PL245526B1

PL245526B1 - Szczep Lactobacillus plantarum PL8 i jego zastosowanie

Info

Publication number: PL245526B1
Application number: PL442281A
Authority: PL
Inventors: Piotr Heczko; Magdalena Strus
Original assignee: Prolab Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Spolka Komandytowa
Priority date: 2022-09-14
Filing date: 2022-09-14
Publication date: 2024-08-19
Also published as: PL442281A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest nowy szczep Lactobacillus plantarum oznaczony symbolem PL8 zdeponowany, zgodnie z traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego, w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu w dniu 03 lutego 2022 roku pod numerem B/00372 i jego zastosowanie do wytwarzania produktów spożywczych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep PL8 i jego zastosowanie do wytwarzania produktów spożywczych.

Jedną z najliczniejszych grup bakterii zasiedlających ludzki organizm są bakterie z rodzaju Lactobacillus. Szczególnie wśród nich wyróżniają się bakterie należące do gatunku Lactobacillus plantarum. Patogenne dla człowieka bakterie powodują szereg zakażeń przewodu pokarmowego. Standardowe leczenie zakażeń jest coraz trudniejsze ze względu na oporność na leki antybiotykowe. Poszukując alternatywnych form leczenia wspomagających antybiotykoterapię, rozważa się stosowanie preparatów zawierających bakterie probiotyczne, wśród których znaczącą rolę odgrywają bakterie z gatunku Lactobacillus plantarum. Istotny wpływ na zdrowie człowieka mają produkty spożywcze uzupełnione o bioaktywne składniki takie jak witaminy, minerały i probiotyki.

Znany jest z chińskiego opisu patentowego CN107058159A Lactobacillus plantarum JMCC0017 o dobrej przeżywalności w napoju mlecznym. Lactobacillus plantarum to probiotyk wyselekcjonowany z tradycyjnych fermentowanych produktów mlecznych w Xinjiang w Chinach. Szczep jest przechowywany we wspólnym centrum ochrony szczepów drobnoustrojów przy Chińskim Komitecie ds. Kolekcji Kultur pod numerem CGMCC NO.12323. Lactobacillus plantarum JMCC0017 charakteryzuje się odpornością na zmiany temperatury, posiada wysoką aktywność i słabą kwasowość, jest wolny od specjalnego smaku roślinnego i ma dobrą tolerancję na kwasy i sole żółciowe oraz odporność na utlenianie.

Znany jest z opisu patentowego WO202215248A1 sposób otrzymywania napoju na bazie herbaty zawierającego probiotyki korzystnie z gatunku Lactobacillus plantarum. Sposób polega na przygotowaniu mieszaniny naparu herbaty z cukrem, który zaszczepia się probiotykiem a następnie prowadzi się fermentację w temperaturze od 15 do 45 stopni C.

Znane są z opisu patentowego WO202202097A1 nowe szczepy probiotyczne z rodzaju Lactobacillus o działaniu immunomodulacyjnym, które używa się do wytwarzania kompozycji probiotycznej. Kompozycja probiotyczna zawiera korzystnie Lactobacillus plantarum RGM 2608 i jest użyteczna do leczenia patologii związanych z zaburzeniami układu odpornościowego i/lub żołądkowo-jelitowego.

Znany jest z polskiego opisu patentowego Pat.216950 „Waflowy wyrób cukierniczy w postaci wafli przekładanych masą, o cechach funkcjonalnych” produkt spożywczy zawierający żywe szczepy bakterii Lactobacillus casei korzystnie w formie liofilizatu. Żywe szczepy bakterii wprowadza się do masy w czasie jej rozdrabniania w temperaturze nie powodującej inaktywacji bakterii mlekowych.

Znane są z opisu patentowego EP 1996696 „Termostabilny szczep Lactobacillus” szczepy z rodzaju Lactobacillus wybrane z gatunku Lactobacillusplantarum i Lactobacillus rhamnosus. Wymienione szczepy zostały zdeponowane w niemieckiej kolekcji mikroorganizmów. Szczepy te są w stanie przetrwać temperatury powyżej 80 stopni C przez ponad 25 minut. Szczepy zostały zastosowane do wytwarzania produktów spożywczych.

Znany jest z opisu patentowego US Patent 10058577 produkt spożywczy zawierający zdeponowany szczep Lactobacillus plantarum zachowujący żywotność w temperaturach od 25 do 250 stopni C. Szczep bakterii w postaci wysuszonego proszku, kapsułki lub pastylki jest mieszany lub łączony ze składnikiem spożywczym podczas przygotowania produktu spożywczego.

Celem wynalazku było wyselekcjonowanie z kolekcji szczepów bakterii z rodzaju Lactobacillus nowego szczepu, który oprócz cech charakterystycznych dla tego gatunku będzie skuteczny wobec patogennych bakterii.

Istotą wynalazku jest szczep Lactobacillus plantarum oznaczony symbolem PL8 zdeponowany, zgodnie z traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego, w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu w dniu 03 lutego 2022 roku pod numerem B/00372 posiadający sekwencję genomową przedstawioną w załączniku nr 1.

Szczep Lactobacillus plantarum PL8 zdeponowany pod numerem B/000372 ma geny trxB, trxD, mrsB, purK kodujące właściwości antyoksydacyjne zgodnie z analizą sekwencji genomowej przedstawionej w załączniku nr 2.

Szczep Lactobacillus plantarum PL8 zdeponowany pod numerem B/00372 ma geny hisE, hisD odpowiedzialne za wiązanie metali zgodnie z analizą sekwencji genomowej przedstawionej w załączniku nr 2.

Szczep Lactobacillus plantarum PL8 zdeponowany pod numerem B/00372 ma geny eno, ppl umożliwiające wiązanie do powierzchni komórek zgodnie z analizą sekwencji genomowej przedstawionej w załączniku nr 2.

Szczep Lactobacillus plantarum PL8 zdeponowany pod numerem B/00372 ma geny ruvA, ruvB, uvrC, lexA, clpC, clpB_1, clpB_2, grpE odpowiedzialne za odporność na stres w tym wysoką temperaturę zgodnie z analizą sekwencji genomowej przedstawionej w zał. nr 2.

Szczep Lactobacillus plantarum PL8 zdeponowany pod numerem B/00372 ma geny kodujące syntezę witamin: ryboflawiny (ribD_1, ribD_2, ribE, ribF_1, ribF_2, ribT), pirodyksyny (serC), tiaminy (thiM, thiD, thil) oraz karoteinodów i kwasu foliowego (folB, folK, folP) zgodnie z analizą sekwencji genomowej przedstawionej w załączniku nr 2.

Szczep Lactobacillus plantarum PL8 zdeponowany pod numerem B/00372 do zastosowania do wytwarzania środków spożywczych, których proces technologiczny odbywa się w temperaturze do 45 stopni Celsjusza.

Szczep Lactobacillus plantarum PL8 zdeponowany pod numerem B/00372 do zastosowania w produktach spożywczych takich jak wyroby czekoladowe.

Pochodzenie szczepu

Szczep Lactobacillus plantarum PL8 został wyizolowany z przewodu pokarmowego zdrowego dziecka. Materiał po pobraniu został w Laboratorium Mikrobiologicznym firmy Prolab opracowany a wyizolowane szczepy bakterii scharakteryzowane w oparciu o metody genotypowe oraz fenotypowi. Jednym z uzyskanych na tej drodze szczepów był szczep Lactobacillus plantarum PL8.

Niniejszy wynalazek przedstawiono na rysunku, na którym:

Fig. 1 przedstawia wynik testu API 50 CH dla szczepu Lactobacillus plantarum PL8.

Fig. 2 przedstawia zdjęcie produktów reakcji PCR w kierunku Lactobacillus plantarum; ścieżki: 1 (L. plantarum PL8); 2 (kontrola negatywna - ultraczysta woda); 3 (kontrola pozytywna - L. plantarum ATCC 8014); M (marker wielkości).

Fig. 3 przedstawia oporność szczepu Lactobacillus plantarum PL8 na sole żółci w stężeniach: 1,2, 5, 10, 20 g/l.

Fig. 4 przedstawia wykazanie, za pomocą metody słupkowej, antagonistycznego działania szczepu L. plantarum PL8 na wzrost czynników etiologicznych powodujących próchnicę oraz zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego.

Fig. 5. przedstawia adherencję szczepu Lactobacillus plantarum PL8, do ludzkiej linii nabłonka jelitowego Caco-2.

Fig. 6 przedstawia porównanie przeżywalności szczepu Lactobacillus plantarum PL8 w podłożach przemysłowych.

Fig. 7 przedstawia porównanie wartości pH hodowli szczepu Lactobacillus plantarum PL8 w różnych podłożach przemysłowych.

I. Fenotypowa identyfikacja szczepu Lactobacillus plantarum PL8 z wykorzystaniem ze- stawu API®50 CH firmy bioMerieux

Identyfikację fenotypową przeprowadzono za pomocą zestawu API 50 CH zgodnie z zaleceniami producenta. Jest to wystandaryzowany zestaw zawierający 50 testów biochemicznych do badania sposobu metabolizmu węglowodanów przez drobnoustroje. API 50 CH firmy bioMerieux wykorzystuje się do identyfikacji bakterii z rodzaju Lactobacillus spp. i rodzajów spokrewnionych w połączeniu z API 50 CHL Medium (bioMerieux; USA).

Wynik testu API 50 CH dla badanego szczepu z rodzaju Lactobacillus spp. przedstawia Tab. 1 i Fig. 1.

PL 245526 Β1

Tab. 1. Wynik testu API 50 CH dla szczepu Lactobacillus plantarum PL8.

Probówka	TEST	Wynik Szczep PL8
0	KONTROLA	-
1	Glicerol	-
2	Erytrotol	-
3	D-arabinoza	-
4	L-arabinoza	-
5	D-ryboza	+
6	D-ksyloza	-
7	L-ksyloza	-
8	D-adonitol	-
9	Metylo-pD-ksylopiranozyd	-
10	D-galaktoza	+
11	D-glukoza	+
12	D-fruktoza	+
13	D-mannoza	+
14	L-sorboza	-
15	L-ramnoza	-
16	Dulcytol	-
17	Inozytol	-
18	D-mannitol	+
19	D-sorbitol	+
20	Metylo-aD-mannopiranozyd	-
21	Metylo-aD-glukopiranozyd	-
22	N-ac ety lo-glukozamina	+
23	Amigdalina	+
24	Arbutyna	+
25	Eskulina	+
	Cytrynian żelaza
26	Salicyna	+
27	D-cclobioza	+
28	D-maltoza	+
29	D-laktoza (wołowa)	+
30	D-melibioza	+
31	O-sacharoza	+
32	D-trelialoza	+
33	Inulina	-
34	D-mclezyloza	-
35	D-rafinoza	+
36	Skrobia	-
37	Glikogen	-
38	Ksylilol	-
39	Gcncjobioza	+
40	D-luranoza	+
41	D-liksoza	-
42	D-tagatoza	-
43	D-fukoza	-
44	L-fukoza	-
45	D-arabilol	-
46	L-arabilol	-
47	Glukonian potasu	-
48	2-kctoglukonian potasu	-
49	5-kc(oglukonian potasu	-

PL 245526 Β1

Na podstawie otrzymanego profilu biochemicznego program apiWeb zidentyfikował szczep PL8 jako Lactobacillus plantarum (% ID=98,7 - dobra identyfikacja).

II. Identyfikacja szczepu Lactobacillus plantarum PL8 z wykorzystaniem metody PCR (ang. Polymerase Chain Reaction)

II. 1. Izolacja genomowego DNA bakterii:

Do izolacji genomowego DNA zastosowano zestaw DNA GeneMATRIX Basic DNA Purification Kit (EURx) wykorzystujący zdolność wiązania się DNA do złóż krzemionkowych w wysokich stężeniach soli chaotropowych. Procedura izolacji DNA przebiegała w następujący sposób:

1. 24-godzinną hodowlę komórek bakteryjnych prowadzoną w płynnym podłożu MRS (Oxoid) odwirowywano w objętości 1 ml (2 min., 12 000 rpm).

2. Supernatant usuwano, a osad dokładnie zawieszano w 250 pl buforu do zawieszania Cell R (w zestawie) z dodatkiem 200 pl niebieskiego buforu lizującego Lysis Blue (w zestawie), aż do uzyskania jednolitej, niebieskiej zawiesiny.

3. Do zawiesiny komórek dodawano 350 pl buforu neutralizującego Neutral B (w zestawie). Dokładnie i powoli mieszano zawartość probówek przez kilkukrotne odwracanie, aż do całkowitego zaniku niebieskiej barwy zawiesiny.

4. Po zakończeniu lizy mieszaninę odwirowywano (7 min., 12 000 rpm), a przesącz nakładano na minikolumnę ze specjalnym złożem krzemionkowym i ponownie wirowano (1 min., 12 000 rpm).

5. Złoże dwukrotnie przepłukiwano: najpierw 500 pl buforu płuczącego Wash UX1, a następnie 650 pL buforu płuczącego Wash UX2 (w zestawie).

6. Oczyszczone DNA eluowano ze złoża za pomocą 50 pl buforu Elution (w zestawie), ogrzanego do temperatury 80°C.

7. Wyizolowane DNA przechowywano w probówce typu Eppendorf w temperaturze 4°C do czasu dalszych analiz.

II. 2. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR):

W Tabeli 2 przedstawiono sekwencje użytych starterów oraz wielkość poszczególnych amplikonów.

Tab. 2. Sekwencje starterów i wielkość amplikonów poszukiwanego gatunku bakterii.

Starter	Sekwencja 5’—>3’	Gatunek	Wielkość amplikonu
Lfpr Planll	GCC GCC TAA GGT GGG ACA GAT TTA CCT AAC GGT AAA TGC GA	L.plantarum	283 pz

Program amplifikacji dla gatunki Lactobacillus plantarum prowadzony byłw termocyklerze S 1000 (BioRad) i przedstawiał się następująco:

1. 92°C -	2 min
2. 95°C -	30 sek
3. 55°C -	30 sck	- 30x
4. 72°C -	30 sek
5. 72°C -	1 min

Amplifikację prowadzono zgodnie z metodą Walter i wsp. (Walter J, Tannock GW, Tilsala-Timisjarvi A, Rodtong S, Loach DM, Munro K, Alatossava T. Detection and Identification of gastrointestinal Lactobacillus species by using denaturing gradient gel electrophoresis and species-specific PCR primers. Appl Environ Microbiol. 2000;66(1):297-303). Z publikacji tej pochodzą również użyte sekwencje starterów.

Po skończonej reakcji PCR produkty amplifikacji były analizowane w 1,5% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. Próbki nakładano do kieszonek żelu w objętości 7 pl z dodatkiem 3 pl bufom obciążającego. Elektroforezę prowadzono w buforze TBE o stężeniu 0,5x, przez 1,5 godziny, pod napięciem 80V, w aparacie do elektroforezy (BioRad).

PL 245526 Β1

Obraz żelu oglądano przy użyciu systemu GelDoc XR + (BioRad), w skład którego wchodził transiluminator UV, kamera zbierająca obraz oraz program komputerowy do dokumentacji i analizy obrazu Image Lab (BioRad).

Obecność produktu PCR o odpowiedniej ilości par zasad uznawany była za pozytywny wynik reakcji. Na każdym żelu umieszczano ponadto kontrolę negatywną, którą stanowiła woda destylowana dodawana do buforu reakcyjnego zamiast genomowego DNA bakterii oraz kontrolę pozytywną, jaką był produkt amplifikacji otrzymany z użyciem DNA szczepu wzorcowego oraz marker wielkości prążków (GeneRuler lOObp, Axygen).

III. Identyfikacja szczepu Lactobacillus plantarum PL8 z wykorzystaniem sekwencjonowania 16S rRNA.

Materiał badawczy stanowiła próbka DNA, którą oceniono pod kątem jakościowym z wykorzystaniem analizy spektrofotometrycznej. Następnie przeprowadzono reakcję PCR w obecności literaturowych oligonukleotydów uniwersalnych, umożliwiających identyfikację gatunkową szczepu bakterii. Amplikony DNA uzyskane w reakcji PCR rozdzielono za pomocą elektroforezy agarozowej w obecności barwników oraz wzorca wielkości DNA. Wyniki wizualizowano za pomocą archiwizatora. Amplikony poddano sekwencjonowaniu DNA, uzyskane sekwencje przeanalizowano in silico z wykorzystaniem narzędzi NCBI Blast. Poprawność odczytanych sekwencji zweryfikowano na podstawie inspekcji wizualnej oraz analizy zasobów bazy danych NCBI Genbank.

Tab.3. Tabelaryczne zestawienie sekwencji DNA uzyskanych dla badanego szczepu Lactobacillus plantarum PL8 z użyciem literaturowych oligonukleotydów, umożliwiających identyfikację gatunkową szczepu bakterii.

Nazwa szczepu

PL8

Sekwencja DNA 5’-3’ startery 1

TTAGGCGGCTGGTTCCTAAAAGGTTACCCCACCGACTTT GGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGT ACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATC CGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTG CAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATT AGCTTACTCTCGCGAGTTCGCAACTCGTTGTACCATCCA TTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGAT GATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCG GCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACT GATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAA CATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACC TGTATCCATGTCCCCGAAGGGAACGTCTAATCTCTTAGA TTTGCATAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGT AGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGG GCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGT ACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCA CTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCG TTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCT ACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAG ACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTAC GCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTC TGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGT TGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCC

PL 245526 Β1

TGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTG CCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGC CGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGT TACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACG AGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCAT CAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCC TCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTG GCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCAT GGTGAGCCGTTACCYCACCATCTAGCTAATACGCCGCG GGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAR CTCGGACCATGCGGTCCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCA TCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTT CCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCACTCAAATGT AAATCATGATGCAAGCACCAATCAATACCAGAGTTCGTT C

Sekwencja DNA 5’-3’ startery 2

GGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAA GAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAG AACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATT TAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCG CGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTG GGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATG TGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAA ACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACT CCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAAC ACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACG CTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGAT A

Na podstawie otrzymanych sekwencji DNA oraz analizy zasobów bazy danych NCBI Genbank zidentyfikowano szczep PL8 jako Lactobacillus plantarum.

Fig. 2 przedstawia zdjęcie produktów reakcji POR w kierunku Lactobacillus plantarum·, ścieżki: 1 (Ł. plantarum PL8); 2 (kontrola negatywna - ultraczysta woda); 3 (kontrola pozytywna - L. plantarum ATCC 8014); M (marker wielkości).

IV. Identyfikacja szczepu Lactobacillus plantarum PL8 przy użyciu spektrometrii masowej (MALDI-TOF MS)

Identyfikacja mikroorganizmów metodą MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/lonization Time-of-Flight) z użyciem desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą z analizatorem czasu przelotu odbywa się dzięki unikalnemu profilowi białkowemu drobnoustrojów. 48-godzinną hodowlę szczepu Lactobacillus plantarum PL8 na podłożu MRS Agar (Oxoid) poddano analizie przy użyciu spektrometru MALDI Biotyper firmy Bruker. Uzyskane widmo białkowe przekształcano w listę pików, a następnie z wykorzystaniem algorytmu biostatystycznego listę pików porównywano z referencyjnymi listami pików dla organizmów znajdujących się w bazie danych z biblioteką wzorców. W kolejnym kroku wygenerowano logarytm uzyskanego wyniku (log(score)) mieszczący się w przedziale 0,00-3,00. Im większy logarytm uzyskanego wyniku (log(score)), tym większy stopień podobieństwa pomiędzy wzorcem nieznanej listy pików, a listą pików znajdującą się w bazie danych z biblioteką wzorców. Uzyskany wynik dla szczepu Lactobacillus plantarum PL8 przedstawia Tabela 4.

PL 245526 Β1

Tab.4. Wynik analizy przeprowadzonej metodą MALDI-TOF MS dla szczepu Lactobacillus plantarum PL8.

Nazwa szczepu	Identyfikacja	Wskaźnik identyfikacji
PL8	Lactobacillus plantarum	2.21

Interpretacja wartości wskaźnika identyfikacji wg systemu MALDI Biotyper firmy Bruker:

Zakres	Opis
>2,00	Identyfikacja z wysoką pewnością (High-confidence Identification)
1,70-1,99	Identyfikacja z niską pewnością (Low-confidence Identification)
0,00-1,69	Brak możliwości identyfikacji (No organism Identification possible)

V. Oznaczenie wrażliwości na antybiotyki szczepu Lactobacillus plantarum PL8.

W celu zbadania lekooporności szczepu L. plantarum PL8 metodą dyfuzyjno-krążkową, zawiesinę hodowli (OD= 0,5 w skali McFarlanda) rozprowadzono na podłożu agarowym MRS (Oxoid) na płytce Petriego. Następnie podłoże z naniesioną zawiesiną pozostawiono w temperaturze pokojowej na 15 minut w celu jej wysuszenia. Po tym czasie na płytkę nanoszono za pomocą jałowej pęsety krążki nasączone odpowiednimi antybiotykami. Inkubację prowadzono w warunkach beztlenowych, przez 48 h w temp. 37°C. Po inkubacji zmierzono strefy zahamowanego wzrostu szczepu bakteryjnego wokół krążka z antybiotykiem (w mm). Odczytu lekooporności różnicującego szczep L. plantarum PL8 na wrażliwy i oporny, dokonano zgodnie z aktualną wersją EUCAST. W doświadczeniu wykorzystano następujące antybiotyki: penicylina, ciprofloksacyna, doksacyklina, oksacylina, kotrymoksazol, erytromycyna, ampicylina, klindamycyna, wankomycyna, gentamycyna, metronidazol (Oxoid).

Tab. 5. Wielkość stref zahamowania wzrostu otrzymanych dla badanego szczepu L. plantarum PL8 oraz szczepu wzorcowego L. plantarum ATCC 8014.

Antybiotyk Stężenie	L.planlarum PL8	L.planlarum ATCC 8014
Penicylina (P) 1 MS	23 mm	19 mm
Ciprofloksacyna (CIP) 5 MS	20 mm	15 mm
Doksacyklina (DO) 30 gg	25 mm	23 mm
Oksycylina (OX) 1 MS	10 mm	10 mm
Kotrymoksazol (SXT) 25 μβ	23 mm	23 mm
Erytromycyna (E) 15 MS	26 mm	26 mm
Ampicylina (AMP) 2 MS	24 mm	25 mm
Klindamycyna (DA) 2 MS	20 mm	28 mm
Gentamycyna (CN) 30 μβ	25 mm	25 mm
Wankomycyna (VA) 30 μβ	6 mm	6 mm
Metronidazol (MTZ) 5 MS	6 mm	6 mm

PL 245526 Β1

VI. Oznaczenie oporności szczepu Lactobacillus plantarum PL8 na sztuczny sok żołądkowy.

Celem badania było oznaczenie przeżywalności w sztucznym soku żołądkowym nowego szczepu Lactobacillus plantarum PL8. W celu oznaczenia stopnia oporności bakterii z rodzaju Lactobacillus spp. na pH soku żołądkowego posłużono się metodą Clarka, którą zmodyfikowano w ten sposób, iż zamiast stężonego kwasu solnego zastosowano sztuczny sok żołądkowy o pH równym 1.2 według następującego przepisu: 2.0 g NaCI, 3.2 g pepsyny w 7 ml 36% HCI o pH 1.2 rozpuszczono w 1000 ml wody destylowanej. Jałowy (po przesączeniu) sztuczny sok żołądkowy rozlewano po 1 ml do jałowych probówek, a następnie do każdej z nich kolejno dodawano po 100 pl świeżej (24-godzinnej) hodowli szczepu Lactobacillus plantarum PL8 o znanej gęstości. Mieszaninę inkubowano przez 30 min. w 37°C w warunkach ściśle beztlenowych. Po upływie wyznaczonego czasu mieszaninę starannie mieszano i wykonywano posiew dziesiętny w celu określenia otrzymanej gęstości końcowej.

Tab. 6. Przeżywalność szczepu Lactobacillus plantarum PL8 w sztucznym soku żołądkowym.

	Gęstość bakterii probiotycznych podana w j.t.k./ml
Nazwa szczepu	Czas wyjściowy	Po 30 min. inkubacji w sztucznym soku żołądkowym o pH 1.2
Lactobacillus plantarum PL8	3,0 x 10'	1.0 xl0⁶

VII. Oznaczenie oporności szczepu Lactobacillus plantarum PL8 na sole żółci.

Celem badania było oznaczenie oporności na sole żółci nowego szczepu Lactobacillus plantarum PL8. Oporność na sole żółci wyznaczono w oparciu o metodę Dashkevicz’a i Feighner’a (Dashkevicz M.P, Feighner S.D. 1989. Development of a differential medium for bile salt hydrolase-active Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 55(1), 1-16). Metoda ta polegała na dodaniu do agaru MRS lub BL barwnika wskaźnikowego - purpury bromokrezolowej (POCH) w ilości 0,17 g/l oraz soli żółci (OXGAL, Difco), wpięciu kolejnych stężeniach: 1 g/l, 2 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l. Na tak przygotowane stałe podłoża posiewano metodą redukcyjną po 100 pl hodowli szczepu L. plantarum PL8, który następnie inkubowano w standardowych warunkach beztlenowych przez 48 godz. Po zakończonej inkubacji kolonie szczepów opornych na dane stężenie soli żółci nabierały koloru jasnożółtego, jak również podłoże wzrostowe zmieniało swoje zabarwienie z fioletowego na żółte. Intensywność wzrostu badanego szczepu i zabarwienia podłoża na kolor żółty oceniono w skali półilościowej od - do +++.

Tab. 7. Oporność szczepu Lactobacillus plantarum PL8 na sole żółci w stężeniach: 1, 2, 5, 10, 20 p/l.

Stężenie soli żółci	L.plantarum PL8
1 g/l	+++
2 g/l	+++
5 g/l	+++
10 g/l	+++
20 g/l	++

Fig. 3 przedstawia oporność szczepu Lactobacillus plantarum PL8 na sole żółci w stężeniach: 1,2,5, 10,20 g/l.

VIII. Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillusplantarum PL8 wobec bakteryjnych czynników etiologicznych próchnicy oraz zaburzeń ze strony przewodu pokarmowego z wykorzystaniem metody półilościowej. Antagonizm szczepów probiotycznych wobec innych

PL 245526 Β1 bakterii chorobotwórczych jest jednym z dokładniej poznanych i udowodnionych mechanizmów działania bakterii z rodzaju Lactobacillus spp. i Bifidobacterium spp. w przewodzie pokarmowym. Polega on na eliminacji drobnoustrojów chorobotwórczych dzięki wytwarzanym metabolitom, takim jak: kwas mlekowy i octowy pochodzących głównie z fermentacji węglowodanów, syntezie swoistych związków antybakteryjnych czyli substancji podobnych do bakteriocyn: lantybiotyków, laktocyny czy acidofiliny. Substancje podobne do bakteriocyn lub bardziej precyzyjnie lantybiotyki są aktywnymi biologicznie, peptydowymi substancjami działającymi bakteriobójczo na blisko spokrewnione drobnoustroje. Mechanizm ich działania polega na wytworzeniu por w ścianie komórek wrażliwych bakterii, przez które wypływają niskocząsteczkowe substancje, takie jak jony i elektrolity zawarte w cytoplazmie, co w konsekwencji prowadzi do zniszczenia komórki. Szczepy wytwarzające bakteriocyny mają jednocześnie geny zabezpieczające je przed samounicestwieniem.

Metoda półilościowa (słupkowa):

Szczep Lactobacillus plantarum PL8 posiewano na stałe podłoże MRS Agar (Oxoid). Hodowlę przeprowadzano w warunkach ściśle beztlenowych przez 48 godzin w temp. 37°C. Po uzyskaniu wzrostu, wycinano w podłożu MRS Agar słupki o średnicy 9 mm, które nakładano następnie na płytki zawierające odpowiednie podłoże stałe z naniesionymi uprzednio za pomocą wymazówek zawiesinami szczepów wzorcowych o gęstości OD= 0,5 w skali McFarlanda (Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Streptococcus mutans PCM 2502, Campylobacter jejuni PCM 2627). Następnie płytki umieszczano na cztery godziny w lodówce w temp. 4°C, a po upływie tego czasu dalej inkubowano je w temperaturze 37°C, w warunkach tlenowych przez 18 godzin. Po inkubacji mierzono średnice stref zahamowania wzrostu szczepów wskaźnikowych podając wynik w mm.

Tab. 8. Antagonistyczne działanie badanego szczepu wobec wybranych czynników etiologicznych powodujących próchnicę oraz zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego w oparciu o metodę półilościową tzw. Metodę słupkową - strefa zahamowania podana w mm.

Szczep bakterii	Stopień zahamowania wzrostu czynników etiologicznych pod wpływem działania szczepu probiotycznego [mm]
Escherichia coli ATCC 25922	Salmonella enteritidis ATCC 13076	Staphylococcus aureus ATCC 25923	Streptococcus mutans PCM 2502	Campylobacter jejuni PCM 2627
L.plantarum PL8	22	17	14	14	22

IX. Oznaczenie właściwości adherencyjnych szczepu Lactobacillus plantarum PL8 do ludzkiej linii tkankowej Caco-2.

Adherencja (adhezja, przyleganie) bakterii do komórek ustroju gospodarza stanowi jeden z ważniejszych elementów opisu aktywności powierzchniowej bakterii. Uważana jest za niezbędny, pierwszy etap kolonizacji błon śluzowych, dotyczący zarówno bakterii patogennych, jak i tych stanowiących normalną florę ludzkiego organizmu. Różnego rodzaju procesy technologiczne odbywające się w poszczególnych etapach wytwarzania gotowego produktu mogą wpłynąć na właściwości probiotyczne poszczególnych szczepów będących substancją czynną przyszłego produktu probiotycznego. W celu sprawdzenia, czy szczep probiotyczny L. plantarum PL8 posiada pożądane cechy (w tym zdolność do adherencji) wykonano badania właściwości adherencyjnych do ludzkiej linii tkankowej nabłonka jelitowego Caco-2.

W celu zbadania adherencji szczepu Lactobacillus plantarum PL8 do tkanki nabłonkowej jelita (Caco-2) prowadzono hodowlę tkanki w atmosferze zawierającej 10% CO2 oraz w temperaturze 37°C,

PL 245526 Β1 w podłożu hodowlanym DMEM (Gibco) z dodatkiem 10% surowicy wołowej (FBS; Sigma-Aldrich). Czas hodowli wyniósł 15 dni. Płyny hodowlane wymieniano regularnie co 48 godzin. Po osiągnięciu zlewnego wzrostu, czyli tzw. „monolayeru”, komórki pasażowano stosując 0,25% Trypsynę (Sigma-Aldrich), a następnie przesiewano je na płytki 24-dołkowe (TPP) doprowadzając do gęstości 5 x 10⁵na dołek. Hodowlę tkankową linii Caco-2 prowadzono dalej na powierzchni jałowych szkiełek podstawowych umieszczonych na dnie 24-dołkowych płytek przez kolejne 3 dni do osiągnięcia na powierzchni szkiełek podstawowych zlewnego wzrostu. Następnie komórki przepłukiwano PBS bez jonów Ca²⁺ i Mg²⁺ (SigmaAldrich) i dodawano do kolejnych dołków po 100 pl odpowiednio przygotowanego szczepu Lactobacillus plantarum PL8. Szczep L plantarum PL8 hodowano w 10 ml płynnego podłoża MRS (Oxoid) przez 24 godziny w warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C. Po upływie tego czasu, sprawdzano gęstość hodowli za pomocą rozcieńczeń dziesiętnych. Szczep L. plantarum PL8 hodowano w 10 ml płynnego podłoża MRS Broth (Oxoid) przez 24 godziny w warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C. Po upływie tego czasu, sprawdzano gęstość hodowli za pomocą rozcieńczeń dziesiętnych. Do każdego dołka zawierającego wyhodowaną tkankę dodawano po 100 pl płynnej hodowli bakterii probiotycznych i uzupełniano 900 pl świeżego podłoża DMEM. Końcowa gęstość populacji badanej bakterii wynosiła w 1 ml około 1 χ 10⁸ j.t.k. Następnie komórki linii tkankowych wraz z badanym szczepem inkubowano w temp. 37°C w atmosferze o zwiększonej wilgotności i przy 10% zawartości CO2 przez okres 2 godzin. Po tym czasie komórki przepłukiwano PBS w celu usunięcia nie przywartych bakterii, a następnie całość utrwalano 3,7% paraformaldehydem w temperaturze 4°C przez okres 3 godzin. Następnie szkiełka płukano PBS i przeprowadzono ich barwienie metodą Grama. Preparat był oceniany w mikroskopie świetlnym pod powiększeniem 1000x. Komórki badanego szczepu L plantarum PL8, które zaadherowały do linii tkankowej były zliczane w 5 polach widzenia preparatu, a następnie wyliczano wynik średni, któremu przyporządkowano odpowiedni stopień adherencji zgodnie z zakresem podanym w literaturze (Tuomola E.M., Salminen S.J. 1998. Adhesion of some probiotic and dairy Lactobacillus strains to Caco-2 celi cultures. Int J Food Microbiol. 41,45-51):

+++ bardzo wysoki stopień adherencji (powyżej 80 komórek bakteryjnych w polu widzenia) ++ wysoki stopień adherencji (od 60 do 80 komórek bakteryjnych w polu widzenia) + średni stopień adherencji (od 40 do 60 komórek bakteryjnych w polu widzenia) słaby stopień adherencji (poniżej 40 komórek bakteryjnych w polu widzenia).

Tab.9. Wyniki adherencji szczepu Lactobacillus plantarum PL8 do ludzkiej linii tkankowej Caco-2.

Nazwa szczepu	Stopień adherencji	Średnia liczba komórek bakteryjnych w polu widzenia
L.plantarum PL8	+++	105

Fig. 5 przedstawia adherencję szczepu Lactobacillus plantarum PL8, do ludzkiej linii nabłonka jelitowego Caco-2.

XI. Sekwencjonowanie NGS (next generation sequencing) genomu szczepu bakterii Lactobacillus plantarum PL8.

Z uwagi na duże podobieństwo pomiędzy szczepami bakterii probiotycznych pochodzenia ludzkiego metodą, która pozwala na ich zróżnicowanie jest sekwencjonowanie pełnego genomu metodą NGS (next generation sequencing).

Metoda ta opiera się o równoległe, masowe sekwencjonowanie od kilku tysięcy do kilkuset milionów różnych matryc tzw. bibliotek. Tym samym charakteryzuje ją bardzo wysoka przepustowość oraz analiza ogromnej ilości danych w stosunkowo krótkim czasie.

W celu przeprowadzenia sekwencjonowania NGS genomu szczepu bakterii Lactobacillus plantarum PL8 wykonano izolację genomowego DNA z wykorzystaniem komercyjnego zestawu opartego o lizę mechaniczną i enzymatyczną. Analizę molekularną wykonano z zastosowaniem technologii całogenomowego sekwencjonowania nanoporowego (Oxford Nanopore Technology).

Dane z sekwencjonowania zostały przefiltrowane pod kątem jakości otrzymanych odczytów wg kryteriów:

- średnia jakość odczytów >= 8 phred score

- średnia jakość fragmentów odczytu o rozmiarze okna 500 bp >= 5 phred score

- długość odczytów >= 4,800 bp.

PL 245526 Β1

Statystyki danych po filtrowaniu przedstawia Tabela 10.

Tab. 10. Statystyki otrzymanych danych z sekwencjonowania po filtrowaniu.

Nazwa szczepu	Liczba odczytów	Całkowita liczba zasad	Średnia długość odczytów	Średnia jakość odczytów [phred scorc]	Długość odczytana N50
PL8	11,611	123,307,024	10,620 bp	12.1	12,026 bp

Dla próbki przeprowadzono składanie odczytów de novo za pomocą narzędzi Unicycler, Racon oraz Medaka. Uzyskano następujące główne złożenia genomowe (Tabela 11).

Tab. 11. Zestawienie głównych założeń genomowych, utworzonych za pomocą programów Unicycler, Racon i Medaka.

Nazwa szczepu	Długość kontigu	Średni stopień pokrycia	Cyrkularny
PL8	3016023 bp	28,4x	tak

Identyfikacja taksonomiczna pojedynczych odczytów algorytmem Centrifuge wykazała następującą klasyfikację szczepu Lactobacillus plantarum PL8 do rodzaju oraz gatunku: L plantarum 77,5%, Lactobacillus 93,6%.

Identyfikacja taksonomiczna otrzymanych założeń genomowych algorytmem Blast wykazała podobieństwo do L plantarum na poziomie: 86% pokrycia, 97,04% identyczności.

Oprócz założeń genomowych otrzymano również krótsze kontigi. W Tabeli 12 przedstawiono dodatkowe kontigi powstałe po analizie programem Flye i polishingu Racon i Medaka.

Tab. 12. Zestawienie otrzymanych krótszych kontigówza pomocą programu Flye i polishingu Racon i Medaka.

Kontigi z numerem 1 są głównymi kontigami chromosomowymi i zostały uwzględnione w Tabeli 12.

Nazwa szczepu	Kontig	Długość kontigu	Średni stopień pokrycia	Cyrkularny
PL8	2	15864 bp	873,3x	tak
3	38377 bp	151,8x	tak
4	57106 bp	98,2x	lak
5	62653 bp	110,2x	tak
6	7069 bp	85,3x	tak
7	51414 bp	23,5x	tak
8	30476 bp	150,7x	tak

Sekwencję genomową szczepu L. plantarum PL8 prezentuje Załącznik 1 w postaci elektronicznej.

Na podstawie poznanych sekwencji genomu szczepu L. plantarum PL8 przeprowadzono analizę genomu za pomocą programu PROKKA (załącznik nr 2) w celu wyszukania genów kodujących szczególnie ważne funkcje z punktu widzenia jego przydatności jako szczepu probiotycznego dobrze przystosowanego do namnażania w warunkach przemysłowych. Analiza wykazała niezwykłą plastyczność i zdolności adaptacyjne szczepu Lactobacillus plantarum PL8. W genomie tego szczepu są szczepy kodujące oporność na roztwory o wysokiej osmolarności. Jednak najważniejsza z punktu widzenia funkcjonalności tego szczepu jest obecność wielokrotnych kopii genów kodujących syntezę witamin: ryboflawiny, tiaminy, kobalaminy, pantotenianu, oraz karoteinodów i kwasu foliowego. L. plantarum PL8 posiada ponadto geny kodujące właściwości antyoksydacyjne, w postaci enzymu oksydoreduktazy i inne umożliwiające usuwanie jonów nadtlenkowych (trxB, mrsB, purK). Szczep PL8 posada także geny odpowiedzialne za wiązanie metali, zarówno żelaza, jak i magnezu (hisE, hisD). Niezwykle istotne są geny obecne w genomie szczepu Lactobacillus plantarum PL8 umożliwiające wiązanie do powierzchni komórek: produkcję egzopolisacharydów i wiązanie fibronektyny (eno, ppl).

X. Zastosowanie wynalazku.

Badania nad przeżywalnością szczepu Lactobacillus plantarum PL8 w warunkach przemysłowych.

W celu określenia przeżywalności szczepu Lactobacillus plantarum PL8 w warunkach przemysłowych, porównano wzrost badanego szczepu na podłożach produkcyjnych względem wzrostu na standardowym podłożu laboratoryjnym dedykowanym dla bakterii z rodzaju Lactobacillus spp. tj. MRS Broth firmy Oxoid (podłoże kontrolne).

Zastosowano następujące warunki hodowli szczepu Lactobacillus plantarum PL8, odzwierciedlające parametry stosowane w wielu procesach przemysłowych przy produkcji żywności:

• temperatura: 45°C, • pH: 5,1, • wilgotność: 100% • warunki: tlenowe.

W celu przeprowadzenia badań szczep Lactobacillus plantarum PL8 zawieszano w następujących płynnych podłożach wzrostowych:

• podłoże kontrolne (MRS Broth), • podłoże przemysłowe z kazeiną, • podłoże przemysłowe z glicyną i treoniną, • podłoże przemysłowe z lizyną, • podłoże przemysłowe z peptonem roślinnym.

W tym celu pobierano jedno oczko ezy 24-godzinnej hodowli szczepu Lactobacillus plantarum PL8 na płytkach stałych i zawieszano w 10 ml danego podłoża płynnego. Hodowlę prowadzono przez 48 godzin w temperaturze 45°C, w warunkach tlenowych, wilgotności 100% oraz pH: 5,1. Liczebność bakterii w poszczególnych podłożach przemysłowych sprawdzano za pomocą metody rozcieńczeń dziesiętnych w następujących punktach czasowych: na początku hodowli (0h) oraz po upływie 12, 24, 36 oraz 48 godzin inkubacji. Liczbę wyrosłych na podłożach stałych kolonii zliczano, a wyniki podawano w jednostkach tworzących kolonie w przeliczeniu na 1 ml (j.t.k./ml). W tych samych punktach czasowych przeprowadzano również pomiar pH hodowli. Uzyskane wyniki prezentują Tabele 13-14 oraz Ryciny 6-7.

PL 245526 Β1

Tab. 13. Porównanie przeżywalności szczepu Lactobacillus plantarum PL8 w podłożach przemysłowych.

Szczep bakterii	Rodzaj podłoża	Liczebność bakterii [j.t.k./ml]
Oh	12h	24h	36h	48h
L. plantarum PL8	Podłoże kontrolne	4,8xl0⁷	2,0xl0⁹	2,5xl0⁹	l,2xl0⁹	4,0xl0⁸
Podłoże przemysłowe z kazeiną	9,0xl0⁷	6,0xl0⁹	5,0xl0⁹	3,0xl0⁹	6,0xl0⁸
Podłoże przemysłowe z glicyną i treoniną	6,3xl0⁷	2,0xl0⁸	2,0xl0⁹	l,5xl0⁹	Ι,ΟχΙΟ⁸
Podłoże przemysłowe z lizyną	5,3xl0⁷	3,2xl0⁸	l,5xl0⁹	8,8xl0⁸	Ι,ΟχΙΟ⁸
Podłoże przemysłowe z peptonem roślinnym	6,8xl0⁷	l,2x!0⁸	l,8x!0⁹	2,3xl0⁹	5,0xl0⁸

Porównanie przeżywalności szczepu Lactobacillus plantarum PL8 w podłożach przemysłowych przestawiono na Fig. 6.

PL 245526 Β1

Tab.14. Porównanie wartości pH hodowli szczepu Lactobacillus plantarum PL8 w różnych podłożach przemysłowych.

Szczep bakterii	Rodzaj podłoża	Wartość pH
Oh	12h	24h	26h	48h
L.plantarum PL8	Podłoże kontrolne	5,90	5,21	3,56	3,36	3,31
Podłoże przemysłowe z kazeiną	5,91	5,15	3,53	3,51	3,41
Podłoże przemysłowe z glicyną i treoniną	5,98	5,22	3,43	3,38	3,33
Podłoże przemysłowe z lizyną	6,03	5,15	3,39	3,35	3,31
Podłoże przemysłowe z peptonem roślinnym	5,70	4,98	3,29	3,33	3,30

Porównanie wartości pH hodowli szczepu Lactobacillus plantarum PL8 w różnych podłożach przemysłowych przedstawiono na Fig. 7.

Przeprowadzone badania wykazały, że szczep Lactobacillus plantarum PL8 zachowuje analogiczną żywotność w badanych podłożach przemysłowych, co w podłożu kontrolnym. Dodatkowo szczep ten doskonale znosi warunki przemysłowe hodowli tj. niskie pH, podwyższoną temperaturę i wilgotność oraz warunki tlenowe co świadczy o jego świetnym przystosowaniu do parametrów wykorzystywanych chociażby w produkcji żywości i wysokim potencjale zastosowania w tym sektorze przemysłowym.

Szczep Lactobacillus plantarum PL8 różni się od pozostałych szczepów probiotycznych tym, że równocześnie:

• jako jeden z pierwszych szczepów pochodzenia ludzkiego, wyizolowanych w Polsce, posiada w pełni poznaną sekwencję genomową wyznaczoną przy pomocy NGS (next generation sequencing) - w chwili obecnej najnowocześniejszej technologii sekwencjonowania, • został wyizolowany z przewodu pokarmowego zdrowego dziecka stąd wykazuje wysoki stopień adherencji do ludzkiej linii tkankowej nabłonka jelitowego (Caco-2) dzięki czemu może blokować adherencję innych bakterii i grzybów chorobotwórczych, • wykazuje dużą oporność na niskie pH i działanie sztucznego soku żołądkowego. Szczep ten po upływie 30 min. redukował swoją populację średnio o 1 log, co może świadczyć o jego doskonałym przystosowaniu do niesprzyjających warunków panującym w trakcie pasażu przez żołądek i dwunastnicę, co jest warunkiem niezbędnym dla probiotyków działających w ludzkim przewodzie pokarmowym.

• wykazuje wysoką skuteczność wobec patogennych bakterii (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Campylobacter fetus) będących najczęstszymi czynnikami etiologicznymi zakażeń bakteryjnych przewodu pokarmowego, a zatem może być wykorzystany jako składnik czynny suplementów diety przeznaczonych do zapobiegania takim zakażeniom i do poprawiania składu zaburzonej mikrobioty jelitowej poprzez hamowanie populacji tych patogennych bakterii dla człowieka i zwiększanie populacji bakterii stanowiących podstawowe składniki prawidłowej mikrobioty jelita.

• wykazuje wysoką skuteczność wobec patogennych bakterii z gatunku Streptococcus mutans będących najpoważniejszą przyczyną próchnicy zębów, a zatem może być wykorzystywany jako składnik produktów zapobiegających próchnicy poprzez zwiększenie udziału bakterii antagonistycznych wobec Streptococcus mutans w mikrobiocie jamy ustnej w postaci różnych preparatów do żucia i ssania.

• wykazuje wysoką przeżywalność w warunkach produkcyjnych (m.in. podwyższonej temperaturze czy wilgotności) stąd może zostać wykorzystany jako probiotyczny składnik funkcjonalny w różnych środkach spożywczy.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Szczep Lactobacillus plantarum oznaczony symbolem PL8 zdeponowany, zgodnie z traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego, w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu w dniu 03 lutego 2022 roku pod numerem B/00372 posiadający sekwencję genomową przedstawioną w załączniku nr 1.
2. Szczep Lactobacillus plantarum PL8 zdeponowany pod numerem B/00372 według zastrz. 1 znamienny tym, że jest zdolny przetrwać w temperaturze do 45 stopni C.
3. Szczep Lactobacillus plantarum PL8 zdeponowany pod numerem B/00372 według zastrz. 1 znamienny tym, że ma geny trxB, trxD, mrsB, purK kodujące właściwości antyoksydacyjne zgodnie z analizą sekwencji genomowej przedstawionej w załączniku nr 2.
4. Szczep Lactobacillus plantarum PL8 zdeponowany pod numerem B/00372 według zastrz. 1 znamienny tym, że ma geny hisE, hisD odpowiedzialne za wiązanie metali zgodnie z analizą sekwencji genomowej przedstawionej w załączniku nr 2.
5. Szczep Lactobacillus plantarum PL8 zdeponowany pod numerem B/00372 według zastrz. 1 znamienny tym, że ma geny eno, ppl umożliwiające wiązanie do powierzchni komórek zgodnie z analizą sekwencji genomowej przedstawionej w załączniku nr 2.
6. Szczep Lactobacillus plantarum PL8 zdeponowany pod numerem B/00372 według zastrz. 1 znamienny tym, że ma geny ruvA, ruvB, uvrC, lexA, clpC,clpB_1, clpB_2, grpE odpowiedzialne za odporność na stres w tym wysoką temperaturę zgodnie z analizą sekwencji genomowej przedstawionej w załączniku nr 2.
7. Szczep Lactobacillus plantarum PL8 zdeponowany pod numerem B/00372 według zastrz. 1 znamienny tym, że ma geny kodujące syntezę witamin: ryboflawiny (ribD_1, ribD_2, ribE, ribF_1, ribF_2, ribT), pirodyksyny (serC),darniny (thiM, thiD, thil) oraz karoteinodów i kwasu foliowego (folB, folK, folP) zgodnie z analizą sekwencji genomowej przedstawionej w załączniku nr 2.
8. Szczep Lactobacillus plantarum PL8 zdeponowany pod numerem B/00372 do zastosowania do wytwarzania środków spożywczych, których proces technologiczny odbywa się w temperaturze do 45 stopni Celsjusza.
9. Szczep Lactobacillus plantarum PL8 zdeponowany pod numerem B/00372 do zastosowania według zastrz. 8 znamienny tym, że produktami spożywczymi są wyroby czekoladowe.