PL225341B1 - New compound, method for obtaining it, pharmaceutical solution containing the new compound, method for determination of the presence of tumor disease, accessories for cancer detection and application of the hydrolysis of the new compound for cancer detection - Google Patents
New compound, method for obtaining it, pharmaceutical solution containing the new compound, method for determination of the presence of tumor disease, accessories for cancer detection and application of the hydrolysis of the new compound for cancer detectionInfo
- Publication number
- PL225341B1 PL225341B1 PL408905A PL40890514A PL225341B1 PL 225341 B1 PL225341 B1 PL 225341B1 PL 408905 A PL408905 A PL 408905A PL 40890514 A PL40890514 A PL 40890514A PL 225341 B1 PL225341 B1 PL 225341B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- buffer
- tyr
- new compound
- abz
- val
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 39
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 11
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 title claims description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 title claims description 5
- 239000003186 pharmaceutical solution Substances 0.000 title claims description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title description 4
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 49
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 claims description 27
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 claims description 26
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 24
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 23
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 23
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 14
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 14
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 11
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical group Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 9
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 9
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 7
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- JZUZJVFERQWLNC-FQEVSTJZSA-N fmoc-3-nitro-l-tyrosine Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 JZUZJVFERQWLNC-FQEVSTJZSA-N 0.000 claims description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 6
- SWZCTMTWRHEBIN-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=C(O)C=C1 SWZCTMTWRHEBIN-QFIPXVFZSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- FBTSQILOGYXGMD-LURJTMIESA-N 3-nitro-L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 FBTSQILOGYXGMD-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000000151 deposition Methods 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 3
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims description 3
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 3
- NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NCC(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 206010005056 Bladder neoplasm Diseases 0.000 claims 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N tetrachloro-1,4-benzoquinone Chemical compound ClC1=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C(Cl)C1=O UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N dichloromethane Natural products ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- AHDSRXYHVZECER-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-tris[(dimethylamino)methyl]phenol Chemical compound CN(C)CC1=CC(CN(C)C)=C(O)C(CN(C)C)=C1 AHDSRXYHVZECER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100074988 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) nmp-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 4
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100025566 Chymotrypsin-like protease CTRL-1 Human genes 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000856199 Homo sapiens Chymotrypsin-like protease CTRL-1 Proteins 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](COC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- JAUKCFULLJFBFN-VWLOTQADSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[4-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]phenyl]propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)(C)C)=CC=C1C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 JAUKCFULLJFBFN-VWLOTQADSA-N 0.000 description 1
- QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M .beta-Phenylacrylic acid Natural products [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWZHDKGQKYEBKK-UHFFFAOYSA-N 3-aminochromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C(N)=CC2=C1 QWZHDKGQKYEBKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZZOKVYOCRSMTSS-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl carbamate Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N)C3=CC=CC=C3C2=C1 ZZOKVYOCRSMTSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022579 ATP dependent 26S protease Proteins 0.000 description 1
- -1 Boc - tert-butyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N Cinnamic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229930016911 cinnamic acid Natural products 0.000 description 1
- 235000013985 cinnamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N dcm dichloromethane Chemical compound ClCCl.ClCCl DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N methyl p-hydroxycinnamate Natural products OC(=O)C=CC1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- VWBWQOUWDOULQN-UHFFFAOYSA-N nmp n-methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O.CN1CCCC1=O VWBWQOUWDOULQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000004963 pathophysiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest nowy związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyc zny zawierający nowy związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do w ykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy nowego związku do wykrywania nowotworów.The invention relates to a new compound, a method for its preparation, a pharmaceutical solution containing the new compound, a method for determining the presence of a neoplastic disease, a cancer detection kit, and the use of hydrolysis of a new compound for the detection of tumors.
Nowy sposób analizy ludzkiego proteasomu 20S obecnego w moczu lub innych płynach biologicznych przy użyciu sondy fluorescencyjnej i jej zastosowanie do diagnostyki raka pęcherza.A new method of analyzing the human 20S proteasome present in urine or other biological fluids using a fluorescent probe and its application for the diagnosis of bladder cancer.
Synteza peptydów na fazie stałej (nośniku) została wprowadzona po raz pierwszy w latach 80 ubiegłego wieku przez Bruca Merfielda, który za to osiągnięcie otrzymał nagrodę Nobla.Solid phase (carrier) peptide synthesis was first introduced in the 1980s by Bruce Merfield, who won the Nobel Prize for this achievement.
Proteasom jest multikatalitycznym kompleksem endopeptydazy (EC 3.4.25.1) odpowiedzialnym za nielizosomalne usuwanie białek uszkodzonych i nieprawidłowo ukształtowanych w wyniku wystąpienia mutacji lub pod wpływem czynników zewnętrznych powodujących stres oksydacyjny [1,2]. D otychczas opracowane związki umożliwiające oznaczanie aktywności proteasomu 20S lub 26S to krótkie peptydy zawierające 4-5 reszt aminokwasowych zawierające na C-końcu ugrupowanie fluorescencyjne. Związki te umożliwiają oznaczanie aktywności proteasomu w tym w obecności proteasomu lub innego enzymu proteolitycznego C-końcowa grupa fluorescencyjna ulega uwolnieniu wykazując wysoki stopień fluorescencji. Przykładowe sekwencje takich substratów fluorogenicznych opisano w pracy Ma [3], wykorzystując tego typu związki do oznaczania aktywności proteasomu w osoczu. Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, AMC to aminokumaryna.The proteasome is a multi-catalytic endopeptidase complex (EC 3.4.25.1) responsible for the non-lysosomal removal of proteins damaged and malformed as a result of mutations or under the influence of external factors causing oxidative stress [1,2]. Compounds developed so far that enable the determination of the activity of the 20S or 26S proteasome are short peptides containing 4-5 amino acid residues containing a fluorescent moiety at the C-terminus. These compounds enable the determination of the proteasome activity, including in the presence of a proteasome or other proteolytic enzyme, the C-terminal fluorescent group is released showing a high degree of fluorescence. Exemplary sequences of such fluorogenic substrates are described in the work of Ma [3], using such compounds to determine the activity of the proteasome in plasma. Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, AMC is aminocoumarin.
Przegląd danych literaturowych wskazuje że głównym obiektem badań monitorujących p oziom aktywności proteasomu są nowotwory układu krwionośnego [4]. Zdecydowana większość p ochodnych peptydowych będących substratami proteasomu została opracowana w laboratoriach komercyjnych takich jak Promega czy Molecular Probes [5]. Alternatywnie pomiar stężenia proteasomu przeprowadza się stosując techniki immunochemiczne (testy ELISA) [6] które wykorzystują rozpoznanie określonej podjednostki proteasomu przez określony typ przeciwciał. Jednak procedura ta jest czasochłonna i prowadzi do oznaczania całej populacji proteasomu a nie jego aktywnie e nzymatycznej frakcji.A review of the literature data indicates that the main target of research monitoring the level of proteasome activity are neoplasms of the blood system [4]. The vast majority of peptide substrates of the proteasome have been developed in commercial laboratories such as Promega or Molecular Probes [5]. Alternatively, the measurement of the proteasome concentration is performed using immunochemical techniques (ELISA assays) [6] that use the recognition of a specific proteasome subunit by a specific type of antibody. However, this procedure is time consuming and leads to the determination of the entire proteasome population rather than its active enzymatic fraction.
Opracowany i otrzymany nowy związek - znakowany peptyd charakteryzuje się wysoką wartością stałej specyficzności (rzędu 7,5 x 10 M- x s-) oraz właściwym dla tego typu oznaczeń limitem oznaczalności i detekcji, wynoszącym odpowiednio 32 pM i 5 pM. Wartości te świadczą o tym że związek jest hydrolizowany przez proteasom z dużą wydajnością, a ponadto już w obecności 32 pM tego enzymu. Cała procedura oznaczania aktywności proteasomu wymaga niewiele czasu (60 minut), nieskomplikowana (wymaga zmieszania 2 roztworów oraz wymaga niewielkiej ilości łatwo dostępnego materiału biologicznego jakim jest ludzki mocz (minimalna objętość 50 μ^. Podstawową zaletą otrzymanego związku i związanej z nią metody jest możliwość diagnostyki nowotworu pęcherza moczowego poprzez opisaną poniżej procedurę. Wynik dodatni (wzrost fluorescencji w czasie) jest jednoznaczny z obecnością w moczu aktywnego proteasomu co z kolei silnie koreluje z obecnością nowotworu.The developed and obtained new compound - the labeled peptide is characterized by a high value of the constant specificity (in the order of 7.5 x 10 M - xs - ) and the determination and detection limit of 32 pM and 5 pM, appropriate for this type of determination. These values prove that the compound is hydrolyzed by the proteasome with high efficiency and, moreover, in the presence of 32 pM of this enzyme. The entire procedure for determining the activity of the proteasome requires little time (60 minutes), simple (requires mixing 2 solutions and requires a small amount of readily available biological material such as human urine (minimum volume 50 μ ^. The main advantage of the obtained compound and the related method is the possibility of diagnosis) cancer of the bladder by the procedure described below: A positive result (increase in fluorescence over time) is synonymous with the presence of active proteasome in the urine, which in turn strongly correlates with the presence of cancer.
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie związku i sposobów, które mogłyby być zastosowane do wykrywania nowotworów, korzystnie nowotworu pęcherza. Nieoczekiwanie problem ten został rozwiązany w istotnym stopniu w niniejszym wynalazku.The object of the present invention is to provide a compound and methods that could be used to detect neoplasms, preferably bladder cancer. Surprisingly, this problem has been substantially solved by the present invention.
Przedmiotem wynalazku jest nowy związek o wzorze ogólnym:The subject of the invention is a new compound of the general formula:
ABZ1-Val2-Val3-Ser4-Tyr5-Ala6-Met7-Gly8-(Tyr(3-NO2)9-NH2 gdzie: ABZ oznacza kwas 2-amino benzoesowy.ABZ 1 -Val 2 -Val 3 -Ser 4 -Tyr 5 -Ala 6 -Met 7 -Gly 8 - (Tyr (3-NO2) 9 -NH2 where: ABZ is 2-amino benzoic acid.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania nowego związku zdefiniowanego powyżej, gdzie w następujących etapach:The invention also relates to a method for the preparation of a novel compound as defined above, wherein the steps below:
a) osadzenie Fmoc-Tyr(3-NO2)-OH na żywicy TentaGel S RAM, poprzez przyłączenie pochodnej aminokwasowej Fmoc-Tyr(3-NO2) do wolnych grup aminowych żywicy,a) depositing Fmoc-Tyr (3-NO 2 ) -OH on the TentaGel S RAM resin, by attaching the amino acid derivative Fmoc-Tyr (3-NO2) to the free amino groups of the resin,
b) żywicę przemyto DMF, a następnie usunięto osłony Fmoc z grupy aminowej,b) the resin was washed with DMF then removed the Fmoc shields from the amino group,
c) przyłączono resztę aminokwasową Fmoc-Gly-OH,c) the amino acid residue Fmoc-Gly-OH has been attached,
d) w taki sam sposób wprowadzono kolejne chronione pochodne aminokwasowe: metioninę, alaninę, tyrozynę, serynę, dwukrotnie waliny i cząsteczkę kwasu 2-aminobenzoesowego (ABZ),d) in the same way, further protected amino acid derivatives were introduced: methionine, alanine, tyrosine, serine, valine twice and a molecule of 2-aminobenzoic acid (ABZ),
e) otrzymano peptyd oznakowany fluorescencyjnie: ABZ1-Val2-Val3-Ser4-Tyr5-Ala6-Met7Gly8-(Tyr(3-NO2)9-NH2,e) a fluorescently labeled peptide was obtained: ABZ 1 -Val 2 -Val 3 -Ser 4 -Tyr 5 -Ala 6 -Met 7 Gly 8 - (Tyr (3-NO2) 9 -NH2,
f) następnie amid peptydu usunięto z nośnika wraz z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: TFA : fenol : woda : TIPS (88 : 5 : 5 : 2, v/v/v/v).f) then the peptide amide was removed from the support along with the simultaneous removal of the side covers with the mixture: TFA: phenol: water: TIPS (88: 5: 5: 2, v / v / v / v).
PL 225 341 B1PL 225 341 B1
Sposób gdzie ABZ jest donorem fluorescencji na N-końcu, a 3-nitro-L-tyrozyna jest wygaszaczem fluorescencji na C-końcu.A method where ABZ is a fluorescence donor at the N-terminus and 3-nitro-L-tyrosine is a fluorescence quencher at the C-terminus.
Roztwór farmaceutyczny do wykrywania nowotworów zawierający substancję czynną i bufor gdzie jako substancję czynną zawiera nowy związek określony w zastrzeżeniu 1 oraz bufor o pHA pharmaceutical solution for the detection of neoplasms comprising an active ingredient and a buffer wherein the active ingredient comprises the novel compound according to claim 1 and a buffer at pH
8,1-8,5.8.1-8.5.
Roztwór gdzie bufor ma pH korzystnie 8,3.A solution wherein the buffer has a pH of preferably 8.3.
Roztwór gdzie bufor jest wybrany z grupy zawierającej TRIS HCl, bufor fosforanowy, HEPES, BisTRIS, korzystnie TRIS-HCI.A solution wherein the buffer is selected from the group consisting of TRIS HCl, phosphate buffer, HEPES, BisTRIS, preferably TRIS-HCl.
Roztwór, który wykrywa nowotwory, korzystnie nowotwór pęcherza moczowego.A solution that detects neoplasms, preferably bladder cancer.
Sposób określania obecności choroby nowotworowej, który obejmuje analizowanie in vitro pobranej od człowieka próbki moczu, do której dodaje się nowy związek określony w zastrzeżeniu 1 i miesza się z buforem o pH 8,1-8,5.A method for determining the presence of a neoplastic disease, which comprises in vitro analyzing a human urine sample to which a novel compound as defined in claim 1 is added and mixed with a pH 8.1-8.5 buffer.
Sposób gdzie dokonuje się w czasie 0 min, 30 min, 60 min. Pomiaru intensywności fluorescencji powstałej na skutek uwolnienia fragmentu zawierającego znacznik fluorescencyjny ABZ -Val -Val Ser4-Tyr5.A method where the time is 0 min, 30 min, 60 min. Measurement of the fluorescence intensity due to the release of the fragment containing the fluorescent marker ABZ -Val -Val Ser 4 -Tyr 5 .
Sposób gdzie bufor ma pH korzystnie 8,3.A method wherein the buffer has a pH preferably of 8.3.
Sposób gdzie bufor jest wybrany z grupy TRIS HCl, bufor fosforanowy, HEPES, BisTRIS, korzystnie TRIS-HCI.A method wherein the buffer is selected from the group of TRIS HCl, phosphate buffer, HEPES, BisTRIS, preferably TRIS-HCI.
Sposób, który wykrywa nowotwory, korzystnie nowotwór pęcherza moczowego.A method that detects neoplasms, preferably bladder cancer.
Zestaw do wykrywania nowotworów, korzystnie nowotworu pęcherza moczowego, który zawiera nowy związek określony w zastrzeżeniu 1 oraz bufor o pH 8,1-8,5.A kit for detecting tumors, preferably bladder cancer, which comprises a novel compound as defined in claim 1 and a buffer with a pH of 8.1-8.5.
Zestaw gdzie bufor ma pH korzystnie 8,3.A kit wherein the buffer has a pH of preferably 8.3.
Zestaw gdzie bufor jest wybrany z grupy TRIS HCl, bufor fosforanowy, HEPES, BisTRIS, korzystnie TRIS-HCI.Kit wherein the buffer is selected from the group of TRIS HCl, phosphate buffer, HEPES, BisTRIS, preferably TRIS-HCI.
Zastosowanie hydrolizy in vitro nowego związku określonego powyżej gdzie w pozycji 5 poprzez proteasom 20S do wykrywania nowotworów, korzystnie nowotworu pęcherza.Use of in vitro hydrolysis of a novel compound as defined above where at position 5 via the 20S proteasome for the detection of tumors, preferably bladder cancer.
Określenia stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:The terms used above and in the specification and claims have the following meanings:
Boc - grupa tert-butyloksykarbonylowaBoc - tert-butyloxycarbonyl group
Fmoc - grupa 9-fluorenylometoksykarbonylowaFmoc - 9-fluorenylmethoxycarbonyl group
DMF - dimetyloformamidDMF - dimethylformamide
NMP - N-metylopirolidonNMP - N-methylpyrrolidone
DCM - dichlorometanDCM - dichloromethane
TFA - Trifluoroacetic acidTFA - Trifluoroacetic acid
TIPS - TriisopropylsilanTIPS - Triisopropylsilane
TRIS-HCI - Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochlorideTRIS-HCI - Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride
ABZ - kwas 2-amino benzoesowyABZ - 2-amino benzoic acid
Opis figur:Description of the figures:
Fig. 1 - przedstawia wynik analizy chromatograficznej związku (A) w obecności ludzkiego proteasomu 20S (B) oraz w trakcie inkubacji z ludzkim moczem (C) po 5 minutach i (D) po 60 minutach.Fig. 1 - Shows the result of the chromatographic analysis of compound (A) in the presence of the human 20S proteasome (B) and during incubation with human urine (C) after 5 minutes and (D) after 60 minutes.
Fig. 2 - Krzywa zależności intensywności fluorescencji od czasu dla próbek 42, 4,Fig. 2 - Fluorescence intensity time curve for samples 42,4,
16, 39 oraz H2 i H4. Fluorescencję monitorowano przy długości fali 450 nm.16, 39 and H2 and H4. Fluorescence was monitored at 450 nm.
Fig. 3 - przedstawia wyniki analizy próbek ludzkiego moczu osób zdrowych próbkiFig. 3 - Shows the results of analysis of human urine samples from healthy subjects
H (39) oraz zdiagnozowanym rakiem pęcherza (69).H (39) and diagnosed with bladder cancer (69).
Fig. 4 - przedstawia Blot próbek moczu osób ze zdiagnozowanym rakiem pęcherza moczowego.Figure 4. - Shows a blot of urine samples from people diagnosed with bladder cancer.
Fig. 5 - przedstawia wyniki Elisa human proteasome 20S detection kit dla 6 próbek osób zdrowych / 15 chorych.Fig. 5 - Shows the Elisa human proteasome 20S detection kit results for 6 healthy / 15 sick samples.
Tabela 1 - przedstawia przykładowe wartości aktywności proteosomu zależności fluorescencji w czasie dla próbek 42, 18, 27, 37 oraz H1 i H11.Table 1 - shows exemplary values of the proteosome activity of the fluorescence dependence on time for samples 42, 18, 27, 37 as well as H1 and H11.
Wynalazek ilustruje następujący przykład wykonania, nie stanowiący jego ograniczenia.The invention is illustrated by the following non-limiting embodiment.
PL 225 341 B1PL 225 341 B1
PrzykładExample
I) Synteza nowego związku:I) Synthesis of a new compound:
a) Pierwszym etapem syntezy było otrzymanie peptydu oznakowanego fluorescencyjnie który otrzymano metodą syntezy w fazie stałej z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBua) The first stage of the synthesis was to obtain a fluorescently labeled peptide obtained by solid phase synthesis using Fmoc / tBu chemistry
Związek o sekwencji ABZ1-Val2-Val3-Ser4-Tyr5-Ala6-Met7-Gly8-(Tyr(3-NO2)9-NH2, gdzie ABZ oznacza kwas 2-amino benzoesowy, otrzymano na drodze syntezy chemicznej w fazie stałej z wyk orzystaniem następujących pochodnych aminokwasowych.Compound with sequence ABZ 1 -Val 2 -Val 3 -Ser 4 -Tyr 5 -Ala 6 -Met 7 -Gly 8 - (Tyr (3-NO2) 9 -NH2, where ABZ is 2-amino benzoic acid, was prepared by solid phase chemical synthesis using the following amino acid derivatives.
Boc-ABZ, Fmoc-Val, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ala, Fmoc-Met, Fmoc-Gly, Fmoc-Tyr(3-NO2).Boc-ABZ, Fmoc-Val, Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Tyr (tBu), Fmoc-Ala, Fmoc-Met, Fmoc-Gly, Fmoc-Tyr (3-NO2).
Syntezę substratów peptydowych prowadzono na dwóch rodzajach nośnika stałego:The synthesis of peptide substrates was carried out on two types of solid support:
- żywicy TentaGel S RAM firmy RAPP Polymere (Niemcy) o osadzeniu 0,23 mmol/g- TentaGel S RAM resin from RAPP Polymere (Germany) with a deposit of 0.23 mmol / g
Syntezę wszystkich peptydów prowadzono w sposób manualny z zastosowaniem wytrząsarki laboratoryjnej. Przez większość etapów reaktorami była strzykawka zakończona spiekiem do syntezy w fazie stałej o pojemności 25 ml.The synthesis of all peptides was carried out manually using a laboratory shaker. For most of the steps, the reactors were a syringe terminated with a 25 mL frit for solid phase synthesis.
Wszystkie syntezowane substraty zawierały w swojej sekwencji na N-końcu kwas 2-aminobenzoesowy (ABZ) i cząsteczkę 3-nitro-L-tyrozyny położoną na C-końcu. ABZ pełnił rolę donora fluorescencji, natomiast Tyr(3-NO2) pełniła rolę wygaszacza fluorescencji. Peptydy w swojej sekwencji zawierały jedno miejsce reaktywne zlokalizowane pomiędzy resztami aminokwasowymi położonymi w pozycji P1-P1'.All synthesized substrates contained in their sequence at the N-terminus 2-aminobenzoic acid (ABZ) and a molecule of 3-nitro-L-tyrosine located at the C-terminus. ABZ acted as a fluorescence donor, while Tyr (3-NO 2 ) acted as a fluorescence quencher. The peptides in their sequence contained one reactive site located between the amino acid residues located in the P1-P1 'position.
Osadzenie Fmoc-Tyr(3-NO2)-OH na żywicy TentaGel S RAM:Deposition of Fmoc-Tyr (3-NO 2 ) -OH on TentaGel S RAM resin:
Syntezę peptydów wykonano na żywicy TentaGel S RAM firmy Rapp Polymere o osadzeniu 0,23 mmol/g. W pierwszym etapie dokonano spulchnienia żywicy poprzez cykl przemywań. Kolejno przystąpiono do usunięcia z nośnika osłony grupy aminowej Fmoc - za pomocą 20% roztworu piperydyny w NMP. Następnie przeprowadzono cykl przemywań rozpuszczalnikami. W celu potwierdzenia obecności wolnych grup aminowych wykonano test chloranilowy.The peptide synthesis was performed on Rapp Polymere's TentaGel S RAM resin with a deposit of 0.23 mmol / g. In the first stage, the resin was fluffed through a washing cycle. Subsequently, the Fmoc amino group protection was removed from the support - with the use of a 20% solution of piperidine in NMP. A solvent wash cycle was then performed. A chloranil test was performed to confirm the presence of free amino groups.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:Solvent wash cycle:
DMF 1 x 10 minutDMF 1 x 10 minutes
IsOH 1 x 10 minutIsOH 1 x 10 minutes
DCM 1 x 10 minutDCM 1 x 10 minutes
Usunięcie osłony Fmoc:Removing the Fmoc Cover:
DMF 1 x 5 minutDMF 1 x 5 minutes
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty20% piperidine in NMP 1 x 3 minutes
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut20% piperidine in NMP 1 x 8 minutes
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:Solvent wash cycle:
DMF 3 x 2 minutyDMF 3 x 2 minutes
IsOH 3 x 2 minutyIsOH 3 x 2 minutes
DCM 3 x 2 minutyDCM 3 x 2 minutes
Test chloranilowy:Chloranil Test:
Test chloranilowy polegał na przeniesieniu za pomocą łopatki, kilku ziaren żywicy z reaktora strzykawki do szklanej ampułki, do której następnie dodano 100 gl nasyconego roztworu p-chloranilu w toluenie i 50 gl świeżego aldehydu octowego. Po upływie 10 minut przeprowadzono kontrolę zabarwienia ziaren.The chloranil test consisted of transferring, using a spatula, a few grains of resin from a syringe reactor to a glass ampoule, to which then 100 g of a saturated p-chloranil solution in toluene and 50 g of fresh acetaldehyde were added. After 10 minutes, the color of the grains was checked.
Na tym etapie po przeprowadzeniu testu otrzymano zielone zabarwienie ziaren, które świadczyło o obecności wolnych grup aminowych. Po potwierdzeniu usunięcia osłon fluorenylometoksykarbonylowych z żywicy można było przystąpić do kolejnego etapu, przyłączania pochodnej aminokwasowej Fmoc-Tyr(3-NO2) .At this stage, after the test was performed, the grains were green, which indicated the presence of free amino groups. After confirming the removal of the fluorenylmethoxycarbonyl shields from the resin, it was possible to proceed to the next step, adding the amino acid derivative Fmoc-Tyr (3-NO2).
Przyłączanie Fmoc-Tyr(3-NO2)-OH do żywicy:Attaching Fmoc-Tyr (3-NO 2 ) -OH to the resin:
Wszystkie przyłączania reszt aminokwasowych poprzedzono przemywaniem żywicy za pomocą DMF przez 5 minut. W kolejnych przyłączan iach stosowano diisopropylokarbodiimid jako środek sprzęgający. Procedurę powtarzano dwukrotnie.All additions of amino acid residues were preceded by washing the resin with DMF for 5 minutes. Subsequent attachments used diisopropylcarbodiimide as a coupling agent. The procedure was repeated twice.
PL 225 341 B1PL 225 341 B1
Po każdym z acylowań rozpoczynano cykl przemywań żywicy, a następnie wykonywano test chloranilowy, w celu monitorowania przyłączania pochodnej aminokwasowej Fmoc-Tyr(3-NO2) do wolnych grup aminowych żywicy.After each acylation, the resin wash cycle was initiated, followed by a chloranil assay to monitor the attachment of the amino acid derivative Fmoc-Tyr (3-NO2) to the free amino groups of the resin.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:Solvent wash cycle:
DMF 3 x 2 minutyDMF 3 x 2 minutes
IsOH 3 x 2 minutyIsOH 3 x 2 minutes
DCM 3 x 2 minutyDCM 3 x 2 minutes
Test chloranilowy:Chloranil Test:
W wyniku przeprowadzonych testów po dwóch pierwszych sprzęganiach zabarwienie ziaren najpierw było zielone, a następnie szare, więc konieczne było przeprowadzenie kolejnego acylowania, w wyniku którego ziarna żywicy badanej testem chloranilowym były bezbarwne. Świadczyło to przyłączeniu Fmoc-Tyr(3-NO2)-OH do żywicy TentaGel S RAM, co pozwoliło przejść do następnego etapu syntezy peptydu.As a result of the tests, after the first two couplings, the color of the grains was first green and then gray, so it was necessary to perform another acylation, as a result of which the resin grains tested with the chloranil test were colorless. This indicated the attachment of Fmoc-Tyr (3-NO 2 ) -OH to the TentaGel S RAM resin, which allowed to proceed to the next stage of peptide synthesis.
Przyłączanie kolejnych chronionych reszt aminokwasowych:Attaching further protected amino acid residues:
Żywicę wraz z przyłączoną resztą Fmoc-Tyr(3-NO2)-OH znajdującą się w reaktorku przemyto za pomocą DMF, a następnie przystąpiono do deprotekcji osłony Fmoc z grupy aminowej w celu przyłączenia chronionej pochodnej aminokwasowej glicyny.The resin along with the attached Fmoc-Tyr (3-NO 2 ) -OH residue in the reactor was washed with DMF followed by deprotection of the Fmoc amine shell to attach the protected amino acid derivative of glycine.
Usunięcie osłony Fmoc:Removing the Fmoc Cover:
DMF 1 x 5 minutDMF 1 x 5 minutes
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty20% piperidine in NMP 1 x 3 minutes
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut20% piperidine in NMP 1 x 8 minutes
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:Solvent wash cycle:
DMF 3 x 2 minutyDMF 3 x 2 minutes
IsOH 3 x 2 minutyIsOH 3 x 2 minutes
DCM 3 x 2 minutyDCM 3 x 2 minutes
Test chloranilowy:Chloranil Test:
W wyniku przeprowadzenia testu chloranilowego otrzymano wynik pozytywny, o czym świadczyło zielone zabarwienie ziaren żywicy. Pozwoliło to na rozpoczęcie kolejnego etapu - przyłączania reszty aminokwasowej Fmoc-Gly-OH.As a result of the chloranil test, a positive result was obtained, as evidenced by the green color of the resin grains. This allowed for the commencement of the next stage - the attachment of the Fmoc-Gly-OH amino acid residue.
Przyłączanie pochodnej aminokwasowej:Attaching an amino acid derivative:
Wykonywane sprzęgania poprzedzono przemywaniem żywicy w DMF. Podczas przyłączania chronionej reszty glicyny skład mieszaniny sprzęgającej pozostawał bez zmian.Performed couplings were preceded by washing the resin in DMF. The composition of the coupling mixture remained unchanged during the attachment of the protected glycine residue.
Po zakończeniu każdego z acylowań stosowano cykl przemywań rozpuszczalnikami według podanej procedury, a następnie przeprowadzono test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych w roztworze.After completion of each acylation, the solvent washing cycle was carried out according to the procedure given, followed by a chloranil test for the presence of free amino groups in the solution.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:Solvent wash cycle:
DMF 3 x 2 minutyDMF 3 x 2 minutes
IsOH 3 x 2 minutyIsOH 3 x 2 minutes
DCM 3 x 2 minutyDCM 3 x 2 minutes
Test chloranilowy:Chloranil Test:
Ziarna żywicy testu przeprowadzonego po drugim acylowaniu były bezbarwne, co pozwoliło na przejście do kolejnego etapu syntezy, jakim było wprowadzenie kolejnych chronionych pochodnych aminokwasowych - metioniny, alaniny, tyrozyny, seryny, dwukrotnie waliny i cząsteczki kwasu 2-aminobenzoesowego. Procesy sprzęgania odbyły się zgodnie z procedurą omówioną wcześniej.The resin grains of the test carried out after the second acylation were colorless, which allowed for the next stage of synthesis, which was the introduction of further protected amino acid derivatives - methionine, alanine, tyrosine, serine, twice valine and 2-aminobenzoic acid molecules. Coupling processes took place according to the procedure discussed earlier.
Testy przeprowadzone po przyłączeniu wyżej wymienionych reszt wykazały wyniki pozytywne, ziarna żywicy były bezbarwne.Tests carried out after the attachment of the abovementioned residues showed positive results, the resin grains were colorless.
b) Usuwanie peptydu z nośnikab) Removing the peptide from the support
Po zakończeniu syntezy amid peptydu usunięto z nośnika wraz z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: TFA : fenol : woda : TIPS (88 : 5 : 5 : 2, v/v/v/v) w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym.After the synthesis was completed, the peptide amide was removed from the support along with the removal of the side covers with the mixture: TFA: phenol: water: TIPS (88: 5: 5: 2, v / v / v / v) in a round bottom flask on a magnetic stirrer.
PL 225 341 B1PL 225 341 B1
Po upływie 3 godzin zawartość kolby sączyło się pod zmniejszonym ciśnieniem na lejkach ze spiekiem Schotta przemywając eterem dietylowym. Powstały osad odwirowano na wirówce SIGMAAfter 3 hours, the contents of the flask were vacuum filtered on Schott funnels, washing with diethyl ether. The resulting pellet was centrifuged on a SIGMA centrifuge
2K30 (Laboratory Centrifuges) w czasie 20 minut. Osad otrzymany po wirowaniu rozpuszcza się w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddano liofilizacji.2K30 (Laboratory Centrifuges) for 20 minutes. The pellet obtained after centrifugation is dissolved in water with the use of ultrasound and then lyophilized.
c) Tożsamość/charakterystyka nowego związku - analiza HPLC, MS oraz NMRc) New compound identity / characterization - HPLC, MS and NMR analysis
HPLC warunki: kolumna RP Bio Wide Pore Supelco C8 250 mm 4 mm, układ faz A 0,1% TFA w wodzie, B: 80% acetonitrylu w A), przepływ 1 ml/min, detekcja UV przy 226 nm.HPLC conditions: RP Bio Wide Pore Supelco C8 column 250mm 4mm, A phase configuration 0.1% TFA in water, B: 80% acetonitrile in A), flow 1 ml / min, UV detection at 226 nm.
tR 20.60tR 20.60
MS MALDI TOF matryca kwas alfa cynamonowy masa cząsteczkowa 1054,23 Da obliczona 1053,1 H1 NMR 500 MHz s 8,50 (1H); m 8,00 (11 H); m 7,5-7,1 (11H); m 6,7-6,5 (5H); s 6,3 (2H); s 5,42 (2H); m 4,8 (3H); m 4,7-4,4 (4H); m 4,1 (4H); m 3,9-3,7 (2H); s 3,6 (1H); m 3,4-3,2 (4H); m 2,7 (2H); m 2,06 (2H); m 1,5 (3H); m 0,8 (12H)MS MALDI TOF matrix alpha cinnamic acid molecular weight 1054.23 Da calculated 1053.1 H 1 NMR 500 MHz s 8.50 (1H); m 8.00 (11H); m 7.5-7.1 (11H); m 6.7-6.5 (5H); s 6.3 (2H); s 5.42 (2H); m 4.8 (3H); m 4.7-4.4 (4H); m 4.1 (4H); m 3.9-3.7 (2H); s 3.6 (1H); m 3.4-3.2 (4H); m 2.7 (2H); m 2.06 (2H); m 1.5 (3H); m 0.8 (12H)
II) Badania potwierdzająceII) Confirmatory tests
a) Wyniki na modelach/walidacjaa) Model results / validation
Otrzymany nowy związek jest efektywnie hydrolizowany przez podjednostkę chymotrypsynopodobną ludzkiego proteasomu 20S. Ten wewnątrzkomórkowy kompleks enzymatyczny w określonych stanach patofizjologicznych wydostaje się z komórki i krąży w osoczu i innych płynach ustrojowych w tym moczu.The resulting new compound is efficiently hydrolyzed by the chymotrypsin-like subunit of the human 20S proteasome. This intracellular enzyme complex under certain pathophysiological conditions leaves the cell and circulates in plasma and other body fluids, including urine.
W wyniku prowadzonej hydrolizy enzymatycznej powstają dwa fragmenty: ABZ-Val-Val-Ser-TyrOH - silnie fluorescencyjny, którego wzrost stężenia w czasie jest podstawą testu oraz C-końcowy fragment Ala-Met-Gly-Tyr(3-NO2)-NH2 pozbawiony właściwości fluorescencyjnych. (Fig. 1A, 1B). Wzrost fluorescencji w obecności proteasomu jest proporcjonalny do jego stężenia.As a result of the enzymatic hydrolysis, two fragments are formed: ABZ-Val-Val-Ser-TyrOH - strongly fluorescent, whose concentration increase over time is the basis of the test and the C-terminal fragment of Ala-Met-Gly-Tyr (3-NO2) -NH2 devoid of fluorescent properties. (Figs. 1A, 1B). The increase in fluorescence in the presence of the proteasome is proportional to its concentration.
Analiza HPLC i MS potwierdza obecność omawianych wyżej fragmentów związku ABZ-Val-ValSer-Tyr-OH oraz Ala-Met-Gly-Tyr(3-NO2)-NH2 powstałych w wyniku trawienia przez podjednostkę chymotrypsynopodobną proteasomu 20S (rys. 1 B). Zahamowanie jej aktywności poprzez użycie selektywnego inhibitora tej podjednostki powoduje brak hydrolizy związku.HPLC and MS analysis confirms the presence of the ABZ-Val-ValSer-Tyr-OH and Ala-Met-Gly-Tyr (3-NO2) -NH2 fragments discussed above, resulting from digestion by the chymotrypsin-like subunit of the 20S proteasome (Fig. 1B). Inhibition of its activity by the use of a selective inhibitor of this subunit results in no compound hydrolysis.
b) Wyniki w moczub) Urine results
Procedura oznaczania aktywności proteasomu w próbce przebiegała następująco. Badaną próbkę moczu (50 μΊ) mieszano z buforem Tris HCl pH 8,3 w stosunku 1:1. Do tak przygotowanej mieszaniny dodano roztworu związku 100 μl w podanym wyżej buforze. Tak otrzymaną mieszaninę inkubowano w temp 37°C. Pomiar fluorescencji układu wykonywano przy długości fali wzbudzenia 320 nm a emisji fluorescencji 450 nm. Pomiar prowadzono w sposób ciągły lub w wybranych odstępach czasu tj.: 0, 30 minut, 60 minut. Podobne wyniki uzyskano w buforze HEPES lecz buforze tym związek wykazywał słabą rozpuszczalność, w buforach fosforanowym i BisTris o analogicznej wartości pH szybkość wzrostu fluorescencji była niższa.The procedure for determining proteasome activity in a sample was as follows. The test urine sample (50 μΊ) was mixed with Tris HCl pH 8.3 buffer in the ratio 1: 1. To the mixture thus prepared, a 100 μl solution of the compound in the above-mentioned buffer was added. The mixture thus obtained was incubated at 37 ° C. System fluorescence measurement was performed at an excitation wavelength of 320 nm and fluorescence emission at 450 nm. The measurement was carried out continuously or at selected time intervals, i.e. 0, 30 minutes, 60 minutes. Similar results were obtained in HEPES buffer, but with this buffer the compound showed poor solubility, in phosphate and BisTris buffers with analogous pH value, the growth rate of fluorescence was lower.
Inkubacja otrzymanego nowego związku w moczu pochodzącego od osób chorych na raka pęcherza i analiza chromatograficzna takiej mieszaniny skutkuje powstaniem fragmentów związku tożsamych z opisanymi wyżej gdzie w systemie zastosowano izolowany proteasom 20S. Użycie selektywnych inhibitorów podjednostki chymotrypsynopodobnej powoduje brak rozpadu związku. Rozp adu związku nie obserwuje się w moczu pochodzących od zdrowych ochotników (Fig. 1C, 1D).Incubation of the obtained new compound in the urine of people suffering from bladder cancer and chromatographic analysis of such a mixture results in the formation of fragments of the compound identical to those described above, where the system uses an isolated 20S proteasome. The use of selective inhibitors of the chymotrypsin-like subunit results in no degradation of the compound. Compound degradation is not observed in urine from healthy volunteers (Fig. 1C, 1D).
Przebadano 108 próbek (69 pochodzących od osób chorych i 39 zdrowych) przy użyciu opracowanego nowego związku wykazała że większość próbek pochodzących od pacjentów chorych (61) wykazuje wzrost fluorescencji świadczący o rozpadzie peptydu pod wpływem proteasomu. Przykładowe krzywe zależności fluorescencji w czasie dla próbek 42, 18, 27, 37 oraz H1 i H11 przedstawiono na Fig. 2 oraz tabeli 1. Żadna z próbek zdrowych takiego wzrostu nie wykazała (Fig. 3).108 samples (69 from sick and 39 healthy) were tested with the use of the new compound, which showed that the majority of samples from sick patients (61) showed an increase in fluorescence, which indicates the decay of the peptide under the influence of the proteasome. Exemplary fluorescence time curves for samples 42, 18, 27, 37 and H1 and H11 are shown in Fig. 2 and Table 1. None of the healthy samples showed such an increase (Fig. 3).
Test potwierdzający - BLOTConfirmation test - BLOT
Analiza immunochemiczna tj. SDS PAGE próbek moczu zdrowych osób (ochotników) i chorych na raka pęcherza a następnie półsuchy transfer na membranę i inkubacja z przeciwciałem antyproteasome 20S ujawniła obecność prążków tylko w materiale pochodzącym od osób chorych (Fig. 4).Immunochemical analysis, ie SDS PAGE, of urine samples from healthy subjects (volunteers) and patients with bladder cancer, followed by semi-dry membrane transfer and incubation with the 20S anti-protease antibody revealed the presence of bands only in the material from sick persons (Fig. 4).
PL 225 341 B1PL 225 341 B1
Test potwierdzający - ELISAConfirmatory test - ELISA
Badane próbki analizowano zestawem ELISA wykrywającym proteasom 20S. Otrzymane wyniki silnie korelują z tymi otrzymanymi przy użyciu nowego związku będącego przedmiotem wynalazku (Fig. 5).Test samples were analyzed with an ELISA kit detecting the 20S proteasome. The obtained results correlate strongly with those obtained with the use of the new compound object of the invention (Fig. 5).
Literatura:Literature:
1. Borissenko L., Groll M., Diversity of proteasomal missions: fine tuning of the immune response, Biol. Chem., 388, 947-955, 2007.1. Borissenko L., Groll M., Diversity of proteasomal missions: fine tuning of the immune response, Biol. Chem., 388,947-955, 2007.
2. Groll M., Bochtler M., Brandstetter H., Clausen T., Huber R., Molecular machines for protein degradation, ChemBioChem., 6, 222-256, 2005.2. Groll M., Bochtler M., Brandstetter H., Clausen T., Huber R., Molecular machines for protein degradation, ChemBioChem., 6, 222-256, 2005.
3. Ma W, Kantarjian H, O'Brien S, Jilani I, Zhang X, Estrov Z, et al. Enzymatic activity of circulating proteasomes correlates with clinical behavior in patients with chronic lymphocytic leukemia. Cancer 2008; 112: 1306-12.3. Ma W, Kantarjian H, O'Brien S, Jilani I, Zhang X, Estrov Z, et al. Enzymatic activity of circulating proteasomes correlates with clinical behavior in patients with chronic lymphocytic leukemia. Cancer 2008; 112: 1306-12.
4. Ostrowska H, Hempel D, Holub M, Sokolowski J, Kloczko J. Assessment of circulating proteasome chymotrypsin-like activity in plasma of patients with acute and chronic leukemias. Clin Biochem. 2008 Nov; 41 (16-17): 1377-83.4. Ostrowska H, Hempel D, Holub M, Sokolowski J, Kloczko J. Assessment of circulating proteasome chymotrypsin-like activity in plasma of patients with acute and chronic leukemias. Clin Biochem. 2008 Nov; 41 (16-17): 1377-83.
5. www.promega.com5. www.promega.com
6. Ma W, Kantarjian H, O'Brien S, Jilani I, Zhang X, Estrov Z, et al. Enzymatic activity of circulating proteasomes correlates with clinical behavior in patients with chronic lymphocytic leukemia. Cancer 2008; 112: 1306-12.6. Ma W, Kantarjian H, O'Brien S, Jilani I, Zhang X, Estrov Z, et al. Enzymatic activity of circulating proteasomes correlates with clinical behavior in patients with chronic lymphocytic leukemia. Cancer 2008; 112: 1306-12.
Claims (16)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL408905A PL225341B1 (en) | 2014-07-17 | 2014-07-17 | New compound, method for obtaining it, pharmaceutical solution containing the new compound, method for determination of the presence of tumor disease, accessories for cancer detection and application of the hydrolysis of the new compound for cancer detection |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL408905A PL225341B1 (en) | 2014-07-17 | 2014-07-17 | New compound, method for obtaining it, pharmaceutical solution containing the new compound, method for determination of the presence of tumor disease, accessories for cancer detection and application of the hydrolysis of the new compound for cancer detection |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL408905A1 PL408905A1 (en) | 2016-01-18 |
| PL225341B1 true PL225341B1 (en) | 2017-03-31 |
Family
ID=55072340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL408905A PL225341B1 (en) | 2014-07-17 | 2014-07-17 | New compound, method for obtaining it, pharmaceutical solution containing the new compound, method for determination of the presence of tumor disease, accessories for cancer detection and application of the hydrolysis of the new compound for cancer detection |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL225341B1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3431490A1 (en) * | 2017-07-17 | 2019-01-23 | Uniwersytet Gdanski | Chemical compounds for use as diagnostic markers of inflammation and neoplams, the method for synthesis of the chemical compounds, diagnostic kit for use in diagnosis of inflammatory processes and epithelial neoplasms and in vitro diagnostic method of inflammatory processes and epithelial neoplasms |
| PL422233A1 (en) * | 2017-07-17 | 2019-01-28 | Uniwersytet Gdański | New compound, method for obtaining it, a kit containing the new compound and application of the new compound for detection of epithelial tumors |
| WO2020017984A1 (en) * | 2018-07-14 | 2020-01-23 | Uniwersytet Gdanski | Chemical compounds for use as diagnostic markers of inflammation and neoplasms |
| EP3919911A1 (en) * | 2020-06-04 | 2021-12-08 | Urteste S.A. | Novel diagnostic marker for prostate cancer |
-
2014
- 2014-07-17 PL PL408905A patent/PL225341B1/en unknown
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3431490A1 (en) * | 2017-07-17 | 2019-01-23 | Uniwersytet Gdanski | Chemical compounds for use as diagnostic markers of inflammation and neoplams, the method for synthesis of the chemical compounds, diagnostic kit for use in diagnosis of inflammatory processes and epithelial neoplasms and in vitro diagnostic method of inflammatory processes and epithelial neoplasms |
| PL422233A1 (en) * | 2017-07-17 | 2019-01-28 | Uniwersytet Gdański | New compound, method for obtaining it, a kit containing the new compound and application of the new compound for detection of epithelial tumors |
| PL238575B1 (en) * | 2017-07-17 | 2021-09-06 | Univ Gdanski | The compound and its use for the detection of epithelial tumors |
| WO2020017984A1 (en) * | 2018-07-14 | 2020-01-23 | Uniwersytet Gdanski | Chemical compounds for use as diagnostic markers of inflammation and neoplasms |
| EP3919911A1 (en) * | 2020-06-04 | 2021-12-08 | Urteste S.A. | Novel diagnostic marker for prostate cancer |
| WO2021246883A1 (en) * | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Urteste S.A. | Novel diagnostic marker for prostate cancer |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL408905A1 (en) | 2016-01-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL225341B1 (en) | New compound, method for obtaining it, pharmaceutical solution containing the new compound, method for determination of the presence of tumor disease, accessories for cancer detection and application of the hydrolysis of the new compound for cancer detection | |
| KR20240099390A (en) | FRET enzyme substrates and their use in liver cancer | |
| Feliu et al. | Synthesis of an 8‐Benzyl‐4‐(p‐substituted‐benzyl)‐1, 4, 8‐triazaspiro [4.5] decan‐2‐one Library on SynPhase TMLanterns | |
| US20250270617A1 (en) | Compound - diagnostic marker for kidney cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of kidney cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of kidney cancer | |
| US20250003970A1 (en) | Fret enzymatic substrate and uses thereof in lung cancer | |
| US20250206777A1 (en) | Compound - diagnostic marker for intestinal cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of intestinal cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of intestinal cancer | |
| CN112794878B (en) | Deubiquitinase activity probe and preparation and application thereof | |
| PL238575B1 (en) | The compound and its use for the detection of epithelial tumors | |
| EP3431490B1 (en) | Chemical compounds for use as diagnostic markers of inflammation and neoplams, the method for synthesis of the chemical compounds, diagnostic kit for use in diagnosis of inflammatory processes and epithelial neoplasms and in vitro diagnostic method of inflammatory processes and epithelial neoplasms | |
| JP2026500952A (en) | Compound - Diagnostic marker for biliary tract cancer, method for detecting enzyme activity, method for diagnosing biliary tract cancer, kit containing the compound, use of the compound, and method for treating biliary tract cancer | |
| PL245425B1 (en) | A diagnostic marker compound for endometrial cancer, a method for detecting enzymatic activity, a method for diagnosing endometrial cancer, a kit containing such a compound and a compound for medical use | |
| TWI776812B (en) | Angiotensin-1-receptor antagonists | |
| HK40113726A (en) | Compound - diagnostic marker for kidney cancer, method for detecting enzymaticactivity, method for diagnosis of kidney cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of kidney cancer | |
| PL236125B1 (en) | Chemical compounds used as diagnostic markers of inflammation and cancer, method of their preparation, diagnostic kit and method of diagnosing inflammatory processes and epithelial cancers | |
| JP2025535688A (en) | Compounds - Diagnostic markers for ovarian cancer, methods for detecting enzyme activity, methods for diagnosing ovarian cancer, kits containing the compounds, uses of the compounds, and methods for treating ovarian cancer | |
| EP3464324B1 (en) | Angiotensin-1-receptor antagonists | |
| HK40129291A (en) | Compound - diagnostic marker for biliary tract cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of biliary tract cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of biliary tract cancer | |
| HK40111059A (en) | Compound - diagnostic marker for intestinal cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of intestinal cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of intestinal cancer | |
| Terrett | Combinatorial Chemistry Online Volume 12, Issue 3, March 2010 | |
| PL238699B1 (en) | A chemical compound used as a tumor diagnostic marker, method of preparation, method of diagnosing epithelial neoplasms | |
| HK40004701A (en) | Angiotensin-1-receptor antagonists | |
| HK40004701B (en) | Angiotensin-1-receptor antagonists |