PL227562B1

PL227562B1 - Zastosowanie antybiotyku bacytracyny do hydrolitycznej degradacji RNA

Info

Publication number: PL227562B1
Application number: PL396418A
Authority: PL
Inventors: Jerzy Ciesiołka; Małgorzata Jeżowska-Bojczuk; Jan Wrzesiński; Justyna Nagaj; Kamila Stokowa-Sołtys; Aleksandra Kasprowicz; Leszek Błaszczyk; Wojciech Szczepanik
Original assignee: Wrocławskie Centrum Badań Eit + Spółka Z Ograniczoną
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2011-09-23
Publication date: 2017-12-29
Also published as: PL396418A1; WO2013042093A1; WO2013042093A8

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest nowe zastosowanie antybiotyku bacytracyny, polegające na wykorzystaniu nieznanych dotychczas właściwości nukleolitycznych tego leku do degradacji kwasów rybonukleinowych (RNA). Bacytracyna jest kompleksem polipeptydowym o uznanych właściwościach przeciwbakteryjnych, wytwarzana jest przez szczep bakterii Bacillus subtilis var Tracy, Bacillus Licheniformis.

Lek ten został odkryty w latach 40-tych ubiegłego wieku i od tego czasu stosowany jest dość powszechnie w terapiach przeciwbakteryjnych (Epperson, J., Ming L. Biochemistry 39, 4037-4045 (2000); Ming, L., Epperson, J. J. Inoorg. Biochem. 91, 46-58 (2002)).

Lek ten nie ulega wchłanianiu drogą pokarmową, w terapii stosowany jest najczęściej jako jeden ze składników maści antybiotykowych używanych do zwalczania bakteryjnych zakażeń skórnych oraz przeciwko bakteryjnym zakażeniom oczu. Podawany jest również domięśniowo, w tym nawet niemowlętom z bakteryjnym zapaleniem płuc. Ponadto, bacytracyna stosowana jest jako dodatek do pasz, zapobiegający zakażeniom u zwierząt.

Uważa się, że podobnie jak inne antybiotyki, bacytracyna powinna być podawana wyłącznie w przypadku zakażeń bakteryjnych. Opisany w literaturze, prawdopodobny mechanizm działania bacytracyny zakłada, że inhibuje ona proces biosyntezy ścian komórkowych bakterii Gram - dodatnich (Ming, L., Epperson, J. J. Inoorg. Biochem. 91, 46-58 (2002)).

Bacytracyna jest antybiotykiem o silnych właściwościach nefrotoksycznych. Kofaktorem bacytracyny są metale dwuwartościowe, zaktywowana bacytrycyna posiada właściwości przeciwbakteryjne i przeciwpasożytnicze.

Jedną z zalet stosowania tego antybiotyku jest to, że w stosunkowo małym stopniu dochodzi w organizmie do generowania szczepów bakterii lekoopornych.

Bacytracyna jest lekiem dopuszczonym do lecznictwa od dawna i w związku z tym zagadnienie efektów ubocznych związanych z jej stosowaniem, takich jak nefrotoksyczność, czy działanie alergizujące, jak i problem lekooporności zostały zbadane (Podlewski, J.K., Chwalibogowska-Podlewska A. Leki współczesnej terapii - wydanie XX, Medical Tribune Polska, Warszawa 2010).

Doniesiono niedawno, że bacytracyna powoduje degradację dwuniciowego DNA (Tay, W. et al., J. Am. Chem. Sci. 132, 5652-5661 (2010)). Reakcja zachodzi wyłącznie po związaniu niektórych jonów metali przejściowych i przebiega według mechanizmu wolnorodnikowego. Podobne właściwości indukowania oksydatywnej degradacji kwasów nukleinowych posiada jednakże szereg innych antybiotyków (Holmes, C. et al., Bioorg. Medicin. Chem. 5, 1235-1248 (1997); Jeżowska-Bojczuk, M. et al., Eur. J. Biochem. 269, 5547-5556 (2002); Szczepanik, W. et al., J. Inorg. Biochem. 94, 355-364 (2003a); Szczepanik, W. et al., J. Chem. Soc. Dalton Trans. 8, 1488-1494 (2003b); Wrzesiński, J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 267-271 (2005)). Sądzi się, że mogą być one współodpowiedzialne za niektóre efekty uboczne stosowanych terapii antybiotykowych. Ustalenie, czy procesy te mają istotne znaczenie z medycznego punktu widzenia wymaga dalszych badań, bowiem stężenia jonów metali, które mogłyby w nich uczestniczyć są w komórce stosunkowo niskie.

W publikacji międzynarodowej WO 94/04185 opisano wykorzystanie właściwości bacytracyny do inhibicji białkowej izomerazy dwusiarczkowej (PDI), w publikacji Lara et al. (Lara, H. et al., Virol. J. 8, 137 (2011)) wykazano, że DTNB oraz bacytracyna są zdolne do hamowania PDI, przez co wirusy, m.in. HIV, RSV wykazują ograniczoną zdolność redukcji wiązań disulfidowych w otoczce, co zmniejsza ich możliwość wnikania do komórek. Nie udowodniono jednak wpływu bacytracyny bezpośrednio na niszczenie wirusów. Oddziaływanie bacytracyny na wirusy jest w tym przypadku jedynie pośrednie. Bacytracyna inhibuje enzym PDI, ingerując przez to w cykl życiowy wirusa.

W publikacjach US 4795740, US 5066783 przedstawiono kompozycję farmaceutyczną skuteczną wobec wirusa HSV, stanowiącą mieszaninę acyklowiru i bacytracyny (jako inhibitora proteaz), przy czym w próbie kontrolnej wskazano, iż sama bacytracyna nie posiada aktywności wobec wirusa HSV-1.

W stanie techniki w żadnej publikacji nie sugerowano wpływu bacytracyny na rozpad RNA.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie bacytracyny do wytwarzania preparatów do degradacji RNA.

Według wynalazku możliwe jest wykorzystanie antybiotyku bacytracyny w sposób inny niż dotychczas, do degradacji niepożądanego RNA. Antybiotyk ten mógłby być stosowany przeciwko wirusom zawierającym jako materiał genetyczny RNA. Do wirusów RNA należą m.in. wirusy zapalenia

PL 227 562 B1 wątroby, polio, czy też wirus HIV. W stosowaniu miejscowym można by wykorzystać go również przeciwko szybko namnażającym się wirusom DNA, np. wirusom opryszczki, poprzez atakowanie wirusowych mRNA.

Według wynalazku, bacytracyna może być stosowana np. zewnętrznie, miejscowo do zwalczania wirusowych zakażeń skóry. Inna możliwość to użycie tego antybiotyku w terapiach mieszanych zakażeń bakteryjno-wirusowych, jak i czysto wirusowych, z uwzględnieniem innego, niż uważano dotychczas mechanizmu jego działania, polegającego na degradacji RNA. Istnieje też potencjalna możliwość zastosowania bacytracyny do wytwarzania preparatów do dezynfekcji.

Zaletą bacytracyny i w związku z tym jej nowego zastosowania jest fakt, że związek ten znany jest od wielu lat i dopuszczony do stosowania u ludzi i zwierząt. Jest to niezwykle istotne w porównaniu z nowo syntetyzowanymi terapeutykami, których wprowadzenie do stosowania jako leków wymaga długotrwałych badań i ogromnych nakładów finansowych.

W stosowanych dotychczas terapiach antywirusowych używa się związków niskocząsteczkowych, blokujących enzymy ważne dla cyklu życiowego wirusa, np. polimerazę RNA niezbędną do syntezy nici tego kwasu, proteazę zaangażowaną w generowanie białek otoczki wirusa itd. Praktycznie żaden z będących w użyciu antybiotyków, skutecznych w terapii zakażeń bakteryjnych, nie jest stosowany w terapii antywirusowej. Wręcz odwrotnie, uważa się, że związki te są nieskuteczne w zwalczaniu infekcji wirusowych.

Zdolność bacytracyny do degradowania cząsteczek RNA była obserwacją zaskakującą, bowiem szereg antybiotyków pochodzących z różnych grup terapeutycznych, które badano wcześniej nie wykazywało podobnych właściwości. Reakcja degradacji RNA zachodzi ze stosunkowo niską specyficznością i przebiega bez udziału jonów metali przejściowych. Nie jest to zatem proces zachodzący według mechanizmu wolnorodnikowego. Przebiega on najprawdopodobniej według mechanizmu hydrolitycznego, w sposób podobny do działania enzymów białkowych o masie cząsteczkowej jednak kilkadziesiąt razy większej. Bardzo ważne jest to, że degradację RNA odnotowano już przy niskim stężeniu antybiotyku, w zakresie mikromolarnym, porównywalnym ze stężeniami jakie oznaczono w osoczu krwi pacjentów poddawanych leczeniu tym lekiem.

Przedmiot wynalazku w przykładach wykonania uwidoczniony jest na rysunku, na którym:

na fig. 1 przedstawiono modelowe cząsteczki RNA i DNA wykorzystane w badaniach właściwości nukleolitycznych bacytracyny: RNA-tRNAPhe, tRNA specyficzny dla fenyloalaniny izolowany z drożdży; RNA-rybHDV, antygenomowy rybozym HDV; RNA-R20, 20-nukleotydowy fragment wirusa HDV; DNA-M39, 39-nukleotydowy oligomer DNA; DNA-M72, 72-nukleotydowy oligomer DNA. Zaznaczono główne miejsca degradacji zachodzącej w obecności bacytracyny;

na fig. 2 przedstawiono autoradiogram obrazujący degradację RNA-tRNAPhe pod wpływem działania różnych stężeń bacytracyny (Bac), jej kompleksu z jonami Cu(II), a także kompleksu w obecności H2O2 (stężenia w μΜ). Warunki reakcji: bufor 50 mM Tris-HCI pH 7,5; temp. 37°C; czas 60 minut; całkowite stężenie RNA 2 OD/ml. K1 - linia kontrolna; K2 - 50 μM Cu(II); K3 - 100 μM Cu(II)-H2O2; L - hydroliza alkaliczna; T - trawienie rybonukleaząT1;

na fig. 3 przedstawiono wpływ wartości stężenia bacytracyny, jej kompleksu z jonami Cu(II) oraz kompleksu w obecności H2O2 na stopień degradacji RNA-tRNAPhe;

na fig. 4 przedstawiono autoradiogram obrazujący degradację RNA-rybHDV pod wpływem różnych stężeń bacytracyny (Bac) oraz jej kompleksu z jonami Cu(II) (stężenia w μM), w warunkach reakcji: bufor 50 mM Tris-HCI pH 7,5; temp. 37°C; czas 60 minut; całkowite stężenie RNA 2 OD/ml. K1 - linia kontrolna; K2 - 50 μM Cu(II); L - hydroliza alkaliczna; T - trawienie rybonukleazą T1;

na fig. 5 przedstawiono wpływ wartości stężenia bacytracyny oraz jej kompleksu z jonami Cu(II) na stopień degradacji RNA-rybHDV;

na fig. 6 przedstawiono autoradiogram obrazujący degradację RNA-R20 pod wpływem działania różnych stężeń bacytracyny (Bac) oraz jej kompleksu z jonami Cu(II) (stężenia w μM), w warunkach reakcji: bufor 50 mM Tris-HCI pH 7,5; temp. 37°C; czas 60 minut; całkowite stężenie RNA 2 OD/ml. K1 - linia kontrolna; K2 - 50 μM Cu(II); L - hydroliza alkaliczna; T - trawienie rybonukleazą T1;

na fig. 7 przedstawiono wpływ wartości stężenia bacytracyny oraz jej kompleksu z jonami Cu(II) na stopień degradacji RNA-R20;

na fig. 8 przedstawiono autoradiogram obrazujący degradację RNA-tRNAPhe w obecności bacytracyny (Bac) oraz jej kompleksu z jonami Cu(II) o stężeniu 22 μM w zależności od czasu (w minutach), w warunkach reakcji: bufor 50 mM Tris-HCI pH 7,5; temp. 37°C; czas 60 minut; całkowite stężenie RNA 2 OD/ml. K - linia kontrolna; L - hydroliza alkaliczna; T - trawienie rybonukleazą T1;

PL 227 562 B1 na fig. 9 przedstawiono postęp degradacji RNA-tRNAPhe w obecności bacytracyny oraz jej kompleksu z jonami Cu(II)o stężeniu 22 μΜ w zależności od czasu inkubacji;

na fig. 10 przedstawiono autoradiogram obrazujący degradację RNA-R20 w obecności bacytracyny (Bac) oraz jej kompleksu z jonami Cu(II) (Bac-Cu) o stężeniu 22 μM w zależności od czasu (w minutach), w warunkach reakcji: bufor 50 mM Tris-HCI pH 7,5; temp. 37°C; czas 60 minut; całkowite stężenie RNA 2 OD/ml. K - linia kontrolna; L - hydroliza alkaliczna; T - trawienie rybonukleazą T1;

na fig. 11 przedstawiono postęp degradacji RNA-R20 w obecności bacytracyny oraz jej kompleksu z jonami Cu(II) o stężeniu 22 μM w zależności od czasu inkubacji;

na fig. 12 przedstawiono autoradiogram obrazujący degradację RNA-rybHDV pod wpływem działania bacytracyny o stężeniu 5 i 25 μM w obecności wybranych czynników potencjalnie wpływających na reakcję degradacji, w warunkach reakcji: bufor 50 mM HEPES-NaOH pH 7,0; temp. 37°C; czas 60 minut; całkowite stężenie RNA 2 OD/ml, K - linie kontrolne;

na fig. 13 przedstawiono postęp degradacji RNA-rybHDV pod wpływem bacytracyny o stężeniu 5 i 25 μM w obecności wybranych czynników potencjalnie wpływających na reakcję degradacji;

na fig. 14 przedstawiono autoradiogram obrazujący degradację DNA-M39 pod wpływem działania różnych stężeń bacytracyny (2,5, 25, 250 i 2500 μM) w obecności wybranych czynników potencjalnie wpływających na reakcję degradacji, w warunkach reakcji: temp. 37°C; czas 60 minut; całkowite stężenie DNA 0,7 OD/ml. K - linie kontrolne;

na fig. 15 przedstawiono autoradiogram obrazujący degradację DNA-M39 pod wpływem działania różnych stężeń bacytracyny (Bac) (stężenia w μM) w obecności wybranych czynników potencjalnie wpływających na reakcję degradacji, w warunkach reakcji: temp. 37°C; czas 60 minut; całkowite stężenie DNA 0,7 OD/ml, K - linie kontrolne;

na fig. 16 przedstawiono autoradiogram przedstawiający degradację DNA-M72 pod wpływem działania różnych stężeń bacytracyny (25, 250 i 2500 μM) w obecności wybranych czynników potencjalnie wpływających na reakcję degradacji, w warunkach reakcji: bufor 50 mM HEPES-NaOH pH 7,0; temp. 37°C; czas 60 minut; całkowite stężenie DNA 0,2 OD/ml. K - linie kontrolne; G+A, C+A - linie sekwencyjne;

na fig. 17 przedstawiono autoradiogram obrazujący degradację cząsteczki RNA-R20 inkubowanej w obecności bacytracyny w buforze 50 mM HEPES-NaOH pH 7,0, w temp. 37°C przez 2 minuty, Panel Bac: 25 i 50 μM bacytracyna, stężenie RNA 8 μg/ml, Panel tRNA carrier: 25 μM bacytracyna, stężenie RNA 8, 0,8, 0,08 i 0,01 μg/ml (-). K - linia kontrolna; L - hydroliza alkaliczna; S1, T1 - trawienie nukleazą S1 i rybonukleazą T1;

na fig. 18 przestawiono autoradiogram obrazujący produkty degradacji DNA-M39 pod wpływem działania różnych stężeń bacytracyny (250 i 2500 μM), w warunkach reakcji: bufor 50 mM HEPESNaOH pH 7,0; temp. 37°C; czas 60 minut; całkowite stężenie DNA 0,2 OD/ml. K - linia kontrolna; S1 - trawienie nukleazą S1, C+A - linia sekwencyjna; pokazano obraz krótkiego i długiego biegu elektroforetycznego;

na fig. 19 przedstawiono autoradiogram obrazujący produkty degradacji RNA-R20 pod wpływem działania różnych stężeń bacytracyny (stężenia w μM), w warunkach reakcji: stężenie RNA 0,01 μg/ml, bufor 50 mM HEPES-NaOH pH 7,0; temp. 37°C; czas 2 minuty, K - linia kontrolna; L - hydroliza alkaliczna; S1, T1 - trawienie nukleazą S1 i rybonukleazą T1.

P r z y k ł a d y

Zgodnie z wynalazkiem, przeprowadzono badania właściwości nukleolitycznych bacytracyny, których celem było uzyskanie odpowiedzi na następujące pytania:

1) jaką specyficzność wykazuje bacytracyna względem różnych typów wiązania fosfodiestrowego, tj. czy degraduje cząsteczki RNA czy DNA, ew. czy wykazuje działanie fosfatazy lub pirofosfatazy,

2) według jakiego mechanizmu zachodzi reakcja degradacji kwasów nukleinowych,

3) czy degradacja RNA/DNA zachodzi preferencyjnie w miejscach określonych nukleotydów lub odcinkach sekwencji nukleotydowej i czy na reakcję wpływa struktura drugorzędowa cząsteczek,

4) biorąc pod uwagę możliwość praktycznego wykorzystania bacytracyny, jak warunki degradacji wpływają na efektywność jej działania, tj. minimalne aktywne stężenie bacytracyny, zależność od stężenia RNA/DNA, wpływ na reakcję jonów metali dwuwartościowych i jednowartościowych,

5) czy dodanie do reakcji z użyciem handlowego preparatu bacytracyny inhibitorów rybonukleaz, bądź też preinkubacja w wysokiej temperaturze wpłynie na właściwości bacytracyny.

W doświadczeniach użyto handlowy preparat bacytracyny zakupiony w firmie Sigma-Aldrich Co. Jako modelowe cząsteczki RNA wykorzystano: tRNA specyficzny dla fenyloalaniny, izolowany z drożPL 227 562 B1 dży o długości 76 nukleotydów (RNA-tRNAPhe) oraz dwa fragmenty RNA wirusa zapalenia wątroby typu D (HDV), antygenomowy rybozym HDV o długości 72 nukleotydów (RNA-rybHDV) i 20-nukleotydowy fragment wirusa (RNA-R20). Natomiast jako modelowe cząsteczki DNA wykorzystano: 39-nukleotydowy oligomer DNA (DNA-M39) oraz 72-nukleotydowy oligomer DNA (DNA-M72) (fig. 1).

Cząsteczki RNA i DNA znakowane były izotopem ³²P na końcu 5' za pomocą T4 kinazy polinukleotydowej i [γ-³²Ρ]ΑΤΡ według standardowej procedury, produkty po reakcji z bacytracyną rozdzielano elektroforetycznie w wysokorozdzielczych żelach poliakryloamidowych, wizualizowano z wykorzystaniem ekranów odwzorowujących i komputerowego skanera radioaktywności FLA-5100 (Fujifilm), a do analizy ilościowej zastosowano program Multi Gauge.

P r z y k ł a d 1

Prowadzono reakcję bacytracyny z RNA-tRNAPhe o stężeniu 2 OD/ml, w następujących warunkach: 60 minutowa inkubacja w temp. 37°C w obecności 5 μΜ antybiotyku.

W wyniku reakcji degradacji uległo ok. 40% wyjściowego RNA (fig. 2, 3).

Podwyższenie stężenia bacytracyny spowodowało wzrost stopnia degradacji i przy stężeniu 100 μΜ osiągnął on około 95%.

Degradacja RNA-rybHDV zachodziła bardziej efektywnie niż RNA-tRNAPhe (fig. 4, 5). W obecności 5 μΜ bacytracyny degradacji uległo ok. 60% RNA. Natomiast, przy 10 μM bacytracynie stopień degradacji osiągnął 80%, a prawie całkowitą degradację RNA-rybHDV zaobserwowano dla 50 μΜ bacytracyny. 20-nukleotydowy oligomer RNA-R20 po 60 minutach inkubacji w obecności 20 μΜ bacytracyny ulegał niemal całkowicie degradacji do krótszych produktów (fig. 6, 7).

Porównanie efektywności degradacji trzech różnych cząsteczek RNA, użytych w stężeniach 2 OD/ml, wykazało, że po 60 minutach inkubacji w temperaturze 37°C w obecności 20 μΜ bacytracyny degradacji uległo 80-95% wyjściowego RNA. Zbadano także kinetykę degradacji RNA-tRNAPhe oraz RNA-R20 w obecności 22 μΜ bacytracyny (fig. 8-11). W przypadku obydwu cząsteczek RNA ok. 50% degradację obserwowano już po 1 minutowej inkubacji. Po 20 minutach reakcja degradacji RNA-tRNAPhe osiągnęła plateau na poziomie 90% (fig. 9), natomiast zanik RNA-R20 po tym czasie był prawie całkowity (fig. 11).

W celu sprawdzenia czy bacytracyna wykazuje działanie fosfatazy lub pirofosfatazy użyto znakowane izotopem ³²P trifosforany nukleozydów: [y-³²P]ATP oraz [a-³²P]UTP, które inkubowano z 25 i 250 μΜ bacytracyną przez 60 minut w temp. 37°C, również w obecności jonów Mg(II), Mn(II) i EDTA. Nie zaobserwowano produktów degradacji żadnego z tych związków po elektroforezie na żelu poliakryloamidowym. Dowiedziono, że bacytracyna posiada także w pewnym stopniu zdolność degradacji jednoniciowego DNA. Jednakże, degradacja DNA-M39 (fig. 14) i DNA-M72 (fig. 16) wymagała znacznie wyższych stężeń antybiotyku niż w przypadku cząsteczek RNA. Porównywalny efekt uzyskano przy przynajmniej 10-krotnie wyższym stężeniu bacytracyny. Degradację DNA-M39 i DNA-M72 obserwowano przy zastosowaniu 250 μM bacytracyny, nie obserwowano natomiast przy 25 μΜ stężeniu antybiotyku.

P r z y k ł a d 2

W mechanizmie reakcji hydrolitycznego rozerwania wiązania fosfodiestrowego bardzo istotne jest czy grupa fosforanowa w miejscu rozerwania łańcucha pozostaje po stronie 3' czy 5' reszty rybozy. Postanowiono zatem określić miejsce lokalizacji grupy fosforanowej we fragmentach RNA i DNA po reakcji degradacji w obecności bacytracyny.

Porównano migrację produktów degradacji RNA-R20 z migracją produktów hydrolizy alkalicznej oraz ograniczonych trawień nukleazą S1 i rybonukleazą T1 stosując elektroforezę w wysokorozdzielczym żelu poliakryloamidowym (fig. 19). Wiadomo, że produkty hydrolizy alkalicznej RNA oraz trawienia rybonukleazą T1 posiadają grupę fosforanową na końcu 3' łańcucha RNA, natomiast produkty trawienia nukleazą S1 na końcu 5'. Migracja fragmentów RNA powstałych po degradacji bacytracyną jest identyczna z migracją fragmentów RNA po hydrolizie alkalicznej oraz trawieniu RNazą T1 oraz inna niż po trawieniu nukleazą S1. Jest to przekonywujący dowód, że grupy fosforanowe znajdują się na końcu 3' powstałych fragmentów.

Analogiczną analizę miejsca lokalizacji grupy fosforanowej przeprowadzono dla produktów reakcji DNA-M39 z bacytracyną (fig. 18). Jej wynik wskazuje, że migracja produktów odpowiada migracji po trawieniu nukleazą S1. Zatem, w przypadku degradacji DNA przez bacytracynę grupy fosforanowe znajdują się na końcu 5' powstałych fragmentów.

Z punktu widzenia mechanizmu degradacji RNA i DNA przez bacytracyną istotne jest czy reakcja wymaga obecności jonów metali dwuwartościowych. Okazało się, że na degradację RNA-rybHDV nie ma wpływu obecność 2 mM EDTA (fig. 12, 13). Podobną obserwację poczyniono dla RNA-tRNAPhe.

PL 227 562 B1

Uderzające z kolei jest, że reakcja degradacji DNA jest kompletnie inhibitowana przez EDTA, tak w przypadku DNA-M39 (fig. 14; zastosowano 0,2 mM EDTA), jak i DNA-M72 (fig. 16; zastosowano 2 mM EDTA). Zatem, reakcja degradacji DNA wymaga bezwzględnej obecności jonów metali dwuwartościowych. Ustalono, że mogą to być, m.in. jony Mg(II), Mn(II) lub Zn(II) (fig. 14-16).

P r z y k ł a d 3

Zgodnie z powyższym opisem prowadzono reakcję degradacji RNA. Stwierdzono, że bacytracyna degraduje RNA przy resztach guanozyny (fig. 2, 4, 6). Degradacja zachodzi w regionach jednoniciowych RNA, dla RNA-tRNAPhe przede wszystkim w pętli D (G15, G18, G19) i TΨC (G57), dla RNA-rybHDV w regionach pętlowych L3/P3 (G28, G30, G31) i L4 (G58), dla jednoniciowego RNA-R20 przy resztach G12, G13, G14, G17 i G18 (fig. 2, 4, 6). Interesujące, że podobną specyficzność degradacji RNA wykazuje rybonukleaza T1. Ponadto, zaobserwowano usuwanie przez bacytracyną grupy fosforanowej z końca 5' (lub 5'-końcowego nukleotydu) cząsteczek RNA. Efekt taki obserwowano dla RNA-tRNAPhe oraz RNA-rybHDV (fig. 2, 4). Nie zaobserwowano go natomiast w przypadku RNA-R20 (fig. 6). Może to wynikać z faktu, że w dwóch pierwszych modelowych RNA 5'-końcowym nukleozydem jest guanozyna, w trzecim cytydyna.

Okazało się, że specyficzność degradacji DNA przez bacytracynę jest wyraźnie różna od obserwowanej w przypadku degradacji RNA. Miejsca degradacji DNA-M72 oraz DNA-M39 są bardzo nieliczne, a występują preferencyjnie w sekwencji w okolicach niektórych reszt cytydyny (fig. 16, 18). W zestawieniu z informacją, że degradacja DNA wymaga obecności jonów niektórych metali dwuwartościowych, można sugerować, że miejsca degradacji DNA zlokalizowane są w pobliżu miejsc silnego wiązania tych jonów.

P r z y k ł a d 4

Prowadzono reakcję degradacji RNA w celu zbadania zależności tego procesu od wartości stężenia RNA. Obserwowany stopień degradacji RNA zależał od jego całkowitego stężenia. Efektywność degradacji trzech różnych cząsteczek RNA, użytych w stężeniach 2 OD/ml, tj. 80 pg/ml, inkubowanych z 20 μΜ bacytracyną przez 60 minut w temperaturze 37°C wynosiła 80-95% wyjściowej ilości RNA. Obniżanie stężenia RNA-R20 do 8, 0,8, 0,08 i ok. 0,01 pg/ml, przy zastosowanej 25 pM bacytracynie i czasie dwuminutowej inkubacji, prowadziło do pogłębienia efektu degradacji (fig. 17). W przypadku użycia znakowanego izotopem ³²P RNA-R20 o stężeniu ok. 0,01 pg/ml i 2 minut inkubacji, w obecności 10 μΜ bacytracyny obserwowano całkowitą degradację wyjściowego RNA, a 15% degradację z 1 pM bacytracyną (fig. 19).

Przetestowano również wpływ wybranych czynników chemicznych mogących potencjalnie zmieniać efektywność degradacji RNA (fig. 12, 13). Porównując reakcję RNA-rybHDV z 5 i 25 pM bacytracyną, bez i po dodaniu 5 mM jonów Mg(II), zaobserwowano pewne różnice w rozkładzie produktów, przy niewiele zmienionym całkowitym stopniu degradacji RNA (fig. 12). W podobnie małym stopniu na degradację wpływała obecność 100 mM NaCI. W reakcji z 25 μΜ bacytracyną po 60 minutach zamiast ok. 5% pozostało 15% wyjściowego RNA.

Reakcje z bacytracyną prowadzono w dwóch różnych buforach: 50 mM Tris-HCI pH 7,5 i 50 mM HEPES-NaOH pH 7,0, nie obserwując istotnych różnic w przebiegu reakcji z RNA i DNA.

P r z y k ł a d 5

Poniższe doświadczenia wykonano w celu zmniejszenia prawdopodobieństwa, że nukleolityczne właściwości bacytracyny, izolowanej z kultur bakteryjnych są wynikiem zanieczyszczenia handlowego preparatu innymi nukleazami.

Reakcję degradacji RNA-rybHDV w obecności 5 i 25 pM bacytracyny prowadzono z dodatkiem inhibitora białkowych rybonukleaz - RNasin (Promega), nie stwierdzając istotnych różnic w efektywności działania antybiotyku (fig. 12, 13). Preinkubacja bacytracyny w temp. 100°C przez 5 minut, przed reakcją 5 pM bacytracyny z RNA-rybHDV przez 60 minut, powodowała tylko nieznaczne obniżenie zdolności antybiotyku do degradacji; ilość niezdegradowanego RNA zwiększyła się z ok. 70 do 80%.

Preinkubacja roztworu bacytracyny przez 5 minut w temp. 100°C, w warunkach w jakich dezaktywacji ulega większość białkowych DNaz, nie wpływała w znaczący sposób na degradację DNA-M72

Claims

1. Zastosowanie bacytracyny do hydrolitycznej degradacji RNA in vitro.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że degradowany RNA jest RNA wirusowym.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że obejmuje wytwarzanie preparatu do dezynfekcji.