DK168061B1 - Med mrna hybridiserbart anti-viralt middel - Google Patents
Med mrna hybridiserbart anti-viralt middel Download PDFInfo
- Publication number
- DK168061B1 DK168061B1 DK493584A DK493584A DK168061B1 DK 168061 B1 DK168061 B1 DK 168061B1 DK 493584 A DK493584 A DK 493584A DK 493584 A DK493584 A DK 493584A DK 168061 B1 DK168061 B1 DK 168061B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- dna
- virus
- mrna
- cells
- hsv
- Prior art date
Links
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims description 56
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 title description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 47
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 claims description 47
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 34
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 29
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 24
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims description 7
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 claims description 3
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 125
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 60
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 42
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 35
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 21
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 14
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 11
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 10
- 108091005902 Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 8
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 7
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 6
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 230000017960 syncytium formation Effects 0.000 description 6
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 5
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 244000309466 calf Species 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 108010039177 polyphenylalanine Proteins 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 4
- 150000005691 triesters Chemical class 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 11-dehydrocorticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N Cortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 2
- MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N Cortisone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 101000633984 Homo sapiens Influenza virus NS1A-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N N-phosphocreatine Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=N)NP(O)(O)=O DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- -1 alkali metal salt Chemical class 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 229960004544 cortisone Drugs 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 230000006656 viral protein synthesis Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 235000019737 Animal fat Nutrition 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- SBYQPGZCKZIXFK-UHNVWZDZSA-N CC(C)(O)[C@@H](S)[C@H](O)CO Chemical compound CC(C)(O)[C@@H](S)[C@H](O)CO SBYQPGZCKZIXFK-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005881 Calendula officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 240000001432 Calendula officinalis Species 0.000 description 1
- ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N Cortisone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2=O ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N 0.000 description 1
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000490229 Eucephalus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 241000175212 Herpesvirales Species 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 101710149086 Nuclease S1 Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 238000010266 Sephadex chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 229960003290 cortisone acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000006694 eating habits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000007373 indentation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 108700032552 influenza virus INS1 Proteins 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- CPJSUEIXXCENMM-UHFFFAOYSA-N phenacetin Chemical compound CCOC1=CC=C(NC(C)=O)C=C1 CPJSUEIXXCENMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
- C12N15/1133—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against herpetoviridae, e.g. HSV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
i DK 168061 B1
Den foreliggende opfindelse angår et farmaceutisk præparat, der i det væsentlige består af en effektiv anti-viral mængde af et oligo-eller polydeoxynukleotid, som har en sekvens, der er identisk med en del af DNA, som er hybridiserbar med mRNA hos herpes-virus, hvilket oligo-5 eller polydeoxynukleotid kan hybridiseres med mRNA'en, samt en farmaceutisk acceptabel bærer.
På det tidlige stade i behandlingen af virusforårsagede sygdomme anvendtes kemisk syntetiserede lægemidler og antibiotika som anti-virale midler for at hæmme formeringen af virus. For de kemisk syntetiserede 10 lægemidlers vedkommende er deres anti-virale spektrum dog temmelig snævert og skadelige bivirkninger forårsaget af sådanne lægemidler optræder hyppigt. I tilfælde af antibiotika er der den ulempe, at der til stadighed kræves udvikling af antibiotika af nye typer ligesom man må forsøge at reducere eventuelle skadelige bivirkninger ved antibiotika, eftersom 15 virus bliver resistente over for de anvendte antibiotika og endelig med tiden bliver immune over for disse.
Med den seneste udvikling inden for bioteknologien, især gensplejsningsteknikken, er identifikation af de strukturelle gener hos virus blevet et stort forskningsobjekt inden for studiet af mikroorganismer. I 20 1977 rapporterede S.C. Inglis et al in vitro translation af cytoplasmisk RNA, der var ekstraheret fra kyllinge-embryo fibrobi aster inficerede med influenza A virus i et hvedekimcelle-frit protein-syntesesystem, med det resultat, at syntesen af det vi rus-specifikke polypeptid svarende til det hybridiserede v-RNA-segment blev reduceret (Virology 78, 522-536 25 (1977)). De i denne reference omtalte forsøg blev imidlertid udført med et celle-frit system uden relation til studiet af lægemidler. En sådan strukturel gen-identifikation er også rapporteret af B.M. Paterson et al. i Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 4370-4374 (1977). Paterson et al.'s forsøg blev også udført i et celle-frit system. I disse to refe-30 rencer anvendtes i virkeligheden til inhibering af proteinsyntesen en enorm genetisk struktur såsom i den først omtalte reference selve den fra influenza-virus ekstraherede RNA eller i den anden reference kanin /3-globin klon PØGl. En sådan enorm struktur kunne ikke forventes at in-hibere den intracellulære proteinsyntese.
35 I 1978 rapporterede P.C. Zamecnik et al., at et tridecamer oligode-oxynukloetid, der var komplementært med de gentagne 3'- og 5'-terminale nukleotider fra Rous sarkoma virus (RSV), var en effektiv inhibitor for syntesen af protein, der specificeres af den virale RNA i hvedecelle- DK 168061 B1 2 frit system (Proc. Natl. Acad. $ci.} USA, 75, 285-288 (1978)) samt i et in vitro vævskultursystem (ibid. 75, 280-284 (1978)). For den første references vedkommende anvendtes fortsat det celle-frie system som tidligere, men en vis forbedring blev erkendt med hensyn til anvendelse af en 5 DNA med en mindre molekylær struktur til inhibering af proteinets translation. I den anden reference udførtes forsøgene under anvendelse af tridecameren i et vævskultursystem til inhibering af formering af virus og transformation af celler. Den i disse referencer til inhibering af formering og transformation anvendte DNA var udvalgt fra en anden region 10 end en specifik kodningsregion, og den var derfor ikke ønskelig. Samme år rapporterede N.D. Hastie et al. endvidere, at hybridisering af gi obi n mRNA til den tilsvarende cDNA viste sig specifikt at inhibere translation af mRNA'en i et celle-frit system (ibid. 75, 1217-1221 (1978)). Det nye i denne reference var kun, at en vis kodningsregion af DNA blev ud-15 valgt til inhibering af translationen ved hybridisering af mRNA. De omtalte forsøg blev imidlertid fortsat udført i et celle-frit system. Der har været et behov for udvikling af lægemidler baseret på denne teori siden publiceringen af disse referencer i 1978. Hidtil har der dog ikke være rapporteret nogen reference i forbindelse med en praktisk anvendel-20 se af denne teori på forsøg in vivo.
I 1983 publiceredes en PCT-patentansøgning vedrørende et oligo-nu-kleotid terapeutisk middel og fremgangsmåder til fremstilling deraf (Molecular Biosystems INC., Inti. Publn. No. W083/01451). I denne patentansøgning findes dog blot en angivelse af, at (-)-streng DNA udvælges fra 25 en vis kodningsregion, som inhiberes af SV 40 transformeret celle.
Selvom udtrykket "in vivo" hyppigt er anvendt i eksempel 1 i denne reference, tyder sammenhængen på, at de angivne beskrivelser vedrører forsøg i et in vitro cellekultursystem. Selvom sådanne forsøg in vitro betragtedes som forsøg in vivo, mangler der konkrete betingelser og om-30 talen kan kun opfattes som en forventning om ønskelige virkninger.
Bortset herfra foreslår denne reference for første gang anvendelse af RNA-DNA hybridiseringteknik på et lægemiddel, men der mangler detaljerede beskrivelser, som kan underbygge anvendelsen som lægemidler og referencen er intet mere end en sammenfatning af den viden, man havde på det 35 pågældende tidspunkt. Den omtalte patentansøgning involverer derfor intet ud over den tekniske viden, som allerede er omtalt i de foran anførte referencer.
I GB-A-1.170.929 beskrives et farmaceutisk præparat, der indeholder Η I ^^— ---- DK 168061 B1 3 antiviralt nukleinsyremateriale aktivt mod både DNA- og RNA-viruser.
I US-A-3.829.567 beskrives et terapeutisk præparat, der indeholder et alkalimetalsalt af et polynukleotid eller oligonukleotid af RNA eller DNA og er aktivt mod det fibrinolytiske system.
5 I FR-A-1.605.535 beskrives polynukleotider, der kan anvendes som induktorer af produktionen af interferoner.
Der er ingen omtale af, at de i de ovennævnte skrifter omhandlede nukleotider skulle opvise en sekvens som er identisk med en del af strukturen af DNA, som kan hybridiseres til en mRNA hos herpes virus, 10 hvilket nukleotid kan hybridiseres til mRNA'en, til inhibering af formeringen af virus.
Under de foreliggende omstændigheder er der et stort behov for tilvejebringelse af et anti-viralt middel af en helt ny type baseret på udvikling af teorien om inhibering af mRNA-transi ation af virus på basis 15 af RNA-DNA hybridiseringteknikken med henblik på inhibering af formeringen af virus in vivo.
Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således et middel til inhibering af formeringen af virus, som omfatter et specifikt oligo- eller polydeoxynukleotid, der afgives til det af virus inficerede sted, 20 hvilket middel udgør en ny type af et anti-viralt middel, som omfatter et specifikt oligo- eller polydeoxynukleotid, som i DNA-sekvens er identisk med en del af strukturen af DNA, som kan hybridiseres til en mRNA dannet ved formeringen af virus, hvilken struktur er i stand til at hybridisere til mRNA'en, til inhibering af formeringen af virus.
25 Opfindelsen beskrives i det følgende nærmere under henvisning til tegningen, hvor figur 1 afbilder en kurve, der viser resultatet af forsøg, som påviser de inhibitoriske virkninger af oligodeoxynukleotidet (20 A) på de cytopatiske virkninger af HSV-1, 30 figur 2 afbilder en kurve, som viser resultatet af forsøg, der påviser de inhibitoriske virkninger af oligodeoxynukleotidet (20 A) på formeringen af virus, figur 3 afbilder en kurve, der viser virkningen af en vis kombination af oligodeoxynukleotiderne til inhibering af formeringen af virus 35 samt den patogene virkning deraf sammenlignet med et enkelt oligodeoxy-nukleotid, og figur 4 er en kurve, der viser resultatet af forsøg, som var udformet for at påvise in vivo effektiviteten (i et levende dyr) af det anti- 4 DK 168061 B1 virale middel ifølge opfindelsen.
I forbindelse med den foreliggende opfindelse har det vist sig, at formeringen af virus effektivt inhiberes, når et oligodeoxynukleotid eller polydeoxynukleotid, som i DNA-sekvens er identisk med en del af 5 strukturen af DNA, som kan hybridisere til mRNA dannet ved formering af virussen, hvilken struktur er i stand til at hybridisere til mRNA'en, afgives til det sted, hvor mRNA'en eksisterer. Ved at administrere oli-go- og polydeoxynukleotiderne til dyr, der var inficeret med en virus, lykkedes det at tilvejebringe et anti-viralt middel, som var i stand til 10 effektivt at inhibere formeringen af virus in vivo. Den foreliggende opfindelse er baseret herpå.
Som beskrevet ovenfor er hybridiseri ngen af viral eller gi obin RNA til den tilsvarende DNA til inhibering af proteinsyntesen kendt fra de ovenfor nævnte referencer. Størsteparten af de tilhørende forsøg udfør-15 tes imidlertid i et celle-frit system med undtagelse af Zamecniks anden reference (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 280-284) og Molecular Biosystem Inc. referencen (PCT, Inti. Publn. nr. W083/01451), hvor inhibering af formeringen af virus er beskrevet i et in vitro cellekultur-system. I Zamecniks in vitro forsøg udvælges denne imidlertid fra en 20 anden region end en specifik kodningsregion for virussen. Med utrykket "kodningsregion" menes her regioner af virale gener, der giver anledning til (bestemmer aminosyresekvensen af) virale proteiner og som undergår transkriptionen ved hjælp af en RNA-polymerase til dannelse af mRNA. Omvendt mangler Molecular Biosystem Inc. referencen omtale af de konkrete 25 betingelser i forsøgene. Som et led i den foreliggende opfindelse er der udført omfattende undersøgelser og forsøg i både in vitro og in vivo systemer under anvendelse af specifikke oligodeoxynukleotider eller polydeoxynukleotider udvalgt fra en specifik kodningsregion og det blev herved for første gang muligt at udvikle teorien om inhibering af forme-30 ringen af virus på basis af RNA-DNA hybridiseringsteknikken til et praktisk anvendeligt terapiniveau, hvorved det er blevet muligt at anvende oligodeoxynukleotiderne eller polydeoxynukleotiderne som lægemidler til inhibering af formeringen af virus. Den foreliggende opfindelse afviger således væsentligt fra den kendte teknik i to henseender, nemlig ved ud-35 vælgeisen af DNA fra en specifik kodningsregion, som kan hybridiseres til mRNA for virus og anvendelsen af et enkeltstrenget deoxynukleotid med en kort kædelængde som den fra den specifikke kodningsregion udvalgte DNA, ligesom den foreliggende opfindelse udmærker sig ved, at de DK 168061 B1 5 ovennævnte forhold udvikles til et praktisk anvendeligt niveau ved hjælp af talrige in vivo forsøg.
Den foreliggende opfindelse angår således et farmaceutisk præparat, som er ejendommeligt ved, at det i det væsentlige består af en effektiv 5 anti-viral mængde af et oligo- eller polydeoxynukleotid, som har en sekvens, der er identisk med en del af DNA, som er hybridiserbart med mRNA hos herpes-virus, hvilken oligo- eller polydeoxynukleotid kan hy-bridiseres med mRNA, samt en farmaceutisk acceptabel bærer.
I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse muliggøres føl -10 gelig inhibering af formeringen af virus ved, at et eller flere oligode-oxynukleotider eller polydeoxynukleotider afgives til et sted, hvor der findes en mRNA dannet ved formeringen af virussen, hvorved oligodeoxy-nukleotiderne eller polydeoxynukleotiderne i DNA-sekvens er identisk med en del af strukturen af DNA, som kan hybridiseres til en ved formering 15 af virussen dannet mRNA, hvilken struktur er i stand til at hybridisere til mRNA'en.
I forbindelse med den foreliggende opfindelse blev det først fundet, at proteinsyntesen, når en syntetisk RNA såsom mRNA transiateres i et in vitro proteinsyntesesystem, inhiberes af et oligodeoxynukleotid, 20 som hybridiserer til den syntetiske RNA (se eksempel 25 nedenfor).
Oligodeoxynukleotider, som ikke hybridiserer til RNAén, inhiberer ikke proteinsyntesen i dette system.
Det blev dernæst fundet, at oligodeoxynukleotider af (-)-streng sekvensen af α-globin eller Ø-globin DNA inhiberer translationen af den 25 tilsvarende mRNA (se eksempel 26 nedenfor).
På grundlag af forsøget blev det fundet, at α-globin DNA specifikt inhiberer translationen af α-globin mRNA i in vitro systemet. Endvidere blev det fundet, at /f-globin DNA specifikt inhiberer translationen af β-globin mRNA i dette system. Endvidere blev dannelsen af α-globin ikke 30 inhiberet, når der anvendtes DNA, som ikke hybridiserer til or-globin mRNA'en. På tilsvarende måde inhiberedes /l-globin-dannelsen ikke af DNA, som ikke hybridiserer til /5-globin mRNA. Endvidere blev det fundet, at ikke kun DNA med en lang kæde, men også oligodeoxynukleotider har en stærk inhibitorisk virkning i dette system p.g.a. hybridisering.
35 På grundlag af disse forsøg foretoges yderligere forsøg vedrørende herpes simplex virus (HSV) infektion*. Når DNA eller oligodeoxynukleotider, som kan hybridisere til den umiddelbart tidlige mRNA for HSV, blev indgivet til celler inficeret med denne virus, viste det sig, at antal- 6 DK 168061 B1 let af syncytia (et plaque-lignende hul, som blev fremkaldt af HSV p.g.a. fusionen af inficerede celler) forårsaget af HSV, blev markant reduceret.
I de ovennævnte forsøg anvendtes CaClg og Ca-phosphat sammen med 5 DNA'en for at stimulere indtrængning af DNA'en i celler. I separate forsøg blev det dog fundet, at oligodeoxynukleotidet kan optages selv uden disse calciumsalte og at det således inhiberer formeringen af HSV og dens cytopatiske virkninger (se eksempel 7 nedenfor).
Ud fra disse forsøg blev det klart, at minus-strengen af DNA, som 10 hybridiserer til en mRNA af HSV-1, inhiberer syncytium-dannelse af denne virus. Baseret på denne iagttagelse blev sådan DNA yderligere tilført mus, der var inficeret med HSV, og det blev påvist, at denne DNA kan anvendes som et anti-viralt middel in vivo til behandling af virale sygdomme.
15 Det er her væsentligt, at kun den negative streng af DNA'en, som er specifik for mRNA'en af det særlige virale gen, anvendes som en effektiv komponent i midlet og fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. Biosyntesen af cellulært protein, der programmeres af andre mRNA'er, bør derfor ikke påvirkes ved anvendelse af den ovenfor omtalte DNA.
20 Der er to grupper af virus, nemlig DNA-virus (herpes simplex virus, adeno virus, vaccinia virus, etc.) og RNA-virus (influenza virus, rhino virus og polio virus, etc.). RNA-virus bærer enten enkelt-strenget RNA eller dobbelt-strenget RNA som et genom. Enkelt-strenget RNA-virus klassificeres i sådanne, der bærer plus-strenget RNA og sådanne, der bærer 25 minus-strenget RNA som genom.
Virale proteiner må altid syntetiseres ved translation af en viral mRNA, der er en plus-strenget RNA. Virus med et dobbelt-strenget DNA-genom danner mRNA (plus-streng) ud fra deres minus-strengede DNA-streng.
I de dobbelt-strengede RNA-virus dannes mRNA'en (plus-strenget) ud fra 30 den minus-strengede RNA. Genomet af plus-strengede RNA-virus fungerer i sig selv som en mRNA, mens de minus-strengede RNA-virus anvender deres RNA som tempi ater for dannelsen af plus-strenget RNA (mRNA).
Iht. den foreliggende opfindelse er translationen af en viral mRNA og således syntesen af virale proteiner uafhængig af mekanismen for syn-35 tesen af mRNA, som inhiberes af en hybridiserende minus-strenget DNA.
Ifølge den foreliggende opfindelse kan formeringen af RNA- eller DNA-virus og disses cytopatiske virkninger standses uden at influere på værts-celler. Endvidere kan infektion af uinficerede værts-celler fore- DK 168061 B1 7 bygges ved hjælp af midlet ifølge opfindelsen. Som et led i den foreliggende opfindelse viste det sig, at oligodeoxynukleotider, der alene hy-bridiserer til den direkte tidlige mRNA af herpes simplex virus, hverken har virkning på normale uinficerede hamsterunge-nyreceller (BHK-celler) 5 eller på mus. Det konkluderedes derfor, at oligodeoxynukleotiderne hverken har særlig virkning på normale celler og dyr eller overhovedet indvirker på væksthastigheden af disse celler.
De negativt-strengede deoxynukleotider, som anvendes ifølge opfindelsen, kan opnås ved enzymatisk hydrolyse af DNA, denaturering og 10 efterfølgende separering ved affinitetskromatografi. Alternativt kan syntetiske negativt-strengede oligodeoxynukleotider anvendes. Det er således klart, at de negativt-strengede deoxynukleotider, som anvendes i de her beskrevne forsøg, kan opnås ved en række forskellige fremgangsmåder.
15 Ved kloningen af RNA-virus-gen kan anvendes revers transkriptase. I nogle tilfælde kan anvendes viral DNA, som er til stede i inficerede celler, og som hidrører fra RNA-virus genomet. Som en kloningsvehikel kan fx. anvendes lambda-fag (Charon-fag) eller plasmid pBR 322 som vektor. Til opnåelse af en enkelt-strenget (-) DNA, anvendes M 13 fag som 20 vektor. Iht. den foreliggende opfindelse kan anvendes den klonede DNA fra kloningsregionen for enhver del af de totale virale genomer. Tidlige eller umiddelbart tidlige gener, hvis ekspression iagttages i tidlige infektionsstadier, er dog særlig ønskelige til hindring af virusforme-ring og de ledsagende cytopatiske virkninger.
25 En rekombinant M 13 fag indeholdende en negativt-strenget viral DNA eller en rekombinant DNA-vektor indeholdende den dobbelt-strengede virale DNA, kan fremstilles ved at dyrke store mængder E. coli indeholdende disse vektorer eller E. Coli inficeret med M 13 fag. Vektorer indeholdende de virale gener isoleredes og behandledes med restriktions-30 endonuklease til afskæring af de virale gener. Blandingen af de afskårne virale gener og vektor-DNA'en underkastedes dernæst agarose-gel elektro-forese eller kromatografi på Sephadex-kolonne til adskillelse af virus-gen-DNA'en fra vektor-DNA'en. De således opnåede DNA-molekyler forkortedes ved partiel fordøjelse med DNA-restriktions-endonuklease eller 35 ved ultralyd-behandling. Kædelængden af de virale DNA-fragmenter juste-redes til et vilkårligt sted mellem 9 og 100 nukleotider ved at isolere disse DNA-strenge ved gel-elektroforese og Sephadex-kromatografi.
Det skal bemærkes, at kun den negative streng af viral DNA er ef- 8 DK 168061 B1 fektiv til i nhi bering af den virale proteinsyntese. DNA'en af vektorer såsom pBR 322 eller lambda-fag som den repli kerende form af M 13 fag er en dobbelt-strenget DNA. Denne dobbelt-strengede DNA må derfor omdannes til en enkelt-strenget DNA efterfulgt af isolering af negativt-strenget 5 DNA. Til dette formål kan forskellige fremgangsmåder anvendes. Fx denatureres DNA ved opvarmning til 100°C i 10 minutter og hurtig afkøling.
Fra en blanding af den separerede negative og positive streng af DNA kan den negativt-strengede DNA isoleres, fx. ved affinitetskromatografi. Til dette formål fremstilles først den positivt-strengede DNA ved 10 kloning i M 13 fag. Denne konjugeres dernæst til et bærermateriale til kromatografisk brug. En blanding af negative og positive strenge af DNA ledes dernæst gennem den konjugerede positive DNA-kolonne. Den negative streng af DNA bindes til denne kolonne, mens den positive streng af DNA passerer gennem kolonnen. Den bundne negative streng af DNA elueres der-15 næst fra kolonnnen.
Ved en alternativ fremgangsmåde til opnåelse af den negative streng af DNA syntetiseres den kemisk i form af oligo- eller polydeoxynukleo-tider ved en passende organisk-kemisk syntesemetode.
I tilfælde af herpes simplex virus har et af de umiddelbart tidlige 20 DNA-gener, Vmw 175, eksempelvis en dobbelt streng bestående af en plus- DNA (5'-ATG.GCG.TCG.GAG.....) og en minus-DNA (3'-TAC.CGC.AGC.CTC.....).
Kun minus-DNA'en med en sekvens, der begynder med TAC, kan hybridisere til en mRNA af Vmw 175. En DNA, som er identisk i en partiel struktur med minus-DNA-strengen, skal derfor udvælges og syntetiseres som et oli-25 godeoxynukleotid. Influenza virus-genomet indeholder hæmaglutinin-genet og NS (ikke-strukturelle) gener. Da hæmaglutinin-genet af forskellige serotyper af influenza virus varierer i RNA-sekvens, foretrækkes sekvensen af en enkelt-strenget DNA, der hybridiserer til mRNA'en af NS-gener-ne. (-)-streng-DNA, som hybridiserer til mRNA'en fra NS-generne, er mere 30 ønskelig end den, som hybridiserer til mRNA'en fra hæmaglutiningenet, fordi hæmaglutinin-genet meget ofte muterer og minus-streng-DNA'en, som hybridiserer til mRNA'en fra hæmaglutinin-genet af en enkelt stamme af influenza virus, kan eventuelt ikke kryds-hybridisere til mRNA'en fra hæmaglutinin-genet af en anden serotype-stamme af influenza virus.
35 Yderligere forklaring om NS-1 genet af influenza virus er fx givet af Lamb et al., (Cell 21 47 (1980)). DNA-sekvensen, der hybridiserer til en mRNA fra NS-1 gen, er 5'.....ACT.TGA.CAC.AGT.GTT.GGA.ATC.CAT.....-3'.
Derfor kan hele denne sekvens eller en del deraf udvælges og syntetise- DK 168061 B1 9 res.
Det fremgår af de foregående forklaringer, at man til inhibering af virus-formeringen med en enkelt-strenget minus-streng-DNA principielt bør vælge en effektiv enkelt-strenget DNA, som hybridiserer til en mRNA 5 af denne virus.
Generelt står betegnelsen "oligodeoxynukleotid" for et molekyle, der har et mindre antal deoxynukleotid-enheder, mens betegnelsen "poly-deoxynukleotid" står for et molekyle, der har et større antal deoxynukleotid-enheder. I forbindelse med den foreliggende opfindelse er fx.
10 antallet af nukleotid-enheder af oligodeoxynukleotiderne sædvanligvis op til 25. Således kan deoxynukleotider, der her mere end 25 deoxynukleotid-enheder, i forbindelse med den foreliggende opfindelse betegnes som "polydeoxynukleotider".
De anti-virale midler ifølge den foreliggende opfindelse, som inde-15 holder oligo- og/eller polydeoxynukleotiderne sammen med en passende flydende bærer eller excipient og eventuelt en hjælpetilsætning eller -tilsætninger, fremstilles i form af flydende præparater, injektioner, suppositorier, etc. iht. kendte fremgangsmåder. Ved ordination kan de ønskede oligodeoxynukleotider og polydeoxynukleotider anvendes enkeltvis 20 eller i kombination med andre farmakologisk aktive bestanddele. I dette tilfælde er det klart, at de andre bestanddele ikke bør modvirke oligo-og polydeoxynukleotidernes anti-virale aktivitet.
Oligo- og polydeoxynukleotiderne kan om ønsket forarbejdes til præparater til udvortes brug såsom cremer, salver, væsker og plastre ved 25 blanding af oligo- og polydeoxynukleotiderne som den aktive bestanddel med en passende inert bærer eller excipient.
De flydende bærere eller exeipienter samt de eventuelle hjælpetilsætninger, som anvendes i de anti-viral midler ifølge opfindelsen, er konventionelle og kommercielt tilgængelige.
30 Eksempler på flydende bærere, excipienter og hjælpetilsætninger, som kan anvendes til fremstilling af de anti-virale midler, er fx destilleret vand til injektionsbrug, fysiologisk saltvand, en vandig opløsning af dextrose, vegetabilske olier til injektionsbrug, pro-pylenglycol, polyethylenglycol og benzylalkohol (til injektioner og 35 flydende præparater), vaseline, vegetabilske olier, animalsk fedt og polyethylenglycol (til præparater til udvortes brug) og isotoniske midler, opløseligheds-fremmende midler, stabilisatorer, farvningsmidler, antiseptiske midler, dulmende midler og lignende tilsætninger (som 10 DK 168061 B1 almindelige hjælpetilsætninger til farmaceutiske præpater). I tilfælde af injektions-præparater kan det være ønskværdigt, at den aktive bestanddel er opløselig i steriliserede flydende bærere. Det er klart, at de ovenfor nævnte forskellige flydende bærere, excipienter og hjælpe-5 tilsætninger hverken bør inhibere eller forstyrre oligo- og polydeoxy-nukleotidernes anti-virale virkning.
Oligo- og polydeoxynukleotiderne forarbejdes sammen med de ovenfor anførte bærere eller excipienter og eventuelt sammen med de ovenfor anførte hjælpetilsætninger iht. kendte fremgangsmåder. Injektionspræpara-10 ter og suppositorier kan sædvanligvis indeholde 1-10 mg oligo- og poly-deoxynukleotid per ampul eller kapsel. For human-patienter er den daglige dosis ca. 0,1-1.000 mg, fortrinsvis 1-100 mg (fra 10-20 øg/kg til 1000-2000 /ig/kg legemsvægt). Den specielle dosis for hver patient afhænger imidlertid af et stort antal faktorer, fx af effektiviteten af de 15 specielle oligo- eller polydeoxynukleotider, der anvendes, af alder, vægt, almenbefindende, køn, spisevaner, tidspunktet og arten af administrationen, udskilningshastigheden, kombination med andre samtidig anvendte medikamenter og omfanget af de specielle sygdomme, mod hvilke terapien anvendes.
20 De anti-virale midler ifølge opfindelsen administreres intravenøse eller påføres direkte til den del af patientens krop, som er inficeret med virus, således at oligo- eller polydeoxynukleotidet effektivt kan tilføres den inficerede del.
Den foreliggende opfindelse vil nu blive belyst nærmere ved hjælp 25 af de efterfølgende eksempler og referenceeksempler.
Eksempel 1-5 angår fremstillingen af oligo- og polydeoxynukleotiderne, som anvendes i præparatet ifølge den foreliggende opfindelse.
Eksempel 1 30 Herpes simplex virus DNA blev isoleret ved phenol-chloroform ekstraktion. Den isolerede DNA blev fordøjet med restriktions-enzymet BamHI.
Den fordøjede DNA blandedes dernæst i nærværelse af T 4 fag ligase med pBR 322 plasmid-DNA, som forud var blevet behandlet med BamHI.
35 Den resulterende blanding, der indeholdt ligerede pi asmider, blev tilført til E. coli og de bakterier, der indeholdt rekombinantplasmidet, blev udvalgt ved at inkubere dem på ampicillin-holdige agar-plader til dannelse af kolonier og ved at screene dem for tetracyclin-følsomhed.
DK 168061 B1 11
Blandt de tetracyclin-føl somme kolonier blev de bakterier, der havde herpes simplex virus-DNA'en, udvalgt ved filter-hybridiseringsmetoden 32 med P-mærket herpes viral DNA som probe. Til opnåelse af rekombinant- 6 7 plasmid-DNA'en blev 2 x 10 - 10 E. coli celler, som indeholdt rekombi-5 nant-plasmidet, anbragt i 2 ml TSB (tryptose-soya-næringssubstrat).
Det podede medium rystedes i et 20 ml testrør ved 37°C i ca. 15 timer indtil den optiske absorption (optisk tæthed : OD) af kulturmediet ved 540 nm nåede 0,5 (ODg^=0,5). På dette tidspunkt tilsattes chloramphenicol til en slutkoncentration på 100 /tg/ml og inkubation fortsattes 10 i 15 timer.
Bakteriesuspensionen centrifugeredes dernæst og pelleten resuspen-deredes i et puffer indeholdende 25¾ saccharose og 50 mM tris HC1 (pH
8,0). Suspensionen henstod ved 0°C i 5 minutter. Til denne suspension sattes 4 ml "Triton X 100“ og den resulterende viskose opløsning centri -15 fugeredes i 30 minutter ved 0°C ved 30.000 g. Til supernatanten af denne opløsning (8 ml) sattes 8 g CsCl, 1 ml af en opløsning af ethidiumbromid (/ig ethidiumbromid/ml). Blandingen centrifugeredes i yderligere 48 timer ved 100.000 g. Den rå pi asmidfraktion, som blev opnået efter denne centrifugering, blandedes med 2 volumendele isopropyl al kohol og henstod i 20 få minutter. Det øvre lag fjernedes og den DNA-holdige opløsning dialyseredes mod 0,1 M tris HC1 og 10 mM EDTA (pH 8,0) natten over.
Den dialyserede opløsning koncentreredes og opløsningen, der indeholdt 200 øg DNA, behandledes med en overskydende mængde restriktionsenzym (BamHI). DNA-fordøjelsesproduktet fraskiltes ved agarose-elektro-25 forese og DNA'en af herpes simplex virus isoleredes fra gelen ved hjælp af elektroelueringsmetoden. DNA'en fordøjedes yderligere delvist med DNase og opvarmedes til 100°C i 10 minutter efterfulgt af hurtig afkøling. På denne måde opnåedes DNA med en kædelængde på 9 til 100 oli godeoxynukleot ider.
30
Eksempel 2
Den replikative form af M 13 fag DNA (dobbelt-strenget DNA) blev overskåret med BamHI. Denne fordøjede M 13 DNA blandedes med herpes simplex virus DNA, der var blevet fordøjet med BamHI, og isoleredes som 35 beskrevet ovenfor. De ligeredes med T 4 fag ligase. E. coli transficere-des med den ligerede DNA i nærværelse af CaCl2. De transficerede bakterier anbragtes på agarplader under anvendelse af en top-agar, der indeholdt IPTG (isopropyl-Ø-D-thio-galactopyranosid) og X-gal (som indi- DK 168061 B1 12 kator). Rekombinant-M 13-fag, der indeholdt herpes simplex virus DNA, danner farveløse fag-plaque inden for 24 timer. M 13 fag uden indføring danner blå plaque. Derfor valgtes de farveløse fag-plaque. For at vælge rekombinant-M 13-fag, som indeholder (-)-strenget HSV-DNA, undersøgtes 5 fag for deres evne til at hybridisere med mærket (+)-HSV-DNA, som syntetiseres kemisk. På denne måde udvalgtes M 13 fag indeholdende en del af (-)-strengen af HSV-DNA. Mængden af den ønskede rekombinant-M 13-fag forøgedes og en enkelt-strenget DNA blev isoleret fra denne fag. Til yderligere rensning af den enkelt-strengede HSV-DNA kan M 13 fag DNA 10 fjernes fra denne blanding ved restriktionsenzym-fordøjelse i nærværelse af visse oligodeoxynukleotider. Alternativt kan DNA-bl andingen uden rensning delvist fordøjes med DNase og der kan isoleres oligodeoxynukleotider med en kædelængde mellem 9 og 100.
15 Eksempel 3
Et DNA-syntetiseringsmiddel (Applied Biosystem Company) anvendtes til syntetisering af mi nus-strenget DNA af det umiddelbart tidlige gen (Vmw 175 eller ICP 4) af herpes simplex virus. I dette eksempel syntetiseredes DNA-sekvensen S'-CGC.AGC.CTC.TTG.TTC.GTC.GC-S', som hybridiserer 20 med mRNA af Vmw 175. Dette deoxynukleotid er eicosamert og betegnes herefter kort 20 A.
Eksempel 4
Et DNA-syntetiseringsmiddel (Applied Biosystem Company) anvendtes 25 til syntetisering af minus-strenget DNA af det umiddelbart tidlige gen (Vmw 12) af herpes simplex virus. I dette eksempel syntetiseredes DNA-sekvensen 3'-GCA.CCC.GGG.ACC.TTT.ACC.GC-5', som hybridiserer med mRNA af Vmw 12. Dette deoxynukleotid er eicosamert og betegnes herefter kort 20 B.
30
Eksempel 5
Et DNA-syntetiseringsmiddel (Applied Biosystem Company) anvendtes til syntetisering af minus-strenget DNA af NS 1 genet af influenza virus. I dette eksempel syntetiseredes DNA-sekvensen 3'-CTA.AGT.TTG.
35 TGA.CAC.AGT.TCA-5', som hybridiserer med mRNA af NS 1. Dette deoxynukleotid er heneicosamert og betegnes herefter kort 20 C.
M I - ΓΤΊ^^" — DK 168061 B1 13
Eksempel 6
Dette eksempel angår et forsøg, ved hvilket det bliver bekræftet, at oligodeoxynukleotidet inhiberer syntesen af virus-protein in vitro.
Tabel I belyser den inhibitoriske virkning af 20 A på Vmw 175 dan-5 nelse og den tilsvarende cytopatiske virkning (syncytium-dannelse) af HSV 1.
Tabel I
20 A/fordybning Relative mængder Relative cytoptiske af Vmw 175 virkninger/syncytium) 10 _ ------------- 1 1 33,6 jug 0,48 0,35 5 BHK-celler (1,5 x 10 ) blev anbragt i hver pladefordybning (1,5 cm 15 i diameter) af en Limbro-plade og der tilsattes MEM med 10% kalveserum. Cellerne inkuberedes dernæst i en 5% COg-atmosfære ved 36°C. Herefter inficeredes cellerne med 5 dele HSV-1 i nærværelse eller fravær af 20 A.
Efter 5 timer fjernedes mediet. Cellerne bragtes dernæst i 1 time i kon- 35 takt med S-methionin (100 μΟί/μΊ) og 20 A blev afbrudt, og proteinerne 20 analyseredes ved polyacrylamidgel-elektroforese efterfulgt af autoradiografi. Til vurdering af den relative cytopatiske virkning var forsøgsbetingelserne identiske med de ovenfor anførte med undtagelse af, at antallet af syncytia blev talt 13 timer efter inficeringen. Der iagttoges ingen formindskelse af cellulær proteinsyntese under disse betingelser.
25
Eksempel 7
Dette eksempel angår et forsøg, ved hvilket det blev bekræftet, at oligodeoxynukleotidet bliver optaget af celler.
Forsøget viser, at det enkelt-strengede oligodeoxynukleotid 20 A 30 faktisk trænger ind i dyrkede celler. BHK-celler (hamsterungenyreceller, 4,4 x 10^ celler) inficeredes med 7,6 x 10^ PFU af HSV-l/ml. Kontrolceller blev ikke inficeret, men fik den samme mængde dyrkningsmedium. Cellerne inkuberedes i 3 timer i en C09-inkubator ved 37°C. Efter inkuba- ^ 32 tionen udsattes cellerne for 7,66 p mol af P-mærket 20 A. Efter udsæt-35 ningen for mærket 20 A fjernedes dyrkningsmediet og cellerne vaskedes to gange med 0,3 ml PBS.
Cellerne henstod herefter i 30 minutter ved 36°C i en opløsning indeholdende 0,1 M NaCl, 33 μΜ ZnC^, 3360 enheder nuklease SI og 33,3 14 DK 168061 B1 mM natriumacetatpuffer (pH 4,5).
Herefter vaskedes cellerne to gange med den ovenfor beskrevne puffer, men uden nuklease SI. De vaskede celler blev sprængt i 0,3 ml opløsning indeholdende 10 mM EDTA, 0,6% natriumdodecylsulfat og 10 mM 5 tris-HCl puffer (pH 7,5). På dette tidspunkt måltes TCA-uopløselig, nuklease Sl-følsom, radioaktiv 20 A. Det blev fundet, at mindst 4,68 x 3 10 molekyler af 20 A var blevet optaget per celle i udsætningsperioden på 8 timer. Den virkelige mængde er sandsynligvis 10 gange større end 32 denne værdi p.g.a. den hurtige hydrolyse af P-terminale phosphater.
10
Det efterfølgende eksempel 8 belyser, at 20 A har en inhiberende virkning på formeringen af virus.
Eksempel 8 5 15 Ca. 1,5 x 10 BHK-celler blev anbragt i hver pladefordybning (1,5 cm i diameter) af en Limbro-plade. Disse celler inkuberedes i 5% C02 ved 36°C i 48 timer og inficeredes med HSV-1 (7,6 x 104 PFU/ml) i 160 μΐ MEM. Inficeringen gennemførtes i 3 timer ved 36°C i 5% COg. Efter inficeringen tiIførtes 20 A til de inficerede celler. Efter 8 timer udskif-20 tedes mediet med normal MEM med 10% kalveserum. 15 timer efter inficeringen høstedes dyrkningsvæsken og virus-titeren måltes. Resultaterne er vist i tabel II nedenfor.
Tabel II
25 Mængde af 20 A/fordybning Relativ mængde af virus 0 100 0,112 jig 45 0,224 μg 35 30
Eksempler 9-13 angår forsøg, ved hvilke det bliver bekræftet, at oligodeoxynukleotidet inhiberer ødelæggelsen af dyreceller p.g.a. virus in vitro.
35 Eksempel 9 c (a) Ca. 1,5 x 10 BHK-celler anbragtes i hver fordybning (1,5 cm i diameter) af en Limbro-plade til celle-dyrkning. Cellerne inkuberedes i 47 timer ved 36°C i 5% C02 og inficeredes dernæst med 160 /il HSV-1 (7,6 DK 168061 B1 15 x 104 PFU/ml) i 3 timer ved 36°C. Til disse inficerede celler sattes et kompleks af calciumphosphat og 20 A i forskellige mængder. Mediets calcium-koncentration varierede fra 1,36 mmol til 24,8 mmol i afhængighed af koncentrationen af 20 A. Komplekset fremstilledes som beskrevet af 5 Ruddle-gruppen (Loiter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 79 422, 1982). De inficerede celler udsattes for 20 A i 8 timer. Dyrkningsmediet fjernedes dernæst og erstattedes af et normalt dyrkningsmedium uden 20 A og cellerne dyrkedes i yderligere 13 timer.
(b) Kontrol cell erne behandledes på identisk måde med undtagelse af 10 tilsætningen af 20 A (Ca-phosphat-kontrol).
(c) Som yderligere kontrol fremstilledes en inficeret kultur, som hverken behandledes med Ca-phosphat eller 20 A (viruskontrol). De ovenfor fremstillede vævskulturceller (a), (b) og (c) fikseredes, plettedes og antallet af syncytia taltes.
15 Resultatet af dette forsøg er vist i figur 1, hvor X-aksen (abscissen) står for mængden af DNA i /ig, der blev tilsat til hver fordybning (dvs. "/ig DNA/fordybning"), og Y-aksen (ordinaten) står for antallet af syncytia i procent (dvs. "% antal af syncytia"), der dannes i en cellekultur i sammenligning med den i tilfælde af forsøg (c) for "viruskon-20 trol" opnåede værdi, som i dette tilfælde altid sættes som 100 og hvori en kurve, der er tegnet som en gennemgående linie (a) (--), viser det med forsøg (a) opnåede resultat, mens en kurve tegnet som en stiplet linie (b) (----), viser det ved forsøg (b) opnåede resultat. Som vist i figur 1, i nhi berede 20 A syncytium-dannelsen betydeligt. Calciumphosphat 25 eller calciumchlorid havde ingen indflydelse på antallet af syncytia.
Eksempel 10 c (a) Ca. 1,5 x 10 BHK-celler per fordybning (1,5 cm i diameter) anbragtes på en Limbro-plade. Cellerne inkuberedes ved 36°C i 47 timer 30 under 5% COg. Til disse celler sattes 160 /il HSV-1 (7,6 x 10^ PFU/ml) og inficering blev tilladt i 3 timer ved 36°C, Til disse inficerede celler sattes forskellige mængder 20 A i form af et calciumchloridkompleks til en calciumion-slutkoncentration på 4,55 mM. Behandlingen fortsattes i 8 timer. Cellerne inkuberedes dernæst i yderligere 14 timer.
35 (b) Derudover fremstilledes en kultur, som var identisk med den oven for under (a) beskrevne, med undtagelse af, at der fremstilledes og inkuberedes et oligodeoxynukleotid, som ikke er beslægtet med HSV-1 sekvens 5'-CAC.GAC.AGA.GGG.CGA-3'. Alle andre betingelser var identiske DK 168061 Bl 16 med tilfælde (a).
(c) Der fremstilledes og inkuberedes en lignende kultur, hvori 20 A blev udeladt, under de samme betingelser som ovenfor. Den betegnes her som "viruskontrol".
5 De ovenfor i (a), (b) og (c) beskrevne celler fikseredes, plettedes og antallet af syncytia taltes. Resultaterne af dette forsøg er vist i figur 2, hvor X-aksen (abscissen) står for mængden af DNA i øg, der blev tilsat til hver fordybning (dvs. "øg DNA/fordybning"), og Y-aksen (ordinaten) står for antallet af syncytia i procent (dvs. "% antal af syncy-10 tia"), der dannes i en cellekultur i sammenligning med den i tilfælde af forsøg (c) for "viruskontrol" opnåede værdi, som i dette tilfælde altid sættes som 100 og hvori en kurve, der er tegnet som en gennemgående linie (a) (--), viser det med forsøg (a) opnåede resultat, mens en kurve tegnet som en stiplet linie (b) (----) viser det med forsøg 15 (b) opnåede resultat.
Som vist i figur 2, har 20 A en inhiberende virkning på antallet af syncytia, der fremstilles af HSV-1. Af dette forsøg kan man konkludere, at 20 A inhiberer syncytium-dannelsen i nærværelse af 4,55 mM calcium-ion. Oligodeoxynukleotider, som ikke er beslægtede med de kendte DNA-20 sekvenser af herpes simplex virus, havde ingen inhibitorisk virkning.
Det fremgik klart af dette forsøg, at minus-strengen af herpes simplex virus DNA specielt inhiberer den cytopatiske virkning af herpes simplex virus.
25 Eksempel 11 I eksempel 9 belystes den virkning, der opnås ved anvendelse af den syntetiske eicosamer 20 A, der er relateret til minus-strengen af HSV-DNA. Dette forsøg angår effektiviteten af klonet herpes simplex DNA. Ved at anvende den HSV-1 DNA-holdige pBR 322 vektor (1,45 megadalton, opnået 30 ved fordøjelse af HSV-1 DNA med BamHI), var det muligt at inhibere syncytium-dannelsen ved HSV-1. I dette forsøg blev HSV-1 DNA ikke udskåret fra rekombinant-plasmidet. Det denaturerede og delvist fordøjede rekom-binant-pBR 322, der indeholdt HSV-1 DNA (0,16 øg), blev anbragt i hver af Limbro-pladens fordybninger som i eksempel 9. Virkningen undersøgtes 35 som beskrevet i eksempel 9 og der iagttoges en inhibering af syncytium-dannelse. Som kontrol for dette forsøg anvendtes DNA af pBR 322 alene. I dette kontrolforsøg blev ingen inhibering fundet.
t --- DK 168061 B1 17
Eksempel 12
Dette eksempel belyser en synergetisk virkning af en blanding af oligodeoxynukleotider.
Ca. 1,5 x 105 BHK-celler blev anbragt i hver fordybning (1,5 cm i 5 diameter) af en Limbro-plade. Cellerne inkuberedes i 5% COg ved 36°C i 47 til 48 timer og inficeredes med HSV1 (7,6 x 10* PFU/ml) i 160 /il MEM. Inficeringen gennemførtes i 3 timer ved 36°C i 5% C02. Efter inficeringen opløstes 20 A alene eller i blanding med 20 B (224 : 1) i et opløsningsmiddel og 0,3 ml af denne opløsning tilførtes cellerne i nærværelse 10 af 4,55 mM calciumion. Disse celler udsattes for 20 A og 20 B i 8 timer.
Modsat blev cellerne behandlet på samme måde som beskrevet ovenfor, med undtagelse af, at 20 A og 20 B manglede. Dette betegnes her som viruskontrol.
Cellerne fikseredes, plettedes og antallet af syncytia taltes.
15 Resultaterne af disse forsøg er vist i figur 3, hvor X-aksen (abscissen) står for mængden af DNA i /ig, der blev tilsat til hver fordybning (dvs.
"/tg DNA/fordybning"), og Y-aksen (ordinaten) står for antallet af syncytia i procent (dvs. "% antal af syncytia"), der dannes i en cellekultur i sammenligning med den i tilfælde af forsøg (c) for "viruskontrol" op-20 nåede værdi, som i dette tilfælde altid sættes som 100 og hvori en kurve, der er tegnet som en gennemgående linie kaldet "20 A" (--), viser det resultat, der opnås ved forsøget under anvendelse af 20 A alene, mens en kurve tegnet som en gennemgående linie kaldet "20 A + 20 B (224 : 1)" (--) viser det resultat, der opnås ved forsøget 25 under anvendelse af 20 A og 20 B i et forhold på 224 :1. Som vist i figur 3, var den iagttagne in vitro virkning stærkere, når blandingen af 20 A og 20 B blev anvendt, sammenlignet med det tilfælde, hvor der anvendtes 20 A alene. Af dette resultat kan der konkluderes, at den samtidige anvendelse af minus-strenget DNA svarende til en portion med DNA-30 sekvens, som er forskellig fra den minus-strengede DNA af herpes simplex virus kan forøge dens virksomhed som anti-viralt middel signifikant.
Eksempel 13
Dette eksempel belyser virkningen af (-)-strengede oligodeoxynukle-35 otider af NS 1 på den cytopatiske virkning af influenza virus. Resultaterne af dette forsøg er vist i tabel III og fremgangsmåden i forsøget er beskrevet mere detaljeret nedenfor.
DK 168061 B1 18
Tabel III
Oligodeoxynukleotider Relativ værdi i forhold til (/ig/ml) antallet af levedygtige celler 5 O 0,21 0,02 0,49 1,30 0,49 5,00 0,49 10 Kitazato-svinenyre (SKK) celler (1,5 x 10^/0,1 ml) dyrkedes i MEM, der indeholdt 5% kalvefosterserum, og anbragtes i hver pladefordybning (0,5 cm i diameter) af en mikroplade. Cellerne inkuberedes i 24 timer ved 35,5°C i 5% CO^-atmosfære i det ovenfor nævnte medium. Mediet fjernedes dernæst og der sattes 100 /il af et medium, som indeholdt forskel -15 lige mængder af oligodeoxynukleotidet (20 C), til hver fordybning og cellerne inkuberedes i 24 timer i 5% CO^-atmosfære. Opløsningen fjernedes dernæst og der sattes 50 μ1 af et medium, som indeholdt 10 TCID50 enheder af influenza A, til hver fordybning. Derudover sattes 50 øg af et dyrkningsmedium, der indeholdt forskellige mængder 20 C, til hver 20 fordybning. Cellerne inkuberedes i yderligere 48 timer. Mediet fjernedes dernæst og 100 /il Hank's opløsning indeholdende 0,1% neutralt rødt sattes til hver fordybning og cellerne inkuberedes i 1 time ved 35,5°C i en 5% C02-inkubator. Opløsningen fjernedes dernæst og cellerne vaskedes med 10 /il 80% ethanol efterfulgt af tilsætningen af 50 μΐ 0,1 N HC1. Det re-25 lative antal levedygtige celler måltes ved optisk absorption ved 577 nm med "ELISA". De levedygtige celler optager neutralt rødt, mens de ikke levedygtige celler ikke gør det. Derfor er antallet af levedygtige celler højere, jo højere den optiske tæthed er.
30 De efterfølgende eksempler 14-20 viser in vivo effektiviteten, når man anvender oligodeoxynukleotiderne som et anti-viralt middel.
Eksempel 14
Ca. 1 x 104 PFU af HSV1 (F-stamme) i 30 /il MEM-suspension injicere-35 des i det intra-cerebrale hulrum på 3 uger gamle BALB/C-mus. Virus-suspensionen indeholdt forskellige mængder 20 A. Desuden injiceredes 200 /il MEM-opløsning indeholdende 1% penicillin, streptomycin og 2 mM glutamin-syre og forskellige mængder 20 A dagligt i 3 dage i det intra-peritonea- i > DK 168061 B1 19 le hulrum, begyndende én dag efter injektionen med HSV-1. Den procentvise dødelighedsrate beregnedes på syvende-dagen. Resultatet af dette forsøg er vist i figur 4, hvor X-aksen (abscissen) står for mængden af DNA i pq injiceret i hver mus (dvs. "/tg DNA/mus") og Y-aksen (ordinaten) 5 står for dødelighedsraten i procent i sammenligning med den i "kontrolgruppen" opnåede rate, hvor mus fik injiceret den samme opløsning, men ingen 20 A, idet dødelighedsraten i "kontrolgruppen" altid sættes til 100. Som vist i figur 4 blev dødelighedsraten reduceret i afhængighed af mængden af den administrerede 20 A.
10 Den grafiske afbildning viser dødelighedsraten udtrykt i procent i sammenligning med kontrolmusegruppen, som ikke modtog 20 A.
Eksempel 15
Ca. 1 x 104 PFU af HSV-1 (F-stamme) i 30 /il MEM-opløsning 15 indeholdende forskellige mængder 20 A, injiceredes i det intra-cerebrale hulrum på 3 uger gamle BALB/C-mus. Desuden injiceredes 200 /il af en opløsning indeholdende forskellige mængder af 20 A, 1% penicillin og streptomycin og 2 mM glutaminsyre intra-peritonealt én gang dagligt, begyndende én dag efter injektionen af HSV-1.
20 Behandlingen fortsattes i 6 efter hinanden følgende dage.
Dødeligheden blandt musene mellem 64 og 65 timer efter injektionen af HSV-1 blev undersøgt. Resultaterne er vist i tabel IV.
Tabel IV
25 Dosering Dødelighed blandt musene 5/19 0,224 /ig/mus 0/9 2,240 /ig/mus 0/10 30
Som vist i denne tabel døde i kontrolgruppen uden administrering af 20 A 5 mus ud af det samlede antal på 19 mus. Modsat var mus, som enten modtog 0,224 /ig 20 A eller 2,240 /ig 20 A, ikke døde på dette tidspunkt (19 mus ialt blev behandlet i de to tilfælde).
Eksempel 16
Ca. 5 x 104 PFU af HSV-1 (F-stamme) i 30 /il MEM-opløsning indeholdende forskellige mængder 20 A injiceredes i det intra-cerebrale hulrum 35 DK 168061 B1 20 på 3 uger gamle BALB/C-mus. Dødeligheden blandt musene mellem 64 og 68 timer eller 71 til 78 timer efter injektionen undersøgtes. Resultaterne er vist i tabel V.
5 Tabel V
Dosering Dødeligheden mellem Dødeligheden mellem 64 og 68 timer 71 og 78 timer 3/10 3/10 10 1,12 øg/mus 0/10 2/10 11,2 /ig/mus 0/10 0/10
Som vist i denne tabel, døde i kontrolgruppen, som ikke modtog 20 A, 3 mus ud af et samlet antal på 10 mus. Modsat var dødeligheden blandt 15 musene i den gruppe, som modtog virus, i nærværelse af 20 A meget reduceret.
Eksempel 17
Ca. 5 x 10^ PFU af HSV-1 (F-stamme) i 30 /ti MEM-opløsning indeholdende forskellige mængder 20 A injiceredes i det intra-cerebrale hulrum 20 på 3 uger gamle BALB/C-mus. Desuden injiceredes fra dagen efter injektionen af de 30 μ\ MEM-opløsning, som indeholdt en given mængde 20 A, 1% penicillin og streptomycin og 2 mM giutaminsyre i det intra-cerebrale hulrum.
Behandlingen forsattes i 2 dage og dødeligheden blandt musene 25 undersøgtes i forskellige perioder efter injiceringen af virus. Resultaterne er vist i tabel VI.
Tabel VI
30 Dosering Dødelighed mellem 64 og 68 timer 71 og 78 timer 88 og 92 timer 1/10 3/10 7/10 1,12 Mg/mus 0/20 2/20 5/20 35
Som vist i denne tabel var dødeligheden blandt kontrolmusene, som ikke modtog 20 A, betydeligt højere end blandt de mus, der modtog 20 A. Selvom effektiviteten af 20 A tilsyneladende aftager mellem 88 og 92 i — r»-—^—— ----- t DK 168061 B1 21 timer efter injektionen, var dødeligheden stadig højere blandt kontrol -musene selv under disse betingelser.
Eksempel 18 5 Ca. 1 x 106 PFU af HSV-1 (F-stamme) i 200 /il MEM-opløsning inde holdende 1,2 /tg 20 A injiceredes i det per i toneal e hulrum på 3 uger gamle BALB/C-mus.
Desuden injiceredes ca. 3 eller 2 timer før HSV-l-injektionen og én dag efter HSV-l-injektionen 200 /il MEM-opløsning indeholdende forskel-10 lige mængder af 20 A intra-peritonealt i de inficerede mus. Intra-peritoneal injektion af 20 A fortsattes i 2 dage. Dødeligheden mellem 211 og 259 timer efter HSV-l-injektionen undersøgtes. Resultaterne er vist i tabel VII.
15
Tabel VII
Dosering Dødelighed efter Dødelighed efter 211 timer 259 timer 20 _ 1/10 2/10 0,224 /tg/mus 0/10 0/10
Som vist i denne tabel døde én ud af et samlet antal på 10 (211 25 timer efter injektionen) eller 2 ud af et samlet antal på 10 (259 timer efter injektionen) mus, når der ikke administreredes 20 A. Modsat døde musene, som modtog 0,224 /ug 20 A, ikke under identiske betingelser.
Eksempel 19 30 Hornhinden på 3 uger gamle BALB/C-mus såredes ved at skrabe den 5 gange med en skarp injektionsnål. Til denne sårede hornhinde administreredes 30 μΐ MEM-opløsning indeholdende 1% penicillin, streptomycin og 2 mM glutaminsyre 5% kalveserum og 3 x 10 PFU af HSV-1 (F-stamme). De behandlede mus opdel tes i fire grupper (A), (B), (C) og 35 (D) som vist nedenfor og øjnene på disse mus blev undersøgt og resultaterne optegnet fotografisk.
(A) På hornhindemembranen hos disse mus dryppedes 10 μΐ MEM-opløsning indeholdende 22,4 μ$ 20 A/ml 2 timer før administrering af DK 168061 B1 22 HSV-1 (F-stamme). Desuden blev denne behandling givet hver anden dag begyndende fra næstedagen efter administrering af HSV-1 (F-stamme).
Desuden modtog disse mus dråber af en opløsning indeholdende cortisonacetat (2 mg/kg muselegemsvægt) 5 timer før injektionen af HSV-1 5 (F-stamme). Cortisonbehandlingen fortsattes også hver anden dag.
(B) Nusene modtog i øjnene 10 /ti MEM-opløsning indeholdende 22,4 /tg 20 A/ml 2 timer før administrering af HSV-1 (F-stamme). Behandlingen med 20 A fortsattes hver anden dag.
(C) Musene modtog 30 /ti af en opløsning indeholdende cortison-10 acetat (2 mg/kg legemsvægt) som beskrevet i (A).
(D) Musene modtog på deres hornhindemembran 10 /ti MEM-opløsning 2 timer før HSV-l-behandlingen (F-stamme). Desuden fortsattes fra næstedagen efter HSV-l-behandlingen (F-stammen) en lignende behandling med MEM-opløsning hver anden dag.
15 Øjnenes og øjenområdets tilstand undersøgtes hos hver mus med speciel opmærksomhed på betændelse og lukning af øjne med patologiske symptomer. Undersøgelsen udførtes på fjerde-, syvende- og tolvtedagen efter behandlingen. Musene, som tilhørte gruppe (A) og gruppe (B), havde meget færre patologiske symptomer i øjnene og det omgivende område i 20 sammenligning med de mus, der tilhørte gruppe (C) og gruppe (D), som ikke modtog 20 A.
Endvidere kan det konkluderes, at effektiviteten af 20 A ikke blev påvirket af administreringen af cortison.
25 De efterfølgende eksempler 20-22 belyser fremstillingen af forskellige typer af anti-virale midler ifølge opfindelsen.
Eksempel 20
Et oligodeoxynukleotid, der er identisk med den i eksempel 3 opnåe-30 de 20 A, syntetiseres iht. triestermetoden (under anvendelse af en tri-ester af de tilsvarende nukleotider i flydende fase). Til 2 g således syntetiseret 20 A sættes en isotonisk MEM-opløsning til et slutvolumen på 1 liter opløsning til injektion, og opløsningen fyldes på ampuller til fremstilling af injektionspræparaterne. Dette injektionspræparat 35 indeholder 2 mg 20 A per ml og administreres, når et symptom iagttages, subkutant i en dosis på 1-5 ml så tæt som muligt ved den inficerede del.
DK 168061 B1 23
Eksempel 21
Et oligodeoxynukleotid, der er identisk med den i eksempel 4 opnåede 20 B, syntetiseres iht. triestermetoden. Til 10 g således syntetiseret 20 B sættes en isotonisk MEM-opløsning til et slutvolumen på 1 5 liter, som er en standardopløsning for et 1% øjendråbepræparat. Dette øjendråbepræparat påføres flere gange dagligt i en dosis på 2-3 dråber, når et symtom iagttages.
Eksempel 22 10 Et oligodeoxynukleotid, som er identisk med den i eksempel 3 opnåede 20 A, syntetiseres iht. triestermetoden. 1 g af den således syntetiserede 20 A formales til et fint pulver og dernæst tilsættes 999 g renset kakaosmør til det fine pulver. Blandingen æltes på et vandbad ved 60°C og formes dernæst til dannelse af suppositorier, som hvert 15 vejer 2 g.
Hvert suppositorium indeholder 2 mg 20 A og anvendes iht. symptomet.
De efterfølgende eksempler 23 og 24 belyser sikkerheden af det 20 anti-virale middel ifølge opfindelsen.
Eksempel 23 Når 20 A i en mængde på 100 /jg/kg administreredes intra-peritonealt til BALB/C-mus, iagttoges der ingen forandring af forsøgsdyret.
25
Eksempel 24
Som en test til bekræftelse af den i de foregående eksempler beskrevne virkning udførtes samme forsøg som beskrevet i eksempel 19 med undtagelse af, at der ikke anvendtes HSV-1. I denne test blev der ikke 30 fundet nogen forskel mellem gruppen af forsøgsdyr, til hvilke der var blevet administreret 20 A, og sådanne, til hvilke der ikke var blevet administreret 20 A.
De foregående eksempler taget i betragtning, er det åbenlyst, at de anti-virale midler ifølge den foreliggende opfindelse er sikre i en 35 effektiv dosis af oligo- og polydeoxynukleotiderne.
De efterfølgende eksempler er optaget heri for at vise, at in vitro proteinsyntesesystemet faktisk bliver inhi beret ved at hybridisere DK 168061 B1 24 mRNA'en med (-)-strenget oligodeoxynukleotid. Disse resultater underbygger det teoretiske grundlag for den foreliggende opfindelse.
Eksempel 25 fReferenceeksempel 1) 5 Dette eksempel illustrerer inhiberingen af polypheny!al aninsyntese, som er afhængig af poly U, med oligodeoxyadenylsyre.
Reaktionsblandingen (40 mikroliter) indeholdt 140 mikrogram poly U, 14 5 C -phenylalanin (10 cpm, 300 mikrocurie/mikromol, E. coli ekstrakt (fremstillet iht. Nirenberg og Mathaei, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 47 10 1588 (1961)), 13 mM Mg acetat, 1 mM ATP, 1 mM creatinphosphat, 1 mikrogram creatinphosphokinase, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og forskellige mængder oligodeoxyadenylsyre. Reaktionsblandingerne anbragtes i 1,5 ml Eppendorf-rør og inkuberedes ved 37°C i 30 minutter. Mængden af syntetiseret polyphenylalanin måltes ved tælning af radioaktiviteten, der var 15 uopløselig i en varm (95°C) 10% trichloreddikesyre. Tælningen gennemførtes med en væskescinti1lationstæller. Den procentuelle inhibering beregnedes til sammenligning med værdien af polyphenylal aninsyntese i fravær af oligodeoxyadenylsyren. Resultaterne er vist i tabel VIII.
20 Tabel VIII
Inhibitor Dosering Inhibering af (mikrogram) polyphenylalanin- syntese (%) 25 _ kontrol - 0 polydeoxyadenylsyre 50 98 oligodeoxyadenylsyre 30 (10 nukleotider) 100 88 ol igodeoxyadenylsyre (9 nukleotider) 100 89 oligodeoxyadenylsyre (8 nukleotider) 100 15 35 oligodeoxyadenylsyre (7 nukleotider) 100 0 i DK 168061 B1 25
Som vist i tabel VIII, er polydeoxyadenylsyren, som hybridiserer med polyuridyl syre, en bemærkelsesværdigt stærk inhibitor af polyphenyl-alaninsyntese. Det kan ses af denne tabel, at oligodeoxyadenylsyre med en kædelængde på mere end 9 nukleotider har en stærk inhibitorisk virk-5 ning.
Eksempel 26 (Referenceeksempel 2)
Det nedenfor beskrevne forsøg demonstrerer, at oligodeoxynukleotirier kan inhibere eukaryotisk mRNA-aktivitet ved at danne et hybrid med 10 denne mRNA. Reaktionsblandingen (30 /il) indeholder 4,2 mM calciumphos-phat, 2 mM dimethyl thiothreitol (DTT), 0,08 mM af hver aminosyre (med undtagelse af methionin), 6 mM calciumacetat, 8 mM magnesiumacetat, 4,5 35 /tg spermidin, 0,1 /iCi S-methionin og 10 /ti af et kanin-reticulocyt-ekstrakt fremstillet iht. Jackson og Pelham (Europ. J. Biochem, 67, 247-15 256, 1976). Inhibitoren opløstes i 21 mM HEPES-opløsning og sattes til reaktionsblandingen som vist i tabel IX.
Tabel IX
20 Inhibitor Dosering % inhibering % inhibering (/tg) af α-globin- af /3-globin- syntese syntese
Kontrol - - 0 0
25 genom DNA
af a-globin 0,06 60 0
genom DNA
af Ø-globin 0,06 0 65 kalvetymus- 30 DNA 0,06 10 10 15 oligodeoxy-nukleotid af ot-globin genom DNA 0,06 88 0 35 15 oligodeoxy- nukleotid af M 13 0,06 5 2 DK 168061 B1 26
Som vist i tabel IX inhiberer (-)-strenget DNA af α-globin specifikt a-globin-syntesen, mens (-)-strenget DNA af /J-globin specifikt inhiberer Ø-globin-syntesen. Der iagttoges ingen inhibering af betydning med kalvetymus-DNA. Ud fra disse iagttagelser kan man konkludere, at DNA 5 af eukaryotisk gen (-streng) specifikt inhiberer syntesen af proteinet, som dette gen koder for. Oligodeoxynukleotidet med en kædelængde på 15, der svarer til den NHg-terminale aminosyresekvens af α-globin, inhibere-de syntesen af α-globin. Denne iagttagelse indikerer, at enkelt-strenget DNA (-streng) med en kædelængde på kun 15 er tilstrækkelig til den spe-10 cifikke inhibering af syntesen af dens respektive protein. Kontrol-oli-gonukleotidet (M 13 fag DNA med en kædelængde på 15 nukleotider) udviste ingen inhibitorisk virkning af betydning.
Det må forstås, at fagmanden kan variere de foregående repræsentative eksempler, både hvad angår virus-type og kodningsregionen, inden 15 for opfindelsens rammer, og i princippet opnå de samme resultater.
i
Claims (10)
1. Farmaceutisk præparat, KENDETEGNET ved, AT det i det væsentlige består af en effektiv anti-viral mængde af et oligo- eller polydeoxynu-kleotid, som har en sekvens, der er identisk med en del af DNA, som er 5 hybridiserbar med mRNA hos herpes-virus, hvilket oligo- eller polydeoxy-nukleotid kan hybridiseres med mRNA'en, samt en farmaceutisk acceptabel bærer.
2. Præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at virussen er en herpes-simplex-virus.
3. Præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at virussen er en herpes-simplex-virus-1.
4. Præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at oligodeoxynukleotid-et eller polydeoxynukleotidet er hybridiserbart med øjeblikkeligt, tidligt mRNA fra herpes-simplex-virus.
5. Præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at oligodeoxynukleotiri et eller polydeoxynukleotidet er hybridiserbart med et non-strukturelt gen hos herpes-virus.
6. Præparat ifølge krav 5, KENDETEGNET ved, at det non-strukturelle gen er ICP 4.
7. Præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at oligodeoxy- nukleotidet eller polydeoxynukleotidet har sekvensen 3'-CGC.AGC.CTC.TTG.TTC.GTC.GC-5'.
8. Præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at oligodeoxy-nukleotidet eller polydeoxynukleotidet har sekvensen 3'-
25 GCA.CCC.GGG.ACC.TTT.ACC.GC-5'.
9. Præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det foreligger i form af en injektionsopløsning, en lokal tilberedning eller en opløsning af øjendråber.
10. Præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det indeholder en 30 blanding af oligodeoxynukleotiderne eller polydeoxynukleotiderne. 35
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19235083 | 1983-10-17 | ||
| JP58192350A JPH0740934B2 (ja) | 1983-10-17 | 1983-10-17 | ウイルス増殖阻害方法 |
| JP4932184 | 1984-03-16 | ||
| JP59049321A JPS60193922A (ja) | 1984-03-16 | 1984-03-16 | 抗ウイルス剤 |
| MT957A MTP957B (en) | 1983-10-17 | 1984-12-12 | Method for inhibiting viral propagation and anti-viral agent |
| MTP957 | 1984-12-12 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK493584D0 DK493584D0 (da) | 1984-10-16 |
| DK493584A DK493584A (da) | 1985-04-18 |
| DK168061B1 true DK168061B1 (da) | 1994-01-31 |
Family
ID=39877713
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK493584A DK168061B1 (da) | 1983-10-17 | 1984-10-16 | Med mrna hybridiserbart anti-viralt middel |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4689320A (da) |
| AT (1) | AT392081B (da) |
| AU (1) | AU578625B2 (da) |
| BE (1) | BE900827A (da) |
| CH (1) | CH667593A5 (da) |
| DE (1) | DE3437852A1 (da) |
| DK (1) | DK168061B1 (da) |
| FR (1) | FR2553420B1 (da) |
| GB (1) | GB2148302B (da) |
| IE (1) | IE57987B1 (da) |
| IT (1) | IT1179144B (da) |
| LU (1) | LU85594A1 (da) |
| MT (1) | MTP957B (da) |
| NL (1) | NL8403163A (da) |
| NZ (1) | NZ209840A (da) |
| PH (1) | PH21629A (da) |
| SE (1) | SE466482B (da) |
| SG (1) | SG31088G (da) |
Families Citing this family (136)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5580716A (en) * | 1985-03-21 | 1996-12-03 | Stephen A. Johnston | Parasite-derived resistance |
| EP0215907B1 (en) * | 1985-03-21 | 2001-05-23 | Johnston, Stephen, Ph.D. | Parasite-derived resistance |
| ES2076143T3 (es) * | 1986-04-02 | 1995-11-01 | Pioneer Hi Bred Int | Plantas resistentes a virus que tienen arn antisentido. |
| US4806463A (en) * | 1986-05-23 | 1989-02-21 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides |
| US5637573A (en) * | 1986-05-23 | 1997-06-10 | Agrawal; Sudhir | Influenza virus replication inhibiting oligonucleotide analogues and their pharmaceutical compositions |
| US5194428A (en) * | 1986-05-23 | 1993-03-16 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates |
| US5834185A (en) * | 1986-10-28 | 1998-11-10 | Johns Hopkins University | Formation of triple helix complexes of single stranded nucleic acids using nucleoside oligomers which comprise pyrimidine analogs, triple helix complexes formed thereby and oligomers used in their formation |
| US4904582A (en) * | 1987-06-11 | 1990-02-27 | Synthetic Genetics | Novel amphiphilic nucleic acid conjugates |
| DE68929343T2 (de) * | 1988-02-16 | 2002-09-12 | Greatbatch Gen-Aid, Ltd. | Modifizierte Zellen mit Resistenz gegen Retroviralinfektionen |
| US5004810A (en) * | 1988-09-30 | 1991-04-02 | Schering Corporation | Antiviral oligomers |
| US5098890A (en) * | 1988-11-07 | 1992-03-24 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Antisence oligonucleotides to c-myb proto-oncogene and uses thereof |
| US6867195B1 (en) * | 1989-03-21 | 2005-03-15 | Vical Incorporated | Lipid-mediated polynucleotide administration to reduce likelihood of subject's becoming infected |
| US5703055A (en) * | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
| US5693622A (en) * | 1989-03-21 | 1997-12-02 | Vical Incorporated | Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal |
| US6673776B1 (en) | 1989-03-21 | 2004-01-06 | Vical Incorporated | Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate, mammal, fish, bird or human |
| ES2116269T3 (es) * | 1989-03-21 | 1998-07-16 | Vical Inc | Expresion de secuencias exogenas de polinucleotidos en un vertebrado. |
| US6214804B1 (en) | 1989-03-21 | 2001-04-10 | Vical Incorporated | Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence |
| WO1990015814A1 (en) * | 1989-06-20 | 1990-12-27 | Meiogenics, Inc. | Nuclease resistant, single-stranded, non-naturally occurring nucleic acid molecules |
| JPH05500217A (ja) * | 1989-09-01 | 1993-01-21 | テンプル ユニバーシティ ― オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション | ｃ―ａｂｌプロト―オンコ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド |
| ATE162219T1 (de) * | 1989-11-16 | 1998-01-15 | Univ Duke | Transformation von tierischen hautzellen mit hilfe von partikeln |
| US5177198A (en) * | 1989-11-30 | 1993-01-05 | University Of N.C. At Chapel Hill | Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates |
| US6005087A (en) | 1995-06-06 | 1999-12-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-modified oligonucleotides |
| US20040142899A1 (en) * | 1990-01-11 | 2004-07-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for enhanced biostability and altered biodistribution of oligonucleotides in mammals |
| US5872232A (en) * | 1990-01-11 | 1999-02-16 | Isis Pharmaceuticals Inc. | 2'-O-modified oligonucleotides |
| US5852182A (en) * | 1990-01-11 | 1998-12-22 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Thiol-derivatized oligonucleosides |
| US6753423B1 (en) | 1990-01-11 | 2004-06-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for enhanced biostability and altered biodistribution of oligonucleotides in mammals |
| US6339066B1 (en) | 1990-01-11 | 2002-01-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides which have phosphorothioate linkages of high chiral purity and which modulate βI, βII, γ, δ, Ε, ζ and η isoforms of human protein kinase C |
| AU651569B2 (en) * | 1990-01-11 | 1994-07-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for detecting and modulating RNA activity and gene expression |
| US5459255A (en) * | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
| US6114513A (en) * | 1990-01-11 | 2000-09-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Thiol-derivatized oligonucleotides |
| US7037646B1 (en) | 1990-01-11 | 2006-05-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides |
| US6399754B1 (en) | 1991-12-24 | 2002-06-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides |
| US6395492B1 (en) * | 1990-01-11 | 2002-05-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties |
| US5859221A (en) * | 1990-01-11 | 1999-01-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-modified oligonucleotides |
| US5248670A (en) * | 1990-02-26 | 1993-09-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides for inhibiting herpesviruses |
| US5514577A (en) * | 1990-02-26 | 1996-05-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide therapies for modulating the effects of herpes viruses |
| US20030186913A1 (en) * | 1990-03-21 | 2003-10-02 | Vical Incorporated | Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate |
| US6228844B1 (en) | 1991-11-12 | 2001-05-08 | Vical Incorporated | Stimulating vascular growth by administration of DNA sequences encoding VEGF |
| US6706694B1 (en) | 1990-03-21 | 2004-03-16 | Vical Incorporated | Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate |
| US5610050A (en) * | 1990-04-20 | 1997-03-11 | The General Hospital Corporation | Methods of preventing viral replication |
| US5639595A (en) * | 1990-05-01 | 1997-06-17 | Isis Phamaceuticals, Inc. | Identification of novel drugs and reagents |
| WO1991018088A1 (en) * | 1990-05-23 | 1991-11-28 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors |
| US5135917A (en) * | 1990-07-12 | 1992-08-04 | Nova Pharmaceutical Corporation | Interleukin receptor expression inhibiting antisense oligonucleotides |
| US6262241B1 (en) * | 1990-08-13 | 2001-07-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compound for detecting and modulating RNA activity and gene expression |
| JPH0813274B2 (ja) * | 1990-08-13 | 1996-02-14 | アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド | 遺伝子発現を検出及び変調する糖修飾されたオリゴヌクレオチド |
| KR970005274B1 (ko) * | 1990-08-14 | 1997-04-15 | 아이시스 파마슈티칼스, 인코포레이티드 | 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 a형 인플루엔자 바이러스, 안 아아보스트레인(ann arbor strain) h2n2의 억제 |
| WO1992003051A1 (en) * | 1990-08-15 | 1992-03-05 | Genta Incorporated | Inhibition of herpesviridae infection by antisense oligonucleotides |
| US5595978A (en) * | 1990-08-16 | 1997-01-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Composition and method for treatment of CMV retinites |
| JPH06501162A (ja) * | 1990-09-21 | 1994-02-10 | ユニバーシティ オブ メリーランド | ウイルス類の成長または複製を抑制するための組成物および方法 |
| WO1992004903A1 (en) * | 1990-09-21 | 1992-04-02 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce | Method of inhibiting viral production |
| US5942389A (en) * | 1990-10-19 | 1999-08-24 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Genes and genetic elements associated with sensitivity to cisplatin |
| WO1992013972A1 (en) * | 1991-02-11 | 1992-08-20 | Thomas Jefferson University | Genetically engineered bacteria to identify and produce medically important agents |
| US5965722A (en) * | 1991-05-21 | 1999-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides |
| WO1992021353A1 (en) * | 1991-05-31 | 1992-12-10 | Genta Incorporated | Compositions and delivery systems for transdermal administration of neutral oligomers |
| US7119184B2 (en) | 1991-08-12 | 2006-10-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry |
| US6369209B1 (en) | 1999-05-03 | 2002-04-09 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry |
| US6335434B1 (en) | 1998-06-16 | 2002-01-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc., | Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates |
| US8153602B1 (en) | 1991-11-19 | 2012-04-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Composition and methods for the pulmonary delivery of nucleic acids |
| CA2126451A1 (en) * | 1991-12-24 | 1993-07-08 | Brett P. Monia | Compositions and methods for modulating .beta.-amyloid |
| US6033909A (en) * | 1992-01-22 | 2000-03-07 | Hoechst Aktiengesellschaft | Oligonucleotide analogs, their preparation and use |
| US6537973B1 (en) | 1992-03-16 | 2003-03-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide inhibition of protein kinase C |
| US5643780A (en) * | 1992-04-03 | 1997-07-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for modulating RNA activity through modification of the 5' cap structure of RNA |
| US6521601B1 (en) * | 1992-04-14 | 2003-02-18 | Signal Pharmaceuticals, Inc. | Method and composition for inhibition of viral replication |
| US6806084B1 (en) * | 1992-06-04 | 2004-10-19 | The Regents Of The University Of California | Methods for compositions for in vivo gene delivery |
| TW244371B (da) * | 1992-07-23 | 1995-04-01 | Tri Clover Inc | |
| US6346614B1 (en) * | 1992-07-23 | 2002-02-12 | Hybridon, Inc. | Hybrid oligonucleotide phosphorothioates |
| CA2140542A1 (en) * | 1992-07-27 | 1994-02-03 | Abeysingle Padmapriya | Oligonucleotide alkylphosphonothioates |
| US5985558A (en) | 1997-04-14 | 1999-11-16 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense oligonucleotide compositions and methods for the inibition of c-Jun and c-Fos |
| CA2151585A1 (en) * | 1992-12-14 | 1994-06-23 | Start Technology Partnership | Administration of oligonucleotides antisense to dopamine receptor mrna for diagnosis and treatment of neurological pathologies |
| AU684748B2 (en) * | 1993-01-21 | 1998-01-08 | Hybridon, Inc. | Foldback triplex-forming oligonucleotides |
| US20040087521A1 (en) * | 1993-03-18 | 2004-05-06 | Merck & Co., Inc. | Nucleic acid pharmaceuticals-influenza matrix |
| US5739309A (en) * | 1993-07-19 | 1998-04-14 | Gen-Probe Incorporated | Enhancement of oligonucleotide inhibition of protein production, cell proliferation and / or multiplication of infectious disease pathogens |
| JPH09501562A (ja) * | 1993-07-19 | 1997-02-18 | ジェン−プローブ・インコーポレイテッド | ヒト・免疫不全ウイルスに対する活性を有するオリゴヌクレオチド |
| US6653458B1 (en) | 1993-09-03 | 2003-11-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modified oligonucleotides |
| AU679566B2 (en) | 1993-09-03 | 1997-07-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides |
| US5837852A (en) * | 1993-10-14 | 1998-11-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Capped nucleic acid oligomers that inhibit cap-dependent transcription of the influenza virus endonuclease |
| US6995008B1 (en) | 1994-03-07 | 2006-02-07 | Merck & Co., Inc. | Coordinate in vivo gene expression |
| IL112820A0 (en) * | 1994-03-07 | 1995-05-26 | Merck & Co Inc | Coordinate in vivo gene expression |
| JPH10503364A (ja) * | 1994-05-10 | 1998-03-31 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション | Ｃ型肝炎ウイルスのアンチセンス阻害 |
| US5733781A (en) | 1994-07-19 | 1998-03-31 | Gen-Probe Incorporated | Oligonucleotides and methods for inhibiting propagation of human immunodeficiency virus |
| EP0818202A4 (en) * | 1994-09-29 | 2000-05-10 | Npp Farmek | DNA-RNA HYBRID AND DNA PREPARATION, PROCESSES FOR OBTAINING THE SAME AND PREPARATION THEREOF FROM STURGEON MILK, AND PHARMACEUTICAL COMPOUND BASED ON THE DNA-RNA HYBRID |
| US5750674A (en) * | 1995-05-23 | 1998-05-12 | Hybridon, Inc. | Methods and compounds for the stereoselective enrichment of oligonucleotide diastereomers and oligonucleotides thereby produced |
| US6117993A (en) * | 1995-05-23 | 2000-09-12 | Hybridon, Inc. | Synthons for oligonucleotide synthesis |
| US5693773A (en) * | 1995-06-07 | 1997-12-02 | Hybridon Incorporated | Triplex-forming antisense oligonucleotides having abasic linkers targeting nucleic acids comprising mixed sequences of purines and pyrimidines |
| US5856099A (en) * | 1996-05-21 | 1999-01-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense compositions and methods for modulating type I interleukin-1 receptor expression |
| US9096636B2 (en) | 1996-06-06 | 2015-08-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation |
| US7812149B2 (en) | 1996-06-06 | 2010-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations |
| US5898031A (en) | 1996-06-06 | 1999-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides for cleaving RNA |
| US5885834A (en) * | 1996-09-30 | 1999-03-23 | Epstein; Paul M. | Antisense oligodeoxynucleotide against phosphodiesterase |
| US6001991A (en) * | 1996-10-04 | 1999-12-14 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of MDR P-glycoprotein gene expression |
| US6077833A (en) * | 1996-12-31 | 2000-06-20 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
| US7235653B2 (en) * | 1996-12-31 | 2007-06-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
| US20040023917A1 (en) * | 1996-12-31 | 2004-02-05 | Bennett C. Frank | Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
| US6319906B1 (en) | 1996-12-31 | 2001-11-20 | Isis Pharmaceuticals | Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
| DE69834038D1 (de) | 1997-07-01 | 2006-05-18 | Isis Pharmaceutical Inc | Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre |
| US6133246A (en) * | 1997-08-13 | 2000-10-17 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins |
| US6809193B2 (en) | 1997-08-13 | 2004-10-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins |
| US20070149472A1 (en) * | 1997-08-13 | 2007-06-28 | Mckay Robert | Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of jnk proteins |
| US5877309A (en) * | 1997-08-13 | 1999-03-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides against JNK |
| US6306831B1 (en) | 1997-09-12 | 2001-10-23 | Qik Technologies, Inc. | Transplacental delivery of oligonucleotides |
| US6232463B1 (en) | 1997-10-09 | 2001-05-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted purines and oligonucleotide cross-linking |
| AUPP249298A0 (en) | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
| WO1999049029A1 (en) * | 1998-03-20 | 1999-09-30 | Benitec Australia Ltd | Control of gene expression |
| JP2002515514A (ja) | 1998-05-21 | 2002-05-28 | アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド | オリゴヌクレオチドの局所送逹のための組成物及び方法 |
| EP1080103A4 (en) | 1998-05-21 | 2003-07-02 | Isis Pharmaceuticals Inc | PREPARATIONS AND METHOD FOR THE NON-PARENTERAL ADMINISTRATION OF OLIGONUCLEOTIDES |
| US6867294B1 (en) | 1998-07-14 | 2005-03-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages |
| US6277967B1 (en) | 1998-07-14 | 2001-08-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Carbohydrate or 2′-modified oligonucleotides having alternating internucleoside linkages |
| US6242589B1 (en) | 1998-07-14 | 2001-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages |
| US6015676A (en) * | 1998-07-31 | 2000-01-18 | Epiclone Inc. | Method for knocking out gene transcripts by covalently binding of an anti-sense probe |
| CZ296576B6 (cs) | 1999-02-12 | 2006-04-12 | Sankyo Company Limited | Nukleosidový analog a oligonukleotidový analog a farmaceutický prostredek, sonda a primer s jeho obsahem |
| US6656730B1 (en) | 1999-06-15 | 2003-12-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs |
| JP4151751B2 (ja) * | 1999-07-22 | 2008-09-17 | 第一三共株式会社 | 新規ビシクロヌクレオシド類縁体 |
| US6423885B1 (en) | 1999-08-13 | 2002-07-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) | Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells |
| US20010011126A1 (en) * | 1999-09-10 | 2001-08-02 | Bock Elisabeth Marianne | Neurogenic compositions and methods |
| AU2001276691A1 (en) * | 2000-08-03 | 2002-02-18 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Brushless motor and method of manufacturing the brushless motor |
| RU2172632C1 (ru) * | 2000-12-01 | 2001-08-27 | Каплина Элли Николаевна | Способ получения иммунотропного противовирусного препарата |
| RU2188659C1 (ru) * | 2001-04-20 | 2002-09-10 | ООО Научно-производственное фармацевтическое предприятие "Полидан" | Фармацевтическая композиция для терапии человека, обладающая иммунотропным действием |
| US20030096770A1 (en) * | 2001-07-11 | 2003-05-22 | Krotz Achim H. | Enhancement of the stability of oligonucleotides comprising phosphorothioate linkages by addition of water-soluble antioxidants |
| US20030191075A1 (en) * | 2002-02-22 | 2003-10-09 | Cook Phillip Dan | Method of using modified oligonucleotides for hepatic delivery |
| US7704965B2 (en) * | 2002-06-26 | 2010-04-27 | The Penn State Research Foundation | Methods and materials for treating human papillomavirus infections |
| US20040009483A1 (en) * | 2002-07-12 | 2004-01-15 | Ilsley Diane D. | Method of linear mRNA amplification using total RNA |
| AU2003273336A1 (en) * | 2002-09-18 | 2004-04-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Efficient reduction of target rna's by single- and double-stranded oligomeric compounds |
| US8604183B2 (en) | 2002-11-05 | 2013-12-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation |
| EP1589931A2 (en) * | 2003-02-05 | 2005-11-02 | University of Massachusetts | RNAi TARGETING OF VIRUSES |
| US8084432B2 (en) * | 2003-02-13 | 2011-12-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for treatment of pouchitis |
| US7960355B2 (en) * | 2003-05-23 | 2011-06-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
| US7897582B2 (en) * | 2003-05-23 | 2011-03-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein |
| US8569474B2 (en) | 2004-03-09 | 2013-10-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand |
| AU2005252663B2 (en) * | 2004-06-03 | 2011-07-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation |
| US8394947B2 (en) | 2004-06-03 | 2013-03-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Positionally modified siRNA constructs |
| US7884086B2 (en) | 2004-09-08 | 2011-02-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays |
| US8101585B2 (en) * | 2006-08-04 | 2012-01-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the modulation of JNK proteins |
| US20120128673A1 (en) | 2009-05-20 | 2012-05-24 | Schering Corporation | Modulation of pilr receptors to treat microbial infections |
| US8691227B2 (en) | 2009-12-17 | 2014-04-08 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Methods of treating multiple sclerosis, rheumatoid arthritis and inflammatory bowel disease using agonists antibodies to PILR-α |
| JP6794258B2 (ja) | 2013-09-30 | 2020-12-02 | ジェロン・コーポレーションＧｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | オリゴヌクレオチドについてのホスホロジアミデート骨格結合 |
| CN105532575A (zh) * | 2016-01-14 | 2016-05-04 | 中国科学院昆明动物研究所 | 一种单纯疱疹病毒感染树鼩动物模型的构建、评估方法及其应用 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1107929A (en) * | 1965-11-14 | 1968-03-27 | Yissum Res Dev Co | Organotin derivatives of natural and synthetic polymers |
| JPS5735516A (en) * | 1980-08-11 | 1982-02-26 | Yamasa Shoyu Co Ltd | Agent for increasing radiosensitivity or agent for increasing effect of substance having activity similar to radiation |
| JPS5767518A (en) * | 1980-09-17 | 1982-04-24 | Yamasa Shoyu Co Ltd | Radiosensitizing agent or agent for increasing effect of radiomimetic substance |
| US4511713A (en) * | 1980-11-12 | 1985-04-16 | The Johns Hopkins University | Process for selectively controlling unwanted expression or function of foreign nucleic acids in animal or mammalian cells |
| US4394443A (en) * | 1980-12-18 | 1983-07-19 | Yale University | Method for cloning genes |
| US4358586A (en) * | 1980-12-23 | 1982-11-09 | Harvey Rubin | Detection and isolation of endorphin mRNA using a synthetic oligodeoxynucleotide |
| DE3106982A1 (de) * | 1981-02-25 | 1982-09-09 | Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach | "neues tridecadeoxynukleotid, verfahren zu seiner herstellung und verwendung" |
| US4464359A (en) * | 1981-04-10 | 1984-08-07 | Research Corporation | (2'-5')-Oligo (3'-deoxyadenylate) and derivatives thereof |
| WO1983001451A1 (en) * | 1981-10-23 | 1983-04-28 | Molecular Biosystems Inc | Oligonucleotide therapeutic agent and methods of making same |
| US4393201A (en) * | 1981-11-04 | 1983-07-12 | The Wistar Institute | DNA Which codes for glycoprotein of era-strain rabies virus |
-
1984
- 1984-10-10 NZ NZ209840A patent/NZ209840A/xx unknown
- 1984-10-12 GB GB08425799A patent/GB2148302B/en not_active Expired
- 1984-10-15 LU LU85594A patent/LU85594A1/de unknown
- 1984-10-15 US US06/661,204 patent/US4689320A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-10-15 SE SE8405133A patent/SE466482B/sv not_active IP Right Cessation
- 1984-10-15 AU AU34239/84A patent/AU578625B2/en not_active Expired
- 1984-10-15 PH PH31340A patent/PH21629A/en unknown
- 1984-10-16 DK DK493584A patent/DK168061B1/da not_active IP Right Cessation
- 1984-10-16 NL NL8403163A patent/NL8403163A/nl active Search and Examination
- 1984-10-16 IT IT68021/84A patent/IT1179144B/it active
- 1984-10-16 AT AT0329284A patent/AT392081B/de not_active IP Right Cessation
- 1984-10-16 BE BE0/213837A patent/BE900827A/fr not_active IP Right Cessation
- 1984-10-16 DE DE19843437852 patent/DE3437852A1/de not_active Withdrawn
- 1984-10-17 FR FR8415930A patent/FR2553420B1/fr not_active Expired
- 1984-10-17 CH CH4975/84A patent/CH667593A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-10-17 IE IE2668/84A patent/IE57987B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-12-12 MT MT957A patent/MTP957B/xx unknown
-
1988
- 1988-05-19 SG SG310/88A patent/SG31088G/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CH667593A5 (de) | 1988-10-31 |
| FR2553420A1 (fr) | 1985-04-19 |
| AU578625B2 (en) | 1988-11-03 |
| IE842668L (en) | 1985-04-17 |
| ATA329284A (de) | 1990-07-15 |
| SE8405133L (sv) | 1985-04-18 |
| NL8403163A (nl) | 1985-05-17 |
| SE8405133D0 (sv) | 1984-10-15 |
| GB2148302B (en) | 1987-10-07 |
| US4689320A (en) | 1987-08-25 |
| DE3437852A1 (de) | 1985-05-23 |
| MTP957B (en) | 1985-05-27 |
| DK493584D0 (da) | 1984-10-16 |
| PH21629A (en) | 1987-12-11 |
| IE57987B1 (en) | 1993-06-02 |
| BE900827A (fr) | 1985-02-15 |
| AT392081B (de) | 1991-01-25 |
| GB2148302A (en) | 1985-05-30 |
| NZ209840A (en) | 1988-11-29 |
| LU85594A1 (de) | 1985-04-02 |
| FR2553420B1 (fr) | 1988-04-01 |
| SE466482B (sv) | 1992-02-24 |
| IT1179144B (it) | 1987-09-16 |
| IT8468021A0 (it) | 1984-10-16 |
| AU3423984A (en) | 1985-04-26 |
| DK493584A (da) | 1985-04-18 |
| GB8425799D0 (en) | 1984-11-21 |
| SG31088G (en) | 1988-09-30 |
| IT8468021A1 (it) | 1986-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK168061B1 (da) | Med mrna hybridiserbart anti-viralt middel | |
| US6372427B1 (en) | Cooperative oligonucleotides | |
| EP0664833B1 (en) | Therapeutic anti-hiv oligonucleotide and pharmaceutical | |
| KR970005274B1 (ko) | 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 a형 인플루엔자 바이러스, 안 아아보스트레인(ann arbor strain) h2n2의 억제 | |
| US6150339A (en) | Anti-viral guanosine-rich oligonucleotides | |
| SenGupta et al. | Activation of interferon-regulated, dsRNA-dependent enzymes by human immunodeficiency virus-1 leader RNA | |
| US20150361432A1 (en) | Modified small interfering rna molecules and methods of use | |
| EP0363059A1 (en) | Antiviral oligomers | |
| WO1994008004A9 (en) | Therapeutic anti-hiv oligonucleotide and pharmaceutical | |
| US8138161B2 (en) | Modified small interfering RNA molecules and methods of use | |
| Goulaouic et al. | Exogenous nucleosides promote the completion of MoMLV DNA synthesis in G0-arrested Balb c/3T3 fibroblasts | |
| US20150376621A1 (en) | Modified small interfering rna molecules and methods of use | |
| CA2211877A1 (en) | Human immunodeficiency virus transcription inhibitors and methods of their use | |
| IE913321A1 (en) | Compositions and methods for inhibiting growth or¹replication of microbes, viruses and self-replicating¹nucleic acids | |
| KR20230034164A (ko) | 수두-대상포진 바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
| WO1997038097A1 (en) | Cooperative oligonucleotides | |
| WO1997033992A1 (en) | Selected oligonucleotides with anti-cytomegalovirus activity | |
| JP3328682B2 (ja) | ヘルペスウィルスの増殖阻害方法 | |
| KR100231318B1 (ko) | 종양괴사인자 알파 수용체의 c-말단 부분을 갖는 레트로바이러스 벡터 및 이를 이용한 hiv-1 증식 억제 방법 | |
| JPH0456804B2 (da) | ||
| JP2003527419A (ja) | 抗ｈｉｖ活性を有する化合物 | |
| US20030099959A1 (en) | Cooperative oligonucleotides | |
| US20030216334A1 (en) | Methods for inhibiting/treating hiv infections and aids related symptoms | |
| EP1248631A1 (en) | Methods for inhibiting/treating hiv infections and aids related symptoms |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |