PL230136B1 - Sposób wytwarzania polilaktydowych rusztowań gąbczastych do hodowli komórek nabłonka walcowatego - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób wytwarzania polilaktydowych rusztowań gąbczastych do hodowli komórek nabłonka walcowatego, zgodnie z którym w reaktorze szklanym umieszcza się roztwór polilaktydu w dioksanie, dichlorometanie lub chloroformie o stężeniu 1,5 - 6% wag., roztwór miesza się przez 20 - 28 h z szybkością 550 - 700 obr/min., w temperaturze 20 - 30°C, do całkowitego rozpuszczenia polimeru, następnie do roztworu dodaje się nierozpuszczalnik polilaktydu, którym jest woda w takiej ilości, aby stężenie nierozpuszczalnika wynosiło od 0 - 5% wag. w stosunku do masy polimeru, po czym, po uzyskaniu jednorodnego roztworu polimeru, roztwór zamraża się przez 20 - 28 h w temperaturze -10 do -20°C i uzyskane zamrożone rusztowanie poddaje się żelowaniu w wodzie z metanolem i/albo etanolem w stosunku objętościowym wody do alkoholu 0,01 - 0,1, przy czym objętość kąpieli żelującej jest minimum 30 razy większa niż objętość roztworu polimeru w rozpuszczalniku, zaś etap żelowania prowadzi się w temperaturze od -10°C do -20°C przez 30 - 48 h, a następnie otrzymane rusztowanie oczyszcza się w wodzie w ciągu 0,5 - 1,5 h, po czym suszy się z pozostałości wody i rozpuszczalników przez 60 - 80 h pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze poniżej 50°C.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania gąbczastych polilaktydowych rusztowań (skafoldów) do hodowli nabłonka walcowatego.

Pochodząca z języka angielskiego nazwa skafold oznacza przestrzenne rusztowanie umożliwiające wzrost komórek. Polimery używane jako skafoldy powinny być biokompatybilne i biodegradowalne. Wykorzystanie polimerów biodegradowalnych do wytwarzania skafoldów pozwala na łatwe usunięcie wyhodowanych tkanek z matrycy polimerowej poprzez jej degradację w łagodnych warunkach, bez uszkadzania żywych komórek. Z tych powodów do wytwarzania skafoldów bardzo często wykorzystuje się polilaktyd i jego kopolimery. Bardzo ważna jest także porowatość ogólna polimeru i wielkość porów. Przyjmuje się, że wielkość i układ porów powinny zapewniać właściwą migrację komórek tkanki oraz transport substancji w obrębie rusztowania. Właściwości morfologiczne skafoldów w znacznym stopniu zależą od metody ich otrzymywania.

Do wykonania skafoldów wykorzystuje się zazwyczaj poli-L-laktyd (bez dodatku centrów D), poli-DL-laktyd oraz kopolimery poli(laktyd-co-glikolid) lub poli(laktyd-co-kaprolakton).

Porowate skafoldy otrzymywane są metodą inwersji faz, występującą w dwóch wariantach - metoda sucha (inwersja faz z odparowaniem rozpuszczalnika) i metoda mokra (żelowanie nierozpuszczalnikiem).

W metodzie suchej skafold formuje się z trójskładnikowego układu o stężeniu od 10-40% wag., w skład którego wchodzi polimer membranotwórczy, jego rozpuszczalnik i nierozpuszczalnik. Układ ten otrzymywany jest w wyniku rozpuszczenia polimeru w jego rozpuszczalniku w podwyższonej temperaturze (40-65°C). Rozpuszczanie trwa około 1-6 h. Następnie w tej samej temperaturze dodawany jest nierozpuszczalnik polimeru. Po wymieszaniu roztwór jest wylewany na szklane podłoże i następuje odparowanie rozpuszczalników w temperaturze otoczenia (Mikos A. Temenoff J. Formation of highly porous biodegradable scaffolds for tissue engineering; Electron J Biotechnol; 2000; 3-23).

W metodzie mokrej w pierwszym etapie jest tworzony roztwór polimeru w jego rozpuszczalniku w sposób taki sam, jak w metodzie suchej. Następnie dodawany jest nierozpuszczalnik analogicznie jak w metodzie suchej. Jednorodny roztwór wylewany jest na szklane podłoże, a następnie zanurzany do kąpieli żelującej składającej się z nierozpuszczalnika lub mieszaniny kilku nierozpuszczalników polimeru. Po upływie około 24 godzin skafold jest suszony na powietrzu w temperaturze pokojowej (Ma P. X., Scaffolds for tissuefabrication; Materials Today; 2004; 30).

Znane procesy najczęściej prowadzi się w podwyższonej temperaturze, w celu poprawy rozpuszczalności stosowanych polimerów. Najbardziej powszechnie stosowanymi rozpuszczalnikami są dimetylosulfotlenek, dimetyloforamid, dioksan lub tetrahydrofuran, zdecydowanie rzadziej korzysta się z chloroformu. Powszechnie stosowane rozpuszczalniki są trudne w regeneracji i kosztowne. Do suszenia skafoldów używa się suszarek próżniowych.

Z publikacji Ming-Hua Ho i in., „Preparation of porous scaffolds by using freeze-extraction and freeze-gelation methods”, Biomaterials 25 (2004), 129-138 znany jest sposób wytwarzania polilaktydowych rusztowań gąbczastych metoda polegająca na połączeniu ekstrakcji rozpuszczalnika polilaktydu z jego nie rozpuszczalnikiem w temperaturze -20°C i żelowania zamrożonego rusztowania w wodzie z etanolem. Otrzymane tą metodą rusztowania mają pory o wielkości od 60 do 150 μm i są odpowiednie do hodowli osteoblastów.

Wymienione wyżej metody prowadzą do uzyskania skafoldów silnie porowatych w całej objętości, o małych, kulistych porach. Rusztowania takie są wykorzystywane najczęściej do hodowli chondrocytów lub osteocytów albo komórek nabłonka płaskiego. Znane skafoldy, ze względu na rozmiar i kształt porów, nie nadają się jednak do hodowli komórek o podłużnym lub cylindrycznym kształcie, jakimi są komórki nabłonka walcowatego. Wyhodowanie komórek nabłonka walcowatego jest szczególnie istotne dla badań oddziaływania leków lub innych nowo syntezowanych substancji na układ pokarmowy człowieka. Obecnie takie badania wymagają stosowania testów na zwierzętach, które są niezwykle kosztowne, pracochłonne oraz wymuszają zabicie wielu zwierząt.

Ponadto w obecnie stosowanych metodach badania toksyczności, efektu drażniącego oraz przenikania substancji aktywnych biologicznie przez przewód pokarmowy bardzo dużą rolę odgrywa tzw. czynnik osobniczy - każde zwierzę jest inne i inaczej reaguje na podaną substancję. Czynnik ten może prowadzić do błędnych wniosków z eksperymentu. Z tego względu istotna jest możliwość prowadzenia badań w powtarzalnych warunkach laboratoryjnych, z wykorzystaniem hodowli komórek nabłonka walcowatego, z zastosowaniem modelu, który będzie pozbawiony czynnika osobniczego.

PL 230 136 B1

Aby otrzymać prawidłowo zróżnicowane komórki nabłonka walcowatego niezbędne jest dostarczenie odpowiednich czynników wzrostu tych komórek. Czynniki wzrostu, takie jak np. aminokwasy są dobrze rozpuszczalne w wodzie, więc w trakcie namnażania komórek w środowisku wodnym mogłyby zostać dostarczone do wnętrza silnie porowatego skafoldu. Jednak znane skafoldy mają lite ścianki wewnętrzne, co zdecydowanie ogranicza transport czynników wzrostu do wnętrza skafoldu. W konsekwencji komórki znajdujące się w środku skafoldu są nieodżywione i nie mogą namnażać się w prawidłowy sposób. Istotne jest również stałe odprowadzanie produktów przemiany materii powstających w trakcie namnażania komórek, ponieważ ich nagromadzenie może spowodować zatrzymanie wzrostu komórek lub ich całkowitą degradację.

Wyżej zdefiniowane problemy zostały rozwiązane dzięki otrzymaniu polilaktydowego skafoldu o wewnętrznej gąbczastej strukturze i bardzo regularnym rozmieszczeniu porów o dużej średnicy i cylindrycznym kształcie.

Sposób wytwarzania polilaktydowych rusztowań gąbczastych do hodowli komórek nabłonka walcowatego według wynalazku charakteryzuje się tym, że roztwór polilaktydu w dioksanie, dichlorometanie lub chloroformie o stężeniu 1,5-6% wag. umieszcza się w reaktorze szklanym i roztwór miesza się przez 20-28 h, z szybkością 550-700 obr/min., w temperaturze 20-30°C, do całkowitego rozpuszczenia polimeru. Następnie do roztworu ewentualnie dodaje się nierozpuszczalnik polilaktydu, którym jest woda w takiej ilości, aby stężenie nierozpuszczalnika wynosiło od 0-5% wag. w stosunku do masy polimeru, po czym, po uzyskaniu jednorodnego roztworu polimeru, roztwór zamraża się przez 20-28 h w temperaturze od -10 do -20°C. Uzyskane zamrożone rusztowanie poddaje się żelowaniu w wodzie z metanolem i/albo etanolem w stosunku objętościowym wody do alkoholu 0,01-0,1, przy czym objętość kąpieli żelującej powinna być minimum 30 razy większa niż objętość roztworu polimeru w rozpuszczalniku. Etap żelowania prowadzi się w temperaturze od -10 do -20°C przez 30-48 h. Otrzymane rusztowanie oczyszcza się w wodzie w ciągu 0,5-1,5 h, a następnie suszy się z pozostałości wody i rozpuszczalników przez 60-80 h, pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze poniżej 50°C.

Korzystnie proces prowadzi się w reaktorze o kształcie kulistym. Korzystnie element mieszający mieszadła ma kształt baryłkowaty. Korzystnie objętość mieszadła stanowi od 40-50% objętości roztworu polimeru.

Korzystnie stosuje się polilaktyd o ciężarze cząsteczkowym 53 500-86 000 g/mol, o zawartości centrów D od 0,01-0,5% wag.

W celu zabezpieczenia przed spontaniczną degradacją otrzymane rusztowanie przetrzymuje się po wysuszeniu w bezwodnym etanolu.

Proces według wynalazku prowadzi się w stanie zamrożenia roztworu polimeru, również kąpiel żelująca jest w niskiej temperaturze, a do wytworzenia porów używa się nieszkodliwą dla komórek wodę. Sposób według wynalazku prowadzi do otrzymania rusztowania polilaktydowego o wewnętrznej gąbczastej strukturze i regularnym rozmieszczeniu porów o dużej średnicy - powyżej 40 um. Pory mają kształt cylindryczny o znacznej długości - powyżej 200 um - oraz mają perforowane ścianki wewnętrzne. Cylindryczny kształt jest szczególnie istotny przy namnażaniu komórek nabłonka walcowatego, a perforowane wnętrze skafoldu pozwala na łatwiejsze wprowadzenie regulatorów wzrostu i składników odżywczych do wnętrza skafoldu i jednocześnie ułatwia usuwanie powstających w trakcie hodowli komórek produktów przemiany materii na zewnątrz rusztowania. Ponadto średnica porów w otrzymanym rusztowaniu (powyżej 10 um) pozytywnie wpływa na kształt i właściwości biologiczne otrzymanych komórek. Komórki nie ulegają zdeformowaniu oraz utrzymują właściwości zbliżone do komórek występujących w organizmach żywych.

Hodowla komórek nabłonka walcowatego namnożonych na rusztowaniu według wynalazku pozwala na prowadzenie badań nowych substancji aktywnych z wyższą powtarzalnością, skraca ich czas, obniża koszty oraz zmniejsza liczbę zwierząt wykorzystywanych w badaniach. W dalszej przyszłości może posłużyć również do wyhodowania fragmentów jelita (w którym występują komórki nabłonka walcowatego), które następnie mogą być przeszczepione ludziom po resekcji fragmentu jelit.

Sposób według wynalazku został przedstawiony w przykładzie.

P r z y k ł a d.

W reaktorze szklanym kulistym o pojemności 50 mL rozpuszczano 0,4 g PLA (o Mn 86 000 g/mol) w 12 mL dioksanu przez 24 h, w 25°C. Następnie roztwór PLA/dioksan podgrzewano w łaźni wodnej do temperatury 25°C, ciągle mieszając przy użyciu mieszadła magnetycznego (szybkość mieszania 600 min^-1). Do mieszania stosowano umieszczony w kolbie element mieszający o baryłkowatym kształ4

PL 230 136 B1 cie, którego objętość stanowiła 45% objętości roztworu polimeru. Po ustabilizowaniu się warunków dodawano 1 mL wody demineralizowanej, podgrzewano roztwór do 30°C ciągle mieszając. Po rozpuszczeniu częściowo wytrąconego PLA dodawano 0,4 mL wody demineralizowanej. Po ponownym rozpuszczeniu częściowo wytrąconego PLA i dokładnym wymieszaniu się składników mieszaniny zawartość kolby wylewano na odtłuszczoną bezwodnym etanolem szalkę Petriego o średnicy 60 mm, która miała temperaturę -18°C. Szalkę z roztworem polimeru zamrażano przez 24 h w temperaturze -18°C. Następnie zamrożony roztwór żelowano w mieszaninie woda:metanol w stosunku objętościowym 0,08. Objętość kąpieli żelującej była 38 razy większa niż objętość roztworu polimeru. Żelowanie prowadzono w temperaturze -18°C przez 48 h. Następnie oczyszczano skafold poprzez kąpiel w wodzie demineralizowanej w ciągu 1 h. Skafold suszono pod próżnią w temperaturze 40°C przez 60 h. Następnie umieszczono go w opakowaniu i zalano 2 ml bezwodnego etanolu. Otrzymano skafold gąbczasty o średnicy porów 40-70 μm (Fig. 1) i długości 200-300 μm (Fig. 2) posiadający porowate ścianki wewnętrzne (Fig. 3).

Claims (5)

1. Sposób wytwarzania polilaktydowych rusztowań gąbczastych do hodowli komórek nabłonka walcowatego, w którym polilaktyd umieszcza się w reaktorze szklanym w rozpuszczalniku, którym jest dioksan, dichlorometan lub chloroform, o stężeniu polilaktydu 1,5-6% wag., i miesza się do całkowitego rozpuszczenia polimeru, następnie do roztworu dodaje się nierozpuszczalnik polilaktydu i po uzyskaniu jednorodnego roztworu polimeru roztwór zamraża się w temperaturze -10 do -20°C i uzyskane zamrożone rusztowanie poddaje się żelowaniu w wodzie z metanolem i/albo etanolem w stosunku objętościowym wody do alkoholu 0,010,1, w temperaturze od -10°C do -20°C, znamienny tym, że roztwór polilaktydu w rozpuszczalniku miesza się przez 20-28 h z szybkością 550-700 obr/min., w temperaturze 20-30°C, jako nierozpuszczalnik stosuje się wodę w takiej ilości, aby jej stężenie nie było wyższe niż 5% wag. w stosunku do masy polimeru, a po uzyskaniu jednorodnego roztworu polimeru zamrażanie roztworu prowadzi się przez 20-28 h, w etapie żelowania objętość kąpieli żelującej jest minimum 30 razy większa niż objętość roztworu polimeru w rozpuszczalniku, a etap żelowania prowadzi się przez 30-48 h, a następnie otrzymane rusztowanie oczyszcza się w wodzie w ciągu 0,5-1,5 h, po czym suszy się z pozostałości wody i rozpuszczalników przez 60-80 h w pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze poniżej 50°C.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się w reaktorze o kształcie kulistym.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że element mieszający mieszadła ma kształt baryłkowaty.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że objętość mieszadła stanowi 40-50% objętości roztworu polimeru.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polilaktyd o ciężarze cząsteczkowym 53 500-86 000 g/mol, o zawartości centrów D od 0,01-0,5% wag.