PL227055B1 - Nowy przewodzacy polimer bisbitiofenowy molekularnie wdrukowany zapomoca białka, wtym ludzkiej albuminy, sposób jego przygotowania ijego zastosowanie - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy przewodzący polimer bisbitiofenowy, wdrukowany molekularnie za pomocą białek, w tym ludzkiej albuminy, sposób jego przygotowania i jego zastosowanie jako warstwy rozpoznającej czujnika elektrochemicznego do selektywnego wykrywania i/lub oznaczania ludzkiej albuminy w moczu i we krwi.

Albumina ludzka (HA) jest podstawowym składnikiem frakcji białkowej osocza krwi, stanowią₁ cym prawie połową zawartych w niej protein.¹ Masa cząsteczkowa HA wynosi, Mw = 66.4 kDa, a wymiary 7.5 x 6.5 x 4.0 nm^3.2. Główne jej zadanie w organizmie ludzkim to transport wielu ważnych sub₃ stancji, w tym hormonów i kwasów tłuszczowych oraz ksenobiotyków, np. leków.³ Ponadto utrzymuje ona ciśnienie onkotyczne krwi i zapobiega fotochemicznemu rozkładowi kwasu foliowego. Stężenie HA w osoczu krwi zwykle utrzymuje się na poziomie od 35 do 50 mg/mL. Niski poziom HA w surowicy krwi (hipoalbuminemia) wskazuje na niewydolność wątroby, marskość wątroby i przewlekłe zapalanie wątroby.⁴ Pomiar stężenia HA może być wykorzystany do wczesnego wykrywania choroby wieńcowej serca i szpiczaka mnogiego. Obecność HA w umiarkowanym stężeniu (30 do 300 pg/mL) w moczu sygnalizuje mikroalbuminurię, a w wyższych stężeniach - albuminurię wywołaną uszkodzeniem nerek, najczęściej spowodowanym cukrzycą lub nadciśnieniem.⁷ Zatem z punktu widzenia analityki klinicznej oznaczanie stężenia HA jest niezwykle istotne.

HA najczęściej oznacza się kolorymetrycznie. Wykorzystuje się w niej reakcję barwnika - zieleni bromokrezolowej - z HA.⁸ Metoda ta, mimo że powszechnie stosowana, wykazuje szereg poważnych wad. Jedna, często spotykana, to zawyżenie mierzonego stężenia albuminy, ponieważ reakcja HA z barwnikiem jest daleka od osiągnięcia stanu równowagi w czasie pomiaru. Dlatego w trakcie pomiaru sygnał wciąż rośnie.^9,10 Ta zależność wielkości sygnału od czasu jest źródłem licznych błędów oznaczeń

HA. Co więcej, zieleń bromokrezolowa reaguje również z innymi białkami obecnymi w próbce.¹¹ Liniowa odpowiedź stężeniowa tej metody zawiera się zazwyczaj w zakresie od 100 do 300 pg/mL HA.¹² Także spektroskopia fluorescencyjna, stosowana do oznaczania HA, nie jest w pełni zadowalająca, zwłaszcza pod względem selektywności i stabilności rejestrowanego sygnału detekcji. Obecne w badanej próbce różne substancje przeszkadzające, w tym inne białka, mogą zakłócać mierzoną emisję.^13-18 Dopiero całkiem niedawno opracowano, z wykorzystaniem Zieleni Pittsburskiej II, procedurę fluorescencyjnego oznaczania HA, w której mierzony sygnał nie zmieniał się w czasie. Sygnał ten wykazywał liniową zależność od stężenia HA w zakresie od 2 do 10 pg/mL HA.¹⁹ Co więcej, opracowano immunosensor impedymetryczny, do budowy którego zastosowano przeciwciała anty-HA osa20 dzone na azotku krzemu (Si3N4).²⁰ Czujnik ten nie wymagał znakowania HA, oznaczanie HA było wysoce selektywne względem innych białek, a mierzony sygnał liniowo zależał od stężenia w zakresie od

-13 -7

10^-13 do 10^-7 M HA. Jednakże czujnik ten wykazywał typowe wady immunosensorów, tzn. wytworzenie czujnika było bardzo skomplikowane i kosztowne. Poza tym przeciwciała anty-HSA są nietrwałe i po pewnym czasie tracą swoje właściwości. Ponadto czujnik ten był czujnikiem jednorazowego użytku, gdyż po wyekstrahowaniu z niego HA, po pierwszym oznaczeniu, jego czułość malała o 40%.

Polimery wdrukowane molekularnie (MlP-γ), syntetyzowane z zastosowaniem makrocząsteczek (Mw > 1500 Da) jako szablonów, cieszą się rosnącym zainteresowaniem od kilku dekad. Podejmowane są liczne próby wytwarzania MIP-ów wiążących białka. W tym celu rozwijane są różne procedury wdrukowania. Można je pogrupować na procedury, w których (i) polimeryzacja przebiega w całej objętości roztworu, (ii) syntezowane są polimerowe nanocząstki, (iii) wdrukowanie ma charakter po21-26 wierzchniowy i (iv) wdrukowywane są epitopy, tzn. niewielkie fragmenty peptydu jako szablony.^21-26

Pomimo rosnącej liczby oryginalnych publikacji, osiągnięty w tej dziedzinie postęp jest wciąż niewielki.

Najbardziej obiecująca jest metoda wdrukowywania cząsteczki epitopu.²⁷ Ale nawet to podejście wykazuje istotne ograniczenia. Mianowicie, fragmenty białka wybrane do wdrukowania powinny być specyficzne tylko dla tego białka, a monomery funkcyjne powinny mieć łatwy do nich dostęp. Na przykład, epitopy powinny występować na powierzchni cząsteczki oznaczanego białka. Co więcej, epitop powinien być stosunkowo tani i łatwo dostępny.

Podjęto także próby wdrukowania molekularnego HA w celu wytworzenia selektywnych chemosensorów. Między innymi molekularnie wdrukowany albuminą układ silikonowy zol-żel osadzono na powierzchni złotej elektrody rezonatora kwarcowego.²⁸ Tak przygotowany element rozpoznający zastosowano do pomiaru stężenia HA za pomocą równoczesnej mikrograwimetrii i elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS) z zastosowaniem mikrowagi kwarcowej. Chemoczujnik ten był wyPL 227 055 B1 soce selektywny względem wielu innych białek a mierzony sygnał liniowo zależał od stężenia w zakresie od 10^-9 do 10^-6 g/mL HA.

Co więcej, opracowano chemosensor fluorescencyjny z wykorzystaniem HA molekularnie wdrukowanej w polimer akrylowy zawierający w swojej strukturze barwnik fluorescencyjny, amid dansylo29 etylenodiaminowy O-akroilo-L-4-hydroksyproliny.²⁹ Liniowy zakres stężeniowy tego chemoczujnika pokrywał stężenia od 0,5 do 5 μΜ HA. Co więcej, chemosensor ten charakteryzował się wysoką selektywnością względem takich białek jak lizozym, awidyna i chymotrypsyna, lecz selektywność wobec albuminy wołowej była niska. Fluorescencja polimeru była wygaszana tylko w wyniku wiązania HA wewnątrz polimeru a nie w wyniku niespecyficznej absorpcji HA na powierzchni polimeru. Gdy zastosowano ten sam polimer jako element rozpoznający czujnika plazmonicznego spektroskopu rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR), to zarówno współczynnik wdrukowania jak i wyznaczona selektywność względem ww. białek były niskie.

Wdrukowywanie peptydów to poważne wyzwanie badawcze głównie ze względu na wielkość ich cząsteczek stosowanych jako szablony, wiele potencjalnych oddziaływań i ich konformacyjną elastyczność. W przypadku niekowalencyjnego wdrukowania bardzo trudno jest oszacować, które i ile grup funkcyjnych białka może oddziaływać z monomerami funkcyjnymi. Wybór właściwego stosunku molowego monomerów funkcyjnych do peptydu ma znaczenie kluczowe. Za wysoka bowiem zawartość monomerów funkcyjnych w MIP-ie doprowadziłaby do związania w matrycy polimeru losowo rozmieszczonych, niezwiązanych z białkiem, monomerów. Wówczas współczynnik wdrukowania byłby niski, a co za tym idzie niska byłaby selektywność MIP-u. Z drugiej strony, przy niskim stężeniu monomerów funkcyjnych, mniejsza liczba miejsc wiążących we wdrukowanej wnęce molekularnej sprawiłaby, że powinowactwo do analitu byłoby niższe. Aby uniknąć ww. trudności, w niniejszych badaniach wprowadziliśmy nowe podejście do wdrukowywania białek. Obejmuje ono wdrukowanie semikowalencyje. We wdrukowaniu tym monomery funkcyjne przed polimeryzacją są kowalencyjnie wiązane z grupami funkcyjnymi cząsteczek szablonu. Następnie, po polimeryzacji, szablon jest usuwany z MIP-u poprzez rozerwanie tychże kowalencyjnych wiązań. Ale w przeciwieństwie do typowego wdrukowania kowalencyjnego, analit w trakcie oznaczania wiąże się z wdrukowaną wnęką wyłącznie niekowaiencyjnie, np. poprzez wiązania wodorowe czy oddziaływania elektrostatyczne. Wdrukowanie to sprawia, że cząsteczki wszystkich monomerów funkcyjnych ulegających polimeryzacji są związane z cząsteczką szablonu.

W ramach niniejszego zgłoszenia opracowaliśmy nowy sposób wdrukowania związków wielkocząsteczkowych, których przykładem jest HA. W tym celu zastosowaliśmy metodę wdrukowania semikowalencyjnego. Metoda ta była dotychczas stosowana do wdrukowywania, jako szablonów, tylko substancji o niewielkich masach cząsteczkowych. Opracowany i wykonany przez nas MIP osadziliśmy w postaci cienkiej warstwy na powierzchni elektrody za pomocą elektropolimeryzacji w warunkach potencjodynamicznych. Warstwę tę wykorzystaliśmy jako element rozpoznający czujnika elektrochemicznego do selektywnego wykrywania i oznaczania HA w próbkach moczu i surowicy krwi.

Zgodnie z obecnym wynalazkiem, rozpoznający przewodzący polimer bisbitiofenowy, charakteryzuje się tym, że stanowi go polimer monomerów funkcyjnych stanowiących kwas 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowy i p-bis(2,2'-bitien-5-ylo)metyloalaninę i monomeru sieciującego stanowiącego 5,5',5-tris[(2,2'-bitien-5-ylo)metan], zawierający luki molekularne wdrukowane za pomocą białka, w tym znakowanej ludzkiej albuminy (HA).

Wynalazek ponadto obejmuje sposób wytwarzania rozpoznającego przewodzącego polimeru bisbitiofenowego, określonego powyżej, metodą wdrukowania molekularnego za pomocą elektropolimeryzacji potencjodynamicznej, charakteryzujący się tym, że prowadzi się elektropolimeryzację monomerów funkcyjnych stanowiących kwas 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowy i p-bis(2,2'-bitien-5-ylo)metyloalaninę w obecności monomeru sieciującego stanowiącego 5,5',5-tris[{2,2'-bitien-5-ylo)metan] i w obecności szablonu który stanowi białko, w tym znakowana ludzka albumina, (HA), przy czym szablon HA jest semikowalencyjnie wdrukowywany molekularne w trakcie tej elektropolimeryzacji, przy czym do elektropolimeryzacji stosuje się roztwór mieszaniny rozpuszczalników, korzystnie acetonitrylu i buforu fosforanowego, zawierający białko HA, kwas 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowy, p-bis(2,2'-bitien-5-ylo)metyloalaninę i 5,5',5-tris[(2,2'-bitien-5-ylo)metan] oraz elektrolit podstawowy o stężeniu 0,1 M, korzystnie chloran(Vll) tetrabutyloamoniowy [(TBA)CIO4); stosowane korzystnie w nadmiarze monomery funkcyjne są wiązane kowalencyjnie z szablonem tworząc addukt ludzkiej albuminy z bitiofenem, a następnie po wytworzeniu i osadzeniu polimeru MIP-HA w postaci warstwy na powierzchni elektrody szablon HA poddaje się wyekstrahowaniu w silnie zasadowym środowisku i otrzymuje się

PL 227 055 B1 rozpoznający przewodzący polimer bisbitiofenowy MIP zawierający luki molekularne wdrukowane za pomocą białka, w tym znakowanej ludzkiej albuminy (HA), przy czym elektropolimeryzację prowadzi się w zakresie potencjałów liniowo zmienianych w sposób cykliczny w zakresie od 0 do 1,20 V, względem Ag/AgCI, ze stałą szybkością w zakresie od 5 mV/s do 5 V/s.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, jako silne zasadowe środowisko stosuje się NaOH, najkorzystniej 30% roztwór NaOH.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, stosowany potencjał jest liniowo zmieniany w sposób cykliczny w zakresie od 0 do 1,20 V, względem Ag/AgCI, ze stałą szybkością 50 mV/s.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, do osadzania warstwy polimeru stosuje się przetwornik sygnału chemicznego - elektrodę pracującą - wybraną spośród grupy elektrod stałych, korzystnie złotej elektrody dyskowej i płytki szklanej z napylonym złotem.

Wynalazek również obejmuje zastosowanie rozpoznającego przewodzącego polimeru bisbitiofenowego określonego wyżej, w postaci warstwy, jako elementu rozpoznającego czujnika elektrochemicznego, do selektywnego wykrywania i/lub oznaczania białek, zwłaszcza w próbkach biologicznych, korzystnie w moczu i we krwi.

Wynalazek jest bliżej przedstawiony za pomocą korzystnych przykładów wykonania, z odniesieniem do załączonego rysunku, na którym

Schemat 1 przedstawia wzory strukturalne monomerów funkcyjnych, kwasu 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowego 1 i p-bis(2,2'-bitien-5-ylo)metyloalaniny 2, oraz monomeru sieciującego, 5,5',5-tris[(2,2'-bitien-5-ylo)metanu] 3

Schemat 2 przedstawia znakowanie HA za pomocą bitiofenu

Fig. 1 przedstawia wielocykliczne krzywe zależności prądu od potencjału zarejestrowane podczas elektropolimeryzacji, w warunkach potencjodynamicznych, na złotej elektrodzie dyskowej o średnicy 2 mm, w roztworze 10 μΜ 5,5',5-tris[{2,2'-bitien-5-ylo)metanu] 3 i 0,1 M chloranu(VII) tetrabutyloamoniowego w acetonitrylu (0,9 mL) z dodatkiem 0,1 mL roztworu znakowanej HA

Fig. 2 przedstawia widma spektroskopii UV-vis ludzkiej albuminy (1) natywnej i (2) znakowanej bitiofenem (w obydwu próbkach stężenie HA wynosiło 3 μg/mL)

Fig. 3 przedstawia (a) krzywe DPV i (b) widma EIS zarejestrowane (1) przed i (2) po osadzeniu warstwy MIP na złotej elektrodzie oraz po ekstrakcji szablonu za pomocą 30% NaOH w 40°C (3) przez 10 min i (4) przez 20 min.

Fig. 4 przedstawia (a) widma PM-IRRAS warstwy MIP-u osadzonej za pomocą elektropolimeryzacji w warunkach potencjodynamicznych na powierzchni elektrody złotej (1) przed i (2) po ekstrakcji HA oraz (b) widma warstwy osadzonej z kropli roztworu acetonitrylu po odparowaniu tego rozpuszczalnika (3) niemodyfikowanej HA i (4) HA znakowanej bitiofenem

Fig. 5 przedstawia zdjęcia AFM powierzchni MIP-u (a) przed i (b) po ekstrakcji HA za pomocą 30% NaOH oraz porównanie (c) ukształtowania powierzchni i (d) właściwości wisko-elastycznych tego samego obszaru (100 nm x 100 nm) MIP-u przed ekstrakcją szablonu HA

Fig. 6 przedstawia zmiany sygnału DPV elektrody złotej pokrytej warstwą MIP-u po dodaniu HA, aby uzyskać jej stężenie w roztworze równe (1) 1,66 μg/mL i (2) 16,6 μg/mL oraz (3) dryf sygnału po zanurzeniu elektrody w roztworze próbnika redoks, K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6], w nieobecności HA

Fig. 7 przedstawia krzywą kalibracyjną sygnału DPV w zależności od stężenia HA w roztworze, dla złotej elektrody dyskowej o średnicy 2 mm pokrytej warstwą MIP-u z wyekstrahowaną HA

Fig. 8 przedstawia krzywą kalibracyjną EIS zależności oporności polimeru MIP od stężenia HA w roztworze, dla złotej elektrody dyskowej pokrytej warstwą MIP-u z wyekstrahowaną HA

Fig. 9 przedstawia krzywą kalibracyjną dla (1) HA, (2) lizozymu, (3) cytochromu c i (4) mioglobiny, wyznaczone za pomocą złotej elektrody dyskowej pokrytej warstwą MIP-u z wyekstrahowaną HA.

Przykłady wykonania wynalazku

Materiały i procedury

Materiały

Odczynniki i reagenty

Wszystkie stosowane odczynniki chemiczne, rozpuszczalniki i białka zakupiono w firmie SigmaAldrich, z wyjątkiem kwasu 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowego zakupionego w firmie Enamine, Ltd., a także chlorowodorku N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodiimidu, (EDC) i 1-hydroksy-7-azabenzotriazolu (HOAt) zakupionych w firmie TCI N.V.

PL 227 055 B1

Synteza monomerów funkcyjnych

Syntezy monomerów: p-bis(2,2'-bitien-5-ylo)metyloalaniny 2 i 5,5',5-tris[(2,2'-bitien-5-ylo)-me31 tanu] 3 zostały opublikowane wcześniej.³¹

Znakowanie ludzkiej albuminy

Przygotowano zawiesinę ludzkiej albuminy (15 mg, 0,23 pmol) w roztworze z mieszanych rozpuszczalników, toluenu (0,5 mL) i chloroformu (0,3 mL). Następnie do tej zawiesiny dodano kwas 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowy 1 (11 mg, 52 pmol), HOAt (11 mg, 80 pmol), EDC (0,015 mL, 13 mg, 68 pmol) i trietyloaminę (0,025 mL). Po 10 godz. mieszania w temperaturze pokojowej, do tej zawiesiny dodano p-bis(2,2'-bitien-5-ylo)metyloalaninę 2 (40 mg, 92 pmol) oraz kolejne porcje EDC (0,015 mL, 13 mg, 68 pmol) i trietyloaminy (0,02 mL), po czym tę mieszaninę mieszano przez kolejne 10 godz. Produkt reakcji - znakowana bitiofenem HA - wyekstrahowano do fazy wodnej za pomocą roztworu solnego buforu fosforanowego, PBS, (2 x 0,5 mL, pH = 7,4). Następnie tak otrzymaną znakowaną HA oczyszczono za pomocą chromatografii cieczowej, LC, na kolumnie wypełnionej złożem Sephadex. Objętość wydzielonej frakcji wynosiła 5 mL, a stężenie znakowanej HA wynosiło ~3 mg/mL.

P r z y k ł a d 1

Otrzymywanie wdrukowanego molekularnie polimeru (MIP-u) i jego osadzanie na powierzchni elektrody

Warstwę MIP-u otrzymano metodą wdrukowanego molekularnie polimeru (MIP-u) i osadzono na powierzchni elektrody złotej za pomocą elektropolimeryzacji w warunkach potencjodynamicznych, w zakresie potencjałów od 0 do 1,20 V. Wykonano 50 cykli potencjałowych z szybkością zmiany potencjału 50 mV/s. Zarejestrowane w trakcie elektropolimeryzacji zależności prądu od potencjału przedstawiono na fig. 1. Aby przygotować roztwór do elektropolimeryzacji, do 0,9 pL roztworu 10 pM 5,5',5-tris[(2,2'-bitien-5-ylo)metanu] 3 (monomeru sieciującego) i 100 mM chloranu(VII) tetrabutyloamoniowego (elektrolit podstawowy) w acetonitrylu dodano 0,1 mL, roztworu znakowanej HA, opisanego powyżej. Przed polimeryzacją elektrodę zanurzono w roztworze „piranii” i wypolerowano za pomocą β-aluminy o średnicy ziarna 0,05 pm, do uzyskania powierzchni lustrzanej.

W celu zarejestrowania widm XPS i PM-IRRAS oraz wykonania zdjęć AFM MIP-u, polimer osadzono na złoconych płytkach szklanych w sposób opisany powyżej z tą różnicą, że powyżej opisany roztwór do elektropolimeryzacji rozcieńczono dziesięciokrotnie.

Ekstrakcja szablonu HA z molekularnie wdrukowanego polimeru

Po elektropolimeryzacji, szablon HA usunięto z warstwy MIP-u. W tym celu zanurzono elektrodę pokrytą tą warstwą na 45 min w 30% NaOH o temperaturze 40°C.

Pomiary elektrochemiczne

Wszystkie pomiary DPV i EIS wykonano w temperaturze pokojowej, 20(±1)°C, z zastosowaniem elektrochemicznego mininaczynka szklanego, w kształcie litery V, o pojemności 2 mL. Pomiary przeprowadzono z zastosowaniem roztworu próbnika redoks, 10 mM K3[Fe(CN)6] i 10 mM K4[Fe(CN)6], w roztworze PBS (pH = 7.4).

W przypadku pomiarów DPV, potencjał zmieniano w zakresie od -0.2 do 0.6 V co 5 mV. Amplituda 50-ms pulsów potencjału wynosiła 25 mV.

W pomiarach EIS częstotliwość była zmieniana w zakresie od 1 MHz do 100 mHz z sinusoidalną amplitudą 10 mV. Elektroda badana w roztworze elektrolitu została przybliżona za pomocą prostego obwodu zastępczego, Rs+CPE/(Rp+Wo), w którym Rs, Rp, CPE i Wo, to odpowiednio, opór roztworu, opór polimeru, element stałofazowy i impedancja Warburga.

Po zakończonym pomiarze elektrodę zanurzano w 30% NaOH na 2 do 20 min, w temperaturze 25 do 40°C w celu tak dokładnego wypłukania analitu, aby mierzony sygnał DPV osiągnął stałą wartość 30 do 45 pA.

Wyniki

Znakowanie ludzkiej albuminy

Wybraliśmy dwa różne monomery funkcyjne. Jeden w swej strukturze miał grupę karboksylową 1 a drugi aminową 2 (Schemat 1). Monomery te kowalencyjnie unieruchomiliśmy na powierzchni HA za pomocą wiązań peptydowych z odpowiednimi grupami funkcyjnymi (Schemat 2). Reakcja prowadzona była w mieszaninie toluenu i chloroformu. Z jednej strony mieszanina tych rozpuszczalników zapewniła wystarczającą rozpuszczalność wszystkich reagentów, a z drugiej - powodowała mniejsze uszkodzenia HA niż mieszanina takich rozpuszczalników jak metanol i aceton.³²

Opracowana procedura znakowania HA umożliwiła zastosowanie znacznego nadmiaru monomerów funkcyjnych względem grup funkcyjnych występujących na powierzchni szablonu HA. Dzięki

PL 227 055 B1 temu wszystkie te grupy zostały związane przez te monomery. Nadmiar monomerów funkcyjnych i powstający w reakcji produkt uboczny 4 następnie usunięto za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie wypełnionej Sephadexem. Ponadto nasza procedura pozwoliła na równoczesne zastosowanie monomerów funkcyjnych zawierających grupy karboksylowe jak i monomerów zawierających grupy aminowe. W przypadku wdrukowywania niekowalencyjnego, grupy te przede wszystkim reagowałyby ze sobą nawzajem. W widmie spektroskopii UV-vis, zarejestrowanym po znakowaniu HA, widoczne są dodatkowe pasma absorpcji związane z obecnością grup tiofenowych w strukturze cząsteczki (fig. 2).

P r z y k ł a d 2

Synteza polimeru molekularnie wdrukowanego za pomocą znakowanej ludzkiej albuminy

Opisaną powyżej znakowaną HA zastosowaliśmy następnie jako szablon do syntezy MIP-u.

W tym celu wybraliśmy warunki elektropolimeryzacji wielokrotnie sprawdzone w naszych wcześniejαλ ΟΟ OC szych badaniach.³⁰,^33-35 Mianowicie, warstwę MIP-u osadziliśmy zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 1 powyżej, a następnie szablon HA usunęliśmy z niej za pomocą 30% NaOH (przykład 1). Krzywe DPV i widma EIS, zarejestrowane przed i po elektropolimeryzacji oraz po ekstrakcji szablonu, są przedstawione na fig. 3.

Krzywe DPV i widma EIS zarejestrowane po ekstrakcji szablonu HA przypominają widma zarejestrowane dla niepokrytej warstwą MIP-u elektrody. Zachowanie to może być związane ze spęcznieniem polimeru, w trakcie ekstrakcji, roztworem elektrolitu o wyższym stężeniu niż w badanych próbkach i/lub samodomieszkowaniem polimeru protonami oddysocjowanymi od monomerów 2 i 3 w silnie zasadowym środowisku roztworu zastosowanego do ekstrakcji (30% NaOH).

Właściwości polimeru molekularnie wdrukowanego za pomocą znakowanej ludzkiej albuminy

W widmie PM-IRRAS zarejestrowanym po osadzeniu warstwy MIP-u występuje szerokie pasmo -1 absorpcji w zakresie od 1800 do 1000 cm^-1 związane z obecnością HA kowalencyjnie unieruchomionej w polimerze (krzywa 1 na fig. 4). Po ekstrakcji HA, pasmo to zniknęło (krzywa 2 na fig. 4).

Wykonano również zdjęcia powierzchni MIP-u za pomocą AFM (fig. 5). Zdjęcia te przedstawiają płaską powierzchnię zbudowaną z ziaren MIP-u o średnicy od 20 do 60 nm (fig. 5a, 5b i 5c). Na powierzchni tych ziaren nie ma żadnych mniejszych struktur a zmiany właściwości wisko-elastycznych powierzchni ziaren polimeru są ściśle skorelowane z granicami jego ziaren (fig. 5c i 5d). Co więcej, szorstkość polimeru, mierzona stosunkiem powierzchni obrazu w trzech wymiarach do powierzchni zrzutowanej na płaszczyznę, tylko nieznacznie zmalała, tj. z 16% do 12%, po ekstrakcji HA. Może to świadczyć o usunięciu pojedynczych cząsteczek HA z powierzchni ziaren polimeru. Grubość tej warstwy wynosiła 75 do 100 nm. Dla porównania, powierzchnia złotych elektrod dyskowych i wielkość przeniesionego podczas elektropolimeryzacji ładunku wskazują, że grubość warstwy MIP-u wynosiła 225 do 520 nm.

Parametry analityczne elektrochemicznego chemosensora do oznaczania HA

Znaczna wielkość biomolekuł, takich jak białka, sprawia, że ich współczynnik dyfuzji w warstwie MIP-u jest niski. Fig. 6 przedstawia zależne od czasu zmiany sygnału prądowego DPV elektrody złotej pokrytej warstwą MIP-u, dla różnych stężeń HA w badanym roztworze. Sygnał ten ulegał gwałtownemu obniżeniu w ciągu pierwszych 10 min pomiaru a po kolejnych 20 min spadek sygnału był wolniejszy i bardziej liniowy w czasie (krzywe 1 i 2 na fig. 6). Podobnie zmieniał się sygnał, lecz nieco mniej, po zanurzeniu elektrody w roztworze próbnika redoks w nieobecności HA (krzywa 3 na fig. 6).

Zmiany sygnałów są prawdopodobnie wynikiem dwóch równocześnie zachodzących procesów. Jeden z nich to usuwanie jonów z polimeru i obniżenie poziomu samodomieszkowania polimeru w roztworze obojętnym, wywołujące dryf sygnału. Drugi proces to wiązanie cząsteczek HA wewnątrz wdrukowanych wnęk polimeru. Rozsądny kompromis pomiędzy uzyskaniem wysokiego sygnału a ergonomią badań polega na wykonywaniu pomiaru po 60 min od chwili dodania HA.

Krzywe kalibracyjne zależności sygnału od stężenia HA skonstruowane zostały przy użyciu dwóch technik analitycznych, DPV i EIS. Za pomocą tych technik pomiary dla tego samego roztworu wykonywane były jeden po drugim, dokładnie po 60 min od chwili dodania HA.

W przypadku pomiarów DPV sygnał był proporcjonalny do stężenia HA w zakresie od 0,8 do 20 pg/mL HA (fig. 7) a równania regresji liniowej opisujące tę zależność miały następującą postać: Wo = 0,67(±0,01)-2,36 x 10^-3(±9,1 x 10^-4)Cha, pg/mL i Wo = 0,67(±0,01)-1,56 x 10^-4 (±6 x 10^-5)Cha, pM. Współczynnik korelacji wynosił 0,9963 a dolna granica wykrywalności była równa 16,6 ng/mL.

PL 227 055 B1

W przypadku EIS (fig. 8) mierzony sygnał był proporcjonalny do stężenia HA w zakresie od 4 do pg/mL HA i spełniał następujące równanie regresji liniowej AR_p,Q = 654(±66) + 23,72(±1,59)Cha, pg/mL i AR_p, Ω, = 654(±66) + 1,56(±0,1)Cha, pM. Współczynnik korelacji wynosi 0,9803 a dolna granica wykrywalności była równa 0,8 pg/mL.

Selektywność chemosensora względem substancji przeszkadzających, o niewielkiej masie cząsteczkowej, występujących w płynach ustrojowych

Zastosowanie molekularnego wdrukowywania semikowalencyjnego sprawia, że usytuowanie monomerów funkcyjnych w polimerze jest ściśle określone i ograniczone tylko do powierzchni wdrukowanych wnęk i powierzchni polimeru. Zwykle taki polimer wykazuje wysoką selektywność względem substancji o niewielkiej masie cząsteczkowej. Substancje te, nawet jeżeli byłyby związane wewnątrz wdrukowanych wnęk, to nie powodowałyby pęcznienia polimeru. Nie blokowałyby też wnęk o średnicy kilku nanometrów, tj. znacznie większych od średnicy cząsteczek tych substancji. W tabeli 1 zebrane są wartości sygnału chemosensora dla substancji o niewielkiej masie cząsteczkowej przeszkadzających w oznaczaniu HA, obecnych we krwi i w moczu.

T a b e l a 1

Sygnał elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej, EIS, chemoczujnika do oznaczania HA względem substancji o niewielkiej masie cząsteczkowej przeszkadzających w oznaczaniu HA, obecnych we krwi i moczu.

Lp.	Substancja	Masa molowa [Da]	Stężenie	Sygnał EIS zmierzony 60 min po zastrzyku [Ω]
1	Albumina ludzka	66400	0.82-115 pg/mL	300-2900
2	Kreatynina	113	16.5 pg/mLa,c 1 mg/mLb	Brak odpowiedzi 7800
3	Glukoza	180	20 pg/mLa	Brak odpowiedzi
4	Mocznik	60	10 mg/mLa,c	Brak odpowiedzi
5	Kwas moczowy	168	80 pg/mLb,c	Brak odpowiedzi

^a Maksymalne stężenie w ludzkim moczu.

^b Maksymalne stężenie w ludzkiej krwi.

^c Pomiar wykonany tylko dla stężenia wyższego z dwóch różnych w moczu lub we krwi.

Opracowany i wykonany chemosensor wykazuje wysoką selektywność względem większości substancji przeszkadzających w oznaczaniu występujących w moczu lub we krwi. Wyjątek stanowi glukoza, której obecność w stężeniu charakterystycznym dla krwi (1 mg/mL) chemosensor wykazuje za pomocą intensywnego sygnału. Jednakże, jeżeli weźmie się pod uwagę, że przed oznaczeniem stężenia HA próbka krwi powinna być rozcieńczona tysiąc razy, to obecność glukozy w takiej próbce nie powinna przeszkadzać w oznaczaniu HA. Cholesterol występujący we krwi zazwyczaj jest związany z białkami transportującymi, natomiast stężenia innych substancji przeszkadzających są znacznie niższe. Tak więc chemosensor może z powodzeniem być stosowany do oznaczania HA zarówno w próbkach moczu jak i krwi.

Selektywność chemosensora względem innych białek

Najważniejszym celem wdrukowania molekularnego, w zastosowaniu do budowy chemosensorów jest, oprócz osiągnięcia wysokiej wykrywalności, uzyskanie jak najwyższej selektywności oznaczeń. Aby ją oszacować, sygnały chemosensora MIP-HA, wygenerowane obecnością kilku białek o różnych stężeniach, zarejestrowano za pomocą EIS (fig. 9).

Czujnik chemiczny wykazał wysoką selektywność względem mioglobiny i cytochromu c. Natomiast jego selektywność względem lizozymu była nieco niższa, lecz również wysoka.

Wnioski

Opracowano i wykonano elektrochemiczny czujnik do selektywnego oznaczania ludzkiej albuminy. Jego elementem rozpoznającym jest przewodzący polimer bitiofenowy semikowalencyjnie wdrukowany molekularnie tym białkiem, MIP-HA. Kowalencyjne unieruchomienie HA w polimerze w trakcie

PL 227 055 B1 elektropolimeryzacji, a następnie jej usunięcie z polimeru potwierdzono za pomocą pomiarów DPV, EIS i PM-IRRAS.

Chemoczujnik MIP-HA z detekcją HA za pomocą DPV wykazywał liniowy zakres stężeniowy od

0,8.do 20 μg/mL HA. Dolna granica detekcji wynosiła 16,6 ng/ml HA. Dla chemoczujnika EIS zakres ten wynosił od 4 do 80 μg/mL HA a dolna granica detekcji była równa 0,8 μg/mL HA.

Chemoczujnik MIP-HA charakteryzował się wysoką selektywnością względem innych białek, takich jak mioglobina i cytochrom c. Selektywność wzglądem lizozymu była nieco niższa, lecz również wysoka. Chemosensor ten wykazywał także wysoką selektywność wzglądem substancji przeszkadzających, o niewielkiej masie cząsteczkowej, występujących w moczu i we krwi.

Odniesienia literaturowe

1. Peters, J. T., All About Albumin: Biochemistry, Genetics, and Medical Applications. Academic Press, San Diego: San Diego, 1995.

2. Erickson, H. P., Size and shape of protein molecules at the nanometer level determined by sedimentation, gel filtration, and electron microscopy. Biol. Proced. Online 2009,11,32-51.

3. Curry, S.; Mandelkow, H.; Brick, P.; Franks, N., Crystal structure of human serum albumin complexed with fatty acid reveals an asymmetric distribution of binding sites. Nat. Struct. Biol. 1998,5, 827-835.

4. Murch, S. H.; Winyard, P. J.; Koletzko, S.; Wehner, B.; Cheema, H. A.; Risdon, R. A.; Phillips, A. D.; Meadows, N.; Klein, N. J.; Walker-Smith, J. A., Congenital enterocyte heparan sulphate deficiency with massive albumin loss, secretory diarrhoea, and malnutrition. Lancet 1996,347,1299-301.

5. Danesh, J.; Collins, R.; Appleby, P.; Peto, R., Association of fibrinogen, C-reactive protein, albumin, or leukocyte count with coronary heart disease - Meta-analyses of prospective studies. Jama-J. Am. Med. Assoc. 1998,279,1477-1482.

6. Greipp, P. R.; San Miguel, J.; Durie, B. G. M.; Crowley, J. J.; Barlogie, B.; Blade, J.; Boccadoro, M.; Child, J. A.; Harousseau, J. L; Kyle, R. A.; Lahuerta, J. J.; Ludwig, H.; Morgan, G.; Powieś, R.; Shimizu, K.; Shustik, C.; Sonneveld, P.; Tosi, P.; Turesson, I.; Westin, J., International staging system for multiple myeloma. J. Clin. Oncol. 2005,23,3412-3420.

7. Hoogenberg, K.; Sluiter, W. J.; Dullaart, R. P., Effect of growth hormone and insulin-like growth factor I on urinary albumin excretion: studies in acromegaly and growth hormone deficiency. Acta Endocrinol. 1993,129,151-7.

8. Rodkey, F. L, Direct spectrophotometric determination of albumin in human serum. Clin. Chem. 1965,11,478.

9. Webster, D.; Bignell, A. H. C.; Attwood, E. C., Assessment of suitability of bromocresol green for determination of serum-albumin. Clin. Chim. Acta 1974,53,101-108.

10. Snozek, C. L. H.; Saenger, A. K.; Greipp, P. R.; Bryant, S. C; Kyle, R. A.; Rajkumar, S. V.; Katzmann, J. A., Comparison of bromcresol green and agarose protein electrophoresis for quantitation of serum albumin in multiple myeloma. Clin. Chem. 2007,53,1099-1103.

11. Keay, G.; Doxey, D. L, A Study of the interaction between Bbromocresol Green-dye and bovine, ovine and equine serum globulins. Vet. Res. Commun. 1984,8,25-32.

12. Doumas, B. T.; Watson, W. A.; Biggs, H. G., Albumin standards and the measurement of serum albumin with bromcresol green. Clin. Chim. Acta 1997,258,21-30.

13. Kessler, M. A.; Meinitzer, A.; Petek, W.; Wolfbeis, O. S., Microalbuminuria and borderlineincreased albumin excretion determined with a centrifugal analyzer and the Albumin Blue 580 fluorescence assay. Clin. Chem. 1997,43, 996-1002.

14. Matulis, D.; Baumann, C. G.; Bloomfield, V. A.; Lovrien, R. E., 1-anilino-8-naphthalene sulfonate as a protein conformational tightening agent. Biopolymers 1999,49,451-8.

15. Suzuki, Y.; Yokoyama, K., Design and synthesis of intramolecular charge transfer-based fluorescent reagents for the highly-sensitive detection of proteins. J. Am. Chem. Soc. 2005,127, 17799-802.

16. Hawe, A.; Sutter, M.; Jiskoot, W., Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization. Pharm. Res. 2008,25,1487-99.

17. Sun, Y.; Wei, S.; Zhao, Y. Y.; Hu, X. Y.; Fan, J., Interactions between 4-(2-dimethylaminoethyloxy)-N-octadecyl-1,8-naphthalimide and serum albumins: Investigation by spectroscopic approach. J. Lumin. 2012,132,879-886.

PL 227 055 B1

18. Volkova, K. D.; Kovalska, V. B.; Losytskyy, M. Y.; Reis, L V.; Santos, P. F.; Almeida, P.; Lynch, D. E.; Yarmoluk, S. M., Aza-substituted squaraines for the fluorescent detection of albumins. Dyes Pigm. 2011,90, 41-47.

19. Smith, S. E.; Williams, J. M.; Ando, S.; Koide, K., Time-Insensitive Fluorescent Sensor for Human Serum Albumin and Its Unusual Red Shift. Anal. Chem. 2014,86,2332-2336.

20. Caballero, D.; Martinez, E.; Bausells, J.; Errachid, A.; Samitier, J., Impedimetric immunosensor for human serum albumin detection on a direct aldehyde-functionalized silicon nitride surface. Anal. Chim. Acta 2012, 720, 43-48.

21. Kryscio, D. R.; Peppas, N. A., Critical review and perspective of macromolecularly imprinted polymers. Acta Blomater. 2012,8,461-73.

22. Li, S. J.; Cao, S. S.; Whitcombe, M. J.; Piletsky, S. A., Size matters: Challenges in imprinting macromolecules. Prog. Polym. Sci. 2014,39,145-163.

23. Yang, K. G.; Zhang, L. H.; Liang, I.; Zhang, Y. K., Protein-imprinted materials: rational design, application and challenges. Anal. Bioanal. Chem. 2012,403, 2173-2183.

24. Verheyen, E.; Schillemans, J. P.; van Wijk, M.; Demeniex, M. A.; Hennink, W. E.; van Nostrum, C. F., Challenges for the effective molecular imprinting of proteins. Biomaterials 2011,32, 3008-20.

25. Bergmann, N. M.; Peppas, N. A., Molecularly imprinted polymers with specific recognition for macromolecules and proteins. Prog. Polym. Sci. 2008,33, 271-288.

26. Bossi, A.; Bonini, F.; Turner, A. P. F.; Piletsky, S. A., Molecularly imprinted polymers for the recognition of proteins: The state of the art. Biosens. Bioetectron. 2007,22, 1131-1137.

27. Rachkov, A.; Minoura, N., Towards molecularly imprinted polymers selective to peptides and proteins. The epitope approach. Biochim. Biophys. Acta 2001,1544, 255-66.

28. Zhang, Z.; Long, Y.; Nie, L; Yao, S., Molecularly imprinted thin film self-assembled on piezoelectric quartz crystal surface by the sol-gel process for protein recognition. Biosens. Bioelectron. 2006,21,1244-51.

29. Inoue, Y.; Kuwahara, A.; Ohmori, K.; Sunayama, H.; Ooya, T.; Takeuchi, T., Fluorescent molecularly imprinted polymer thin films for specific protein detection prepared with dansyl ethylenediamine-conjugated o-acryloyl L-hydroxyproline. Biosens. Bioelectron. 2013,48,113-9.

30. Huynh, T. P.; Bikram, K. C. C.; Lisowski, W.; D'Souza, F.; Kutner, W., Molecularly imprinted polymer of bis(2,2 '-bithienyl)methanes for selective determination of adrenaline. Bioelectrochemistry 2013,93, 37-45.

31. Huynh, T. P.; Sosnowska, M.; Sobczak, J. W.; Kc, C. B.; Nesterov, V. N.; D'Souza, F.; Kutner, W., Simultaneous chronoamperometry and piezoelectric microgravimetry determination of nitroaromatic explosives using molecularly imprinted thiophene polymers. Anal. Chem. 2013, 85, 8361-8368.

32. Klibanov, A. M., Improving enzymes by using them in organic solvents. Nature 2001, 409, 241-246.

33. Huynh, T. P.; Pietrzyk-Le, A.; Bikram, K. C. C.; Noworyta, K. R.; Sobczak, J. W.; Sharma, P. S.; D'Souza, F.; Kutner, W., Electrochemically synthesized molecularly imprinted polymer of thiophene derivatives for flow-injection analysis determination of adenosine-5'-triphosphate (ATP). Biosens. Bioelectron. 2013,41, 634-641.

34. Pietrzyk, A.; Suriyanarayanan, S.; Kutner, W.; Maligaspe, E.; Zandler, M. E.; D'Souza, F., Molecularly imprinted poly[bis(2,2 '-bithienyl)methane] film with built-in molecular recognition sites for a piezoelectric microgravimetry chemosensor for selective determination of dopamine. Bioelectrochemistry 2010,80, 62-72.

35. Pietrzyk, A.; Suriyanarayanan, S.; Kutner, W.; Chitta, R.; Zandler, M. E.; D'Souza, F., Molecularly imprinted polymer (MIP) based piezoelectric microgravimetry chemosensor for selective determination of adenine. Biosens. Bioelectron. 2010,25, 2522-2529.

Claims (6)

1. Rozpoznający przewodzący polimer bisbitiofenowy, znamienny tym, że stanowi go polimer monomerów funkcyjnych stanowiących kwas 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowy i p-bis(2,2'-bitien5-ylo)metyloalaninę i monomeru sieciującego stanowiącego 5,5',5-tris[(2,2'-bitien-5-ylo)metan], zawierający luki molekularne wdrukowane za pomocą białka, w tym znakowanej ludzkiej albuminy (HA).

PL 227 055 B1

2. Sposób wytwarzania rozpoznającego przewodzącego polimeru bisbitiofenowego, określonego w zastrz. 1, metodą wdrukowania molekularnego za pomocą elektropolimeryzacji potencjodynamicznej, znamienny tym, że prowadzi się elektropolimeryzację monomerów funkcyjnych stanowiących kwas 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowy i p-bis(2,2'-bitien-5-ylo)metyloalaninę w obecności monomeru sieciującego stanowiącego 5,5',5-tris[(2,2'-bitien-5-ylo)metan] i w obecności szablonu który stanowi białko, w tym znakowana ludzka albumina, (HA), przy czym szablon HA jest semikowalencyjnie wdrukowywany molekularne w trakcie tej elektropolimeryzacji, przy czym do elektropolimeryzacji stosuje się roztwór mieszaniny rozpuszczalników, korzystnie acetonitrylu i buforu fosforanowego, zawierający białko HA, kwas 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowy, p-bis(2,2'-bitien-5-ylo)metyloalaninę i 5,5',5-tris[(2,2'-bitien-5-ylo)metan] oraz elektrolit podstawowy o stężeniu 0,1 M, korzystnie chloran(Vll) tetrabutyloamoniowy [(TBA)CIO4); stosowane korzystnie w nadmiarze monomery funkcyjne są wiązane kowalencyjnie z szablonem tworząc addukt ludzkiej albuminy z bitiofenem, a następnie po wytworzeniu i osadzeniu polimeru MIP-HA w postaci warstwy na powierzchni elektrody szablon HA poddaje się wyekstrahowaniu w silnie zasadowym środowisku i otrzymuje się rozpoznający przewodzący polimer bisbitiofenowy MIP zawierający luki molekularne wdrukowane za pomocą białka, w tym znakowanej ludzkiej albuminy (HA), przy czym elektropolimeryzację prowadzi się w zakresie potencjałów liniowo zmienianych w sposób cykliczny w zakresie od 0 do 1,20 V, względem Ag/AgCI, ze stałą szybkością w zakresie od 5 mV/s do 5 V/s.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako silne zasadowe środowisko stosuje się NaOH, najkorzystniej 30% roztwór NaOH.

4. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że stosowany potencjał jest liniowo zmieniany w sposób cykliczny w zakresie od 0 do 1,20 V, względem Ag/AgCI, ze stałą szybkością

50 mV/s.

5. Sposób według zastrz. 2 albo 3, albo 4, znamienny tym, że do osadzania warstwy polimeru stosuje się przetwornik sygnału chemicznego - elektrodę pracującą - wybraną spośród grupy elektrod stałych, korzystnie złotej elektrody dyskowej i płytki szklanej z napylonym złotem.

6. Zastosowanie rozpoznającego przewodzącego polimeru bisbitiofenowego określonego w zastrz. 1, w postaci warstwy, jako elementu rozpoznającego czujnika elektrochemicznego, do selektywnego wykrywania i/lub oznaczania białek, zwłaszcza w próbkach biologicznych, korzystnie w moczu i we krwi.