PL236125B1 - Chemical compounds used as diagnostic markers of inflammation and cancer, method of their preparation, diagnostic kit and method of diagnosing inflammatory processes and epithelial cancers - Google Patents
Chemical compounds used as diagnostic markers of inflammation and cancer, method of their preparation, diagnostic kit and method of diagnosing inflammatory processes and epithelial cancers Download PDFInfo
- Publication number
- PL236125B1 PL236125B1 PL426332A PL42633218A PL236125B1 PL 236125 B1 PL236125 B1 PL 236125B1 PL 426332 A PL426332 A PL 426332A PL 42633218 A PL42633218 A PL 42633218A PL 236125 B1 PL236125 B1 PL 236125B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- abz
- anb
- pna
- pro
- compound
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 title claims abstract description 41
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 34
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 title claims abstract description 30
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 11
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 title abstract description 9
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 title abstract 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title 1
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 63
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 63
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 22
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- -1 2-chlorochlorotrityl Chemical group 0.000 claims description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 10
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 8
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 8
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000000151 deposition Methods 0.000 claims description 8
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 6
- KZZWQCKYLNIOBT-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-nitrobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(O)=O)=C1 KZZWQCKYLNIOBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 73
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 26
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 25
- UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N tetrachloro-1,4-benzoquinone Chemical compound ClC1=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C(Cl)C1=O UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 description 18
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 17
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101100074988 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) nmp-1 gene Proteins 0.000 description 12
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 12
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 12
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 11
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 10
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- AHDSRXYHVZECER-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-tris[(dimethylamino)methyl]phenol Chemical compound CN(C)CC1=CC(CN(C)C)=C(O)C(CN(C)C)=C1 AHDSRXYHVZECER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 208000034179 Neoplasms, Glandular and Epithelial Diseases 0.000 description 9
- ZPGDWQNBZYOZTI-UHFFFAOYSA-N 1-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCN1C(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ZPGDWQNBZYOZTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 8
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 5
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 5
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 5
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 5
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 5
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007821 HATU Substances 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012317 TBTU Substances 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000006593 Urologic Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000008636 Neoplastic Processes Diseases 0.000 description 3
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000003741 urothelium Anatomy 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZZOKVYOCRSMTSS-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl carbamate Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N)C3=CC=CC=C3C2=C1 ZZOKVYOCRSMTSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010046431 Urethral cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010046458 Urethral neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 2
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N phosphoryl trichloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)=O XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229910019213 POCl3 Inorganic materials 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- WXIONIWNXBAHRU-UHFFFAOYSA-N [dimethylamino(triazolo[4,5-b]pyridin-3-yloxy)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CN=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 WXIONIWNXBAHRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- BLMPQMFVWMYDKT-NZTKNTHTSA-N carfilzomib Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)[C@]1(C)OC1)NC(=O)CN1CCOCC1)CC1=CC=CC=C1 BLMPQMFVWMYDKT-NZTKNTHTSA-N 0.000 description 1
- 108010021331 carfilzomib Proteins 0.000 description 1
- 229960002438 carfilzomib Drugs 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000010932 epithelial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100001039 immunological change Toxicity 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000013101 initial test Methods 0.000 description 1
- QTBFPMKWQKYFLR-UHFFFAOYSA-N isobutyl chloride Chemical compound CC(C)CCl QTBFPMKWQKYFLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- VWBWQOUWDOULQN-UHFFFAOYSA-N nmp n-methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O.CN1CCCC1=O VWBWQOUWDOULQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035778 pathophysiological process Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/1013—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia są nowe związki mające zastosowanie w diagnostyce stanu zapalnego i nowotworów. Pierwsze dwa związki to związek o wzorze ogólnym: ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-X6, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, X to oznacza ANB-NH2 lub pNA, przy czym ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, zaś pNA oznacza 4-nitroanilinę. Kolejny związek to: związek o wzorze ogólnym: ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA6 gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, pNA oznacza 4-nitroanilinę. Przedmiotem zgłoszenia jest również sposób otrzymywania nowych związków, marker diagnostyczny, zestaw diagnostyczny do zastosowania we wczesnej diagnostyki nowotworu nabłonkowego i/lub stanu zapalnego, sposób diagnozowania nowotworu nabłonkowego i/lub procesu zapalnego w materiale biologicznym ssaka.The subject of the application is new compounds that are used in the diagnosis of inflammation and cancer. The first two compounds are a compound of the general formula: ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-X6, where: ABZ is 2-aminobenzoic acid, X is ANB-NH2 or pNA, where ANB-NH2 is 5-amino-2-benzoic acid amide, and pNA is 4-nitroaniline. The next compound is: a compound of the general formula: ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA6 where: ABZ is 2-aminobenzoic acid, pNA is 4-nitroaniline. The subject of the application is also a method of obtaining new compounds, a diagnostic marker, a diagnostic kit for use in early diagnosis of epithelial cancer and/or inflammation, a method of diagnosing epithelial cancer and/or inflammation in biological material of a mammal.
Description
Opis wynalazkuDescription of the invention
Przedmiot wynalazku mieści się w dziedzinie diagnostyki stanów zapalnych toczących się in vivo w wyniku reakcji komórek immunologicznych w ognisku zapalnym oraz diagnostyki nowotworów, zwłaszcza nabłonkowych, jak i markerów diagnostycznych procesów zapalnych i markerów diagnostycznych umożliwiających wykrywanie, na wczesnym etapie, rozwój nowotworów nabłonkowych. Wynalazek dotyczy związków do zastosowania medycznego - diagnostycznego - w diagnostyce stanów zapalnych oraz we wczesnej diagnostyce nowotworów nabłonkowych, przy czym związki te używane są jako odczynnik diagnostyczny - marker diagnostyczny - do wykrywania procesu patofizjologicznego w materiale biologicznym ssaków, zwłaszcza krwi i moczu człowieka. Wynalazek dotyczy markerów diagnostycznych - odczynnik diagnostyczny do wykrywania zmian immunologicznych w tym do predykcji rozwoju procesu nowotworzenia z komórek nabłonkowych na bardzo wczesnym etapie rozwoju choroby, nawet przed procesem nowotworzenia, i diagnozowania procesu zapalnego, czy też wykrywania już rozpoczętego procesu nowotworzenia z jednoczesną reakcją zapalną, oraz odczynnik do wykrywania dodatkowych procesów zapalnych przy obecności nowotworu nabłonkowego np. zakażenia bakteryjnego lub wirusowego. Wynalazek dotyczy również sposobu otrzymywania nowych związków na bazie łańcucha aminokwasów, które znajdują zastosowanie w diagnostyce procesów zapalnych i/lub nowotworów nabłonkowych.The subject of the invention is in the field of diagnostics of in vivo inflammatory conditions as a result of immune cells reaction in the inflammatory focus and diagnostics of neoplasms, especially epithelial, as well as diagnostic markers of inflammatory processes and diagnostic markers enabling the detection, at an early stage, of the development of epithelial neoplasms. The invention relates to compounds for medical - diagnostic - use in the diagnosis of inflammatory conditions and in the early diagnosis of epithelial neoplasms, these compounds being used as a diagnostic reagent - diagnostic marker - to detect pathophysiological processes in biological material of mammals, especially human blood and urine. The invention concerns diagnostic markers - a diagnostic reagent for the detection of immunological changes, including the prediction of the development of the neoplastic process from epithelial cells at a very early stage of the development of the disease, even before the neoplastic process, and the diagnosis of the inflammatory process, or the detection of an already started neoplastic process with a simultaneous inflammatory reaction, and a reagent for detecting additional inflammatory processes in the presence of an epithelial tumor, e.g. bacterial or viral infection. The invention also relates to a process for the preparation of novel compounds based on the amino acid chain which are useful in the diagnosis of inflammatory processes and / or epithelial neoplasms.
Znane są związki i markery diagnostyczne do wykrywania stanu zapalnego jak i procesu nowotworzenia.Compounds and diagnostic markers for the detection of inflammation and neoplasms are known.
Ze względu na fakt, że późno wykryty stan zapalny zmierzający do powstania nowotworu wiąże się ze zmniejszeniem szans na wyleczenie lub wiąże się z trudnościami terapeutycznymi, wciąż poszukuje się nowych związków diagnostycznych mogących w sposób jak najbardziej czuły i specyficzny wykryć procesy chorobowe jak w najwcześniejszym etapie procesu patofizjologicznego.Due to the fact that late-detected inflammation leading to cancer formation is associated with a reduction in the chances of a cure or associated with therapeutic difficulties, new diagnostic compounds that could, in the most sensitive and specific manner, detect disease processes at the earliest stage of the process are still being sought. pathophysiological.
Przedmiotem wynalazku było opracowanie czułego i specyficznego markera diagnostycznego, który umożliwi zdiagnozowanie nowotworu, zwłaszcza nabłonkowego, zwłaszcza raka pęcherza, raka przewodów moczowych, raka cewki moczowej, czy też innych nowotworów, którym towarzyszy podwyższeniem aktywności enzymów proteolitycznych, i których to proces chorobowy może być obserwowany w materiale biologicznym, zwłaszcza moczu pacjenta, na bardzo wczesnym etapie chorobotwórczym, czyli nawet na etapie reakcji zapalnej. Nieoczekiwanie okazało się, że opracowane nowe związki zawierające aminokwasy stanowią markery diagnostyczne, które jedynie w obecności enzymów proteolitycznych, które są wynikiem reakcji zapalnej i/lub nowotworu nabłonkowego, i które to enzymy uwalniane są i obecne w materiale biologicznym, wykazują właściwości chromogeniczne i/lub fluorogeniczne mierzone w zakresie fal 300-500 nm, zwłaszcza 380-430. Właściwości barwne są obserwowane podczas hydrolizy enzymatycznej tych związków w materiale biologicznym, zwłaszcza moczu i krwi pacjenta, u którego rozwija się lub już rozwinął się nowotwór nabłonkowy, w tym z towarzyszącym procesem zapalnym czy też rozwinęła się sama odpowiedź zapalna lub odpowiedź zapalna towarzysząca dodatkowo chorobie nowotworowej. W przypadku nowotworów, proces ten wiąże się ze skutkami choroby nowotworowej czyli podwyższeniem aktywności enzymów proteolitycznych guza i okolicznych tkanek wynikających z wielu procesów, do których zalicza się podwyższoną angiogenezę, remodeling tkanek, nekrozę tkanek zdrowych wskutek nacieku nowotworu a także apoptozę komórek nowotworowych. Część związków według wynalazku umożliwia wykrywanie nawet już procesu zapalnego, poprzez również ich hydrolizę, w tym za pomocą uwalnianych enzymów z ogniska zapalnego w trakcie procesu immunologicznego, co wiąże się z wywołaniem reakcji barwnej wykrywanej poprzez pomiar absorbancji w zakresie fal 300-500 nm, zwłaszcza 380-430.The subject of the invention was the development of a sensitive and specific diagnostic marker that would enable the diagnosis of neoplasms, especially epithelial neoplasms, especially bladder cancer, urethral cancer, urethral cancer, or other neoplasms accompanied by increased activity of proteolytic enzymes, and the disease process of which can be monitored in biological material, especially in the patient's urine, at a very early pathogenic stage, i.e. even at the stage of an inflammatory reaction. Unexpectedly, it turned out that the developed new amino acid-containing compounds are diagnostic markers which, only in the presence of proteolytic enzymes, which result from an inflammatory reaction and / or epithelial tumor, and which enzymes are released and present in biological material, show chromogenic properties and / or fluorogenic measured in the wavelength range 300-500 nm, especially 380-430. The color properties are observed during enzymatic hydrolysis of these compounds in biological material, especially in the urine and blood of a patient who develops or has already developed epithelial cancer, including the accompanying inflammatory process, or has developed an inflammatory response itself or an inflammatory response additionally accompanying cancer . In the case of cancer, this process is associated with the effects of neoplastic disease, i.e. an increase in the activity of proteolytic enzymes in the tumor and surrounding tissues, resulting from many processes, including increased angiogenesis, tissue remodeling, necrosis of healthy tissues due to tumor infiltration, and apoptosis of tumor cells. Some of the compounds according to the invention allow even the inflammatory process to be detected, also by their hydrolysis, including enzymes released from the inflammatory focus during the immunological process, which is associated with the induction of a color reaction detected by measuring absorbance in the wavelength range 300-500 nm, especially 380-430.
W trakcie badań prowadzonych w Pracowni Analityki i Nanodiagnostyki Biochemicznej Uniwersytetu Gdańskiego przeprowadzono identyfikację związków, które byłyby podatne na zwiększoną aktywność proteolityczną w materiale biologicznym, zwłaszcza ludzkim moczu mających zastosowanie jako markery diagnostyczne nowotworów nabłonkowych i markery diagnostyczne procesów zapalnych, w tym zwłaszcza nowotworu nabłonka układu moczowego. W trakcie badań przeprowadzono badanie eksperymentalne na materiale biologicznym człowieka, w tym moczu osób chorych, u których potwierdzono reakcję zapalną i/lub nowotwory nabłonkowe na różnym etapie rozwoju, jak i moczu osób z wykluczonym stanem zapalnym - grupie kontrolnej.During the research conducted at the Laboratory of Biochemical Analytical and Nanodiagnostics at the University of Gdańsk, the identification of compounds that would be susceptible to increased proteolytic activity in biological material, especially human urine, used as diagnostic markers of epithelial neoplasms and diagnostic markers of inflammatory processes, especially cancer of the urinary tract epithelium, was carried out. . During the research, an experimental study was carried out on human biological material, including the urine of patients with confirmed inflammatory reactions and / or epithelial neoplasms at various stages of development, as well as the urine of people with excluded inflammation - the control group.
W wyniku tych badań zostały opracowane związki o sekwencji ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2, gdzie ABZ to kwas 2-aminobenzoesowy a ANB-NH2 to amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, ANB to kwas 5-amino-2-benzoesowy, oraz ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-pNA, gdzie pNA to para-nitroanilina. ZwiązkiAs a result of these studies, compounds with the sequence ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 were developed, where ABZ is 2-aminobenzoic acid and ANB-NH2 is 5-amino-2-benzoic acid amide, ANB is 5- amino-2-benzoic, and ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-pNA, where the pNA is para-nitroaniline. Relationships
PL 236 125 B1 te znajdują zastosowanie jako markery już do wykrywania procesu immunologicznego - odpowiedzi immunologicznej jak również markery diagnostyczne nowotworów nabłonkowych. Wykrywany proces zapalny przez wymienione związki, może być skorelowany również w chwili pojawienia się nowotworu, wokół którego pojawia się stan zapalny. Wykrycie stanu zapalnego może być również przydatne w przypadku zakażenia bakteriami lub wirusami w obecności lub bez obecności nowotworu nabłonkowego. W obu diagnozowanych przez zaproponowane związki procesach towarzyszy hydroliza enzymatyczna tych markerów - w wyniku uwalniania enzymów w trakcie procesów immunologicznych zachodzących in vivo i/lub enzymów proteolitycznych uwalnianych w wyniku rozwoju nowotworu nabłonkowego. Proces ten obserwuje się poprzez odpowiednio monitoring uwalnianej cząsteczki ANB-NH2 (amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego) lub pNA (p-nitroanilina) przy długości fali 300-400, korzystnie 380-430 nm, czyli hydroliza następuje w pozycji 5 związku - po 5-tym w kolejności aminokwasie.These are used as markers for the detection of the immune process - the immune response, as well as diagnostic markers of epithelial tumors. The inflammatory process detected by the aforementioned compounds may also be correlated at the time of the appearance of a neoplasm around which inflammation occurs. Detection of inflammation may also be useful when infected with bacteria or viruses in the presence or absence of an epithelial tumor. Both processes diagnosed by the proposed compounds are accompanied by enzymatic hydrolysis of these markers - as a result of the release of enzymes during immunological processes taking place in vivo and / or proteolytic enzymes released as a result of the development of epithelial cancer. This process is monitored by respectively monitoring the released ANB-NH2 molecule (5-amino-2-benzoic acid amide) or pNA (p-nitroaniline) at a wavelength of 300-400, preferably 380-430 nm, i.e. hydrolysis takes place at the 5-position of the compound - after the 5th amino acid in order.
Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze ogólnym: ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-X6, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, X to oznacza ANB-NH2 lub pNA, przy czym ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, ANB - kwas 5-amino-2-benzoesowy, a pNA oznacza 4-nitroanilinę.The subject of the invention is a compound of the general formula: ABZ1-Leu 2 -Glu 3 -Pro 4 -Val 5 -X 6 , where: ABZ is 2-aminobenzoic acid, X is ANB-NH2 or pNA, and ANB-NH2 is an amide 5-amino-2-benzoic acid, ANB - 5-amino-2-benzoic acid, and pNA is 4-nitroaniline.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania związku ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-ANB-NH26, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, zaś związek ten otrzymuje się w syntezie na nośniku stałym i sposób prowadzi się w następujących etapach:The invention also relates to a method for the preparation of ABZ1-Leu 2 -Glu 3 -Pro 4 -Val 5 -ANB-NH2 6 , where: ABZ means 2-aminobenzoic acid, ANB-NH2 means 5-amino-2-benzoic acid amide, and this compound is obtained by solid-phase synthesis and the process is carried out in the following steps:
a) przygotowanie żywicy umożliwiającej przekształcenie kwasu w amid,a) preparation of a resin enabling the conversion of acid into amide,
b) deprotekcja - usunięcie grupy ochronnej,b) deprotection - removal of the protecting group,
c) osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego ANB,c) depositing 5-amino-2-nitrobenzoic acid ANB,
d) powtarzanie etapów od b) do c) aż do momentu uzyskania związku, przy czym syntezę prowadzi się od reszty 6 do 1, a następnie odszczepia się otrzymany peptyd od żywicy.d) repeating steps b) to c) until a compound is obtained, the synthesis being carried out from residue 6 to 1, and then cleaving the obtained peptide from the resin.
Wynalazek dotyczy również sposobu otrzymywania związku ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-pNA6, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, pNA oznacza 4-nitroanilinę, a związek otrzymuje się w syntezie częściowo na nośniku stałym i częściowo w buforze lub tylko na nośniku stałym, zaś sposób prowadzi się w następujących etapach:The invention also relates to a method for the preparation of the compound ABZ1-Leu 2 -Glu 3 -Pro 4 -Val 5 -pNA 6 , wherein: ABZ is 2-aminobenzoic acid, pNA is 4-nitroaniline, and the compound is partially synthesized on a solid and partially in buffer or only on a solid support, and the process is carried out in the following steps:
a) przygotowanie żywicy 2-chlorochlorotrytylowej,a) preparation of 2-chlorochlorotrityl resin,
b) deprotekcja grupy ochronnej,b) deprotection of the protecting group,
c) osadzenie Pro4 na żywicy,c) embedding Pro 4 on resin,
d) powtarzanie etapów od b) do c) aż do momentu uzyskania ABZ-Leu-Glu-Pro,d) repeating steps b) to c) until ABZ-Leu-Glu-Pro is obtained,
e) odszczepienie otrzymanego peptydu od żywicy,e) cleavage of the obtained peptide from the resin,
f) otrzymanie paranitroanilidu aminokwasu (Val-pNA),f) obtaining the amino acid paranitroanilide (Val-pNA),
g) sprzęganie paranitroanilidu z chronionym peptydem (ABZ-Leu-Glu-Pro + Val-pNA), h) usunięcie osłon grup bocznych aminokwasów.g) coupling of a paranitroanilide with a protected peptide (ABZ-Leu-Glu-Pro + Val-pNA); h) removal of the amino acid side group covers.
Przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania nowotworu nabłonkowego i/lub procesu zapalnego w materiale biologicznym ssaka, który charakteryzuje się tym, że jako marker diagnostyczny stosuje się co najmniej jeden związek o wzorze ogólnym ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-X6, który stanowi marker odpowiedzi immunologicznej i dodatkowo nowotworu, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, X oznacza ANB-NH2 lub pNA, przy czym ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, pNA oznacza 4-nitroanilinę. Związek ten dodaje się i inkubuje w materiale biologicznym ssaka, zwłaszcza moczu lub krwi człowieka, a następnie dokonuje się pomiaru absorbancji przy długości fali w zakresie od 300 do 500 nm. Wykazanie zabarwienia, wzrostu absorbancji, wskazuje na wynik pozytywny. Zabarwienie jest wynikiem hydrolizy enzymatycznej związku zwłaszcza w pozycji 5 - po piątym z kolei aminokwasie, pod wpływem enzymów proteolitycznych obecnych w materiale biologicznym in vitro w wyniku odpowiedzi immunologicznej i/lub nowotworu in vivo. Czas odczytu absorbancji ustala się w zależności od ilości dodanego związku. Odczyt może nastąpić po około 60 minutach.The invention relates to a method of diagnosing an epithelial tumor and / or an inflammatory process in a mammalian biological material, which is characterized in that at least one compound of the general formula ABZ1-Leu 2 -Glu 3 -Pro 4 -Val 5 -X is used as a diagnostic marker. 6 , which is a marker of immune response and additionally tumor, wherein: ABZ is 2-aminobenzoic acid, X is ANB-NH2 or pNA, wherein ANB-NH2 is 5-amino-2-benzoic acid amide, pNA is 4-nitroaniline. This compound is added and incubated in mammalian biological material, especially human urine or blood, and then the absorbance is measured at a wavelength ranging from 300 to 500 nm. Demonstration of color, increase in absorbance, indicates a positive result. The coloration is the result of enzymatic hydrolysis of the compound, especially at the 5th position after the fifth amino acid, under the influence of proteolytic enzymes present in biological material in vitro as a result of an immune response and / or tumor in vivo. The absorbance reading time is determined by the amount of compound added. It may take approximately 60 minutes for it to be read.
Korzystnie, pomiaru absorbancji dokonuje się przy długości fali 380-430 nm.Preferably, the measurement of absorbance is done at a wavelength of 380-430 nm.
Sposób otrzymywania związku ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-ANB-NH26, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, w wariancie wykonania, prowadzi się sposób w następujących etapach:The method of obtaining the compound ABZ1-Leu 2 -Glu 3 -Pro 4 -Val 5 -ANB-NH2 6 , where: ABZ is 2-aminobenzoic acid, ANB-NH2 is 5-amino-2-benzoic acid amide, in an embodiment, way in the following steps:
pę cznienia żywicy amidowej;amide resin cracking;
a) deprotekcja - usunięcie osłony Fmoc,a) deprotection - removal of the Fmoc cover,
b) przemywanie żywicy,b) washing the resin,
c) osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego,c) depositing 5-amino-2-nitrobenzoic acid,
PL 236 125 B1PL 236 125 B1
d) przemywanie żywicy,d) washing the resin,
e) powtarzanie etapów od b) do d) aż do momentu uzyskania związku/peptydu; syntezę prowadzimy od C od N-końca (od reszty 6 do 1),e) repeating steps b) to d) until the compound / peptide is obtained; we run the synthesis from the C to the N-terminus (from the rest 6 to 1),
f) odszczepienie otrzymanego peptydu od żywicy.f) cleaving the obtained peptide from the resin.
Sposób otrzymywania związku ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-pNA6, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, pNA oznacza para-nitroanilinę według wariantu wykonania prowadzi się w sposób w następujących etapach:The method of obtaining the compound ABZ 1 -Leu 2 -Glu 3 -Pro 4 -Val 5 -pNA 6 , wherein: ABZ is 2-aminobenzoic acid, pNA is para-nitroaniline according to an embodiment, it is carried out in the following steps:
a) proces pęcznienia żywicy 2-chlorochlorotrytylowej,a) the swelling process of 2-chlorochlorotrityl resin,
b) deprotekcja - usunięcie osłony Fmoc,b) deprotection - removal of the Fmoc cover,
c) przemywanie żywicy,c) washing the resin,
d) osadzenie Pro4 na żywicy,d) embedding Pro 4 on the resin,
e) przemywanie żywicy,e) washing the resin,
f) powtarzanie etapów od b) do e) aż do momentu uzyskania ABZ-Leu-Glu-Pro,f) repeating steps b) to e) until ABZ-Leu-Glu-Pro is obtained,
g) odszczepienie otrzymanego peptydu od żywicy,g) cleavage of the obtained peptide from the resin,
h) otrzymanie paranitroanilidu aminokwasu (Val-pNA),h) obtaining the amino acid paranitroanilide (Val-pNA),
i) sprzęganie paranitroanilidu z chronionym peptydem (ABZ-Leu-Glu-Pro + Val-pNA),i) coupling of a paranitroanilide with a protected peptide (ABZ-Leu-Glu-Pro + Val-pNA),
j) usunięcie osłon grup bocznych aminokwasów (Glu(tBu)).j) removal of the amino acid side group covers (Glu (tBu)).
Część określeń stosowanych powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:Some of the terms used above and in the specification and claims have the following meanings:
Nowotwór nabłonkowy - czyli taki, którego komórki wywodzą się z nabłonka gruczołów wydzielania zewnętrznego i wewnętrznego oraz z przewodów tych gruczołów, np. nowotwór nabłonka układu moczowego.Epithelial neoplasm - that is, cells whose cells are derived from the epithelium of the glands of external and internal secretion and from the ducts of these glands, e.g. a cancer of the epithelium of the urinary system.
Właściwości chromogeniczne - oznaczają powstawanie produktu barwnego,Chromogenic properties - mean the formation of a colored product,
Właściwości fluorogeniczne - oznaczają powstawanie produktu emitującego fluorescencję,Fluorogenic properties - means the formation of a product emitting fluorescence,
NMP - N-metylopirolidon,NMP - N-methylpyrrolidone,
DMF - dimetyloformamid,DMF - dimethylformamide,
DCM - chlorek metylenu, pNA - 4-nitroanilina, para-nitroanilina,DCM - methylene chloride, pNA - 4-nitroaniline, para-nitroaniline,
ABZ - kwas 2-aminobeznoesowy,ABZ - 2-aminobeznoesic acid,
ANB-NH2 - amid kwasu 5-amino-2-benzoesowy.ANB-NH2 - 5-amino-2-benzoic acid amide.
Wynalazek przedstawiono bliżej w przykładach wykonania na rysunku.The invention is illustrated in more detail in the drawings.
Fig. 1 - przedstawia szybkość hydrolizy substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 w próbkach moczu ze zdiagnozowanym nowotworem. Cyfry arabskie oznaczają numer losowo wybranej próbki moczu.Fig. 1 - Shows the rate of hydrolysis of ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 substrate in urine samples with diagnosed cancer. Arabic numerals indicate the number of a randomly selected urine sample.
Fig. 2 - przedstawia szybkość hydrolizy substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-pNA w próbkach moczu ze zdiagnozowanym nowotworem. Cyfry arabskie oznaczają numer losowo wybranej próbki moczu.Figure 2 - Shows the rate of hydrolysis of ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-pNA substrate in urine samples with diagnosed cancer. Arabic numerals indicate the number of a randomly selected urine sample.
Fig. 3 - przedstawia szybkości hydrolizy substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 w zależności od obecności inhibitora ludzkiej elstazy neutrofilnej, który to enzym jest markerem stanu zapalnego, w próbce ludzkiego moczu ze stwierdzonym stanem zapalnym i/lub nowotworem nabłonka układu moczowego.Fig. 3 - shows the rates of hydrolysis of the ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 substrate depending on the presence of an inhibitor of human neutrophilic elastase, which enzyme is a marker of inflammation, in a sample of human urine with confirmed inflammation and / or cancer epithelium of the urinary system.
Fig. 4 - przedstawia zależność stopnia hydrolizy substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 od środowiska pH.Fig. 4 - shows the dependence of the degree of hydrolysis of the ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 substrate on the pH environment.
Fig. 5 - przedstawia wydajności hydrolizy substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 w zależności od stopnia zagęszczenia ludzkiego moczu ze stwierdzonym nowotworem nabłonka układu moczowego.Fig. 5 - shows the hydrolysis efficiency of ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 substrate depending on the concentration degree of human urine with diagnosed cancer of the urinary system epithelium.
Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia.The invention is illustrated by the following non-limiting examples.
P r z y k ł a d 1P r z k ł a d 1
Synteza nowego związku ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-ANB-NH26 Synthesis of a new compound ABZ 1 -Leu 2 -Glu 3 -Pro 4 -Val 5 -ANB-NH2 6
1. Otrzymanie peptydu chromogenicznego1. Obtaining a chromogenic peptide
a) Pierwszym etapem syntezy było otrzymanie peptydu chromogenicznego który otrzymano metodą syntezy w fazie stałej - na nośniku stałym - z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBu, czyli z użyciem osłon.a) The first stage of the synthesis was to obtain a chromogenic peptide which was obtained by solid phase synthesis - on a solid support - with the use of Fmoc / tBu chemistry, i.e. with the use of shields.
Związek o sekwencji ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-ANB-NH26, gdzie ABZ - oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, a ANB-NH2 to amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, zaś ANB to kwas 5-amino-2-benzoesowy, otrzymano na drodze syntezy chemicznej w fazie stałej z wykorzystaniem następujących pochodnych aminokwasowych.Compound with the sequence ABZ 1 -Leu 2 -Glu 3 -Pro 4 -Val 5 -ANB-NH2 6 , where ABZ - is 2-aminobenzoic acid and ANB-NH2 is 5-amino-2-benzoic acid amide, and ANB is 5-amino-2-benzoic acid was obtained by solid phase chemical synthesis using the following amino acid derivatives.
Boc-ABZ, Fmoc-Leu, Fmoc-Glu(Trt), Fmoc-Pro, Fmoc-Val, ANBBoc-ABZ, Fmoc-Leu, Fmoc-Glu (Trt), Fmoc-Pro, Fmoc-Val, ANB
PL 236 125 B1PL 236 125 B1
Syntezę związku, czyli markera diagnostycznego do wykrywania nowotworów nabłonkowych, których diagnostyka jest związana z hydrolizą tego związku pod wpływem enzymów proteolitycznych prowadzono na nośniku stałym umożliwiającym przekształcenie kwasu 5-amino-2-beznoesowego w amid ANB-NH2:The synthesis of the compound, i.e. a diagnostic marker for the detection of epithelial neoplasms, the diagnosis of which is related to the hydrolysis of this compound under the influence of proteolytic enzymes, was carried out on a solid support enabling the conversion of 5-amino-2-benzoic acid into the ANB-NH2 amide:
- np. żywicy amidowej np. TentaGel S RAM firmy RAPP Polymere (Niemcy) np. o osadzeniu 0,23 mmol/g.- e.g. an amide resin e.g. TentaGel S RAM from RAPP Polymere (Germany) e.g. with a deposit of 0.23 mmol / g.
Możliwe jest zastosowanie innej dostępnej handlowo żywicy amidowej, w tym Rink Amide (Niemcy).It is possible to use other commercially available amide resin, including Rink Amide (Germany).
Syntezę związku prowadzono w sposób manualny z zastosowaniem wytrząsarki laboratoryjnej. Przez większość etapów reaktorami była strzykawka zakończona spiekiem do syntezy w fazie stałej o pojemności 25 ml.The synthesis of the compound was carried out manually using a laboratory shaker. For most of the steps, the reactors were a syringe terminated with a 25 mL frit for solid phase synthesis.
Wszystkie otrzymywane końcowe związki zawierały w swojej sekwencji w pozycji 1 czyli na N-końcu kwas 2-aminobenzoesowy - ABZ i w pozycji 6: cząsteczkę kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego ANB na C-końcu. ABZ pełni rolę donora fluorescencji, natomiast ANB - kwas 5-amino-2-benzoesowy pełni rolę wygaszacza fluorescencji i jednocześnie chromoforu. Peptydy w swojej sekwencji zawierały co najmniej i korzystnie jedno miejsce reaktywne zlokalizowane pomiędzy resztami aminokwasowymi Val-ANB-NH2: w pozycji 5 związku. Syntezę polegającą na przyłączaniu pochodnych aminokwasowych prowadzi się od reszty 6 do 1, czyli od końca C do N.All the resulting final compounds contained in their sequence in position 1, ie at the N-terminus, 2-aminobenzoic acid - ABZ and in position 6: molecule of 5-amino-2-nitrobenzoic acid ANB at the C-terminus. ABZ acts as a fluorescence donor, while ANB - 5-amino-2-benzoic acid acts as a fluorescence quencher and a chromophore at the same time. The peptides in their sequence contained at least and preferably one reactive site located between the amino acid residues Val-ANB-NH2: at position 5 of the compound. The synthesis involving the addition of amino acid derivatives is carried out from residue 6 to 1, i.e. from the C terminus to N.
b) Osadzenie ANB na żywicy TentaGel S RAM:b) Mounting of ANB on TentaGel S RAM resin:
Syntezę peptydów wykonano na żywicy TentaGel S RAM firmy Rapp Polymere o osadzeniu 0,23 mmol/g. W pierwszym etapie przygotowano żywicę, w tym dokonano spulchnienia żywicy poprzez cykl przemywań. Kolejno przystąpiono do usunięcia z nośnika osłony grupy aminowej Fmoc - za pomocą 20% roztworu piperydyny w NMP. Następnie przeprowadzono cykl przemywań rozpuszczalnikami. W celu potwierdzenia obecności wolnych grup aminowych wykonano test chloranilowy.The peptide synthesis was performed on Rapp Polymere's TentaGel S RAM resin with a deposit of 0.23 mmol / g. In the first stage, the resin was prepared, including the resin fluffiness through a washing cycle. Subsequently, the Fmoc amino group protection was removed from the support - with the use of a 20% solution of piperidine in NMP. A solvent wash cycle was then performed. A chloranil test was performed to confirm the presence of free amino groups.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:Solvent wash cycle:
DMF 1 x 10 minutDMF 1 x 10 minutes
IsOH 1 x 10 minutIsOH 1 x 10 minutes
DCM 1 x 10 minutDCM 1 x 10 minutes
Usunięcie osłony Fmoc:Removing the Fmoc Cover:
DMF 1 x 5 minutDMF 1 x 5 minutes
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty20% piperidine in NMP 1 x 3 minutes
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut20% piperidine in NMP 1 x 8 minutes
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:Solvent wash cycle:
DMF 3 x 2 minutyDMF 3 x 2 minutes
IsOH 3 x 2 minutyIsOH 3 x 2 minutes
DCM 3 x 2 minutyDCM 3 x 2 minutes
c) Test chloranilowy:c) Chloranil test:
Test chloranilowy polegał na przeniesieniu za pomocą łopatki, kilku ziaren żywicy z reaktora strzykawki do szklanej ampułki, do której następnie dodano 100 μl nasyconego roztworu p-chloranilu w toluenie i 50 μl świeżego aldehydu octowego. Po upływie 10 minut przeprowadzono kontrolę zabarwienia ziaren.The chloranil test consisted of transferring, using a spatula, a few grains of resin from a syringe reactor to a glass ampoule, to which then 100 µl of a saturated p-chloranil solution in toluene and 50 µl of fresh acetaldehyde were added. After 10 minutes, the color of the grains was checked.
Na tym etapie po przeprowadzeniu testu otrzymano zielone zabarwienie ziaren, które świadczyło o obecności wolnych grup aminowych. Po potwierdzeniu usunięcia osłon 9-fluorenylometoksykarbonylowych z żywicy można było przystąpić do kolejnego etapu, przyłączania pochodnej ANB (kwasu 5-amino-2-nitrobenozesowego).At this stage, after the test was performed, the grains were green, which indicated the presence of free amino groups. After confirming the removal of the 9-fluorenylmethoxycarbonyl shields from the resin, it was possible to proceed to the next step, adding the ANB derivative (5-amino-2-nitrobenoseic acid).
d) Osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego na nośniku stałymd) Supporting 5-amino-2-nitrobenzoic acid on a solid support
Pierwszym etapem syntezy biblioteki peptydowej - mieszaniny peptydów, było osadzenie ANB na 1 g żywicy. Przed przyłączeniem chromoforu przemyto żywicę używaną do reakcji następującymi rozpuszczalnikami: DMF, DCM i ponownie DMF, po czym usunięto osłonę Fmoc- z grupy funkcyjnej nośnika. Jeden cykl usuwania osłony Fmoc- obejmował następujące etapy:The first step in the synthesis of a peptide library - a mixture of peptides, was the deposition of the ANB on 1 g of resin. Prior to chromophore attachment, the resin used for the reaction was washed with the following solvents: DMF, DCM, and again DMF, and the Fmoc-shield was removed from the support functional group. One cycle of Fmoc- cover removal included the following steps:
Usunięcie osłony Fmoc-:Removal of the Fmoc- cover:
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty20% piperidine in NMP 1 x 3 minutes
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut20% piperidine in NMP 1 x 8 minutes
e) Przemywanie DMF 3 x 2 minutye) Washing with DMF 3 x 2 minutes
IsOH 3 x 2 minutyIsOH 3 x 2 minutes
DCM 3 x 2 minutyDCM 3 x 2 minutes
PL 236 125 B1PL 236 125 B1
f) Test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych.f) Chloranil test for free amino groups.
Żywicę z wolną grupą aminową przemyto 5% roztworem N-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a następnie DMF. Procedurę usuwania osłony Fmoc- oraz cykl przemywań przeprowadzono w naczynku Merrifielda. W osobnej kolbie rozpuszczono ANB w DMF i dodałam kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6. Tak przygotowaną mieszaninę dodano do żywicy i mieszano przez 3 godziny. Żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF, DCM i izopropanolem, a całą procedurę acylowania powtórzono dwa razy. Do przeprowadzenia kolejnych reakcji przyłączania ANB do żywicy zastosowano heksafluorofosforan-O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N, N, N’, N’-tetrametylouroniowy (HATU), a potem heksafluorofosforan-O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetrametylouroniowy (HBTU). W ostatnim etapie żywicę przemyto kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i suszono na powietrzu.The resin with the free amino group was washed with a 5% solution of N-methylmorpholine (NMM) in DMF followed by DMF. The Fmoc- sheath removal procedure and the wash cycle were performed in a Merrifield pan. ANB was dissolved in DMF in a separate flask and I added successively TBTU, DMAP, and finally diisopropylethylamine (DIPEA) in the following excesses relative to polymer deposition: ANB / TBTU / DMAP / DIPEA, 3: 3: 2: 6. The mixture thus prepared was added to the resin and stirred for 3 hours. The resin was filtered off under reduced pressure, washed with DMF, DCM and isopropanol, and the entire acylation procedure was repeated twice. O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium (HATU) hexafluorophosphate (HATU) and then O- (benzotriazol-1-yl) hexafluorophosphate were used to carry out the subsequent ANB attachment reactions to the resin. ) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium (HBTU). In the last step, the resin was washed sequentially with DMF, DCM, and isopropanol, and air dried.
g) Przyłączenie C-końcowej reszty aminokwasowej do ANBg) Attachment of the C-terminal amino acid residue to the ANB
Odpowiednią pochodną aminokwasową (9-krotny nadmiar molowy w stosunku do osadzenia żywicy) rozpuszczono w pirydynie i przeniesiono do kolby zawierającej żywicę z osadzonym ANB. Całość chłodzono do uzyskania temperatury -15°C (łaźnia lodowa: 1 cz. wagowa NH4CI, 1 cz. wagowa NaNO3, 1 cz. wagowa lodu). Po osiągnięciu żądanej temperatury dodano POCI3 (w stosunku 1:1 do użytej ilości pochodnej aminokwasowej) i całość mieszano na mieszadle magnetycznym: 20 minut w -15°C, 30 minut w temperaturze pokojowej oraz 6 godzin w 40°C (łaźnia olejowa). Po zakończeniu reakcji żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF oraz MeOH i zostawiono do wysuszenia.The appropriate amino acid derivative (9-fold molar excess to the resin loading) was dissolved in pyridine and transferred to the flask containing the ANB-loaded resin. It was cooled down to -15 ° C (ice bath: 1 part by weight of NH4Cl, 1 part by weight of NaNO3, 1 part by weight of ice). When the desired temperature was reached, POCl3 (1: 1 ratio to the amount of amino acid derivative used) was added and the whole was stirred on a magnetic stirrer: 20 minutes at -15 ° C, 30 minutes at room temperature and 6 hours at 40 ° C (oil bath). After completion of the reaction, the resin was filtered off under reduced pressure, washed with DMF and MeOH and allowed to dry.
W kolejnym etapie przyłączono resztę w pozycji P2 (prolinę).In the next step the residue at position P2 (proline) was attached.
Wszystkie przyłączania reszt aminokwasowych poprzedzono przemywaniem żywicy za pomocą DMF przez 5 minut. W kolejnych przyłączaniach stosowano diisopropylokarbodiimid jako środek sprzęgający. Procedurę powtarzano dwukrotnie.All additions of amino acid residues were preceded by washing the resin with DMF for 5 minutes. Subsequent attachments use diisopropylcarbodiimide as a coupling agent. The procedure was repeated twice.
Po każdym z acylowań rozpoczynano cykl przemywań żywicy, a następnie wykonywano test chloranilowy, w celu monitorowania przyłączania pochodnej aminokwasowej do wolnych grup aminowych żywicy.After each acylation, the resin wash cycle was initiated, and then a chloranil test was performed to monitor the attachment of the amino acid derivative to the free amino groups of the resin.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:Solvent wash cycle:
DMF 3 x 2 minutyDMF 3 x 2 minutes
IsOH 3 x 2 minutyIsOH 3 x 2 minutes
DCM 3 x 2 minutyDCM 3 x 2 minutes
Test chloranilowy:Chloranil Test:
W wyniku przeprowadzonych testów po dwóch pierwszych sprzęganiach zabarwienie ziaren najpierw było zielone, a następnie szare, więc konieczne było przeprowadzenie kolejnego acylowania, w wyniku, którego ziarna żywicy badanej testem chloranilowym były bezbarwne. Świadczyło to przyłączeniu ANB do żywicy TentaGel S RAM, co pozwoliło przejść do następnego etapu syntezy peptydu.As a result of the tests, after the first two couplings, the color of the grains was first green and then gray, so it was necessary to perform another acylation, as a result of which the resin grains tested with the chloranil test were colorless. This indicated the attachment of ANB to the TentaGel S RAM resin, which allowed to proceed to the next stage of peptide synthesis.
h) Przyłączanie kolejnych chronionych reszt aminokwasowych:h) Joining of consecutive protected amino acid residues:
Żywicę wraz z przyłączoną resztą ANB znajdującą się w reaktorku przemyto za pomocą DMF, a następnie przystąpiono do deprotekcji osłony Fmoc z grupy aminowej w celu przyłączenia chronionej pochodnej aminokwasowej glicyny.The resin along with the attached ANB residue in the reactor was washed with DMF, and then proceeded to deprotect the Fmoc shell of the amino group to attach the protected amino acid derivative of glycine.
Usunięcie osłony Fmoc:Removing the Fmoc Cover:
DMF 1 x 5 minutDMF 1 x 5 minutes
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty20% piperidine in NMP 1 x 3 minutes
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut20% piperidine in NMP 1 x 8 minutes
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:Solvent wash cycle:
DMF 3 x 2 minutyDMF 3 x 2 minutes
IsOH 3 x 2 minutyIsOH 3 x 2 minutes
DCM 3 x 2 minutyDCM 3 x 2 minutes
Test chloranilowy:Chloranil Test:
W wyniku przeprowadzenia testu chloranilowego otrzymano wynik pozytywny, o czym świadczyło zielone zabarwienie ziaren żywicy. Pozwoliło to na rozpoczęcie kolejnego etapu - przyłączania reszty aminokwasowej Fmoc-Glu(Trt)-OH.As a result of the chloranil test, a positive result was obtained, as evidenced by the green color of the resin grains. This allowed for the commencement of the next stage - the attachment of the Fmoc-Glu (Trt) -OH amino acid residue.
Przyłączanie pochodnej aminokwasowej:Attaching an amino acid derivative:
Wykonywane sprzęgania poprzedzono przemywaniem żywicy w DMF. Podczas przyłączania chronionej reszty kwasu glutaminowego skład mieszaniny sprzęgającej pozostawał bez zmian.Performed couplings were preceded by washing the resin in DMF. During the attachment of the protected glutamic acid residue, the composition of the coupling mixture remained unchanged.
PL 236 125 B1PL 236 125 B1
Po zakończeniu każdego z acylowań stosowano cykl przemywań rozpuszczalnikami według podanej procedury, a następnie przeprowadzono test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych w roztworze.After completion of each acylation, the solvent washing cycle was carried out according to the procedure given, followed by a chloranil test for the presence of free amino groups in the solution.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:Solvent wash cycle:
DMF 3 x 2 minutyDMF 3 x 2 minutes
IsOH 3 x 2 minutyIsOH 3 x 2 minutes
DCM 3 x 2 minutyDCM 3 x 2 minutes
Test chloranilowy:Chloranil Test:
Ziarna żywicy podczas testu przeprowadzonego po drugim acylowaniu były bezbarwne, co pozwoliło na przejście do kolejnego etapu syntezy, jakim było wprowadzenie kolejnej chronionej pochodnej aminokwasowej - leucyny i cząsteczki kwasu 2-aminobenzoesowego. Procesy sprzęgania odbyły się zgodnie z procedurą omówioną wcześniej.During the test conducted after the second acylation, the resin grains were colorless, which allowed for the next stage of the synthesis, which was the introduction of another protected amino acid derivative - leucine and a molecule of 2-aminobenzoic acid. Coupling processes took place according to the procedure discussed earlier.
Testy przeprowadzone po przyłączeniu wyżej wymienionych reszt wykazały wyniki pozytywne, ziarna żywicy były bezbarwne.Tests carried out after attaching the above-mentioned residues showed positive results, the resin grains were colorless.
2. Usuwanie peptydu z nośnika2. Removal of the peptide from the support
Po zakończeniu syntezy amid peptydu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 usunięto z nośnika wraz z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: TFA : fenol : woda : TIPS (88:5:5:2, v/v/v/v) w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym.After the synthesis was completed, the ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 peptide amide was removed from the support with the simultaneous removal of the side covers with the mixture: TFA: phenol: water: TIPS (88: 5: 5: 2, v / v / v / v) in a round-bottom flask on a magnetic stirrer.
Po upływie 3 godzin zawartość kolby odsączyło się pod zmniejszonym ciśnieniem na lejkach ze spiekiem Schotta przemywając eterem dietylowym. Powstały osad odwirowano na wirówce SIGMA 2K30 (Laboratory Centrifuges) w czasie 20 minut. Osad otrzymany po wirowaniu rozpuszcza się w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddano liofilizacji.After 3 hours, the contents of the flask were filtered under reduced pressure on Schott funnels, washing with diethyl ether. The resulting pellet was centrifuged on a SIGMA 2K30 centrifuge (Laboratory Centrifuges) for 20 minutes. The pellet obtained after centrifugation is dissolved in water by means of ultrasound and then lyophilized.
Tożsamość/charakterystyka nowego związku - analiza HPLC, MSNew compound identity / characterization - HPLC analysis, MS
HPLC warunki: kolumna RP Bio Wide Pore Supelco C8 250 mm 4 mm, układ faz A 0,1% TFA w wodzie, B: 80% acetonitrylu w A), przepływ 1 ml/min, detekcja UV przy 226 nm. Potwierdzono otrzymanie związku.HPLC conditions: RP Bio Wide Pore Supelco C8 column 250mm 4mm, A phase configuration 0.1% TFA in water, B: 80% acetonitrile in A), flow 1 ml / min, UV detection at 226 nm. Compound was confirmed.
P r z y k ł a d 2P r z k ł a d 2
Otrzymywanie związku o wzorze związku ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-pNA6.Preparation of Compound of Formula ABZ1-Leu 2 -Glu 3 -Pro 4 -Val 5 -pNA 6 .
Proces prowadzi się w podobny sposób jak opisano w przykładzie 1 z tym, że wykorzystuje się odpowiednie pochodne aminokwasowe i dodatkowe podstawniki i proces przeprowadza się częściowo w roztworze częściowo na nośniku stałym.The process is similar to that described in Example 1 except that the appropriate amino acid derivatives and additional substituents are used and the process is carried out partially in solution and partially on a solid support.
Otrzymanie p-nitroanilidu ValPreparation of p-nitroanilide Val
a. Pierwszym etapem syntezy było otrzymanie chronionego peptydu, który otrzymano metodą syntezy w fazie stałej z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBu.a. The first step in the synthesis was the preparation of the protected peptide, which was obtained by solid phase synthesis using Fmoc / tBu chemistry.
Związek ABZ1-Leu2-Glu(OtBu)3-Pro4-OH, gdzie ABZ - oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, otrzymano na drodze syntezy chemicznej w fazie stałej z wykorzystaniem następujących pochodnych aminokwasowych:The compound ABZ1-Leu 2 -Glu (OtBu) 3 -Pro 4 -OH, where ABZ - stands for 2-aminobenzoic acid, was obtained by chemical synthesis in solid phase with the use of the following amino acid derivatives:
Boc-ABZ, Fmoc-Leu, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Pro.Boc-ABZ, Fmoc-Leu, Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Pro.
Syntezę związku prowadzono na nośniku stałym:The synthesis of the compound was carried out on a solid support:
- żywica 2-chloro-chlorotytylowa np. firmy Ms BIOTECH GMBH (Niemcy) o osadzeniu grup 1,6 mmol Cl/g.- 2-chloro-chlorotyl resin, e.g. from Ms BIOTECH GMBH (Germany), with a deposition of 1.6 mmol Cl / g groups.
Syntezę związku prowadzono manualnie z zastosowaniem wytrząsarki laboratoryjnej. Przez wszystkie etapy reaktor stanowiła strzykawka zakończona spiekiem do syntezy w fazie stałej o pojemności 25 ml.Compound synthesis was carried out manually using a laboratory shaker. Throughout all stages, the reactor was a syringe terminated with a sintered 25 ml solid-phase synthesis frit.
Syntezę peptydów wykonano na nośniku: żywicy 2-chloro-chlorotytylowa np. firmy Ms BIOTECH GMBH (Niemcy) o osadzeniu grup 1,6 mmol Cl/g. W pierwszym etapie dokonano spulchnienia żywicy poprzez cykl przemywań. Kolejno przystąpiono do usunięcia z nośnika osłony grupy aminowej Fmoc za pomocą 20% roztworu piperydyny w NMP. Następnie przeprowadzono cykl przemywań rozpuszczalnikami. W celu potwierdzenia obecności wolnych grup aminowych wykonano test chloranilowy.The peptide synthesis was performed on the support: 2-chloro-chlorotyl resin, e.g. from Ms BIOTECH GMBH (Germany), with 1.6 mmol Cl / g groups. In the first stage, the resin was fluffed through a washing cycle. Subsequently, the Fmoc amine shield was removed from the support with a 20% solution of piperidine in NMP. A solvent wash cycle was then performed. A chloranil test was performed to confirm the presence of free amino groups.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:Solvent wash cycle:
DMF 1 x 10 minutDMF 1 x 10 minutes
IsOH 1 x 10 minutIsOH 1 x 10 minutes
DCM 1 x 10 minutDCM 1 x 10 minutes
Usunięcie osłony Fmoc:Removing the Fmoc Cover:
DMF 1 x 5 minutDMF 1 x 5 minutes
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty20% piperidine in NMP 1 x 3 minutes
PL 236 125 B1PL 236 125 B1
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut20% piperidine in NMP 1 x 8 minutes
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:Solvent wash cycle:
DMF 3 x 2 minutyDMF 3 x 2 minutes
IsOH 3 x 2 minutyIsOH 3 x 2 minutes
DCM 3 x 2 minutyDCM 3 x 2 minutes
b) Test chloranilowy:b) Chloranil test:
Test chloranilowy polegał na przeniesieniu za pomocą łopatki, kilku ziaren żywicy z reaktora strzykawki do szklanej ampułki, do której następnie dodano 100 μl nasyconego roztworu p-chloranilu w toluenie i 50 μl świeżego aldehydu octowego. Po upływie 10 minut przeprowadzono kontrolę zabarwienia ziaren.The chloranil test consisted of transferring, using a spatula, a few grains of resin from a syringe reactor to a glass ampoule, to which then 100 µl of a saturated p-chloranil solution in toluene and 50 µl of fresh acetaldehyde were added. After 10 minutes, the color of the grains was checked.
Na tym etapie po przeprowadzeniu testu otrzymano zielone zabarwienie ziaren, które świadczyło o obecności wolnych grup aminowych. Po potwierdzeniu usunięcia osłon 9-fluorenylometoksykarbonylowych z żywicy można było przystąpić do kolejnego etapu, przyłączania pochodnej Fmoc-Pro.At this stage, after the test was performed, the grains were green, which indicated the presence of free amino groups. After confirming the removal of the 9-fluorenylmethoxycarbonyl shields from the resin, it was possible to proceed to the next step, adding the Fmoc-Pro derivative.
b. Osadzenie Fmoc-Pro na nośniku stałymb. Embedding Fmoc-Pro on a solid support
Pierwszym etapem syntezy biblioteki peptydowej było osadzenie Fmoc-Pro na 1 g żywicy. Przed przyłączeniem pochodnej aminokwasowej przemyto żywicę używaną do reakcji następującymi rozpuszczalnikami: DMF (dimetyloformamid), DCM (chlorek metylenu) i ponownie DMF, po czym usunięto osłonę Fmoc- z grupy funkcyjnej nośnika. Jeden cykl usuwania osłony Fmoc- obejmował następujące etapy:The first step in the synthesis of the peptide library was the deposition of Fmoc-Pro on 1 g of resin. Prior to attachment of the amino acid derivative, the resin used for the reaction was washed with the following solvents: DMF (dimethylformamide), DCM (methylene chloride) and again DMF, and the Fmoc-shield was removed from the support function. One cycle of Fmoc- cover removal included the following steps:
Usunięcie osłony Fmoc-:Removal of the Fmoc- cover:
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty20% piperidine in NMP 1 x 3 minutes
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut20% piperidine in NMP 1 x 8 minutes
Przemywanie:Wash:
DMF 3 x 2 minutyDMF 3 x 2 minutes
IsOH 3 x 2 minutyIsOH 3 x 2 minutes
DCM 3 x 2 minutyDCM 3 x 2 minutes
Test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych.Chloranil test for the presence of free amino groups.
Żywicę z wolną grupą aminową przemyto DMF. W osobnej kolbie rozpuszczono Fmoc-Pro w DMF i dodano kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: Fmoc-Pro/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6. Tak przygotowaną mieszaninę dodano do żywicy i mieszano przez 3 godziny. Żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF, DCM i izopropanolem, a całą procedurę acylowania powtórzono dwa razy. Do przeprowadzenia kolejnych reakcji przyłączania Fmoc-Pro do żywicy zastosowano heksafluorofosforan-O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N, N, N’, N’ ,-tetrametylouroniowy (HATU), a potem heksafluorofosforanO-(benzotriazol-1-yl)-N, N, N’, N ’-tetrametylouroniowy (HBTU). W ostatnim etapie żywicę przemyto kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i suszono na powietrzu.The resin with the free amino group was washed with DMF. Fmoc-Pro was dissolved in DMF in a separate flask and TBTU, DMAP, and finally diisopropylethylamine (DIPEA) were added sequentially in the following excesses relative to the polymer deposition: Fmoc-Pro / TBTU / DMAP / DIPEA, 3: 3: 2: 6. The mixture thus prepared was added to the resin and stirred for 3 hours. The resin was filtered off under reduced pressure, washed with DMF, DCM and isopropanol, and the entire acylation procedure was repeated twice. O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N', -tetramethyluronium (HATU) hexafluorophosphate (HATU) hexafluorophosphate, followed by O- (benzotriazol-1- yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium (HBTU). In the last step, the resin was washed sequentially with DMF, DCM, and isopropanol, and air dried.
c. Przyłączanie kolejnych chronionych reszt aminokwasowych:c. Addition of consecutive protected amino acid residues:
Żywicę wraz z przyłączoną resztą Fmoc-Pro znajdującą się w reaktorku przemyto za pomocą DMF, a następnie przystąpiono do deprotekcji osłony Fmoc z grupy aminowej w celu przyłączenia chronionej pochodnej aminokwasowej kwasu glutaminowego.The resin along with the attached Fmoc-Pro residue in the reactor was washed with DMF and then proceeded to deprotect the Fmoc amine shield to attach the protected amino acid derivative of glutamic acid.
Usunięcie osłony Fmoc:Removing the Fmoc Cover:
DMF 1 x 5 minutDMF 1 x 5 minutes
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty20% piperidine in NMP 1 x 3 minutes
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut20% piperidine in NMP 1 x 8 minutes
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:Solvent wash cycle:
DMF 3 x 2 minutyDMF 3 x 2 minutes
IsOH 3 x 2 minutyIsOH 3 x 2 minutes
DCM 3 x 2 minutyDCM 3 x 2 minutes
Test chloranilowy:Chloranil Test:
W wyniku przeprowadzenia testu chloranilowego otrzymano wynik pozytywny, o czym świadczyło zielone zabarwienie ziaren żywicy. Pozwoliło to na rozpoczęcie kolejnego etapu - przyłączania reszty aminokwasowej Fmoc-Glu(OtBu)-OH.As a result of the chloranil test, a positive result was obtained, as evidenced by the green color of the resin grains. This allowed for the commencement of the next stage - the attachment of the Fmoc-Glu (OtBu) -OH amino acid residue.
Przyłączanie pochodnej aminokwasowej:Attaching an amino acid derivative:
Wykonywane sprzęgania poprzedzono przemywaniem żywicy w DMF. Podczas przyłączania chronionej reszty kwasu glutaminowego skład mieszaniny sprzęgającej pozostawał bez zmian.Performed couplings were preceded by washing the resin in DMF. During the attachment of the protected glutamic acid residue, the composition of the coupling mixture remained unchanged.
PL 236 125 B1PL 236 125 B1
Po zakończeniu każdego z acylowań stosowano cykl przemywań rozpuszczalnikami według podanej procedury, a następnie przeprowadzono test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych w roztworze.After completion of each acylation, the solvent washing cycle was carried out according to the procedure given, followed by a chloranil test for the presence of free amino groups in the solution.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:Solvent wash cycle:
DMF 3 x 2 minutyDMF 3 x 2 minutes
IsOH 3 x 2 minutyIsOH 3 x 2 minutes
DCM 3 x 2 minutyDCM 3 x 2 minutes
Test chloranilowy:Chloranil Test:
Ziarna żywicy podczas testu przeprowadzonego po drugim acylowaniu były bezbarwne, co pozwoliło na przejście do kolejnego etapu syntezy, jakim było wprowadzenie kolejnej chronionej pochodnej aminokwasowej - leucyny i cząsteczki kwasu 2-aminobenzoesowego. Procesy sprzęgania odbyły się zgodnie z procedurą omówioną wcześniej.During the test conducted after the second acylation, the resin grains were colorless, which allowed for the next stage of the synthesis, which was the introduction of another protected amino acid derivative - leucine and a molecule of 2-aminobenzoic acid. Coupling processes took place according to the procedure discussed earlier.
Testy przeprowadzone po przyłączeniu wyżej wymienionych reszt wykazały wyniki pozytywne, ziarna żywicy były bezbarwne.Tests carried out after attaching the above-mentioned residues showed positive results, the resin grains were colorless.
d. Usuwanie peptydu z nośniku z zachowaniem osłon grup bocznychd. Removal of the peptide from the support preserving the side group covers
Po zakończeniu syntezy chroniony peptyd ABZ-Leu-Glu(OtBu)-Pro-OH usunięto z nośnika wraz z zachowaniem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: kwas octowy : TFE (trifluoroetanol) : DCM (2:2:6, v/v/v) w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym.After the synthesis was completed, the protected ABZ-Leu-Glu (OtBu) -Pro-OH peptide was removed from the support along with the side shields with the mixture of: acetic acid: TFE (trifluoroethanol): DCM (2: 2: 6, v / v / v ) in a round-bottomed flask on a magnetic stirrer.
Po upływie 2 godzin zawartość kolby odsączyło się pod zmniejszonym ciśnieniem na lejkach ze spiekiem Schotta przemywając mieszaniną ściągającą. Roztwór przemyto heksanem (1:10 v/v), odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie poddano liofilizacji.After 2 hours, the contents of the flask were filtered under vacuum on Schott funnels, washing with the astringent mixture. The solution was washed with hexane (1:10 v / v), evaporated under reduced pressure then freeze-dried.
e. Chemiczna synteza pochodnych paranitroanilidu Vale. Chemical synthesis of Val paranitroanilide derivatives
Do syntezy Fmoc-Val-pNA wykorzystano metodę mieszanych bezwodników. W pierwszym etapie 2 mmole Fmoc-Val rozpuszczono w bezwodnym tetrahydrofuranie (THF) w obecności 2 mmoli N-metylomorfoliny (NMM). Grupa karboksylowa pochodnej aminokwasowej była aktywowana 2 mmolami chlorku izobutylu. Po 10 minutach aktywacji dodano 3 mmole p-nitroaniliny. Reakcje prowadzono przez 2 godziny w temperaturze -15°C, a następnie dobę w temperaturze pokojowej. Po skończonej reakcji rozpuszczalnik odparowano, a suchą pozostałość rozpuszczono w octanie etylu. Otrzymany roztwór przemywano kolejno nasyconym wodnym roztworem NaCl, 10% kwasem cytrynowym, 5% wodorowęglanem sodu. Otrzymany roztwór wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, octan etylu oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a suchą pozostałość suszono w eksykatorze próżniowym nad P2O5 i KOH.The mixed anhydride method was used to synthesize Fmoc-Val-pNA. In the first step, 2 mmol of Fmoc-Val was dissolved in anhydrous tetrahydrofuran (THF) in the presence of 2 mmol of N-methylmorpholine (NMM). The carboxyl group of the amino acid derivative was activated with 2 mmol of isobutyl chloride. After 10 minutes of activation, 3 mmol of p-nitroaniline were added. Reactions were carried out for 2 hours at -15 ° C and then overnight at room temperature. After completion of the reaction, the solvent was evaporated and the dry residue was dissolved in ethyl acetate. The resulting solution was washed sequentially with saturated aqueous NaCl solution, 10% citric acid, 5% sodium bicarbonate. The resulting solution was dried over anhydrous sodium sulfate, ethyl acetate was distilled off under reduced pressure, and the dry residue was dried in a vacuum desiccator over P2O5 and KOH.
f. Sprzęganie chronionego peptydu z paranitroanilidem Valf. Conjugation of the protected peptide to the Val paranitroanilide
Chroniony peptyd ABZ1-Leu2-Glu(OtBu)3-Pro4-OH rozpuszczono w niewielkiej ilości DCM, kolejno aktywowano za pomocą TFFH (tetrametylofluoroformamid) przez 30 minut w temperaturze 0°C. Następnie dodano katalityczną ilość DMAP oraz Fmoc-Val-pNA.The protected peptide ABZ1-Leu 2 -Glu (OtBu) 3 -Pro4-OH was dissolved in a little DCM, then activated with TFFH (tetramethylfluoroformamide) for 30 minutes at 0 ° C. Then a catalytic amount of DMAP and Fmoc-Val-pNA were added.
Reakcję prowadzono przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, po czym odparowano rozpuszczalnik. Otrzymany roztwór zalano mieszaniną ściągającą osłony boczne: TFA : fenol : woda : TIPS (88:5:5:2, v/v/v/v) i mieszano w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym przez 3 godziny.The reaction was carried out for 24 hours at room temperature, then the solvent was evaporated. The resulting solution was quenched with side-shell astringent: TFA: phenol: water: TIPS (88: 5: 5: 2, v / v / v / v) and stirred in a round bottom flask on a magnetic stirrer for 3 hours.
Po tym czasie do kolby dodano zimny eter dietylowy, a powstały osad odwirowano na wirówce SIGMA 2K30 (Laboratory Centrifuges) w czasie 20 minut. Osad otrzymany po wirowaniu rozpuszcza się w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddano liofilizacji.At this time, cold diethyl ether was added to the flask and the resulting pellet was centrifuged on a SIGMA 2K30 centrifuge (Laboratory Centrifuges) for 20 minutes. The pellet obtained after centrifugation is dissolved in water by means of ultrasound and then lyophilized.
Tożsamość/charakterystyka nowego związku - analiza HPLC, MSNew compound identity / characterization - HPLC analysis, MS
HPLC warunki: kolumna RP Bio Wide Pore Supelco C8 250 mm 4 mm, układ faz A 0,1% TFA w wodzie, B: 80% acetonitrylu w A), przepływ 1 ml/min, detekcja UV przy 226 nm. Potwierdzono otrzymanie związku.HPLC conditions: RP Bio Wide Pore Supelco C8 column 250mm 4mm, A phase configuration 0.1% TFA in water, B: 80% acetonitrile in A), flow 1 ml / min, UV detection at 226 nm. Compound was confirmed.
P r z y k ł a d 3P r z k ł a d 3
Badanie zastosowania nowych związków otrzymanych według przykładu 1 i 2 w diagnostyce stanów zapalnych i diagnostyce nowotworów nabłonkowych.Study of the application of new compounds obtained according to examples 1 and 2 in the diagnosis of inflammation and diagnosis of epithelial neoplasms.
Badanie wykonano na grupie 130 chorych - nowotwory nabłonkowe/stan zapalny, 430 osób bez choroby nowotworowej w postaci kontroli.The study was performed on a group of 130 patients - epithelial tumors / inflammation, 430 people without cancer in the form of control.
Inkubacja związku o strukturze ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2/ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-pNA w niżej opisanych warunkach.Incubation of the compound with the structure ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 / ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-pNA under the conditions described below.
- 80 μl moczu pacjentów z diagnozą nowotworu nabłonka układu moczowego lub mocz od grupy kontrolnej- 80 μl of urine from patients diagnosed with cancer of the urinary tract epithelium or urine from the control group
- 100 gl buforu (50 mM Tris-HCl, pH 8.3)- 100 g of buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.3)
PL236 125B1PL236 125B1
- 20 μΙ substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB NH2 -NH2 (0,5 mg/ml DMSO - dimetylosulfotlenek) lub ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-pNA (0,5 mg/ml DMSO - dimetylosulfotlenek)- 20 μΙ of ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB NH2 -NH2 substrate (0.5 mg / ml DMSO - dimethylsulfoxide) or ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-pNA (0.5 mg / ml DMSO - dimethylsulfoxide)
- Czas inkubacji 60 minut- Incubation time 60 minutes
- Temperatura 37°C- Temperature 37 ° C
Przeprowadzono również badanie zastosowania markera diagnostycznego otrzymanego według przykładu 1 lub 2 do wykrywania stanu zapalnego. W tym celu marker dodawano do moczu ze zdiagnozowanym stanem zapalnym, potwierdzonym wykryciem markera stanu zapalnego jakim jest elastaza neutrofilna. W wyniku badań wykazano, że marker ten może zostać zastosowany jako marker stanu zapalnego, jak również marker stanu zapalnego i nowotworu nabłonkowego, w przypadku obecności i nowotworu i potwierdzonego stanu zapalenia. W obu przypadkach obserwowano zabarwienie - odczyt absorbancji przy długości fali około 410 nm - w zakresie 380-430 nm.A study was also carried out on the use of the diagnostic marker obtained according to example 1 or 2 for the detection of inflammation. For this purpose, the marker was added to the urine with diagnosed inflammation, confirmed by the detection of an inflammatory marker, i.e. neutrophilic elastase. As a result of the research, it was shown that this marker can be used as a marker of inflammation, as well as a marker of inflammation and epithelial cancer, in the presence of both cancer and confirmed inflammation. In both cases, a color was observed - absorbance reading at about 410 nm - in the range of 380-430 nm.
W wyniku inkubacji otrzymano następujące wyniki, których przykłady przedstawiono i opisano poniżej.Incubation gave the following results, examples of which are shown and described below.
Przeprowadzono również badania użycia tych związków do wykrywania stanu zapalnego i nowotworu nabłonkowego w próbkach krwi pacjentów z rozpoznanym stanem zapalnym/nowotworem nabłonkowym. Proces pomiaru absorbancji przeprowadza się w analogiczny sposób jak opisano dla próbek moczu. Wstępne wyniki badań potwierdzają ich zastosowanie diagnostyczne również dla tego materiału biologicznego - osocza lub surowicy.Studies have also been carried out on the use of these compounds for the detection of inflammation and epithelial cancer in blood samples of patients diagnosed with inflammation / epithelial cancer. The absorbance measurement process is analogous to that described for urine samples. Initial test results confirm their diagnostic application also for this biological material - plasma or serum.
Analiza HPLC:HPLC analysis:
Substrat ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB NH2 w buforze o składzie 50 mM Tris-HCl, pH 8.3ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB NH 2 substrate in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.3
ABZ-Leu-Gtu-Pro-Vol-ANB-NH;, ta=22.89ABZ-Leu-Gtu-Pro-Vol-ANB-NH ; , t a = 22.89
Hydroliza substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB NH2 w moczu ze zdiadnozowanym nowotworem nabłonka układu moczowegoHydrolysis of ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB NH 2 substrate in urine with diagnosed cancer of the urinary tract epithelium
Próbka moczu z substrafemUrine sample with substraf
19.5619.56
PL236 125 Β1PL236 125 Β1
Aktywność proteolityczna enzymów obecnych w badanym materiale biologicznym (próbki moczu ze zdiagnozowanym nowotworem) jest proporcjonalna do intensywności obserwowanego sygnału absorbancji, uwalnianego w wyniku hydrolizy wiązania peptydowego ANB. Analiza potwierdziła, że w przypadku badanych próbek hydroliza substratu ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-ANB-NH26 następuje w pozycji 5, gdzie otrzymujemy ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5 oraz ANB-NH26. Analogicznemu procesowi ulega związek ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-pNA6 który uwalnia wolną cząsteczkę pNA i fragment ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-OH.The proteolytic activity of enzymes present in the tested biological material (urine samples with diagnosed cancer) is proportional to the intensity of the observed absorbance signal, released as a result of the hydrolysis of the ANB peptide bond. The analysis confirmed that in the case of the tested samples, the hydrolysis of the substrate ABZ 1 -Leu 2 -Glu 3 -Pro 4 -Val 5 -ANB-NH2 6 takes place in position 5, where we obtain ABZ 1 -Leu 2 -Glu 3 -Pro 4 -Val 5 and ANB-NH2 6 . The compound ABZ1-Leu2-Glu3-Pro4-Val5-pNA6, which releases the free pNA molecule and the fragment ABZ 1 -Leu 2 -Glu 3 -Pro 4 -Val 5 -OH, undergoes an analogous process.
Z wykresu - Fig. 1 odczytać możemy, że w przypadku próbek 148, 305, i 233 rozpad substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 zachodzi wydajniej niż w przypadku materiałów 89, 42 czy 117. Taki rezultat może być spowodowany różnicą w aktywności, jak i ilości enzymów odpowiedzialnych za proteolizę. Identyczny obraz otrzymujemy przy zastosowaniu substratu ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-pNA Fig. 2.From the diagram - Fig. 1 we can read that in the case of samples 148, 305, and 233, the decomposition of the ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 substrate occurs more efficiently than in the case of materials 89, 42 or 117. This result may be caused by the difference in activity and amount of enzymes responsible for proteolysis. An identical image is obtained with the use of ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-pNA substrate Fig. 2.
Tabela 1. Rodzaje inhibitorów, mechanizm ich działania oraz zastosowane stężenie efektywneTable 1. Types of inhibitors, their mechanism of action and the effective concentration used
Aktywność proteolityczna jest zależna od obecności określonych związków nazywanych inhibitorami (enzymów proteolitycznych). Ich inkubacja z danym materiałem biologicznym pozwala nam wstępnie określić klasę enzymów obecnych w badanych próbkach. W tym celu do połączonych próbek moczu osób chorych (nowotwór nabłonka układu moczowego) dodaliśmy efektywne stężenia hamujące określone klasy enzymów proteolitycznych.Proteolytic activity is dependent on the presence of specific compounds called inhibitors (proteolytic enzymes). Their incubation with a given biological material allows us to initially determine the class of enzymes present in the tested samples. To this end, we added effective concentrations that inhibit certain classes of proteolytic enzymes to the pooled urine samples of sick people (urinary tract cancer).
Na aktywność enzymatyczną wpływa wiele czynników, spośród których jednym jest pH środowiska reakcji. Przeprowadzony eksperyment może wskazywać, że w badanym moczu znajdują się enzymy preferujące odmienne warunki. Obserwujemy jedno maksimum aktywności proteolitycznej, co sugeruje na obecność proteinaz przeprowadzających hydrolizę w warunkach zasadowych (fig. 3).The enzyme activity is influenced by many factors, one of which is the pH of the reaction medium. The conducted experiment may indicate that the investigated urine contains enzymes that prefer different conditions. We observe one peak of proteolytic activity, suggesting the presence of alkaline hydrolyzing proteinases (Figure 3).
Użycie inhibitorów różnych klas enzymów nie spowodowało spadku aktywności proteolitycznej. Jedynie inkubacja moczu z AHX-VYDnVp(C4H2CI)2 skutkowała całkowitym wyhamowaniem hydrolizy (fig. 4). Taki wynik mógłby sugerować obecność proteinaz serynowych, a dokładniej tych o specyficzności elastazowej. Wykonaliśmy dodatkowy eksperyment, który potwierdził, że stosowany przez nas związek ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 jest hydrolizowany przez elastazę, podczas gdy proteinaza 3 nie powoduje proteolizy. Obserwowana aktywność może świadczyć o stanie zapalnym towarzyszącym chorobie nowotworowej, jako że elastaza jest uwalniana przez neutrofile jako odpowiedź immunologiczna na stan zapalny. Carfizomib także w pewnym stopniu hamuje proteolizę, stąd nasuwa się wniosek, że za aktywność enzymatyczną w moczu osób ze zdiagnozowaną chorobą nowotworową pęcherza moczowego odpowiadają) enzym(y) należący(e) do innego rodzaju niż wymienione w powyższej tabeli.The use of inhibitors of different classes of enzymes did not reduce the proteolytic activity. Only incubation of urine with AHX-VYDnV p (C4H2Cl) 2 resulted in complete inhibition of the hydrolysis (Fig. 4). Such a result would suggest the presence of serine proteinases, and more specifically those with elastase specificity. We performed an additional experiment which confirmed that the compound ABZ-Leu-Glu-Pro-Val-ANB-NH2 we use is hydrolyzed by elastase, while proteinase 3 does not cause proteolysis. The observed activity may be indicative of the inflammation associated with the neoplastic disease, as elastase is released by neutrophils as an immune response to inflammation. Carfizomib also inhibits proteolysis to some extent, hence the conclusion that enzymatic activity in the urine of people diagnosed with bladder cancer is due to enzyme (s) belonging to a different type than those listed in the table above.
Aby zwiększyć czułość metody detekcji otrzymany materiał biologiczny (ludzki mocz ze stwierdzonym nowotworem nabłonka układu moczowego) został zagęszczony. W tym celu użyto kolumn filtracyjnych Amicon. W wyniku tego procesu otrzymaliśmy czterokrotnie zagęszczony materiał o aktywności około 2 krotnie wyższej niż materiał wyjściowy (fig. 5). Fakt liniowej odpowiedzi na wzrastające stężenie enzymu potwierdza selektywność otrzymanego przez nas związku.To increase the sensitivity of the detection method, the obtained biological material (human urine with diagnosed cancer of the urinary system epithelium) was concentrated. For this purpose, Amicon filtration columns were used. As a result of this process, we obtained a four times densified material with an activity about 2 times higher than that of the starting material (Fig. 5). The fact of a linear response to the increasing concentration of the enzyme confirms the selectivity of the compound obtained by us.
PL 236 125 B1PL 236 125 B1
PodsumowanieSummary
Analiza potwierdziła zastosowanie związków według przykładu 1 i 2 w diagnostyce stanów zapalnych i w diagnostyce nowotworu nabłonkowego. Wstępne wyniki wskazują, że związki te mogą mieć zastosowanie do rozpoznania stanu zapalnego - odpowiedzi immunologicznej, który towarzyszy nowotworowi nabłonkowego jak również do rozpoznania dodatkowego stanu zapalnego np. wywołanego zakażeniem które towarzyszy nowotworowi lub przy barku obecności nowotworu, czyli rozpoznania samej odpowiedzi immunologicznej, która np. może prowadzić do procesu chorobowego w tym nowotworzenia.The analysis confirmed the use of compounds according to Examples 1 and 2 in the diagnosis of inflammation and in the diagnosis of epithelial cancer. Preliminary results indicate that these compounds may be used to diagnose inflammation - the immune response that accompanies an epithelial tumor, as well as to identify additional inflammation, e.g. caused by infection that accompanies the tumor or at the shoulder of the tumor, i.e. to recognize the immune response itself, which may lead to a disease process, including cancer.
Mechanizm działania nowych związków - markerów diagnostycznych według wynalazku polega na hydrolizie enzymatycznej w takim miejscu peptydu, w wyniku czego uwalnia się ANB-NH2 - amid kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego lub pNA, który wykazuje absorbancję przy długości fali 300-500 nm, zwłaszcza 380-430 nm.The mechanism of action of the new compounds - diagnostic markers according to the invention is based on enzymatic hydrolysis in such a place of the peptide, as a result of which ANB-NH2 is released - 5-amino-2-nitrobenzoic acid amide or pNA, which shows absorbance at a wavelength of 300-500 nm, especially 380-430 nm.
Claims (6)
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL426332A PL236125B1 (en) | 2018-07-14 | 2018-07-14 | Chemical compounds used as diagnostic markers of inflammation and cancer, method of their preparation, diagnostic kit and method of diagnosing inflammatory processes and epithelial cancers |
| EP18183815.2A EP3431490B1 (en) | 2017-07-17 | 2018-07-16 | Chemical compounds for use as diagnostic markers of inflammation and neoplams, the method for synthesis of the chemical compounds, diagnostic kit for use in diagnosis of inflammatory processes and epithelial neoplasms and in vitro diagnostic method of inflammatory processes and epithelial neoplasms |
| PL18183815T PL3431490T3 (en) | 2017-07-17 | 2018-07-16 | Chemical compounds for use as diagnostic markers of inflammation and neoplams, the method for synthesis of the chemical compounds, diagnostic kit for use in diagnosis of inflammatory processes and epithelial neoplasms and in vitro diagnostic method of inflammatory processes and epithelial neoplasms |
| PCT/PL2019/050004 WO2020017984A1 (en) | 2018-07-14 | 2019-01-21 | Chemical compounds for use as diagnostic markers of inflammation and neoplasms |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL426332A PL236125B1 (en) | 2018-07-14 | 2018-07-14 | Chemical compounds used as diagnostic markers of inflammation and cancer, method of their preparation, diagnostic kit and method of diagnosing inflammatory processes and epithelial cancers |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL426332A1 PL426332A1 (en) | 2020-01-27 |
| PL236125B1 true PL236125B1 (en) | 2020-12-14 |
Family
ID=65686914
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL426332A PL236125B1 (en) | 2017-07-17 | 2018-07-14 | Chemical compounds used as diagnostic markers of inflammation and cancer, method of their preparation, diagnostic kit and method of diagnosing inflammatory processes and epithelial cancers |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL236125B1 (en) |
| WO (1) | WO2020017984A1 (en) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040009911A1 (en) * | 2002-01-31 | 2004-01-15 | Irm, Llc | Hepsin substrates and prodrugs |
| EA200801822A1 (en) * | 2008-06-19 | 2009-04-28 | Ано "Институт Молекулярной Диагностики" | TEST SYSTEM FOR DIAGNOSTIC PROSTATE CANCER AND METHOD OF DIAGNOSTIC PROSTATE CANCER |
| PL225341B1 (en) * | 2014-07-17 | 2017-03-31 | Univ Gdański | New compound, method for obtaining it, pharmaceutical solution containing the new compound, method for determination of the presence of tumor disease, accessories for cancer detection and application of the hydrolysis of the new compound for cancer detection |
-
2018
- 2018-07-14 PL PL426332A patent/PL236125B1/en unknown
-
2019
- 2019-01-21 WO PCT/PL2019/050004 patent/WO2020017984A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2020017984A1 (en) | 2020-01-23 |
| PL426332A1 (en) | 2020-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240353410A1 (en) | Fret enzymatic substrate and uses thereof in liver cancer | |
| PL236125B1 (en) | Chemical compounds used as diagnostic markers of inflammation and cancer, method of their preparation, diagnostic kit and method of diagnosing inflammatory processes and epithelial cancers | |
| EP3431490B1 (en) | Chemical compounds for use as diagnostic markers of inflammation and neoplams, the method for synthesis of the chemical compounds, diagnostic kit for use in diagnosis of inflammatory processes and epithelial neoplasms and in vitro diagnostic method of inflammatory processes and epithelial neoplasms | |
| US20250270617A1 (en) | Compound - diagnostic marker for kidney cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of kidney cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of kidney cancer | |
| PL238700B1 (en) | Chemical compounds applicable as diagnostic markers of inflammation and neoplasms for use as a diagnostic kit and method for the diagnosis and differentiation of inflammatory processes and epithelial neoplasms | |
| US20250003970A1 (en) | Fret enzymatic substrate and uses thereof in lung cancer | |
| US20250206777A1 (en) | Compound - diagnostic marker for intestinal cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of intestinal cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of intestinal cancer | |
| PL238699B1 (en) | A chemical compound used as a tumor diagnostic marker, method of preparation, method of diagnosing epithelial neoplasms | |
| HK40113726A (en) | Compound - diagnostic marker for kidney cancer, method for detecting enzymaticactivity, method for diagnosis of kidney cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of kidney cancer | |
| CN120476216A (en) | Compound-diagnostic marker for biliary tract cancer, method for detecting enzyme activity, method for diagnosing biliary tract cancer, kit comprising the compound, use of the compound, and method for treating biliary tract cancer | |
| HK40105068A (en) | Fret enzymatic substrate and uses thereof in liver cancer | |
| HK40129291A (en) | Compound - diagnostic marker for biliary tract cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of biliary tract cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of biliary tract cancer | |
| PL238575B1 (en) | The compound and its use for the detection of epithelial tumors | |
| PL245425B1 (en) | A diagnostic marker compound for endometrial cancer, a method for detecting enzymatic activity, a method for diagnosing endometrial cancer, a kit containing such a compound and a compound for medical use | |
| HK40107766A (en) | Fret enzymatic substrate and uses thereof in lung cancer | |
| HK40116114A (en) | Compound-diagnostic marker for uterine body cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of uterine body cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of uterine body cancer | |
| HK40111059A (en) | Compound - diagnostic marker for intestinal cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of intestinal cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of intestinal cancer |