PL228341B1 - Sposób uzyskiwania białka poliepitopowego oraz wektor DNA do realizacji tego sposobu - Google Patents

Sposób uzyskiwania białka poliepitopowego oraz wektor DNA do realizacji tego sposobu

Info

Publication number
PL228341B1
PL228341B1 PL407950A PL40795014A PL228341B1 PL 228341 B1 PL228341 B1 PL 228341B1 PL 407950 A PL407950 A PL 407950A PL 40795014 A PL40795014 A PL 40795014A PL 228341 B1 PL228341 B1 PL 228341B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
dna
sequence
vector
epitope
protein
Prior art date
Application number
PL407950A
Other languages
English (en)
Other versions
PL407950A1 (pl
Inventor
Piotr Skowron
Agnieszka Żylicz-Stachula
Agnieszka Zylicz-Stachula
Olga Żołnierkiewicz
Olga Zołnierkiewicz
Małgorzata Skowron
Łukasz Janus
Joanna Jeżewska-Frąckowiak
Joanna Jezewska-Frackowiak
Aneta Szymańska
Aneta Szymanska
Original Assignee
Bio Ventures Inst Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Ventures Inst Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia filed Critical Bio Ventures Inst Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority to PL407950A priority Critical patent/PL228341B1/pl
Priority to ES15738474T priority patent/ES2842216T3/es
Priority to SI201531495T priority patent/SI3134426T1/sl
Priority to RS20210076A priority patent/RS61384B1/sr
Priority to US15/305,453 priority patent/US10874735B2/en
Priority to CN201580028495.1A priority patent/CN106488983A/zh
Priority to PT157384744T priority patent/PT3134426T/pt
Priority to JP2017507091A priority patent/JP6692796B2/ja
Priority to DK15738474.4T priority patent/DK3134426T3/da
Priority to PCT/IB2015/052915 priority patent/WO2015162560A1/en
Priority to EP15738474.4A priority patent/EP3134426B1/en
Priority to LTEP15738474.4T priority patent/LT3134426T/lt
Priority to PL15738474T priority patent/PL3134426T3/pl
Priority to SM20210045T priority patent/SMT202100045T1/it
Publication of PL407950A1 publication Critical patent/PL407950A1/pl
Priority to IL248011A priority patent/IL248011B/en
Publication of PL228341B1 publication Critical patent/PL228341B1/pl
Priority to US17/132,103 priority patent/US20210187102A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A61K2039/645—Dendrimers; Multiple antigen peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób uzyskiwania białka poliepitopowego oraz wektor DNA do realizacji tego sposobu. Uzyskiwane zgodnie z wynalazkiem białka mogą znaleźć szereg zastosowań, w szczególności być wykorzystane do wytwarzania ulepszonych szczepionek.
Shen, S-H P.N.A.Sci USA 81:4627-4631 (1984) ujawnia sposób uzyskiwania multimerycznej proinsuliny (do 7 kopii). Multimery uzyskano za pomocą sekwencyjnego łączenia odcinków DNA przy zastosowaniu syntetycznych fragmentów DNA, ciętych endonukleazą restrykcyjną klasy IIS - SfaNI, alkalicznej fosfatazy, kinazy polinukleotydowej i ligazy DNA. Metoda nie pozwalała jednak na łatwe uzyskanie wielokrotnego powielania odcinka DNA w jednej reakcji, ponieważ każdorazowo mogła być dodana tylko jedna, dodatkowa kopia monomeru.
Lennick i in. Gene 61:103-112 (1987) ujawnia multimeryczny gen kodujący 8 kopii hormonu peptydowego - przedsionkowego peptydu natriuretycznego. W opisanej metodzie nie stosowano wektora umożliwiającego powielanie kopii sekwencji kodującej peptyd, a otrzymany in-vitro gen multimeryczny został sklonowany ostatecznie do ogólnie stosowanego wektora ekspresyjnego. Metoda również nie pozwala na łatwe uzyskanie wielokrotnego powielania odcinka DNA w jednej reakcji, ponieważ każdorazowo mogła być dodana tylko jedna, dodatkowa kopia monomeru.
Kim, S. C. and Szybalski, W., Gene 71:1-8 (1988) ujawnia sposób kierunkowego powielania klonowanego fragmentu DNA za pomocą endonukleazy restrykcyjnej klasy IIS - BspMI, wektora DNA pSK3 oraz ligazy DNA. Uzyskano 30 kopii monomeru w konkatamerze. Jednak stosowanie enzymu BspMI jest w praktyce utrudnione, ponieważ nie trawi on w pełni substratu DNA. W efekcie uniemożliwia to zachowanie ciągłości Otwartej Ramy Odczytu translacji (ORF), a powielanie wprowadza dodatkowe sekwencje DNA do powielonego konkatameru. Opisany sposób nie pozwala na powtórzenie cyklu powielania co istotnie ogranicza możliwość osiągnięcia pożądanej ilości kopii powielonego segmentu DNA. Ujawniony wektor nie był wektorem ekspresyjnym.
Lee, J. H. i in., Genetic Analysis: Biomolecular Engineering 13:139-145 (1996) ujawnia sposób kierunkowego powielania klonowanego fragmentu DNA za pomocą endonukleazy restrykcyjnej klasy IIS - BspMI i Bbsl, wektora DNA pBBS1 oraz ligazy DNA. Metoda, oparta na autoligacji 4-nukleotydowych (nt) kohezyjnych końców DNA uniemożliwia zachowanie ciągłości ORF, stanowi jednak istotne usprawnienie opisanej wcześniej metody, gdyż pozwalała na powtórzenie cyklu powielania, celem osiągnięcia pożądanej ilości kopii powielonego segmentu DNA. Zastosowany wektor nie był wektorem ekspresyjnym. Metodę zastosowano dla powielenia krótkiego genu peptydu przeciwbakteryjnego - mogaininy (108 kopii).
Lee, J. H. i in., Protein Expression and punfication 12:53-60 (1998) ujawnia kolejny wariant sposobu opierającego się na wcześniej opisanym wektorze pBBS1. Zastosowany wektor nie był wektorem ekspresyjnym. Zastosowano enzym Bbsl do generowania 4-nt kohezyjnych końców, poważnie utrudniając tym samym utrzymanie ciągłości ORF. Opisano uzyskanie nie więcej niż 6 kopii mon omeru DNA w powielonym odcinku. Metodę zastosowano dla powielenia genu peptydu przeciwbakteryjnego - mogaininy oraz buforyny II.
Wang, Y.-Q and Cai, J.Y. Appl Biochem Biotechnol. 141:203-13 (2007) ujawnia kolejny wariant zastosowania multimeryzacji genów kodujących antybiotyki peptydowe przy zastosowaniu autoligacji syntetycznych fragmentów DNA, zawierających asymetryczne kohezyjne końce w obecności 2 adapterów DNA. Adaptery zawierały sekwencje rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjnych Sall i EcoRI. Procedura nie wykorzystuje wektora, powielanie jest trudne do kontroli, pracochłonne i wymaga dodawania podczas reakcji kolejnych porcji syntetycznego monomeru DNA. W wyniku ujawnionej metody składania polimerycznego genu, opracowanej do celów produkcji peptydów przeciwbakteryjnych, uzyskano 8 kopii monomeru w polimerycznym białku.
Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu pozwalającego na łatwe uzyskiwanie białka poliepitopowego o dowolnej długości oraz wektora nadającego się do realizacji takiego sposobu. Uzyskiwane białka poliepitopowe mogą znaleźć szereg zastosowań, w szczególności nadają się do wytwarzania ulepszonych szczepionek o podwyższonej skuteczności.
Przedmiotem wynalazku jest wektor DNA zawierający sekwencję modułu powielającego obejmującą dwie konwergentnie skierowane sekwencje DNA rozpoznawane przez endonukleazę Sapl i znajdującą się pomiędzy nimi sekwencję DNA zawierającą miejsce służące do wklonowania insertu rozpoznawane przez endonukleazę Smal, przy czym korzystnie moduł powielający posiada sekwencję
PL 228 341 B1
GCTCTTCACCCGGGCCCAGAAGAGC (Sekw. Id. Nr 11). Korzystnie wektor DNA według wynalazku jest wektorem ekspresji białek, który zawiera dodatkowo origin replikacji, korzystnie p15A, gen oporności na antybiotyk, korzystnie chloramfenikol, promotor transkrypcji, korzystnie PR bakteriofaga lambda, gen represora, korzystnie cl 857 ts, sygnał inicjacji translacji, ewentualnie sekwencję kodującą 6-ciu reszt histydyny, oraz sekwencję kodującą sygnał stopu translacji. Korzystnie wektor DNA według wynalazku zawiera sekwencję wybraną spośród sekwencji 1-6 przedstawionych również na Fig. 2. Korzystnie wektor DNA według wynalazku posiada sekwencję 7 (pAMPI -HisA).
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób uzyskiwania białka poliepitopowego charakteryzujący się tym, że:
a) posiadającą tępe końce sekwencję DNA kodującą epitop wklonowuje się do wektora DNA określonego w zastrz. 1-4 w miejscu rozpoznawanym przez endonukleazę Smal,
b) uzyskany wektor namnaża się w gospodarzu bakteryjnym, izoluje się i trawi się endonukleazą restrykcyjną pod-Typu IIS - Sapl, a następnie izoluje się fragment zawierający sekwencję DNA kodującą epitop, zmodyfikowaną w taki sposób, że opatrzona jest ona jednoniciowymi kohezyjnymi końcami, warunkującymi kierunkową ligację insertu do konkatameru,
c) prowadzi się autoligację wyizolowanego fragmentu,
d) produkt autoligacji wklonowuje się do wektora DNA określonego w zastrz. 1-4 w miejscu rozpoznawanym przez endonukleazę restrykcyjną pod-Typu IIS - Sapl i
e) uzyskanym wektorem transformuje się gospodarza bakteryjnego i prowadzi się ekspresję, a następnie izolację białka poliepitopowego, przy czym w celu zwiększenia wielkości białka poliepitopowego, przed przystąpieniem do realizacji etapu e) powtarza się etapy od b) do d).
Poniższe przykłady zawierają szczegółowy opis jednego z możliwych wariantów realizacji sposobu według wynalazku. Alternatywną metodą wklonowania insertu jest zastosowanie wektora przeciętego Sapl z wypełnionymi kohezyjnymi końcami polimerazą DNA w obecności trójfosforanów deoksyrybonukleotydów. Postępując zgodnie z przedmiotowym wynalazkiem specjalista jest w stanie zaproponować kolejne warianty jego realizacji. Korzystnie, epitopem jest epitop HBV, zwłaszcza kodowany przez syntetyczną sekwencję 9 (patrz również Fig. 3). Korzystnie, powielany odcinek monomeru może zawierać różne epitopy, pochodzące z różnych białek lub różnych rejonów tego samego białka, korzystnie kodowane przez syntetyczną sekwencję (porównaj schemat przedstawiony na Fig. 1).
Ujawniono sposób konstrukcji oraz zastosowanie nie istniejących w naturze sztucznych genów za pomocą technologii inżynierii genetycznej oraz syntezy chemicznej, zawierających wielokrotne kopie DNA kodującego powtarzające się segmenty, zawierające powielone jednostki monomeryczne jednego lub więcej peptydów. Poddanie procedurze powielania genu, kodującego peptyd (epitop) o określonej funkcji biologicznej lub chemicznej prowadzi do zwielokrotnienia pożądanego oddziaływania otrzymanego (poli)peptydu ze specyficznym ligandem. W szczególności tak otrzymane poliepitopowe białka znajdą zastosowanie m.in. jako: (i) sztuczne antygeny - szczepionki nowej generacji o zwielokrotnionym potencjale stymulacji układu immunologicznego; (ii) poliproteiny zawierające moduły chelatujące jony metali rzadkich, celem ich pozyskiwania przemysłowego lub remediacji środowiska naturalnego; (iii) moduły wiążące kofaktory enzymów (m.in. kationy, aniony, molekuły organiczne) m.in. proteinaz działających w obrębie ran, celem zahamowania ich działania destrukcyjnego; (iv) multiepitopowe białka osłonowe, zawierające zwielokrotnione moduły peptydowe będące aktywatorami lub inhibitorami funkcji biologicznych celem leczenia chorób molekularnych, wirusowych i bakteryjnych; (v) multiepitopowe białka, zawierających multimery hormonów peptydowych lub biologicznie czynne fragmenty białek sygnałowych i stymulujących procesy regeneracji tkanek. Białka takie, umieszczone w ranie, stopniowo uwalniałyby pod wpływem proteinaz biologicznie czynne peptydy, stymulujące regenerację tkanek. W szczególności, zaprojektowano układ wektorowo-enzymatyczny, służący do powielania segmentu DNA. Powielany segment DNA może być pochodzenia naturalnego lub uzyskany na drodze syntezy chemicznej.
P r z y k ł a d 1. Ogólny schemat realizacji sposobu według wynalazku.
Ogólny schemat sposobu według wynalazku omówiony na przykładzie powielania antygenu powierzchniowego wirusa HBV ilustruje Fig. 1. Przedstawia ona schemat ideowy wektora powielającego oraz reakcji powielania epitopu (na rysunku: syntetycznego epitopu HBV).
Wektor powielający zawiera 2 konwergentnie skierowane sekwencje DNA rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną pod-Typu IIS, preferencyjnie rozpoznającą względnie długą sekwencję w DNA oraz przecinającą DNA generując 3-nt (lub wielokrotność 3 nt) kohezyjne końce. Zastosowano
PL 228 341 B1 endonukleazę Sapl, której cechą szczególną jest to, że rozpoznaje ona relatywnie długą sekwencję 7-miu par zasad (zatem unikatową w wektorze i powielanym segmencie DNA) oraz przecina DNA w odległości 1 nt w łańcuchu górnym oraz 4 nt w łańcuchu dolnym, tym samym generując 3-nt kohezyjne końce, czyli odpowiednik jednego kodonu. Miejsca Sapl sąsiadują w wektorze z sekwencją klasycznej endonukleazy Typu II, przeznaczonej do wklonowania powielanego insertu DNA. Zastosowano endonukleazę Smal, przecinającą DNA w obrębie sekwencji rozpoznawanej, generując tzw. „tępe” końce. Do wektora przeciętego Smal można wklonować dowolny segment DNA syntetycznego lub naturalnego, mający ulec powieleniu. W korzystnej realizacji powielany segment DNA koduje antygen lub sekwencję aminokwasową obejmującą kilka identycznych lub różnych antygenów. Jedynym ograniczeniem jest długość fragmentu powielanego, podyktowana maksymalną długością insertu DNA akceptowanego przez daną klasę wektorów DNA. Moduł powielający może być przeniesiony drogą klonowania do różnych klas wektorów.
P r z y k ł a d 2. Seria 6-ciu zaprojektowanych wektorów pAMP1.
W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 2 zaprojektowano 1-szą serię wektorów pAMP, opartych na szkielecie wektora, zawierającego origin replikacji p15A. Spośród zaprojektowanych wektorów skonstruowano wektor pAMP1-A (nie zawierający fuzyjnego znacznika His6) oraz pAMP1-HisA (zawierający fuzyjny znacznik His6). Dodatkowo, w serię wektorów pAMP wbudowano opcję wysokiej ekspresji białek pod kontrolą promotora bakteriofaga lambda PR oraz opcję fuzji ze znacznikiem His6, pozwalającym na izolowanie poliepitopowego białka wydajną metodą chromatografii metalopowinowactwa.
Wektory zawierają origin replikacji p15A, gen oporności na antybiotyk chloramfenikol, silny promotor transkrypcji PR bakteriofaga lambda, gen represora cl 857 ts, sygnały inicjacji translacji, sekwencje 6-ciu reszt histydyny o powinowactwie do jonów niklu, układ miejsc restrykcyjnych do fuzji z kodonem startu translacji ATG oraz moduły do kierunkowego powielania fragmentu DNA z zachowaniem ramy odczytu ORF. Warianty różnią się między sobą możliwościami manipulacji trzema ramami odczytu (co może być istotne przy powielaniu naturalnych, niesyntetycznych odcinków DNA) oraz obecnością lub brakiem znacznika His6, znakomicie ułatwiającego późniejszą izolację eksprymowanego poliepitopowego białka, niezależnie od jego ładunku, rozpuszczalności i innych parametrów biochemicznych. Wariant nr 4 został zastosowany do opisanego w poniższym przykładzie powielania epitopu antygenu powierzchniowego wirusa HBV.
Pełna sekwencja wektora pAMP1-HisA zastosowanego w przykładzie 3 została przedstawiona jako sekwencja 7. Ponadto, na Fig. 8 przedstawiono mapę restrykcyjną wektora pAMP1-HisA, a na Fig. 9 mapę restrykcyjną wektora pAMP1-HisA z wklonowanym 13-merem peptydu antygenowego.
P r z y k ł a d 3. Wytwarzanie poliepitopowego białka zawierającego modelowy 7-mio aminokwasowy epitop antygenu powierzchniowego wirusa HBV.
Modelowy 7-mio aminokwasowy epitop antygenu powierzchniowego wirusa HBV poddany reakcji powielania został przedstawiony na Fig. 3.
Syntetyczny odcinek DNA, kodujący epitop antygenu powierzchniowego wirusa HBV poddano pilotowemu doświadczeniu powielania w wektorze pAMP1-HisA. Uzyskano >60 kopii epitopu w konkatamerze DNA in vitro oraz 13 kopii w hybrydowym białku poliepitopowym, klonowanym in vivo.
Na Fig. 4 zostały przedstawione wyniki reakcji powielania in vitro 7-mio aminokwasowego epitopu modelowego białka otoczki wirusa HBV przy pomocy wektora pAMP1-HisA, endonukleazy Sapl oraz ligazy DNA.
Analizowano produkty reakcji powielania przy użyciu elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Do plazmidu powielającego pAMP1 -HisA wklonowano syntetyczny odcinek DNA długości 21 par zasad, kodujący 7-mio aminokwasowy epitop wirusa HBV. Plazmid zawierający monomer epitopu HBV strawiono endonukleazą Sapl, wycinając zmodyfikowany gen epitop z konstruktu plazmidowego. Modyfikacja polegała na dodaniu do niego 3-nt jednoniciowe kohezyjne 5'-końce. Poza funkcją powielania, końce te w polimerycznym hybrydowym białku odpowiedzialne są za dodanie reszty aminokwasu proliny (ang. „helical breaker”), oddzielające monomery epitopów i ułatwiające niezależne zwijanie epitopów do struktur 3-cio rzędowych, tym samym zachowując ich naturalną strukturę przestrzenną. Ilość dodanych „helical breaker można dowolnie regulować, poprzez inkorporowanie kodujących je aminokwasów do końca syntetycznego epitopu (na poziomie kodującego DNA). Wycięte zmodyfikowane DNA kodujące epitopy poddano autoligacji in vitro. Ścieżki od 5 do 160 min ukazują kinetykę autoligacji. Produkty reakcji analizowano elektroforetycznie, uzyskując w stosunku do kontrolnej reakcji bez ligazy DNA (K) szereg odcinków DNA o wzrastającej długości, stanowiące kierunkowe konkaPL 228 341 B1 tamery (polimery) genu epitopu. Tak uzyskane in vitro konkatamery zostały ponownie wklonowane do wektora pAMP1-HisA, gdzie można je poddać kolejnemu cyklowi powielania lub ekspresji kodowanego multimerycznego białka.
Na Fig. 5 przedstawione zostały wyniki analizy klonów hybrydowych genów kodujących białka poliepitopowe HBV, uzyskane w wyniku pierwszej rundy powielania.
Mieszaninę spolimeryzowanych in vitro syntetycznych genów epitopu HBV (Fig. 4, ścieżka MIX) za pomocą układu: wektor powielający pAMP1-HisA/endonukleaza Sapl/ligaza DNA klonowano ponownie do wektora powielającego pAMP1-HisA, celem utrwalenia wariantów poli-genów epitopu HBV, ekspresji kodowanych białek poliepitopowych oraz powtórzenia cyklu powielania. W pierwszej rundzie reakcji powielania uzyskano szereg klonów, zawierających od 2 do 13 kopii epitopu (ścieżki 1-13, analiza PCR, fragmenty DNA migrują coraz wolniej podczas elektroforezy ze względu na wzrastającą długość, bezpośrednio odzwierciedlającą ilość połączonych kopii epitopu). Analiza sekwencyjna DNA wykazała ciągłość otwartej ramy odczytu (ORF) w uzyskanych konstruktach, zatem każdy taki sztuczny poli-gen koduje inne białko poliepitopowe HBV, co jest istotne z punktu widzenia docelowej roli tych sztucznych białek, gdyż różne ich warianty, będą wywoływały różne natężenie odpowiedzi immunologicznej oraz będą różniły się rozpuszczalnością. Po ponownym wycięciu Sapl, każdy z wariantów konkatamerycznych genów może być w całości poddany kolejnej reakcji powielania, prowadząc do uzyskania kolejnych poli-genów, składającego się z setek kopii genu epitopu HBV (przedzielonych resztami proliny), w obrębie hybrydowego konstruktu, zachowującego ciągłość ORF w układzie nad- ekspresyjnym bakterii Escherichia coli. Tym samym każda kolejna runda powielania zwiększa ilość kopii monomeru w konkatamerze w postępie geometrycznym, prowadząc w krótkim czasie do uzyskania planowanej ilości kopii w docelowym konstrukcie plazmidowym.
Na Fig. 6 zostały przedstawione wyniki drugiej rundy powielania pięciomerowego konkatameru epitopu HBV.
Odcinek DNA wycięto endonukleazą Sapl z konstruktu pAMP1-HisA, zawierającego wklonowany konkatamer 5-ciu kopii epitopu, uzyskanego w wyniku 1-szej rundy powielania i poddano ponownej reakcji amplifikacji. Największy widoczny na granicy rozdzielczości żelu agarozowego konkatamer zawierał 12 kopii 5-cio meru, stanowiąc zatem 60-cio krotnie kierunkowo spolimeryzowany epitop HBV. Ewidentnie widoczne są jednak większe konkatamery, jakkolwiek nierozdzielone do dyskretnych prążków. Uzyskane produkty drugiej rundy powielania zostały wklonowane ponownie do wektora pAMP-HisA i mogą być poddane trzeciej rundzie powielania, prowadząc docelowo do uzyskania setek lub tysięcy kopii epitopu HBV, ułożonych w obrębie jednego długiego rekombinantowego polipeptydu (białka), z zachowaniem ciągłości ORF.
Na Fig. 7 została przedstawiona analiza rezultatów ekspresji hybrydowego genu kodującego białko poliepitopowe HBV, uzyskanej w wyniku modelowej, pierwszej rundy powielania (13-mer) w wektorze pAMP1-HisA (Sekw. Id. Nr 7, Fig. 8). Wykonana została analiza elekt roforetyczna eksprymowanego 13-meru poliepitopu HBV w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących, barwionego Coomassie Blue. Nietypowe, czerwone zabarwienie prążka 13-meru, którego zawartość zwiększa się w miarę trwania czasu indukcji ekspresji w hodowli bakterii (kolejne ścieżki), wynika prawdopodobnie z uporządkowanego ułożenia barwnika na powtarzających się segmentach sekwencji aminokwasowej. Eksperymentowi ekspresji (syntezy białka in vivo) poddano klon zawierający wariant 13-kopijnego konkatamerycznego genu, uzyskanego w wyniku powielania 7-aminokwasowego epitopu wirusa HBV, gdzie każdy epitop jest oddzielony resztą aminokwasu proliny (plazmid ekspresyjny patrz: Sekw. Id. Nr 8, Fig. 9). Technologia pozwala na zachowanie ciągłości ramy odczytu OR F. Ekspresję prowadzono w układzie bakterii Escherichia coli/ promotor PR bakteriofaga lambda uzyskując nadprodukcję sztucznego białka poliepitopowego HBV. Uzyskane białko stanowi prototypową szczepionkę przeciw HBV.
PL 228 341 Β1
Wykaz sekwencji
<110> BioVentures Institute Sp. z o.o.
<120> Sposób uzyskiwania białka poliepitopowego oraz wektor DNA do
realizacji tego sposobu
<130> PK/2483/RW
<160> 11
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> arti ficial
<220>
<223> pAMPl-A: moduł powielający
<400> 1
atgcgctctt cacccgggcc cagaagagct aagtaagtaa g
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> arti ficial
<220>
<223> pAMPl-B: moduł powielający
<400> 2
atggctcttc acccgggccc agaagagcta agtaagtaag
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> pAMPl-C: moduł powielający
<400> 3
atgccgctct tcacccgggc ccagaagagc taagtaagta ag
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> pAMPl-HisA: moduł powielający <400> 4 atgcaccacc accaccacca cagctcttca cccgggccca gaagagctaa gtaagtaag <210> 5 <211> 58 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> pAMPl-HisB: moduł powielający <400> 5 atgcaccacc accaccacca cgctcttcac ccgggcccag aagagctaag taagtaag <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> pAMPl-HisC: moduł powielający <400> 6 atgcaccacc accaccacca cccgctcttc acccgggccc agaagagcta agtaagtaag <210> 7 <211> 3003 <212> DNA <213> artificial <220>
PL 228 341 Β1 <223> wektor pAMPl-HisA <400> 7 catgcaccac caccaccacc acagctcttc acccgggccc agaagagcta agtaagtaag 60 agctcgaccc ggtcgaattt gctttcgaat ttctgccatt catccgctta ttatcactta 120 ttcaggcgta gcaccaggcg tttaagggca ccaataactg ccttaaaaaa attacgcccc 180 gccctgccac tcatcgcagt actgttgtaa ttcattaagc attctgccga catggaagcc 240 atcacagacg gcatgatgaa cctgaatcgc cagcggcatc agcaccttgt cgccttgcgt 300 ataatatttg cccatggtga aaacgggggc gaagaagttg tccatattgg ccacgtttaa 360 atcaaaactg gtgaaactca cccagggatt ggctgagacg aaaaacatat tctcaataaa 420 ccctttaggg aaataggcca ggttttcacc gtaacacgcc acatcttgcg aatatatgtg 480 tagaaactgc cggaaatcgt cgtggtattc actccagagc gatgaaaacg tttcagtttg 540 ctcatggaaa acggtgtaac aagggtgaac actatcccat atcaccagct caccgtcttt 600 cattgccata cggaattccg gatgagcatt oatcaggcgg gcaagaatgt gaataaaggc 660 cggataaaac ttgtgcttat ttttctttac ggtctttaaa aaggccgtaa tatccagctg 720 aacggtctgg ttataggtac attgagcaac tgactgaaat gcctcaaaat gttctttacg 780 atgccattgg gatatatcaa cggtggtata tccagtgatt tttttctcca ttttagcttc 840 cttagctcct gaaaatctcg ataactcaaa aaatacgccc ggtagtgatc ttatttcatt 900 atggtgaaag ttggaacctc ttacgtgccg atcaacgtct cattttcgcc aaaagttggc 960 ccagggcttc ccggtatcaa cagggacacc aggatttatt tattctgcga agtgatcttc 1020 cgtcacaggt atttattcgg cgcaaagtgc gtcgggtgat gctgecaact tactgattta 1080 gtgtatgatg gtgtttttga ggtgctccag tggcttctgt ttctatcagc tgtccctcct 1140 gttcagctac tgacggggtg gtgcgtaacg gcaaaagcac cgccggacat cagcgctagc 1200 ggagtgtata ctggcttact atgttggcac tgatgagggt gtcagtgaag tgcttcatgt 1260 ggcaggagaa aaaaggctgc accggtgcgt cagcagaata tgtgatacag gatatattcc 1320 gcttcctcgc tcactgactc gctacgctcg gtcgttcgac tgcggcgagc ggaaatggct 1380 tacgaacggg gcggagattt cctggaagat gccaggaaga tacttaacag ggaagtgaga 1440 gggccgcggc aaagccgttt ttccataggc tccgcccccc tgacaagcat cacgaaatct 1500 gacgctcaaa tcagtggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 1560 ctggcggctc cctcgtgcgc tctcctgttc ctgcctttcg gtttaccggt gtcattccgc 1620 tgttatggcc gcgtttgtct cattccacgc ctgacactca gttccgggta ggcagttcgc 1680 tccaagctgg actgtatgca cgaacccccc gttcagtccg accgctgcgc cttatccggt 1740 aactatcgtc ttgagtccaa cccggaaaga catgcaaaag caccactggc agcagccact 1800 ggtaattgat ttagaggagt tagtcttgaa gtcatgcgcc ggttaaggct aaactgaaag 1860 gacaagtttt ggtgactgcg ctcctccaag ccagttacct cggttcaaag agttggtagc 1920 tcagagaacc ttcgaaaaac cgccctgcaa ggcggttttt tcgttttcag agcaagagat 1980 tacgcgcaga ccaaaacgat ctcaagaaga tcatcttatt aatcagataa aatatttcta 2040 gatttcagtg caatttatct cttcaaatgt agcacctgaa gtcagcccca tacgatataa 2100 gttgtaattc tcatgtttga cagcatgcca tcgatcgcga tcttgctcaa ttgttatcag 2160 ctatgcgccg accagaacac cttgccgatc agccaaacgt ctcttcaggc cactgactag 2220 cgataacttt ccccacaacg gaacaactct cattgcatgg gatcattggg tactgtgggt 2280 ttagtggttg taaaaacacc tgaccgctat ccctgatcag tttcttgaag gtaaactcat 2340 cacccccaag tctggctatg cagaaatcac ctggctcaac agcctgctca gggtcaacga 2400 gaattaacat tccgtcagga aagcttggct tggagcctgt tggtgcggtc atggaattac 2460 cttcaacctc aagccagaat gcagaatcac tggctttttt ggttgtgctt acccatctct 2520 ccgcatcacc tttggtaaag gttctaagct caggtgagaa catccctgcc tgaacatgag 2580 aaaaaacagg gtactcatac tcacttctaa gtgaeggctg cataetaacc gcttcataca 2640 tctcgtagat ttctctggcg attgaagggc taaattcttc aacgctaact ttgagaattt 2700 ttgcaagcaa tgcggcgtta taagcattta atgcattgat gccattaaat aaagcaccaa 2760 cgcctgactg ccccatcccc atcttgtctg cgacagattc ctgggataag ccaagttcat 2820 ttttcttttt ttcataaatt gctttaaggc gacgtgcgtc ctcaagctgc tcttgtgtta 2880 atggtttctt ttttgtgctc atacgttaaa tctatcaccg caagggataa atatctaaca 2940 ccgtgcgtgt tgactatttt acctctggcg gtgataatgg ttgcatgtac taaggaggtt 3000 gtt 3003 <210> 8 <211> 3348 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> wektor pAMPl-HisA-13-epitop <400> 8 catgcaccac caccaccacc acagctcttc acccaccaaa ccgaccgacg gtaacgggcc 60
PL 228 341 Β1 caccaaaccg accgacggta acgggcccac caaaccgacc gacggtaacg ggcccaccaa 120 accgaccgac ggtaacgggc ccaccaaacc gaccgacggt aacgggccca ccaaaccgac 180 cgacggtaac gggcccacca aaccgaccga cggtaacggg cccaccaaac cgaccgacgg 240 taacgggccc accaaaccga ccgacggtaa cgggcccacc aaaccgaccg acggtaacgg 300 gcccaccaaa ccgaccgacg gtaacgggcc caccaaaccg accgacggta acgggcccac 360 caaaccgacc gacggtaacg ggcccagaag agctaagtaa gtaagagctc gacccggtcg 420 aatttgcttt cgaatttctg ccattcatcc gcttattatc acttattcag gcgtagcacc 480 aggcgtttaa gggcaccaat aactgcctta aaaaaattac gccccgccct gccactcatc 540 gcagtactgt tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac agacggcatg 600 atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat 660 ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa 720 actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt tagggaaata 780 ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa 840 atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt 900 gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa 960 ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg 1020 cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata 1080 ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat 1140 atcaacggtg gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa 1200 tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga 1260 acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt 1320 atcaacaggg acaccaggat ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca caggtattta 1380 ttcggcgcaa agtgcgtcgg gtgatgctgc caacttactg atttagtgta tgatggtgtt 1440 tttgaggtgc tccagtggct tctgtttcta tcagctgtcc ctcctgttca gctactgacg 1500 gggtggtgcg taacggcaaa agcaccgccg gacatcagcg ctagcggagt gtatactggc 1560 ttactatgtt ggcactgatg agggtgtcag tgaagtgctt catgtggcag gagaaaaaag 1620 gctgcaccgg tgcgtcagca gaatatgtga tacaggatat attccgcttc ctcgctcact 1680 gactcgctac gctcggtcgt tcgactgcgg cgagcggaaa tggcttacga acggggcgga 1740 gatttcctgg aagatgccag gaagatactt aacagggaag tgagagggcc gcggcaaagc 1800 cgtttttcca taggctccgc ccccctgaca agcatcacga aatctgacgc tcaaatcagt 1860 ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctggc ggctccctcg 1920 tgcgctctcc tgttcctgcc tttcggttta ccggtgtcat tccgctgtta tggccgcgtt 1980 tgtctcattc cacgcctgac actcagttcc gggtaggcag ttcgctccaa gctggactgt 2040 atgcacgaac cccccgttca gtccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 2100 tccaacccgg aaagacatgc aaaagcacca ctggcagcag ccactggtaa ttgatttaga 2160 ggagttagtc ttgaagtcat gcgccggtta aggctaaact gaaaggacaa gttttggtga 2220 ctgcgctcct ccaagccagt tacctcggtt caaagagttg gtagctcaga gaaccttcga 2280 aaaaccgccc tgcaaggcgg ttttttcgtt ttcagagcaa gagattacgc gcagaccaaa 2340 acgatctcaa gaagatcatc ttattaatca gataaaatat ttctagattt cagtgcaatt 2400 tatctcttca aatgtagcac ctgaagtcag ccccatacga tataagttgt aattctcatg 2460 tttgacagca tgccatcgat cgcgatcttg ctcaattgtt atcagctatg cgccgaccag 2520 aacaccttgc cgatcagcca aacgtctctt caggccactg actagcgata actttcccca 2580 caacggaaca actctcattg catgggatca ttgggtactg tgggtttagt ggttgtaaaa 2640 acacctgacc gctatccctg atcagtttct tgaaggtaaa ctcatcaccc ccaagtctgg 2700 ctatgcagaa atcacctggc tcaacagcct gctcagggtc aacgagaatt aacattccgt 2760 caggaaagct tggcttggag cctgttggtg cggtcatgga attaccttca acctcaagcc 2820 agaatgcaga atcactggct tttttggttg tgcttaccca tctctccgca tcacctttgg 2880 taaaggttct aagctcaggt gagaacatcc ctgcctgaac atgagaaaaa acagggtact 2940 catactcact tctaagtgac ggctgcatac taaccgcttc atacatctcg tagatttctc 3000 tggcgattga agggctaaat tcttcaacgc taactttgag aatttttgca agcaatgcgg 3060 cgttataagc atttaatgca ttgatgccat taaataaagc accaacgcct gactgcccca 3120 tccccatctt gtctgcgaca gattcctggg ataagccaag ttcatttttc tttttttcat 3180 aaattgcttt aaggcgacgt gcgtcctcaa gctgctcttg tgttaatggt ttcttttttg 3240 tgctcatacg ttaaatctat caccgcaagg gataaatatc taacaccgtg cgtgttgact 3300 attttacctc tggcggtgat aatggttgca tgtactaagg aggttgtt 3348 <210 9 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220 <223> sekwecja kodująca epitop HBV
PL 228 341 Β1 <220>
<221> CDS <222> (1) . .(21) <400> 9 acc aaa ccg acc gac ggt aac Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> Synthetic Construct <400> 10
Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn 1 5 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> moduł powielający <400> 11 gctcttcacc cgggcccaga agagc

Claims (7)

1. Wektor DNA zawierający sekwencję modułu powielającego obejmującą dwie konwergentnie skierowane sekwencje DNA rozpoznawane przez Sapl i znajdującą się pomiędzy nimi sekwencję DNA zawierającą miejsce służące do wklonowania insertu rozpoznawane przez Smal, przy czym korzystnie moduł powielający posiada sekwencję GCTCTTCACCCGGGCCCAGAAGAGC.
2. Wektor DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że jest on wektorem ekspresji białek, zawiera dodatkowo origin replikacji, korzystnie p15A, gen oporności na antybiotyk, korzystnie chloramfenikol, promotor transkrypcji, korzystnie PR bakteriofaga lambda, gen represora, korzystnie cl 857 ts, sygnał inicjacji translacji, ewentualnie sekwencję kodującą 6-ciu reszt histydyny, oraz sekwencję kodującą sygnał stopu translacji.
3. Wektor DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję wybraną spośród sekwencji 1-6.
4. Wektor DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada sekwencję 7.
5. Sposób uzyskiwania białka poliepitopowego, znamienny tym, że:
a) posiadającą tępe końce sekwencję DNA kodującą epitop wklonowuje się do wektora DNA określonego w zastrz. 1-4 w miejscu rozpoznawanym przez Smal,
b) uzyskany wektor namnaża się w gospodarzu bakteryjnym, izoluje się i trawi się Sapl, a następnie izoluje się fragment zawierający sekwencję DNA kodującą epitop, zmodyfikowaną w taki sposób, że opatrzona jest ona jednoniciowymi kohezyjnymi końcami, warunkującymi kierunkową ligację insertu do konkatameru,
c) prowadzi się autoligację wyizolowanego fragmentu,
d) produkt autoligacji wklonowuje się do wektora DNA określonego w zastrz. 1-4 w miejscu rozpoznawanym przez Sapl i
e) uzyskanym wektorem transformuje się gospodarza bakteryjnego i prowadzi się ekspresję, a następnie izolację białka poliepitopowego, przy czym w celu zwiększenia wielkości białka poliepitopowego, przed przystąpieniem do realizacji etapu e) powtarza się etapy od b) do d).
PL 228 341 Β1
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że epitopem jest epitop HBV, korzystnie kodowany przez syntetyczną sekwencję 9.
7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że powielany odcinek monomeru zawiera różne epitopy, pochodzące z różnych białek lub różnych rejonów tego samego białka, korzystnie kodowane przez sekwencję syntetyczną.
PL407950A 2014-04-21 2014-04-21 Sposób uzyskiwania białka poliepitopowego oraz wektor DNA do realizacji tego sposobu PL228341B1 (pl)

Priority Applications (16)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL407950A PL228341B1 (pl) 2014-04-21 2014-04-21 Sposób uzyskiwania białka poliepitopowego oraz wektor DNA do realizacji tego sposobu
JP2017507091A JP6692796B2 (ja) 2014-04-21 2015-04-21 ポリエピトープタンパク質を得る方法とこの方法を具体化するためのｄｎａベクター
EP15738474.4A EP3134426B1 (en) 2014-04-21 2015-04-21 A method of obtaining a polyepitopic protein as well as a dna vector for embodying this method
RS20210076A RS61384B1 (sr) 2014-04-21 2015-04-21 Postupak dobijanja proteina sa više epitopa kao i vektora dnk za izvođenje ovog postupka
US15/305,453 US10874735B2 (en) 2014-04-21 2015-04-21 Method of obtaining a polyepitopic protein and polyepitopic DNA vector
CN201580028495.1A CN106488983A (zh) 2014-04-21 2015-04-21 获得多表位蛋白的方法以及用于体现该方法的dna载体
PT157384744T PT3134426T (pt) 2014-04-21 2015-04-21 Um método para obter uma proteína poliepitópica, assim como um vetor de adn para incorporar este método
ES15738474T ES2842216T3 (es) 2014-04-21 2015-04-21 Procedimiento para obtener una proteína poliepitópica, así como un vector de ADN para realizar este procedimiento
DK15738474.4T DK3134426T3 (da) 2014-04-21 2015-04-21 Fremgangsmåde til at opnå et polyepitopisk protein samt en DNA-vektor til at udføre denne fremgangsmåde
PCT/IB2015/052915 WO2015162560A1 (en) 2014-04-21 2015-04-21 A method of obtaining a polyepitopic protein as well as a dna vector for embodying this method
SI201531495T SI3134426T1 (sl) 2014-04-21 2015-04-21 Postopek za pridobivanje poliepitopnega proteina in DNA vektor za ta postopek
LTEP15738474.4T LT3134426T (lt) 2014-04-21 2015-04-21 Poliepitopinio baltymo gavimo būdas, o taip pat dnr vektorius, skirtas šio metodo įgyvendinimui
PL15738474T PL3134426T3 (pl) 2014-04-21 2015-04-21 Sposób uzyskiwania białka poliepitopowego oraz wektor DNA do realizacji tego sposobu
SM20210045T SMT202100045T1 (it) 2014-04-21 2015-04-21 Metodo per ottenere una proteina poliepitopica nonche' un vettore di dna per l'attuazione di questo metodo
IL248011A IL248011B (en) 2014-04-21 2016-09-25 A method for producing a polyepitope protein as well as a DNA vector embodying this method
US17/132,103 US20210187102A1 (en) 2014-04-21 2020-12-23 Method of obtaining a polyepitopic protein and polyepitopic dna vector

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL407950A PL228341B1 (pl) 2014-04-21 2014-04-21 Sposób uzyskiwania białka poliepitopowego oraz wektor DNA do realizacji tego sposobu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL407950A1 PL407950A1 (pl) 2015-10-26
PL228341B1 true PL228341B1 (pl) 2018-03-30

Family

ID=53610926

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL407950A PL228341B1 (pl) 2014-04-21 2014-04-21 Sposób uzyskiwania białka poliepitopowego oraz wektor DNA do realizacji tego sposobu
PL15738474T PL3134426T3 (pl) 2014-04-21 2015-04-21 Sposób uzyskiwania białka poliepitopowego oraz wektor DNA do realizacji tego sposobu

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL15738474T PL3134426T3 (pl) 2014-04-21 2015-04-21 Sposób uzyskiwania białka poliepitopowego oraz wektor DNA do realizacji tego sposobu

Country Status (14)

Country Link
US (2) US10874735B2 (pl)
EP (1) EP3134426B1 (pl)
JP (1) JP6692796B2 (pl)
CN (1) CN106488983A (pl)
DK (1) DK3134426T3 (pl)
ES (1) ES2842216T3 (pl)
IL (1) IL248011B (pl)
LT (1) LT3134426T (pl)
PL (2) PL228341B1 (pl)
PT (1) PT3134426T (pl)
RS (1) RS61384B1 (pl)
SI (1) SI3134426T1 (pl)
SM (1) SMT202100045T1 (pl)
WO (1) WO2015162560A1 (pl)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3549947A1 (en) 2018-04-04 2019-10-09 Uniwersytet Gdanski Polyrgd peptides obtained by chemical and biotechnology methods with injury reducing and/or neuroprotective effects and a kit for their activity evaluation

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0916733A1 (de) * 1997-11-17 1999-05-19 Roche Diagnostics GmbH Verfahren und Kit zur Klonierung von Fragmenten
US20030074695A1 (en) * 1998-06-24 2003-04-17 Farese Robert V. Plant diacylglycerol O-acyltransferase and uses thereof
FR2950350B1 (fr) * 2009-09-24 2013-12-13 Centre Nat Rech Scient Nouveaux polynucleotides et polypeptides chimeriques permettant la secretion d'un polypeptide d'interet en association avec des exosomes et leurs utilisations
AU2011254564B2 (en) * 2010-05-21 2014-03-27 Xl-Protein Gmbh Biosynthetic proline/alanine random coil polypeptides and their uses

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3549947A1 (en) 2018-04-04 2019-10-09 Uniwersytet Gdanski Polyrgd peptides obtained by chemical and biotechnology methods with injury reducing and/or neuroprotective effects and a kit for their activity evaluation

Also Published As

Publication number Publication date
SI3134426T1 (sl) 2021-03-31
IL248011B (en) 2021-06-30
US20210187102A1 (en) 2021-06-24
RS61384B1 (sr) 2021-02-26
JP6692796B2 (ja) 2020-05-13
PT3134426T (pt) 2021-01-29
JP2017513527A (ja) 2017-06-01
PL3134426T3 (pl) 2021-06-14
EP3134426A1 (en) 2017-03-01
US20170095553A1 (en) 2017-04-06
IL248011A0 (en) 2016-11-30
ES2842216T3 (es) 2021-07-13
WO2015162560A1 (en) 2015-10-29
PL407950A1 (pl) 2015-10-26
EP3134426B1 (en) 2020-10-28
LT3134426T (lt) 2021-02-10
CN106488983A (zh) 2017-03-08
DK3134426T3 (da) 2021-01-25
US10874735B2 (en) 2020-12-29
SMT202100045T1 (it) 2021-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7104994B2 (ja) アデノウイルスおよび対応するプラスミドの作製方法
US5766882A (en) recombinant poxviruses with foreign DNA in essential regions
CA2785992C (en) Plasmids and methods for peptide display and affinity-selection on virus-like particles of rna bacteriophages
WO2017180770A1 (en) Recombinant arterivirus replicon systems and uses thereof
JP2007516696A5 (pl)
CN115427071A (zh) 包含ltb和病原性抗原的组合物及其用途
RU2019112725A (ru) Композиции и способы для повышения стабильности трансгенов в поксвирусах
CA3107672A1 (en) Multimerizing polypeptides derived from jelly roll fold domain of adenovirus penton base
CN112725329B (zh) 一种功能元件的建库方法及其应用
JP2011135897A (ja) 遺伝子送達のための改変ノダウイルスｒｎａ
PL228341B1 (pl) Sposób uzyskiwania białka poliepitopowego oraz wektor DNA do realizacji tego sposobu
CN101437547A (zh) 用于遗传免疫的载体和方法
JPS5951793A (ja) 新規クロ−ニングビヒクル
CN115209909A (zh) 递送组合物和方法
Skowron et al. An efficient method for the construction of artificial, concatemeric DNA, RNA and proteins with genetically programmed functions, using a novel, vector-enzymatic DNA fragment amplification-expression technology
CN104975043A (zh) 构建重组mva病毒的带有标记基因自删除系统的穿梭载体
HK1235428A1 (en) A method of obtaining a polyepitopic protein as well as a dna vector for embodying this method
US20160207964A1 (en) Designing a soluble full-length hiv-1 gp41 trimer
EP3087187A1 (en) A method of making adenovirus and corresponding plasmids
JPS6034184A (ja) 形質発現用ベクタ−