PL222575B1

PL222575B1 - Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec białka Map, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie

Info

Publication number: PL222575B1
Application number: PL398828A
Authority: PL
Inventors: Marcin Sieńczyk; Agnieszka Łupicka; Kamila Bobrek; Renata Grzywa; Maciej Walczak; Eric L. Brown; Daria Nowak; Joanna Oniśkiewicz; Józef Oleksyszyn; Andrzej Gaweł; Tadeusz Stefaniak
Original assignee: Politechnika Wroclawska; Univ Przyrodniczy We Wrocławiu
Priority date: 2012-04-16
Filing date: 2012-04-16
Publication date: 2016-08-31
Also published as: PL398828A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec białka Map ze Stephylococcus aureus izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci rekombinowanego białka Map19 pochodzącego ze Staphylococcus aureus o określonej sekwencji przedstawionej. Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka Map ze Stephylococcus aureus polega na tym, że immunizuje się drób białkowym antygenem w postaci rekombinowanego białka Map19 pochodzącego ze Staphylococcus aureus, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 100-160 mg/jajko i czystością 85-95%. Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka Map do wykrywania bakterii Staphylococcus aureus.

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 222575 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 398828 (22) Data zgłoszenia: 16.04.2012 (51) Int.Cl.

C07K 16/02 (2006.01) C07K 16/12 (2006.01)

Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy

Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec białka Map, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie

	(73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA WROCŁAWSKA, Wrocław, PL UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL
	(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	MARCIN SIEŃCZYK, Wrocław, PL
19.11.2012 BUP 24/12	AGNIESZKA ŁUPICKA, Milicz, PL KAMILA BOBREK, Łaziska Górne, PL RENATA GRZYWA, Wrocław, PL MACIEJ WALCZAK, Wrocław, PL
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:	ERIC L. BROWN, Houston, US
31.08.2016 WUP 08/16	DARIA NOWAK, Oława, PL JOANNA ONIŚKIEWICZ, Nysa, PL JÓZEF OLEKSYSZYN, Siechnice, PL ANDRZEJ GAWEŁ, Wrocław, PL TADEUSZ STEFANIAK, Wrocław, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Katarzyna Paprzycka

PL 222 575 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec białka Map, sposób ich wytwarzania oraz zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka Map w immunoterapii ludzi i zwierząt przeciw infekcjom Staphylococcus aureus, zarówno pasywnej immunizacji jak i zastosowań w infekcjach zewnętrznych.

Białko Map znane także jako Eap lub p70 wytwarzane przez szczepy Staphylococcus aureus należy do zewnątrzkomórkowych białek adhezyjnych, które umożliwiają bakteriom przyleganie do podłoża oraz kolonizację tkanek organizmu. Białko Map wykazuje zarówno strukturalną, jak i funkcj onalną analogię do białek ludzkiego głównego układu zgodności tkankowej (MHC II). Białko Map wyk azuje także zdolność do modulacji układu odpornościowego.

Diagnostyka Staphylococcus aureus opiera się w znacznym stopniu na technikach mikrobiologicznych - badania mikroskopowe oraz hodowlane - jednak wykazują one szereg wad jak np. mała siła różnicująca (w obrębie gatunku), trudność pozyskania materiału do badań (ropnie narządów wewnętrznych) lub nieprawidłowe wyniki u osób po antybiotykoterapii [Colque-Navarro P. Soderquist B, Holmberg H. Blomqvist L. Olcen P. Mollby R. J. Med. Microbiol, 47. 1998. 217-25]. Serologiczne metody diagnostyczne oparte są na zasadzie reakcji antygen-przeciwciało, np. przy wykorzystaniu testu ELISA. Jedną z metod jest pomiar ilości przeciwciał specyficznych wobec docelowych antygenów w materiale biologicznym (krew. surowica). Opisano w literaturze naukowej zastosowanie całych komórek Staphylococcus aureus lub ich wybranych antygenów do opłaszczenia płytki mikrotitracyjnej (test ELISA), a następnie wykonaniu analizy potwierdzającej obecność specyficznych przeciwciał (klas IgG lub IgM) we krwi pacjenta [Joost I. Jacob S, Utermohlen O. Schubert U., Patti JM, Ong MF, Gross J. Justinger C. Renno H. Preissner KT. Bischoff M, Herrmann M., FEMS Immunol Med Microbiol 2011,62(1): 23-31; Kumar A, Ray P. Kanwar M. Sharma M., Varma S., Int J Med Sci. 2005, 2(4): 129-36]. Opisano także zastosowanie antygenów Staphylococcus aureus do wykrywania enterotoksyn gronkowcowych w żywności [Fey II. Pfister O. Ruegg O., J Clin Microbiol, 1984, 19(1): 34-8]. Wysoka specyficzność gatunkowa białka Map wykorzystywana jest także w diagnostyce infekcji S. aureus, w której potwierdza się obecność genu map [Hussain M, von Eiff C, Sinha B, Joost I, Herrmann M. Peters G. Becker K., J. Clin Microbiol. 2008, 46(2): 470-6).

Z międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 2009023043 znane są przeciwciała IgG izolowane z myszy lub królika specyficzne wobec wybranych białek Staphylococcus aureus lub całych komórek - Abcam, produkt numer ab20920, jednak nie przedstawiono ich zastosowania w diagnostyce infekcji gronkowcem złocistym.

Przeciwciała IgY należą do głównej klasy immunoglobulin występujących u ptaków, gadów, pł azów oraz prapłaźcokształtnych. Pełnią analogiczne funkcje do przeciwciał klasy IgG ssaków. Występują one nie tylko we krwi, ale w dużych ilościach transportowane są do żółtka jaja, co zapewnia potomstwu ochronę przed patogenami. Dzięki obecności przeciwciał IgY w żółtku jaj możliwe jest wykorz ystanie ich jako źródła specyficznych przeciwciał. W literaturze opisano szereg metod izolacji przeciwciał IgY z żółtka jaj ptaków, a także wykorzystania ich jako źródła pozyskiwania specyficznych imm unoglobulin.

Dotychczas nie opisano w literaturze otrzymywania przeciwciał IgY specyficznych wobec białka Map ze Staphylococcus aureus.

Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec białka Map izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci rekombinowanego białka Map 19 pochodzącego ze Staphylococcus aureus o sekwencji przedstawionej wzorem 1.

Korzystnie przeciwciała mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.

Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka Map polega na tym, że immunizuje się drób. korzystnie kury ras hodowlanych, białkowym antygenem w postaci rekombinowanego białka Map19 pochodzącego ze Staphylococcus aureus o sekwencji przedstawionej wzorem 1, przy czym immunizację prowadzi się z trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu używa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 100-160 mg/jajko i czystością 85-95%.

Korzystnie w celu wzbogacenia wyizolowanych przeciwciał o specyficzne przeciwciała anty-Map stosuje się metodę chromatografii powinowactwa, która polega na tym, że białko Map wiąże się kowalencyjne z nośnikiem, korzystnie z γ-aminoagarozą, a następnie na złoże nanosi się mieszaninę poliPL 222 575 B1 klonalnych przeciwciał IgY o specyficzności anty-Map, po czym po usunięciu niezwiązanych niespecyficznych przeciwciał, otrzymuje się przeciwciała o pożądanej specyficzności.

Korzystnie roztwór przeciwciał IgY specyficznych wobec białka Map poddaje się dializie wobec buforu węglanowego, równolegle peroksydazę chrzanową w buforze węglanowym miesza się z chlorkiem cyjanurowym, po czym mieszaninę reakcyjną poddaje się dializie wobec buforu węglanowego, w kolejnym etapie otrzymany po dializie roztwór peroksydazy chrzanowej miesza się z roztworem przeciwciała IgY otrzymanym w pierwszym etapie przez 4 godziny w temperaturze 37°C, pH mieszaniny reakcyjnej doprowadza się do wartości 7,2-7,4 przy użyciu 1M roztworu kwasu cytrynowego, dodaje się równą objętość glicerolu i otrzymuje się koniugaty IgY-HRP.

Zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka Map do wykrywania in vitro bakterii Staphylococcus aureus.

Wyizolowane przeciwciała poddaje się analizie biochemicznej w celu określenia ich czystości, miana przeciwciał, specyficzności antygenowej i stężenia. W trakcie procesu immunizacji analizę przeciwciał przeprowadzano dla każdego pobranego jaja w okresie 22 tygodni. Odpowiedź organizmu w postaci produkcji specyficznych przeciwciał IgY pojawiła się po 7 tygodniu od momentu immunizacji.

Sposób według wynalazku cechuje niska inwazyjność, ponieważ nie wymaga skrwawiania zwierząt w określonych odstępach czasu w celu izolacji przeciwciał.

Przeciwciała według wynalazku znajdują zastosowanie w immunoterapii ludzi i zwierząt przeciw infekcjom Staphylococcus aureus, zarówno pasywnej immunizacji jak i zastosowań w infekcjach zewnętrznych, skórnych.

Diagnostyczne wykorzystanie otrzymanych przeciwciał anty-Map IgY polega na ich zdolności do specyficznego wiązania z docelowym antygenem, a następnie detekcji powstałych kompleksów Map-IgY przy użyciu handlowo dostępnych drugorzędowych przeciwciał anty-lgY (np. królicze przeciwciała IgG anty-IgY) zawierających dowolny znacznik (peroksydaza, fosfataza alkaliczna, biotyna. fluoresceina) umożliwiający detekcję kompleksów antygen-przeciwciało. Otrzymano także koniugaty specyficznych przeciwciał IgY anty-Map i peroksydazy chrzanowej (anty-Map IgY-HRP) do zastosowań w testach bezpośredniej detekcji białka Map w testach ELISA i western blotting.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach wykonania oraz na rysunku na którym:

Fig. 1 - Analiza elektroforetyczna (SDS-PAGE) w warunkach nieredukujących otrzymanych przeciwciał IgY. Barwienie wykonano przy użyciu barwnika Coomassie R 250.

Fig. 2 - Wykres przedstawiający odpowiedź w postaci produkcji specyficznych wobec białka Map przeciwciał IgY. Strzałkami oznaczono czas immunizacji.

Fig. 3 - Detekcja białka Map przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY (obraz uzyskany w technice western blotting).

Fig. 4 - Wykres przedstawiający zdolność przeciwciał IgY do wykrywania białka Map: Abs* przedstawione wartości absorbancji po odjęciu wartości absorbancji otrzymanych dla roztworów kontrolnych przeciwciał IgY.

Fig. 5 - Wykres przedstawiający zdolność przeciwciał IgY (różnych rozcieńczeń) do wykrywania białka Map; Abs* - przedstawione wartości absorbancji po odjęciu wartości absorbancji otrzymanych dla roztworów kontrolnych przeciwciał IgY.

Fig. 6 - Zdolność detekcji białka Map przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY: obraz western blotting (lewy) i uzyskane wartości intensywności sygnału (prawy).

Fig. 7 - Detekcja białka Map przez otrzymane specyficzne przeciwciała klasy IgY (western blotting).

Fig. 8 - Określenie poziomu niespecyficznego wiązania otrzymanych przeciwciał IgY wobec wybranych białek (western blotting).

Fig. 9 - Wyniki analizy western blotting hodowli bakterii Staphylococcus aureus w celu określenia obecności białka Map. Przy zastosowaniu otrzymanych przeciwciał IgY; rMap19 - rekombinowane białko Map użyte do immunizacji; fMap - natywne białko Map; h - płyn hodowlany; o - osad z płynu hodowlanego (opis w tekście); A - hodowle A009 i E006; B - hodowle E025 i E58; C - hodowle E039 i E52.

Fig. 10 - Wykres przedstawiający detekcję koniugatów IgY przez królicze przeciwciała IgG anty-IgY; Abs* - przedstawione wartości absorbancji po odjęciu wartości absorbancji otrzymanych dla roztworów kontrolnych.

PL 222 575 B1

Fig. 11 - Bezpośrednia detekcja białka Map19 przez przeciwciała IgY sprzężone z peroksydazą chrzanową (IgY-HRP) (western blotting).

Fig. 12 -Detekcja białka Map19 przez przeciwciała IgY przed i po ich oczyszczeniu metodą chromatografii powinowactwa (western blotting).

P r z y k ł a d 1

1.1 Przygotowanie antygenu do immunizacji

Białko Map (rMapl9, rekombinowane. 22,5 kDa o sekwencji przedstawionej wzorem 1) rozpuszczono w buforze fosforanowym o pH 7,4 a następnie zliofilizowano. Białko rozpuszczono tuż przed wykonaniem iniekcji w mieszaninie sterylnego roztworu soli fizjologicznej i pełnego adiuwantu Freund'a w stosunku 1:1 (v/v).

1.2. Immunizacja zwierząt

Kury hodowlane, rasy White Leghorn immunizuje się przez podanie domięśniowe antygenu, w ilości 40 pg/zwierzę (300 pl). Immunizację powtarza się następnie po 5 i 8 tygodniach stosując antygen, w ilości 10 pg na zwierzę. Grupa kontrolna otrzymuje iniekcję roztworu soli fizjologicznej zawierającej pełny adiuwant Freund'a (1:1, v/V, 300 pl/zwierzę).

1.3. Pobieranie i przechowywanie materiału biologicznego

Jaja kolekcjonowane były codziennie od następnego dnia po immunizacji przez 4 miesiące i przechowywane w temperaturze 4°C do czasu izolacji przeciwciał.

1.4. Izolacja przeciwciał IgY

Zebrane jaja zostały najpierw umyte 50% roztworem izopropanolu, a następnie rozdzielono żółtko od białka. Po usunięciu błony białkowej otaczającej worek żółtkowy płynną zawartość rozcieńczono pięciokrotnie buforem fosforanowym (100 mM, pH 7,4), a następnie dodano glikol polietylenowy 6000 do końcowego stężenia 3,5%. Po dokładnym wymieszaniu całość wirowano w 11 000 rpm przez 15 min w 4°C a otrzymany supernatant filtrowano przez sączek bibułowy. Do supernatantu dodano następnie PEG 6000 do końcowego stężenia 12%. Po dokładnym wymieszaniu wytrącony osad odw irowano (11 000 rpm przez 15 min w 4°C). Supernatant odrzucono, a osad zawierający przeciwciała klasy IgY rozpuszczono dokładnie w buforze fosforanowym (pH 7.4) w objętości 5 ml. Po wykonaniu analiz biochemicznych roztwory przeciwciał przechowywano w temperaturze -20°C. Stężenie otrzymanych białek określono spektrofotometrycznie (A₂₈₀).

P r z y k ł a d 2. Analiza czystości wyizolowanych przeciwciał klasy IgY

Czystość wyizolowanych przeciwciał określono wykonując rozdział elektroforetyczny otrzym anych białek w warunkach nieredukujących. W tym celu na studzienki żelu poliakrylamidowego (SDS PAGE, 4%-12%) naniesiono 10 pl otrzymanego roztworu analizowanego białka rozcieńczonego 100-krotnie. Wizualizację białek wykonano przy użyciu barwnika Coomassie R 250. Na podstawie analizy obrazów elektroforetycznych oznaczono czystość uzyskanych przeciwciał, która mieściła się w zakresie od 85% do 95%.

P r z y k ł a d 3. ELISA - ogólny opis wykonania testu

W celu potwierdzenia obecności przeciwciał specyficznych wobec białka Map wykonano test ELISA dla każdego z otrzymanych preparatów. Płytki mikrotitracyjne 96-cio dołkowe pokryto antygenem rozpuszczonym w buforze węglanowym (50 mM, pH 9.6) i inkubowano w temperaturze 4°C przez 12 godzin. Po odmyciu niezwiązanego antygenu wolne miejsca zablokowano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0.05% (v/v) Tween-20. Blokowanie wykonuje się w temperaturze 37°C w czasie 60-120 minut. Po odmyciu czynnika blokującego specyficzne oraz kontrolne przeciwciała rozcieńczone w 0.5% roztworze mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0.05% (v/v) Tween-20 (v/v) (100 mM, pH 7.4) naniesiono na opłaszczoną antygenem płytkę mikrotitracyjną (100 pl) i inkubowano w czasie 1-2 godzin w temperaturze 37°C. Detekcję kompleksów białko Map-przeciwciało IgY wykonano przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach.

P r z y k ł a d 4. Analiza odpowiedzi na podany antygen.

Do analizy odpowiedzi immunologicznej immunizowanych zwierząt i określenia miana produkowanych przeciwciał zastosowano test ELISA według sposobu opisanego w przykładzie 3 dla każdego wyizolowanego przeciwciała w rozcieńczeniu 1:100, 1:1000 oraz 1:10000. Jako miano przeciwciał przyjęto takie rozcieńczenie, przy którym obserwowano przynajmniej 2,1 razy wyższą wartość absorbancji w stosunku do absorbancji roztworu przeciwciał kontrolnych. Wszystkie pomiary wykonano

PL 222 575 B1 w dwóch powtórzeniach dla każdego przeciwciała i każdego rozcieńczenia. Ilość antygenu użytego w teście wynosiła 6 ng/studzienkę płytki mikrotitracyjnej.

P r z y k ł a d 5. Analiza specyficzności - western blotting.

W celu potwierdzenia specyficzności otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec białka Map wykonano analizę western blotting. W tym celu przeprowadzono rozdział elektroforetyczny w warunkach denaturujących (SDS PAGE, 4%-12%) białka Map rozpuszczonego w buforze do próbek zawierającym czynnik redukujący (39,4 ng białka na studzienkę). Następnie przeprowadzono elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową w aparacie do transferu półsuchego. Blokowanie wolnych miejsc wiążących na membranie nitrocelulozowej wykonano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% Tween-20 (v/v) przez 12 h w temperaturze 4°C. Następnie specyficzne wobec białka Map przeciwciała rozcieńczono (1:100) w 0,5% roztworze mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% Tween-20 (v/v) i inkubowano z membraną w czasie 1-2 h w temperaturze 37°C. Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

P r z y k ł a d 6. Limit detekcji Map - ELISA

W celu określenia limitu detekcji białka Map przez otrzymane specyficzne przeciwciała IgY w ykorzystano enzymatyczny test immunosorpcyjny fazy stałej (ELISA) w sposób opisany powyżej. W tym celu 96-cio dołkową płytkę mikrotitracyjną opłaszczono białkiem Map w różnych stężeniach w przedziale od 2000 ng/ml do 0,15 pg/ml (100 pl/studzienkę). Po wypłukaniu dołków dodano roztwór specyficznego wobec Map przeciwciała rozcieńczonego 2500-krotnie roztworem mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0.05% (v/v) Tween-20. Detekcję kompleksów Map-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-lgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach.

P r z y k ł a d 7. Limit detekcji - miano przeciwciał (rozcieńczenia) - ELISA

Miano otrzymanych przeciwciał specyficznych wobec użytego antygenu Map określono przy użyciu testu ELISA. Płytkę mikrotitracyjną opłaszczono antygenem w ilości 6 ng/studzienkę (po 100 pl roztworu o stężeniu 60 ng/ml na studzienkę). Przygotowano następnie serię rozcieńczeń przeciwciał IgY (specyficznych wobec białka Map oraz kontrolnych) w zakresie od 1:10 do 1:100 000 i inkubowano z opłaszczoną antygenem płytką. Detekcję kompleksów Map-IgY przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek, Jako miano specyficznych wobec białka Map przeciwciał uznano najwyższe rozcieńczenie, dla którego obserwowano wartość absorbancji minimum 2,1 razy wyższą niż wartość absorbancji roztworu przeciwciała wyizolowanego z żółtka jaja kur nieimmunizowanych. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach.

P r z y k ł a d 8. Limit detekcji Map - western blotting

W celu określenia limitu detekcji białka Map w technice western blotting w pierwszym etapie wykonano rozdział elektroforetyczny (SDS PAGE, 4%-12%) białka Map w warunkach redukujących w ilości mieszczącej się w zakresie od 2,1 ng do 39,4 ng/studzienkę. Następnie wykonano transfer półsuchy białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST membranę inkubowano z roztworem otrzymanego specyficznego wobec białka Map przeciwciała IgY rozcieńczonego w stosunku 1:1000 0,5% roztworem odtłuszczonego mleka w buforze PBST. Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

P r z y k ł a d 9. Limit detekcji - miano przeciwciał (rozcieńczenia) - western blotting

W celu określenia zakresu stężeń otrzymanych przeciwciał klasy IgY w technice western blotting niezbędnego do detekcji białka Map na studzienki żelu poliakrylamidowego naniesiono białko Map w ilości 4,8 ng/studzienkę a następnie wykonano rozdział elektroforetyczny białek w warunkach redu6

PL 222 575 B1 kujących (SDS PAGE, 4%-12%). Po półsuchym transferze białek na membranę nitrocelulozową i blokowaniu wolnych miejsc przy użyciu 5% roztworu odtłuszczonego mleka w buforze PBST paski membrany inkubowano przez 1 h z roztworami specyficznego wobec białka Map przeciwciała IgY rozcieńczonego w zakresie od 1:100 do 1:50 000 buforem PBST zawierającego 0,5% odtłuszczonego mleka. Po wypłukaniu pasków membrany buforem PBST detekcję związanych z antygenem specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY koniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

P r z y k ł a d 10. Niespecyficzne wiązanie przeciwciał IgY - western blotting

W celu określenia możliwości niespecyficznego wiązania otrzymanych przeciwciał IgY do innych niż Map białek wykorzystano test western blotting. W tym celu roztwory białka w warunkach redukujących naniesiono na żel poliakrylamidowy (4%-12%. SDS PAGE) w ilości 1 pg/studzienkę i wykonano półsuchy transfer białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących membranę inkubowano z roztworem specyficznego wobec białka Map otrzymanego przeciwciała IgY rozcieńczonego w stosunku 1:10 000 w buforze PBST zawierającym 0,5% mleka odtłus zczonego. Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję związanych z białkami specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

P r z y k ł a d 11. Detekcja białka Map w hodowli S. ureus

W celu określenia zdolności otrzymanych przeciwciał klasy IgY do detekcji białka Map w hodowli bakterii Staphylococcus aureus - izolaty środowiskowe pochodzące z kolekcji Katedry Epizootiologii z Kliniką Ptaków i Zwierząt Egzotycznych Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu: A009 i E006 (kloaka gołębia), E025 (oczy kota), E039 (wole gołębia). E052 (migdałki psa). E058 (skóra konia) wykorzystano technikę western blotting. Jako medium hodowlane użyto: pepton sojowy (3 g/l), pepton kazeinowy (17 g/I), chlorek sodu (3 g/l), wodorofosforan potasu (2,5 g/l). pirogronian sodu (10 g/l), pH 7,3. Hodowlę bakterii prowadzono w temperaturze 37°C. Po 24 h i 48 h / hodowli pobrano medium hodowlane i wykonano rozdział elektroforetyczny w warunkach redukujących (4%-12%. SDS PAGE). Przeprowadzono także analizę obecności białka Map w osadzie hodowlanym. W tym celu 25 ml płynu hodowlanego odwirowano (4500 obr./min, 4°C, 15 min). Osad rozpuszczono następnie w 2% roztworze SDS w wodzie i gotowano przez 5 min, a następnie zwirowano (4500 obr./min. 4°C, 15 min) i pobrany supernatant ponownie odwirowano (4500 obr./min, 4°C, 15 min) i przeniesiono do czystej probówki. W celu przeprowadzenia analizy western blotting wykonano jego rozdział w warunkach redukujących. Po rozdziale elektroforetycznym wykonano transfer półsuchy białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu miejsc wiążących przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST membranę inkubowano z roztworem przeciwciała IgY (1:1000) specyficznego wobec antygenu Map. Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję związanych z białkiem Map specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

P r z y k ł a d 12. Otrzymywanie koniugatów IgY-HRP

W pierwszym etapie roztwór specyficznych wobec białka Map przeciwciał IgY poddaje się dializie wobec buforu węglanowego (50 mM, pH 9,6) i rozcieńcza do stężenia 5 mg/ml. W drugim etapie do probówki odważa się peroksydazę chrzanową w ilości 1,2 mg (stężenie 6 mg/ml) i rozpuszcza w zimnym (4°C) buforze węglanowym (50 mM, pH 9,6) i przenosi do probówki zawierającej 670 pg chlorku cyjanurowego. Całość delikatnie miesza się w temperaturze pokojowej przez 6 h po czym mieszaninę reakcyjną poddaje się dializie wobec buforu węglanowego (50 mM, pH 9,6). W kolejnym etapie cały otrzymany po dializie roztwór peroksydazy chrzanowej miesza się z 90 pl roztworu przeciwciała IgY otrzymanym w pierwszym etapie i delikatnie miesza przez 4 godziny w tem peraturze 37°C. Po tym czasie doprowadza się pH mieszaniny reakcyjnej do wartości 7,2-7,4 przy użyciu 1M roztworu kwasu cytrynowego a następnie dodaje się równą objętość glicerolu.

W celu potwierdzenia obecności koniugatów IgY-HRP wykonuje się test ELISA. W tym celu studzienki 96-cio dołkowej płytki mikrotitracyjnej pokryto króliczym przeciwciałem IgG anty-IgY rozpuszczonym w buforze węglanowym (50 mM, pH 9,6) w rozcieńczeniu 1:5000 i inkubowano w temperaturze 4°C przez 12 godzin. Po odmyciu niezwiązanego przeciwciała wolne miejsca zablokowano przy użyciu 5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v)

PL 222 575 B1

Tween-20. Blokowanie wykonuje się w temperaturze 37°C w czasie 60-120 minut. Po odmyciu czynnika blokującego otrzymany koniugat IgY-HRP rozcieńczony w 0,5% roztworze w buforze fosforanowym zawierającym 0,05% (v/v) Tween-20 (v/v) (100 mM, pH 7,4) naniesiono na opłaszczoną antygenem płytkę mikrotitracyjną (100 pl) i inkubowano w czasie 1-2 godzin w temperaturze 37°C. Detekcję kompleksów IgG-IgY-HRP wykonano przy zastosowaniu O-fenylodiaminy jako chromogenicznego substratu. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali 490 nm za pomocą czynnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonano w dwóch powtórzeniach.

P r z y k ł a d 13. Bezpośrednia detekcja białka Map przy zastosowaniu koniugatu IgY-HRP western blotting.

W celu potwierdzenia specyficzności oraz zdolności rozpoznania białka Map przez otrzymane koniugaty IgY-HRP wykorzystano technikę western blotting - na studzienki żelu poliakrylamidowego naniesiono białko Map w ilości 4,8 ng/studzienkę a następnie wykonano rozdział elektroforetyczny białek w warunkach redukujących (SDS PAGE, 4%-12%). Po półsuchym transferze białek na membranę nitrocelulozową i blokowaniu wolnych miejsc przy użyciu 5% roztworu odtłuszczonego mleka w buforze PBST paski membrany inkubowano przez 1 h z roztworem koniugatu IgY-HRP w ilości 33 pg w buforze PBST (5 ml) zawierającym 0,5% odtłuszczonego mleka. Po wypłukaniu pasków membrany buforem PBST detekcję kompleksów Map-IgY-HRP przeprowadzono przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

P r z y k ł a d 14. Izolacja specyficznych wobec białka Map przeciwciał IgY

Jako stałego nośnika białka w metodzie chromatografii powinowactwa użyto ω-aminobutylo agarozy (5,2 pmol/ml). W pierwszym etapie grupy aminowe nośnika podstawiono grupami S-acetylotiooctowymi przy użyciu W-bursztynimido-S-acetylotiooctanu, a następnie usunięto grupę S-acetylową przy zastosowaniu 0.5M roztworu hydroksyloaminy w buforze PBS zawierającego 25 mM EDTA. Wolne grupy tiolowe nośnika zmodyfikowano heterodwufunkcyjnym łącznikiem GMBS (10-krotny nadmiar molowy) i po wypłukaniu nadmiaru łącznika zawiesinę nośnika w buforze PBS inkubowano z białkiem Map. Reakcję prowadzi się w czasie 2-6 h w temperaturze pokojowej delikatnie mieszając. Reakcję przerywa się następnie 1M roztworem glicyny i całość przemywa się buforem PBS. Na tak przygotowane złoże (75 pl) nanosi się mieszaninę przeciwciał IgY specyficznych wobec białka Map (200 pl) i przemywa buforem PBS. Po wypłukaniu całości niezwiązanych przeciwciał na szczyt kolumny nanosi się bufor cytrynianowy (20 mM, pH 2,5) w ilości 500 pl i neutralizuje każdą frakcję przy użyciu 1M Tris-base (pH 8,5). Obecność przeciwciał w zebranych frakcjach potwierdza się przy zastosowaniu elektroforezy (SDS PAGE. warunki nieredukujące) oraz barwienia srebrem. Frakcje zawierające przeciwciała łączy się i określa stężenie białka przy użyciu testu microBCA. W celu określenia immunoreaktywności otrzymanych przeciwciał wobec białka Map19 wykonuje się test western blotting w sposób opisany powyżej. Na studzienki żelu poliakrylamidowego nanosi się białko Map w ilości 4,8 ng/studzienkę. Po przeprowadzonym rozdziale elektroforetycznym przeprowadza się półsuchy transfer białek na membranę nitrocelulozową i wolne miejsca wiążące blokuje się 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBST (4°C, 12 h). Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję białka Map przeprowadza się przy użyciu otrzymanych przeciwciał IgY o specyficzności antyMap przed i po wykonaniu chromatografii powinowactwa. W tym celu przeciwciało (przed oczys zczaniem metodą chromatografii powinowactwa) w ilości 5 pg oraz oczyszczone przeciwciało w ilości 5 pg i 1 pg odmierza się do 10 ml 0,5% roztworu mleka odtłuszczonego w buforze PBST i inkubuje z paskami membrany nitrocelulozowej zawierającej przeniesione z żelu poliakrylamidowego białko Map (37°C, 1 h). Po wypłukaniu membrany buforem PBST detekcję związanych z białkami specyficznych przeciwciał przeprowadzono przy użyciu przeciwciała króliczego anty-IgY skoniugowanego z peroksydazą chrzanową przy zastosowaniu chemiluminescencyjnego substratu. Analizę obrazów wykonano przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego zaopatrzonego w kamerę CCD.

PL 222 575 B1

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Przeciwciała poliklonalne klasy IgY specyficzne wobec białka Map izolowane z żółtka jaj drobiu immunizowanego białkowym antygenem w postaci rekombinowanego białka Map19 pochodzącego ze Staphylococcus aureus o sekwencji przedstawionej wzorem 1.
2. Przeciwciała według zastrz. 1, znamienne tym, że mają masę cząsteczkową od 175000 do 200000 daltonów.
3. Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka Map, znamienny tym, że immunizuje się drób białkowym antygenem w postaci rekombinowanego białka Map19 pochodzącego ze Staphylococcus aureus o sekwencji przedstawionej wzorem 1, przy czym immunizację prowadzi się w trzech osobnych dawkach, a jako adiuwantu uż ywa się pełnego adiuwantu Freund'a, po czym znaną metodą izoluje się przeciwciała z wydajnością 100-160 mg/jajko i czystością 85-95%.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że immunizuje się kury ras hodowlanych.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że w celu wzbogacenia wyizolowanych przeciwciał o specyficzne przeciwciała anty-Map stosuje się metodę chromatografii powinowactwa, która polega na tym, że białko Map wiąże się kowalencyjne z nośnikiem, a następnie na złoże nanosi się mieszaninę poliklonalnych przeciwciał IgY o specyficzności anty-Map, po czym po usunięciu niezwiązanych niespecyficznych przeciwciał, otrzymuje się przeciwciała o pożądanej specyficzności.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako nośnik stosuje się γ-aminoagarozę.
7. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że roztwór przeciwciał IgY specyficznych wobec białka Map poddaje się dializie wobec buforu węglanowego, równolegle peroksydazę chrzanową w buforze węglanowym miesza się z chlorkiem cyjanurowym, po czym mieszaninę r eakcyjną poddaje się dializie wobec buforu węglanowego, w kolejnym etapie otrzymany po dializie roztwór peroksydazy chrzanowej miesza się z roztworem przeciwciała IgY otrzymanym w pierwszym etapie przez 4 godziny w temperaturze 37°C, pH mieszaniny reakcyjnej doprowadza się do wartości 7,2-7,4 przy użyciu 1M roztworu kwasu cytrynowego, dodaje się równą objętość glicerolu i otrzymuje się koniugaty IgY-HRP.
8. Zastosowanie przeciwciał poliklonalnych klasy IgY specyficznych wobec białka Map do wykrywania in vitro bakterii Staphylococcus aureus.