PL230548B1 - Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL3, jego metabolit oraz zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 i jego metabolitu - Google Patents

Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL3, jego metabolit oraz zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 i jego metabolitu

Info

Publication number
PL230548B1
PL230548B1 PL410757A PL41075714A PL230548B1 PL 230548 B1 PL230548 B1 PL 230548B1 PL 410757 A PL410757 A PL 410757A PL 41075714 A PL41075714 A PL 41075714A PL 230548 B1 PL230548 B1 PL 230548B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
strain
lactobacillus plantarum
metabolite
atcc
candida
Prior art date
Application number
PL410757A
Other languages
English (en)
Other versions
PL410757A1 (pl
Inventor
Piotr Heczko
Magdalena Strus
Original Assignee
Prolab Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Spolka Komandytowa
Prolab Spólka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Spólka Komandytowa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Prolab Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Spolka Komandytowa, Prolab Spólka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Spólka Komandytowa filed Critical Prolab Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Spolka Komandytowa
Priority to PL410757A priority Critical patent/PL230548B1/pl
Publication of PL410757A1 publication Critical patent/PL410757A1/pl
Publication of PL230548B1 publication Critical patent/PL230548B1/pl

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus plantarum PL3, jego metabolit oraz ich zastosowanie w leczeniu zakażeń grzybiczych i bakteryjnych.
Jama ustna jest pierwszym odcinkiem układu pokarmowego oraz układu oddechowego. Jama ustna zawiera mikroflorę występującą stale i mikroflorę występującą czasowo. Do stale występującej mikroflory jamy ustnej należą gatunki: Streptococcus, Veillonella, Baeteroides, Maemophilus, Actinomyces, z których ostatni jest czynnikiem etiologicznym próchnicy.
Mikroflorę jamy ustnej występującą czasowo tworzą bakterie spożywcze i bakterie patogenne, a także grzyby z rodzaju Candida albicans i Candida spp. Przy obniżonej odporności organizmu następuje zaburzenie biocenozy patogennych bakterii i grzybów, które mogą atakować jamę ustną a także przewód pokarmowy. Leczenie jest uciążliwe i długotrwałe. Stosowanie w leczeniu antybiotyków, sterydów lub cytostatyków powoduje wzrost bakterii i grzybów opornych na ich działanie.
Zdrowa jama ustna jest zabezpieczona przed szkodliwymi czynnikami chorobotwórczymi przez systemy obronne gospodarza (odporność np. bariera nabłonkowa; czynniki nieswoiste, np. Iizozym i system peroksydazy oraz czynniki swoiste, np. immunoglobuliny). W przypadku zaburzeń tych mechanizmów odpowiedniego dla danej jednostki chorobowej. Specyfika środowiska jamy ustnej, związana z ograniczonym obszarem działania leku, budową i fizjologią błony śluzowej wpływem fizjologicznej flory bakteryjnej, funkcjami i rolą śliny oraz przyjmowanych pokarmów, zmianami temperatury i pH jest znacznym ograniczeniem dla stosowanych tutaj leków. Ograniczeniem jest również brak dostępności na polskim rynku farmaceutycznym wielu leków i preparatów przystosowanych do aplikacji i w jamie ustnej. Środki takie, charakteryzują się właściwym podłożem zapewniającym adhezyjność do błony śluzowej, odpowiednim stężeniem substancji czynnych, brakiem właściwości drażniących i naruszających biocenozę jamy ustnej.
Istnieje więc konieczność poszukiwania nowych preparatów leczniczych. Do najczęściej izolowanych czynników etiologicznych zakażeń jamy ustnej zaliczyć można:
• Streptococcus pneumoniae (dwoinka zapalenia płuc) - bakteria odpowiedzialna głównie za zapalenia płuc ale również zapalenie ucha środkowego, zapalenie zatok, zapalenie wsierdzia i stawów, posocznicę (sepsę) i zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Szacuje się, że pneumokoki są przyczyną około 30-40 procent wszystkich bakteryjnych zapaleń płuc, zarówno u dorosłych, jak i u starszych dzieci. Inwazyjne zakażenia pneumokokowe mają zwykle ciężki przebieg i są obarczone śmiertelnością sięgającą w niektórych grupach wiekowych nawet >40 procent.
• Streptoeoccus pyogenes - paciorkowiec beta-hemolizujący, będący czynnikiem etiologicznym anginy oraz kilku innych zespołów chorobowych. Ze względu na objawy kliniczne towarzyszące infekcji bywa nazywany paciorkowcem ropnym. Źródłem zakażenia jest człowiek, nosicielstwo wynosi około 10-20% (kolonizacja u dzieci jest częstsza).
• Streptoeoccus mutans - paciorkowiec zieleniejący pospolicie występujący w jamie ustnej a odpowiedzialny za powstawanie próchnicy. Bakteria ta jest zdolna do wytwarzania kwasów w wyniku metabolizowania cukrów pochodzenia zewnątrzustrojowego i wewnątrzustrojowego. Kwaśne środowisko powoduje demineralizację szkliwa, co pozbawia zęby naturalnej ochrony, a bakterie wnikają w głąb zęba. Gatunek ten przyczynia się też do powstania płytki nazębnej, co jest też powszechnym problemem stomatologicznym.
• Staphyloeoceus aureus - bakteria stosunkowo często występująca w środowisku człowieka. Szacuje się, że 10 do 50% populacji ludzkiej stale lub okresowo jest nosicielami tej bakterii bez wystąpienia objawów chorobowych. Nosicielstwo dotyczy najczęściej śluzówki przedsionka jamy nosowej, może również występować przejściowo na skórze, w gardle oraz w drogach rodnych u kobiet. Kolonizacja szczepem gronkowca złocistego w niekorzystnych warunkach może stanowić punkt wyjścia dla zakażenia. Gronkowiec złocisty najczęściej powoduje zakażenia ropne skóry, tkanek podskórnych oraz tkanek miękkich, zakażenia układowe, zakażenia lub zatrucia związane z produkcją toksyn. Zakażenia tą bakterią wywołują ponadto zapalenie płuc, zapalenie tchawicy czy zapalenie gardła i zatok przynosowych.
• Haemophilus influenzae - Gram-ujemna pałeczka przenoszona drogą kropelkową, wywołująca głównie zakażenia układu oddechowego i zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Rezerwuarem drobnoustrojów należących do grupy Haemophilus influenzae są osoby chore oraz nosiciele. Nawet 25-80% całej populacji jest nosicielem zarazka (więcej nosicieli jest wśród dzieci, zwłaszcza tych uczęszczających do żłobków i przedszkoli). Haemophilus influenzae szerzy się drogą kropelkową lub
PL 230 548 B1 przez bezpośredni kontakt z wydzieliną dróg oddechowych chorego i może wywoływać takie jednostki chorobowe jak: zapalenie nagłośni, zapalenie płuc, zapalenie gardła, zapalenie zatok, zapalenie ucha środkowego, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych.
• Poryphomonas gingivalis - beztlenowa bakterie nieprzetrwalnikująca, określana jako periodontopatogen lub periopatogen, odgrywający istotną rolę w etiopatogenezie przewlekłego zapalenia przyzębia. Porphyromonas gingivalis jest ważnym klinicznie, stwierdzanym u ponad 40% chorych z chorobą przyzębia, gatunkiem bakterii z rodzaju Porphyromonas, sklasyfikowanym w obrębie rodziny Porphyromonadaceae.
Znany jest z polskiego opisu patentowego PL202576 szczep bakterii kwasu mlekowego wybrany z grupy Streptococcus thermophilus i Lactococcus lactis, który jest egzogenny wobec mikroflory jamy ustnej i zdolny do przylegania do błonki zębów. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wybranego szczepu bakterii kwasu mlekowego do wytwarzania czynnika hamującego wzrost bakterii Actionomyces nearlundii.
Znane są z polskiego opisu patentowego PL 201312 bakterie kwasu mlekowego niewystępujące stale w jamie ustnej a które regulują pH jamy ustnej i są zdolne do przywierania do błonki zębów. Bakterie według wynalazku znalazły zastosowania do wytwarzania kompozycji przeznaczonej do profilaktyki i leczenia próchnicy.
Znana jest z polskiego opisu patentowego PL 218228 kompozycja farmaceutyczna zawierająca produkty metabolizmu szczepów Lactobacillus rhamnosus i przeznaczona do zapobiegania i/lub leczenia zakażeń spowodowanych przez grzyby lub bakterie zwłaszcza jamy ustnej i układu moczowo-rodnego.
Znane jest, że właściwości hamujące wobec chorobotwórczych bakterii i grzybów mogą być znacząco różne dla różnych szczepów Lactobacillus. Znane dotychczas bakterie Lactobacillus plantarum nie są dostatecznie skuteczne do odtworzenia kolonizacji śluzówki jamy ustnej.
Celem wynalazku jest wyizolowanie nowego szczepu Lactobacillus plantarum i jego metabolitu o silnych właściwościach antagonistycznych szczególnie wobec takich patogenów jak bakterie i grzyby z rodzaju Candida.
Terminem metabolit określa się naturalną mieszaninę każdego związku, substancji lub przez mikroorganizmy, która ma aktywność produktu ubocznego fermentacji prowadzonej przez mikroorganizmy, która ma aktywność bójczą w odniesieniu do bakterii i grzybów.
Istotą wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus plantarum PL3. Szczep Lactobacillus plantarum PL3, który został zdeponowany, zgodnie z traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego, w Polskiej Kolekcji Mikrorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu (53-114 Wrocław, ul. Rudolfa Weigla 12). Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL3 został zdeponowany w dniu 12 listopada 2014 r. i otrzymał numer dostępu do depozytu B/00079.
Wynalazek obejmuje też nowy metabolit otrzymany z hodowli szczepu Lactobacillus plantarum PL3, który wykazuje właściwości antygrzybicze i antybakteryjne. Szczep Lactobacillus plantarum PL3 jest zdolny do produkcji metabolitu, w skład którego wchodzą kwasy, w szczególności kwas 3-hydroksydekanowy i kwas 3-(4-hydroksyfenylo)mlekowy. Dodatkowo szczep ten jest zdolny do produkcji peptydów, wchodzących w skład metabolitu, w tym przede wszystkim peptydu określonego przez sekwencję: NH2-NLPQLELVLLV-COOH.
Wynalazek obejmuje też zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) 12 listopada 2014 r. pod numerem depozytu B/00079 i/lub metabolitu wytworzonego przez szczep Lactobacillus plantarum PL3 jako środka redukującego liczebność populacji oraz hamującego wzrost drobnoustrojów takich jak szczepy grzybów z rodzaju Candida oraz patogenów stanów zapalnych jamy ustnej, w szczególności: Streptoccocus pyogenes, Streptoccocus pneumoniae, Streptoccocus mutans, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Poryphomonas gingivalis.
Badania przesiewowe pozwoliły na zidentyfikowanie szczepu Lactobacillus plantarum wyizolowanego z organizmu ludzkiego.
Szczep Lactobacillus plantarum PL3 został wyizolowany w takcie rutynowych badań laryngologicznych z jamy ustnej pacjenta bez bakteryjnych i grzybiczych stanów zapalnych jamy ustnej. Materiał po pobraniu był natychmiast transportowany do Laboratorium Mikrobiologicznego firmy Prolab, gdzie został opracowany, a wyizolowane szczepy bakterii szczegółowo scharakteryzowane w oparciu o metody genotypowe oraz fenotypowe.
PL 230 548 Β1
Szczep Lactobacillus plantarum PL3 jest to szczep, który w naturalny sposób kolonizuje jamę ustną. Dzięki temu oraz specyficznym cechom indywidualnym szczep Lactobacillus platarium PL3 jest szczególnie predysponowany do leczenia zakażeń grzybiczych i bakteryjnych jamy ustnej. Do tej pory nie był znany chemiczny skład metabolitu wytwarzanego przez nowy szczep Lactobacillus platarum PL3. Dzięki zidentyfikowaniu kwasów: 3-hydroksydekanowego i kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)mlekowego oraz peptydu o sekwencji: NH2-NLPQLELVLLV-COOH, przyporządkowano tej naturalnej mieszaninie wybitną zdolność do hamowania populacji grzybów i bakterii.
Niniejszy wynalazek przedstawiony jest na załączonym rysunku, na którym:
Fig. 1. przedstawia wynik testu API 50 CH dla szczepu Lactobacillus plantarum PL3
Fig. 2. przedstawia zdjęcie produktów reakcji PCR w kierunku Lactobacillus plantarum·, ścieżki: 1-(szczep PL3); 2-kontrola negatywna; 3-kontrola pozytywna (szczep 57B); M- marker wielkości.
Fig. 3. przedstawia strefy zahamowania wzrostu otrzymane dla szczepu Lactobacillus plantarum PL3.
Fig. 4. przedstawia antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 wraz z wytworzonym metabolitem wobec wybranych gatunków bakterii chorobotwórczych z wykorzystaniem metody ilościowej.
Fig. 5. przedstawia antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 wraz z wytworzonym metabolitem wobec grzybów z rodzaju Candida z wykorzystaniem metody półilościowej.
Fig. 6. przedstawia antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 wraz z wytworzonym metabolitem wobec wybranych gatunków grzybów drożdżopodobnych z wykorzystaniem metody ilościowej.
Fig. 7. przedstawia antagonistyczne działanie naturalnej mieszaniny, kwasu 3-(4-hydroksydekanowego)mlekowego oraz peptydu NH2- NLPQLELVLLV-COOH wobec wybranych czynników etiologicznych zakażeń jamy ustnej.
I. Fenotypowa identyfikacja szczepu Lactobacillus plantarum PL3 z wykorzystaniem zestawu API®50 CH firmy bioMerieux.
Identyfikację fenotypową przeprowadzono za pomocą zestawu API 50 CH zgodnie z zaleceniami producenta. Jest to wystandaryzowany zestaw zawierający 50 testów biochemicznych do badania sposobu metabolizmu węglowodanów przez drobnoustroje. API 50 CH FIRMY biom bioMerieux wykorzystuje się do identyfikacji bakterii z rodzaju Lactobacillus i rodzajów spokrewnionych w połączeniu z API 50 CHL Medium (bioMerieux; USA).
Wynik testu API 50 CH dla badanego szczepu z rodzaju Lactobacillus przedstawia Tab. 1.
T a b e I a . 1. Wynik testu API 50 CH dla szczepu PL3
Probówka TEST Wynik
Szczep PL3
0 KONTROLA -
1 Glicerol -
2 Erytrotol -
3 D-arabinoza -
4 L-arabinoza -
5 D-ryboza +
6 D-ksyloza -
7 L-ksyloza -
8 D-adonitol -
9 Metylo-pD-ksylopiranozyd -
10 D-galaktoza +
PL 230 548 Β1
11 D-glukoza +
12 D-fruktoza
13 D-mannoza
14 L-sorboza -
15 L-ramnoza -
16 Dulcytol -
17 Inozytol -
18 D-mannitoI +
19 D-sorbitol +
20 Metylo-aD-mannopiranozyd -
21 Metylo-aD-glukopiranozyd -
22 N-acetylo - glukozamina +
23 Amigdalina +
24 Arbutyna +
25 Eskulina Cytrynian żelaza +
26 Salicyna +
27 D-celobioza +
28 D-maltoza +
29 D-laktoza (wołowa) +
30 D-melibioza +
31 D-sacharoza +
32 D-trehaloza +
33 Inulina -
34 D-melezytoza -
35 D-rafinoza -
36 Skrobia -
37 Glikogen -
38 Ksylitol -
39 Gencjobioza +
40 D-turanoza +
41 D-liksoza -
42 D-tagatoza -
43 D-fukoza -
PL 230 548 Β1
44 L-fukoza -
45 D-arabitol -
46 L-arabitol -
47 Glukonian potasu +
48 2-ketoglukonian potasu -
49 5-ketoglukonian potasu -
Na podstawie otrzymanego profilu biochemicznego program apiWeb zidentyfikował szczep PL3 jako Lactobacillus plantarum (% ID=98 - Bardzo dobra identyfikacja).
Wynik testu API 50 CH dla szczepu Lactobacillus plantarum PL3 przedstawia Fig. 1.
II. Identyfikacja szczepu Lactobacillus plantarum PL3 z wykorzystaniem metody PCR (ang. Polymerase Chain Reaction):
II. 1. Izolacja genomowego DNA bakterii:
Do izolacji genomowego DNA zastosowano zestaw DNA Gene MATRIX Basic DNA Purification Kit (EURx) wykorzystujący zdolność wiązania się DNA do złóż krzemionkowych w wysokich stężeniach soli chaotropowych. Procedura izolacji DNA przebiegała w następujący sposób:
I, 24-godzinną hodowlę komórek bakteryjnych prowadzoną w płynnym podłożu MRS (Biocorp) odwirowywano w objętości 1 ml (2 min., 12 000 rpm).
2. Supernatant usuwano, a osad dokładnie zawieszano w 250 μΙ buforu do zawieszania Celi R (w zestawie) z dodatkiem 200 μΙ niebieskiego buforu lizującego Lysis Blue (w zestawie), aż do uzyskania jednolitej, niebieskiej zawiesiny.
3. Do zawiesiny komórek dodawano 1350 μΙ buforu neutralizującego Neutral B (w zestawie). Dokładnie i powoli mieszano zawartość probówek przez kilkukrotne odwracanie, aż do całkowitego zaniku niebieskiej barwy zawiesiny.
4. Po zakończeniu lizy mieszaninę odwirowywano (7 min., 12 000 rpm), a przesącz nakładano na minikolumnę ze specjalnym złożem krzemionkowym i ponownie wirowano (1 min., 12 000 rpm).
5. Złoże dwukrotnie przepłukiwano: najpierw 500μΙ buforu płuczącego Wash UX1, a następnie 650 μί buforu płuczącego Wash UX2 (w zestawie).
6. Oczyszczone DNA eluowano ze złoża za pomocą 50 μΙ buforu Elution (w zestawie), ogrzanego do temperatury 80°C.
7. Wyizolowane DNA przechowywano w probówce typu Eppendorf w temperaturze 4°C do czasu dalszych analiz.
II. 2. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR):
W Tabeli 2 przedstawiono sekwencje użytych starterów oraz wielkość amplikonów.
T a b e I a. 2. Sekwencje starterów i wielkość amplikonów poszukiwanego gatunku bakterii.
Starter Sekwencja 5’—*3’ Gatunek Wielkość amplikonów
Lfpr Planll GCC GCC TAA GGT GGG ACA GAT TTA CCT AAC GGT AAA TGC GA L. plantarum 283 pz
Zdjęcie produktów reakcji PCR w kierunku Lactobacillus plantarum; ścieżki: 1-(szczep PL3);
2-kontrola negatywna; 3-kontrola pozytywna (szczep 57B); M-marker wielkości, przestawia Fig. 2.
PL 230 548 Β1
Program amplifikacji dla gatunku Lactobacillus prowadzony był w termocyklerze S 1000
(BioRad) i przedstawiał się następująco
1.92°C - 2 min
2. 95°C - 30 sek
3.55°C - 30 sek >. 30x
4. 72°C - 30 sek
□ « f £> V.- ” 1 min
Amplifikację prowadzono zgodnie z metodą Walter i wsp. Z publikacji tej pochodzą również użyte sekwencje starterów.
Po skończonej reakcji PCR produkty amplifikacji były analizowane w 1,5% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. Próbki nakładano do kieszonek żelu w objętości 7 μΙ z dodatkiem 3 μΙ buforu obciążającego. Elektroforezę prowadzono w buforze TBE o stężeniu 0,5x, przez 1,5 godziny, pod napięciem 80V, w aparacie do elektroforezy (BioRad). Obraz żelu oglądano przy użyciu systemu GelDoc1 XR + (BioRad), w skład którego wchodził transiluminator UV, kamera zbierająca obraz oraz program komputerowy do dokumentacji i analizy obrazu Image Lab (BioRad).
Obecność produktu PCR o odpowiedniej ilości par zasad uznawana była za pozytywny wynik reakcji. Na każdym żelu umieszczano ponadto kontrolę negatywną, którą stanowiła woda destylowana dodawana do buforu reakcyjnego zamiast genomowego DNA bakterii, kontrolę pozytywną, jaką był produkt amplifikacji oraz marker wielkości prążków (GeneRuler 100 bp Axygen).
Tabela 3. Zestawienie wyników - identyfikacja gatunkowa przeprowadzona za pomocą testu API50 CH oraz reakcji PCR.
Szczep Obraz mikroskopowy Obraz makroskopowy Test API Test PCR
PL3 L .plantarum Kremowy L. plantarum L. plantarum
III. Oznaczenie wrażliwości na antybiotyki szczepu Lactobacillus plantarum PL3.
W celu zbadania lekooporności szczepu L. plantarum PL3 metodą dyfuzyjno-krążkową. zawiesinę hodowli (OD= 0,5 w skali McFarlanda) rozprowadzono na podłożu agarowym MRS (Oxoid) na płytce Petriego. Następnie podłoże z naniesioną zawiesiną pozostawiono w temperaturze pokojowej na 15 minut w celu jej wysuszenia. Po tym czasie na płytkę naniesiono za pomocą jałowej pęsety krążki nasączone odpowiednimi antybiotykami. Inkubację prowadzono w warunkach beztlenowych, przez 24h w temp. 37°C. Po inkubacji zmierzono strefy zahamowanego wzrostu szczepu bakteryjnego wokół krążka z antybiotykiem (w mm). Odczytu lekooporności różnicującego szczep L. plantarum PL3 na wrażliwy i oporny, dokonano zgodnie z EUCAST. W doświadczeniu wykorzystano następujące antybiotyki: penicylina, ciprofloksacyna, cefaklor, doksacyklina, oksacylina, kotrymoksazol, erytromycyna, ampicylina, klindamycyna, wankomycyna, gentamycyna, metronidazol, (Oxoid).
PL 230 548 Β1
Tabela 4. Wielkość stref zahamowania wzrostu otrzymane dla badanego szczepu L. plantarum PL3 oraz szczepu wzorcowego L. plantarum ATCC 8014.
Antybiotyk Stężenie L. plantarum PL3 L. plantarum ATCC 8014
Penicylina (P) [1 pg] 16 mm 13 mm
Ciprofloksacyna (CIP) [5 pg] 11 mm 11 mm
Cefaklor (CEC) [30 Mg] 34 mm 32 mm
Doksacyklina (DO) [30 pg] 26 mm 26 mm
Oksycylina (OX) Li pgl 10 mm 11 mm
Kotrymoksazol (SXT) [25 pg] 17 mm 25 mm
Erytromycyna (E) [15 Mg] 28 mm 26 mm
Ampicylina (AMP) [2 Mg] 32 mm 32 mm
Klindamycyna (DA) [2 Mgl 17 mm 18 mm
Gentamycyna (CN) [30 pg] 19 mm 18 mm
Wankomycyna (VA) [30 pg] 6 mm 6 mm
Metronidazol (MTZ) [5 pg] 6 mm 6 mm
Strefy zahamowania wzrostu otrzymane dla szczepu Lactobacillus plantarum PL3 przedstawiono na Fig. 3.
IV. Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 wobec bakteryjnych czynników etiologicznych powodujących zakażenia jamy ustnej z wykorzystaniem metody ilościowej.
W celu określenia aktywności przeciwbakteryjnej szczepu L. plantarum PL3 do 900 mikrolitrów 24-godzinnej hodowli szczepu bakterii kwasu mlekowego o średniej gęstości 1x108 j.t.k/ml, dodawano po 100 mikrolitrów 24-godzinnych hodowli badanych szczepów czynników etiologicznych zakażeń
PL 230 548 Β1 jamy ustnej o średniej gęstości 1x107 j.t.k/ml, przygotowanych przez zawieszanie jednego oczka ezy w 10 ml bulionu TSB (Biocorp) dla bakterii tlenowych oraz 10 ml bulionu Schetadlera (Biocorp) dla bakterii beztlenowych. Całość inkubowano odpowiednio w warunkach tlenowych i w beztlenowych, w temperaturze 37°C. W czasie 0 h oraz po upływie 8 i 24 godzin inkubacji z każdej z mieszanin wykonano rozcieńczenia dziesiętne, wysiewając kolejno po 100 mikrolitrów mieszaniny na podłoże Columbia (Biocorp) dla szczepów: S.pyogenes ATCC 19615, S.pneumonic ATCC 49619, S.mutans ATCC 25175, S.aureus ATCC 25923, P.gingivalis ATCC 33277 oraz na agar czekoladowy (BD) dla szczepu H.influenzae ATCC 700222. Liczbę kolonii zliczano, a wyniki podano w jednostkach tworzących kolonie przeliczeniu na 1 ml (j.t.k/ml).
Tabela 5. Antagonistyczne działanie | szczepu Lactobacillus plantarum PL3 wraz z wytworzonym metabolitem wobec bakteryjnych czynników etiologicznych powodujących zakażenia jamy ustnej w oparciu o metodę ilościową.
Szczep O godz CFU/ml 8 godz CFU/ml 24 godz CFU/ml
Streptoccocus pyogenes ATCC 19615 1,0x10' 0 0
Strepiococcus pneumonicie ATCC 49619 3,0x10' 0 0
Strepiococcus mutans ATCC 25175 1,0x106 0 0
Staphylococcus aureus ATCC 25923 1,0x10' 5,0xl0J 0
Haemophilus influenzae ATCC 700222 3,0x106 0 0
Poryphomonas gingivalis ATCC 33277 3,OxlO6 0 0
Kontrola hodowli L.plantarum PL3 2,0x10“ 5,0x10s Ι,ΟχΙΟ9
Kontrola hodowli Streptoccocus pyogenes ATCC 19615 3,5x10' 5,0x10' 4,0x10'
Kontrola hodowli Strepiococcus pneumoniae ATCC 49619 4,0x10' 2,0x106 l,5xl06
Kontrola hodowli Strepiococcus mutans ATCC 25175 1,0x106 2,0x106 l,0xl0ó
Kontrola hodowli Staphylococcus aureus ATCC 25923 3,0x10' 2,5x10* 2,0x10“
Kontrola hodowli Haemophilus influenzae ATCC 700222 4,0x106 7,0x10ft Ι,ΟχΙΟ7
Kontrola hodowli Poryphomonas gingivalis ATCC 33277 5,0χ10ΰ Ι,ΟχΙΟ7 2,0x107
PL 230 548 B1
Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 wraz z wytworzonym metabolitem wobec wybranych gatunków bakterii chorobotwórczych przedstawiono na Fig. 4.
V. Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 wobec grzybiczych czynników etiologicznych powodujących zakażenia jamy ustnej z wykorzystaniem metody półilościowej.
Do najczęstszych zakażeń jamy ustnej wywoływanych przez grzyby drożdżopodobne należy grzybica gardła wywoływana przez różne gatunki m.in. Candida albicans, Candida krusei i Candida tropicalis. Zapalenie grzybicze gardła bardzo często towarzyszy różnego rodzaju grzybicom jamy ustnej. Zaliczają się tutaj: kandydoza rzekomobłoniasta ostra i przewlekła, na którą głównie chorują małe dzieci, noworodki lub osoby starsze z obniżoną odpornością; kandydoza zanikowa ostra i przewlekła, pojawiająca się u cukrzyków czy u osób zażywających antybiotyki oraz grzybica rumieniowa przewlekła. Zakażenie grzybicze gardła i jamy ustnej pojawia się najczęściej u osób z osłabionym układem odpornościowym. Bardzo często zapadają na nią osoby cierpiące na choroby przewlekłe, jak cukrzyca. Występuje również u osób z AIDS. Do grupy ryzyka zakażenia grzybiczego zalicza się małe dzieci oraz osoby starsze, szczególnie noszące protezy zębowe. Długotrwała antybiotykoterapia także sprzyja rozwojowi infekcji grzybiczych stąd istnieje konieczność poszukiwania nowych naturalnych preparatów zwalczających grzybicę jamy ustnej. W tym celu zbadano antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 wobec grzybów drożdżopodobnych związanych z zakażeniami grzybiczymi jamy ustnej. Badanie to zostało przeprowadzone w oparciu o półilościową metodę słupkową.
Metoda słupkowa:
W badaniu posłużono się zmodyfikowaną metodą półilościową według Fitzsimmons i Berry (Struś M., Kucharska A., Kukla G., Brzychczy-Włoch M., Maresz K., Heczko P.B., The in vitro activity of vaginal Lactobacillus with probiotic properties against Candida. Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 2005; 13:69-75).
Do badania wybrano pięć grzybów wzorcowych pochodzenia ludzkiego z kolekcji ATCC tj. Candida albicans ATCC 10231, Candida glabrata ATCC 15126, Candida krusei ATCC 34135, Candida tropicalis ATCC 750, Candida kefyr ATCC 4135.
Metoda polegała na zastosowaniu podłoży dwuwarstwowych. Pierwszą warstwę stanowiło podłoże dla wzrostu Lactobacillus oparte na związkach chemicznych o składzie:
• Ekstrakt drożdżowy (Argenta) • Bezwodny octan sodu (Argenta) • Cytrynian sodu (Argenta) • Siarczan magnezu (Argenta) • Chlorek manganu (Argenta) • Siarczan amonu (Argenta) • Glukoza (Argenta)
Na podłoże to posiewano w formie paska o szerokości 2 cm badany szczep probiotyczny z rodzaju Lactobacillus. Po wymazaniu płytki inkubowano w temp. 37°C, w warunkach beztlenowych przez 48 godzin, a po upływie tego czasu na wierzch wylewano drugie, lekko przestudzone płynne podłoże Sabouraud Dextrose (Biocorp) w kierunku wzrostu grzybów wskaźnikowych. Po zastygnięciu, na podłoże wysiewano grzyby z rodzaju Candida o gęstości 0,5 MacFarlanda. Następnie płytki umieszczano na 4 godziny w lodówce (temperatura 4°C), a po upływie tego czasu dalszą inkubację prowadzono już w warunkach tlenowych, w temperaturze 37°C przez 24 godziny.
Uzyskane wyniki oceniono według następującej legendy:
- Brak działania antagonistycznego Lactobacillus wobec szczepów Candida (nie zaobserwowano żadnej strefy zahartowania wzrostu Candida wzdłuż paska z wymazanym szczepem probiotycznym), + Częściowe działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec szczepów Candida (obserwuje się lekkie zahamowania wzrostu Candida jedynie nad paskiem z wymazanym szczepem probiotycznym), ++ Wyraźne działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec szczepów Candida (obserwuje się wyraźne zahamowania wzrostu Candida nad paskiem z wymazanym szczepem pro biotycznym czasami wyraźniej w jego górnej i dolnej części), +++ Bardzo silne działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec szczepów Candida (obserwuje się wyraźne zahamowania wzrostu Candida nad paskiem i poza jego powierzchnią wzdłuż całej linii posiewu szczepu probiotycznego).
PL 230 548 Β1
Tabela. 6. Antagonistyczne działanie bakterii z rodzaju Lactobacillus wobec grzybów z rodzaju Candida przy zastosowaniu metody półilościowej.
Bakterie z rodzaju Lactobacillus Candida albicans ATCC 10231 Candida glabrata ATCC 15126 Candida krusei ATCC 34135 Candida tropicalis ATCC 750 Candida kefyr ATCC 4135
PL3 ++ ++ +/- +H—h +++
Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 wobec grzybów z rodzaju Candida przedstawia Fig. 5.
VI. Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 wobec grzybiczych czynników etiologicznych powodujących zakażenia jamy ustnej z wykorzystaniem metody ilościowej.
Kolejnym etapem badań było określenie działania szczepu PL3 wobec tych samych grzybów wskaźnikowych w oparciu o metodę ilościową. W metodzie ilościowej szczep probiotyczny oraz szczepy grzybów wskaźnikowych hodowano w tej samej probówce zawierającej po 900 mikrolitrów 24 godzinnej hodowli Lactobacillus o średniej gęstości 1x108 j.t.k/ml oraz 100 mikrolitrów 24 godzinnej hodowli grzybów wskaźnikowych o średniej gęstości 1x106 j.t.k/ml. Całość dalej hodowano, a po upływie 8 i 24 godzin od rozpoczęcia badania materiał posiewano ilościowo zarówno na stałe podłoże przeznaczone do wzrostu Lactobacillus oraz stałe podłoże przeznaczone do wzrostu pozostałych chorobotwórczych grzybów wskaźnikowych. Liczebność obu populacji zliczano, a wynik podawano w jednostkach tworzących kolonie w przeliczeniu na 1 ml (c.f.u./ml).
Tabela 7. Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 wraz z wytworzonym metabolitem wobec grzybiczych czynników etiologicznych powodujących zakażenia jamy ustnej w oparciu o metodę ilościową.
Szczep O godz CFU/ml 8 godz CFU/ml 24 godz CFU/ml
Candida albicans ATCC 10231 2,0xl06 0 0
Candida glabrata ATCC 15126 1,2x10' 0 0
Candida kefyr ATCC 4135 Ι,ΟχΙΟ6 0 0
Candida krusei ATCC 34135 Ι,ΟχΙΟ6 0 0
Candida tropicalis ATCC 750 3,0xl06 0 0
Kontrola hodowli L. plantarum PL3 6,0xl08 2,5x109 1,4x109
Kontrola hodowli Candida albicans \rrc irrni 2,3xlOy l,2xlOy 5,0x10*
Kontrola hodowli Candida glabrata ATCC 15126 1,2x10' 5,0x10'
Kontrola hodowli Candida kefyr ATCC 4135 Ι,ΟχΙΟ6 2,7x107 2,0x107
Kontrola hodowli Candida krusei ATCC 34135 Ι,ΟχΙΟ6 3,0x10' Ι,ΟχΙΟ7
Kontrola hodowli Candida tropicalis ATCC 750 3,0xl06 2,5x10' 1,0x10'
PL 230 548 Β1
Antagonistyczne działanie szczepu L. plantarum PL3 wraz z wytworzonym metabolitem wobec wybranych gatunków grzybów drożdżopodobnych przedstawiono na Fig. 6.
VII. Charakterystyka metabolitu produkowanego przez szczep Lactobacillus plantarum PL3
Zgodnie z definicją podaną we wstępie terminem metabolit określa się naturalną mieszaninę każdego związku, substancji lub produktu ubocznego fermentacji prowadzonej przez L. plantarum PL3 który ma aktywność bójczą w odniesieniu do bakterii i grzybów.
Przeprowadzone analizy jakościowe oraz ilościowe metabolitu bakterii Lactobacillus plantarum PL3 zostały wykonane przy wykorzystaniu metody LC/MS-MS. Ponadto przy zastosowaniu systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (UltiMate 3000; Thermo Scientific) sprzężonej ze spektrometrem masowym (LCQ, Thermo Scientific) źródłem jonów typu nanoESI przeprowadzono analizę peptydów zawartych w badanej próbce po odcięciu dużych białek o masie 10 000 kDA. Przeprowadzone analizy pozwoliły na wykrycie w badanym metabolicie następujących kwasów:
• kwas 3-hydroksydekanowy • kwas 3-(4-hydroksyfenylo)mlekowy • δ-d od e kala kto n • kwas 3-fenylomlekowy • kwas heksanowy • kwas mlekowy • kwas piroglutaminowy • mewalonolakton • cyklo(L-Leu-Gly) • kwas benzoesowy • kwas 3-hydroksydodekanowy, przy czym w dominującej ilości w metabolicie szczepu L. plantarum PL3 występowały: kwas 3-hydroksydekanowy oraz kwas 3-(4-hydroksyfenylo)mlekowy. Ponadto w metabolicie szczepu L. plantarum PL3 zidentyfikowano 13 mas peptydomu (m.in.: 702.57 Da, 626.42 Da, 707.95 Da, 768.79Da, 517.08 Da). Następnie masę 626,42 Da, dla której wykryto statystycznie istotną różnicę pomiędzy próbką kontrolną, którą stanowiło podłoże do hodowli, a badaną poddano sekwencjonowaniu de novo. Uzyskano 11-aminokwasowy peptyd o sekwencji: NH2-NLPQLELVLLV-COOH.
Przykład.
Przeprowadzone analizy in vitro pozwoliły na przypisanie aktywności bakteriobójczej oraz grzybobójczej naturalnej mieszaninie zawierającej kwas 3-hydroksydekanowy oraz kwas 3-(4-hydroksyfenylo)mlekowy w połączeniu z peptydem o sekwencji: NH2-NLPQLELVLLV-COOH.
Antagonistyczne działanie naturalnej mieszaniny kwasu 3-hydroksydekanowego, kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)mlekowego oraz peptydu NH2-NLPQLELVLLV-COOH wobec wybranych czynników etiologicznych zakażeń jamy ustnej przedstawiono na Fig. 7.
Tabela 8. Strefa zahamowania wzrostu badanych szczepów z kolekcji ATCC pod wpływem działania naturalnej mieszaniny kwasu 3-hydroksydekanowego, kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)mlekowego oraz peptydu NH2-NLPQLELVLLV-COOH
Numer krążka Badany kwas/stężenie Streptococcus agalactiae Escherichia coli Candida albicans
1 Mieszanina: kwas 3-hydroksydekanowy [2,36 pg/ml] kwas 3-(4-hydroksyfenylo)mlekowy [34,26 pg/ml] NH2-NLPQLELVLLV-COOH 23 mm 15 mm 20 mm
Z danych przestawionych w tabeli wynika, (że zastosowanie metabolitów szczepu Lactobacillus plantarum PL3 prowadzi do zahamowania wzrostu patogenów grzybiczych i bakteryjnych.
PL 230 548 B1
Wyniki przeprowadzonych badań wykazały, że szczep Lactobacillus plantarum PL3 i wytworzony przez niego metabolit; są skuteczne wobec grzybów patogennych i bakterii i mogą być wykorzystane jako składnik czynny środka hamującego rozwój i/lub ograniczającego wzrost populacji grzybów patogennych dla człowieka.

Claims (5)

1. Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL3 zdeponowany w dniu 12 listopada 2014 r. w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu pod numerem dostępu B/00079.
2. Metabolit otrzymany z hodowli szczepu Lactobacillus plantarum PL3 określonego w zastrz. 1, który wykazuje właściwości antygrzybicze i antybakteryjne.
3. Metabolit według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera kwasy, w tym szczególnie kwas 3-hydroksydekanowy i kwas 3-(4-hydroksyfenylo)mlekowy.
4. Metabolit według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera peptydy, w tym przede wszystkim peptyd określony przez sekwencję NH2-NLPQLELVLLV-COOH.
5. Zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów we Wrocławiu pod numerem dostępu B/00079 i/lub metabolitu wytworzonego przez szczep Lactobacillus plantarum PL3 jako środka hamującego rozwój i/lub ograniczającego wzrost populacji grzybów patogennych dla człowieka.
PL410757A 2014-12-23 2014-12-23 Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL3, jego metabolit oraz zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 i jego metabolitu PL230548B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL410757A PL230548B1 (pl) 2014-12-23 2014-12-23 Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL3, jego metabolit oraz zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 i jego metabolitu

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL410757A PL230548B1 (pl) 2014-12-23 2014-12-23 Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL3, jego metabolit oraz zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 i jego metabolitu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL410757A1 PL410757A1 (pl) 2016-07-04
PL230548B1 true PL230548B1 (pl) 2018-11-30

Family

ID=56234565

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL410757A PL230548B1 (pl) 2014-12-23 2014-12-23 Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL3, jego metabolit oraz zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 i jego metabolitu

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL230548B1 (pl)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107805620B (zh) * 2017-10-12 2021-03-02 昆明理工大学 一株基因工程菌乳酸乳球菌及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL248297B1 (pl) * 2024-01-11 2025-11-24 Prolab Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Spolka Komandytowa Szczep Lactiplantibacillus plantarum PL6 i zastosowanie szczepu Lactiplantibacillus plantarum PL6

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107805620B (zh) * 2017-10-12 2021-03-02 昆明理工大学 一株基因工程菌乳酸乳球菌及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
PL410757A1 (pl) 2016-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3471836B1 (en) Dermatological preparations for maintaining and/or restoring healthy skin microbiota
EP3494206B1 (en) Lactic bacteria and the use thereof for the preventive, inhibitory and/or reductive treatment of the formation of bacterial biofilms
US11000558B2 (en) Vaginal preparations for maintaining and/or restoring healthy female microbiota
CA2800514C (en) Use of streptococcus salivarius in the treatment of chronic infections of the respiratory tract
Fraga et al. Vaginal lactic acid bacteria in the mare: evaluation of the probiotic potential of native Lactobacillus spp. and Enterococcus spp. strains
CN1888051A (zh) 一株植物乳杆菌及其应用
EP4299067A1 (en) Composition for improving oral immunoglobulin a content and inhibiting pathogens, and use
EP3818985B1 (en) Lactobacillus fermentum pl9 and its application
Affhan et al. Lactic acid bacteria protect human intestinal epithelial cells from Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa infections
Al-Dahmoshi Genotypic and phenotypic investigation of alginate biofilm formation among Pseudomonas aeruginosa isolated from burn victims in Babylon, Iraq
PL230548B1 (pl) Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL3, jego metabolit oraz zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 i jego metabolitu
Oladipo et al. Virulence potential of Enterococcus gallinarum strains isolated from selected Nigerian traditional fermented foods.
KR101098946B1 (ko) 신규한 락토바실러스 살리바리우스 균주 및 이를 함유하는 사료첨가제 조성물
Widyarman et al. Inhibitory effect of probiotic lactobacilli against Streptococcus mutans and Porphyromonas gingivalis biofilms
CZ2014565A3 (cs) Kmeny laktobacilů produkující látky účinné proti vaginálním patogenům, jejich použití a hygienické prostředky je obsahující
James et al. A search within the genera Streptococcus, Enterococcus and Lactobacillus for organisms inhibitory to mutans streptococci
Christidou et al. Review of Pasteurella multocida infections over a twelve-year period in a tertiary care hospital
Rudenko et al. search for promising strains of probiotic microbiota isolated from different biotopes of healthy cats for use in the control of surgical infections. Pathogens 2021; 10 (6): 667
KR100736517B1 (ko) 장내 유해세균 억제능을 갖는 락토바실루스 존소니이 아이디씨씨 9203
CZ309916B6 (cs) Kmen Bacillus weihenstephanensis a jeho použití
WO2004072272A1 (en) Bacterial compositions
PL245526B1 (pl) Szczep Lactobacillus plantarum PL8 i jego zastosowanie
Servin et al. Probiotic potentials of Lactic acid bacteria isolated from vaginal swabs on selected genital pathogens.
Celebi et al. Efficacy of Pyocyanin Isolated from Pseudomonas aeruginosa and Lactobacillus plantarum Against Methicillin Resistant Staphylococcus aureus Caused Bovine Mastitis
PL230832B1 (pl) Nowy szczep Lactobacillus plantarum PM1, jego metabolit oraz zastosowanie nowego szczepu Lactobacillus plantarum PM1 i jego metabolitu