po odmyciu czynnika blokującego na płytkę mikrotitracyjną naniesiono przeciwciała specyficzne lub kontrolne w stukrotnym rozcieńczeniu w 0,5% roztworze odtłuszczonego mleka PBS-T i inkubowano przez 60 min w temperaturze 37°C. W celu oznaczenia awidności przeciwciał część próbek inkubowano z 6M roztworem mocznika w PBS-T. Detekcję kompleksów epitopu białka Efb(127-140) ze specyficznymi przeciwciałami IgY prowadzono z wykorzystaniem króliczych przeciwciał detekcyjnych anty-IgY sprzężonych z peroksydazą chrzanową. Jako chromogenicznego substratu użyto O-fenylenodiaminy. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 2).

P r z y k ł a d 4. Analiza specyficzności przeciwciał IgY anty-Efb(127-140) w czasie immunizacji (western blotting).

W celu potwierdzenia specyficzności otrzymanych przeciwciał IgY wobec białka Efb(127-140) wykonano analizę western blotting. Po rozdziale elektroforetycznym koniugatu Efb(127-140)-BSA (50 ng peptydu na studzienkę) w warunkach redukujących (SDS-PAGE, 4%-12%) przeprowadzono elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową. Blokowanie wolnych miejsc wiążących na membranie nitrocelulozowej wykonano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w PBS-T przez 12h w temperaturze 4°C. W kolejnym etapie membranę inkubowano z roztworem przeciwciał IgY specyficznych wobec fragmentu Efb(127-140) lub przeciwciał kontrolnych, rozcieńczonych w stosunku 1:100 w 0,5% roztworze mleka odtłuszczonego w PBS-T (1h, 37°C). Po przemyciu membrany buforem PBS-T detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY sprzężonego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 3).

P r z y k ł a d 5. Limit detekcji epitopu białka Efb(127-140) w teście ELISA.

W celu określenia limitu detekcji epitopu białka Efb(127-140) przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY wykorzystano test ELISA w sposób opisany powyżej. W tym celu 96 dołkową płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatem Efb(127-140)-BSA w zakresie stężeń peptydu od 1 gg/ml do 0,03125 gg/ml (100 gl/studzienkę). Następnie inkubowano z roztworem specyficznego wobec białka Efb(127-140) przeciwciała IgY rozcieńczonego 100-krotnie 0,5% roztworem mleka odtłuszczonego w PBS-T. Detekcję kompleksów Efb( 127-140)-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jako kontroli użyto przeciwciała z grupy kontrolnej w analogicznych rozcieńczeniach. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 4).

P r z y k ł a d 6. Miano przeciwciał - test ELISA.

Miano przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb( 127-140) określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę mikrotitracyjną opłaszczono koniugatem BSA-Efb(127-140) w ilości 100 ng peptydu na studzienkę. Po inkubacji z antygenem (12h, 4°C) i zablokowaniu wolnych miejsc (5% odtłuszczone mleko w PBS-T) przygotowano serię rozcieńczeń specyficznych oraz kontrolnych przeciwciał IgY w zakresie od 1:100 do 1:100000 i inkubowano z opłaszczoną antygenem płytką. Detekcję kompleksów Efb(127-140)-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach (fig. 5).

P r z y k ł a d 7. Określenie limitu detekcji epitopu białka Efb(127-140) (western blotting).

W celu określenia limitu detekcji fragmentu epitopowego białka Efb (127140) w technice western blotting w pierwszym etapie wykonano rozdział elektroforetyczny (SDS PAGE, 4%-12%) koniugatu Efb(127-140)-BSA w warunkach redukujących w zakresie od 200 ng do 62,5 pg peptydu na studzienkę. Następnie wykonano transfer białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST membranę inkubowano z roztworem otrzymanego specyficznego przeciwciała IgY w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% odtłuszczone mleko/PBS-T). Detekcję kompleksów Efb(127-140) z przeciwciałami IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 6).

PL 224 388 B1

P r z y k ł a d 8. Miano przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb (127-140).

W celu określenia zakresu stężeń otrzymanych przeciwciał klasy IgY w technice western blotting niezbędnego do detekcji epitopu białka Efb(127-140) rozdział elektroforetyczny koniugatu Efb(127-140)-BSA (50 ng peptydu na studzienkę). Po transferze białek na membranę nitrocelulozową i blokowaniu wolnych miejsc paski membrany inkubowano z roztworami specyficznych wobec epitopu białka Efb(127-140) przeciwciał IgY rozcieńczonych w zakresie od 1:100 do 1:25000 (0,5% odtłus zczone mleko w PBS-T). Po wypłukaniu pasków membrany buforem PBS-T detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 7).

P r z y k ł a d 9. Zdolność przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb(127-140) do rozpoznawania pełnego białka Efb.

Zdolność przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb( 127-140) do rozpoznawania pełnego białka Efb potwierdzono testem western blotting. W tym celu przeprowadzono rozdział elektroforetyczny (SDS-PAGE, 4%-12%) pełnego białka Efb w warunkach redukujących. Następnie wykonano elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową. Zablokowano wolne miejsca wiążące przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST (pH 7,4) a następnie membranę inkubowano z roztworami przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb(127-140) lub przeciwciałami IgY wyizolowanymi z jaj nieimmunizowanych kur lub przeciwciałami IgY specyficznymi wobec natywnego białka Efb przygotowanych w rozcieńczeniu 1:100 (0,5% mleko odtłuszczone w PBS-T, pH 7,4). Detekcję kompleksów białka Efb z przeciwciałami IgY prowadzono z wykorzystaniem przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD (fig. 8).

P r z y k ł a d 10. Detekcja białka Efb z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych wobec epitopu białka Efb(127-140) w teście ELISA.

W celu określenia zdolności detekcji białka Efb przez otrzymane przeciwciała IgY specyficzne wobec epitopu Efb(127-140), płytkę mikrotitracyjną opłaszczono natywnym białkiem Efb w ilości 100 ng na studzienkę. Następnie inkubowano z roztworem przeciwciał specyficznych wobec epitopu Efb(127-140) lub przeciwciał kontrolnych, rozcieńczonych 500-krotnie (0,5% roztwór mleka odtłuszczonego w PBS-T). Detekcję kompleksów Efb-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylenodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek (fig. 9).

P r z y k ł a d 11. Test diagnostyczny do wykrywania białka Efb w teście ELISA.

Surowicę pacjenta rozcieńcza się 100-krotnie buforem PBS i nanosi na płytkę mikrotitracyjną w dwóch powtórzeniach. Równocześnie przygotowuje się roztwór białka Efb(127-140)-BSA w zakresie stężeń peptydu od 1 μg/ml do 0,03125 μg/ml i nanosi na płytkę w dwóch powtórzeniach. Płytkę inkubuje się następnie w temperaturze 37°C przez 1h, po czym płucze, blokuje wolne miejsca wiążące przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBS-T. Po 2 godzinnej inkubacji w 37°C płytkę płucze się i inkubuje z roztworem specyficznych przeciwciał IgY otrzymanych po immunizacji koniugatem E-Efb(127-140)-KLH. Płytkę inkubuje się w 37°C przez 1h, płucze a następnie inkubuje z dowolnym przeciwciałem specyficznym wobec IgY zawierającym dowolny enzym znacznikowy (peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna) lub znacznik fluorescencyjny (fluoresceina). Po 1h inkubacji w temperaturze 37°C płytkę płucze się i dodaje dowolny substrat enzymatyczny lub, w przypadku, zastosowania znacznika fluorescencyjnego, analizę wykonuje się spektrofluorymetrycznie. Wynik uzyskany dla badanej próbki porównuje się z wynikami krzywej standardowej i na tej podstawie potwierdza się obecność białka Efb oraz określa jego ilość.

P r z y k ł a d 12. Test diagnostyczny, do wykrywania białka Efb w teście western blotting.

Próbkę badanej surowicy rozcieńcza się 100-krotnie, a następnie poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu (SDS PAGE) w warunkach redukujących. Równolegle rozdziałowi poddaje się białko Efb(50 ng/studzienkę) oraz białko Efb(127-140)-BSA (50 ng peptydu/studzienkę). Po wykonaniu elektroforezy białka przenosi się na membranę nitrocelulozową, blokuje wolne miejsca wiążące 5% ro ztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBS-T (2h, 37°C) a następnie membranę płucze się buforem. PBS-T. Wypłukaną membranę inkubuje się następnie z roztworem przeciwciał IgY otrzymanych

PL 224 388 B1 po immunizacji koniugatem E-Efb(127-14Q)-KLH (1 h, 37°C). Detekcję kompleksów białka Efb lub jego fragmentu z przeciwciałami IgY prowadzi się z wykorzystaniem dowolnych, przeciwciał zawierających dowolny enzym znacznikowy (peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna) lub znacznik fluorescencyjny (fluoresceina) przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego lub chromogennego substratu, lub światła, o odpowiedniej długości fali wzbudzenia dla znaczników fluorescencyjnych. Na podstawie uzyskanych wyników określa się, czy analizowana próbka zawiera białko Efb lub fragmenty jego degradacji.

Claims

1. Test diagnostyczny do detekcji białka Efb(127-140), znamienny tym, że zawiera jako czynnik detekcyjny przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec epitopu białka Efb(127-140) izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci koniugatu fragmentu epitopowego białka E-Efb(127-140) o sekwencji CVSAHRK(Val^p(OPh)2)AQK(Val^p(OPh)2)AVNLV przedstawionej wzorem 1 z białkiem nośnikowym - hemocyjaniną.

2. Test diagnostyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.