PL230914B1 - Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin leśnych, metodą Real Time PCR - Google Patents
Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin leśnych, metodą Real Time PCRInfo
- Publication number
- PL230914B1 PL230914B1 PL410982A PL41098215A PL230914B1 PL 230914 B1 PL230914 B1 PL 230914B1 PL 410982 A PL410982 A PL 410982A PL 41098215 A PL41098215 A PL 41098215A PL 230914 B1 PL230914 B1 PL 230914B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- species
- identification
- nematodes
- time pcr
- name sequence
- Prior art date
Links
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 title abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 38
- 241000243772 Bursaphelenchus mucronatus Species 0.000 claims abstract description 12
- 241001540472 Mesocriconema xenoplax Species 0.000 claims abstract description 9
- 241000071675 Rotylenchus uniformis Species 0.000 claims abstract 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 20
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 15
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 11
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 5
- 241000243770 Bursaphelenchus Species 0.000 claims description 4
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims description 4
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 claims 1
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 241000243771 Bursaphelenchus xylophilus Species 0.000 description 7
- 241000710331 Rotylenchus robustus Species 0.000 description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 7
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 6
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 2
- 241001540484 Criconematidae Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241001540493 Hoplolaiminae Species 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 2
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241001467594 Aphelenchoididae Species 0.000 description 1
- 241001150670 Bursaphelenchus crenati Species 0.000 description 1
- 241000426601 Bursaphelenchus fraudulentus Species 0.000 description 1
- 241000233087 Bursaphelenchus tiliae Species 0.000 description 1
- 241001481710 Cerambycidae Species 0.000 description 1
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 1
- 241001267662 Criconemoides Species 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102100030378 Hemoglobin subunit theta-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000843063 Homo sapiens Hemoglobin subunit theta-1 Proteins 0.000 description 1
- 241001540470 Mesocriconema Species 0.000 description 1
- 241001251426 Mesocriconema curvatum Species 0.000 description 1
- 241001251429 Mesocriconema rusticum Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000855013 Rotylenchus Species 0.000 description 1
- 241000300990 Rotylenchus agnetis Species 0.000 description 1
- 241001132771 Rotylenchus buxophilus Species 0.000 description 1
- 241000416883 Rotylenchus paravitis Species 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000529915 Xylophilus Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000024293 detection of nematode Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008659 phytopathology Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Ujawniono zarówno sposób jak i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin leśnych, metodą Real Time PCR. W szczególności wynalazek dotyczy sposobu i zestawu do identyfikacji nicieni obejmujących gatunki Bursaphelenchus mucronatus, Mesocriconema xenoplax, oraz Rotylenchus uniformis. Dzięki specyficznie dobranym starterom i sondom rozwiązanie umożliwia precyzyjną identyfikację wskazanych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin leśnych, metodą Real Time PCR. W szczególności, wynalazek dotyczy sposobu i zestawu do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Bursaphelenchus mucronatus z rodziny Aphelenchoididae, Mesocriconema xenoplax z rodziny Criconematidae, oraz Rotylenchus uniformis z rodziny Hoplolaiminae.
Bursaphelenchus xylophilus jest pasożytem drzew iglastych i jest groźnym szkodnikiem drzew iglastych powodującym tzw. „chorobę więdnięcia sosen”. Żyjąc w przewodach żywicznych, namnaża się. Tym doprowadza do ich zatykania, a w konsekwencji do śmierci rośliny. B. xylophilus jest przenoszony przez różne owady rozwijające się w zasiedlonym przez niego drewnie, a zwłaszcza z rodziny kózkowatych (Cerambycidae). Znajduje się na liście organizmów kwarantannowych. Bursaphelenchus mucronatus podobnie jak B. xylophilus należy do grupy „xylophilus” w obrębie rodzaju Bursaphelenchus.
Identyfikacja gatunków nicieni oparta jest na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych, w tym diagnozowane są m.in.: zabarwienie samicy na poszczególnych etapach rozwojowych, kształt cysty, długość i kształt guzów sztyletu, długość larwy inwazyjnej, wzór na płytce perinealnej. Jest to jednak analiza bardzo pracochłonna i czasochłonna. Wymaga dużo wiedzy i doświadczenia w pracy z materiałem biologicznym. Ponadto, istnieje możliwość nachodzenia na siebie wymiarów różnych gatunków. Metody opartej na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych nie można zastosować do identyfikacji młodocianych osobników, u których cechy morfologiczne nie są jeszcze wykształcone.
Obecnie w diagnostyce nematologicznej coraz częściej stosowane są techniki oparte na analizie kwasów nukleinowych, w tym wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Podstawą techniki PCR jest powielenie fragmentu/ów DNA, specyficznego dla określonego organizmu, do poziomu umożliwiającego jego szybką i prostą detekcję przy użyciu elektroforezy. Uzyskuje się to stosując krótkie jednoniciowe oligonukleotydy (12-40 nukleotydów), tzw. startery, specyficzne dla powielanego fragmentu DNA oraz enzym - termostabilną polimerazę, która umożliwia powielenie żądanego fragmentu w cyklicznej, trzyetapowej reakcji, złożonej z denaturacji, wiązania starterów oraz syntezy DNA. Zazwyczaj po około 30 cyklach reakcji uzyskuje się ponad milion kopii powielanego fragmentu DNA, co pozwala zidentyfikować go techniką elektroforezy żelowej.
Udoskonaleniem łańcuchowej reakcji polimerazy jest Real-Time PCR, to jest reakcji PCR z pomiarem ilości powielonego fragmentu w każdym cyklu reakcji. Do pomiaru ilości powielonego fragmentu wykorzystuje się fluorochromy (barwniki fluorescencyjne), np.: SYBR Green I, SYTO9, Eva Green, SYBR Gold, których fluorescencja jest proporcjonalna do ilości powielonego fragmentu. Identyfikację powstałych produktów przeprowadza się poprzez pomiar wielkości fluorescencji oraz analizę krzywej topnienia produktów reakcji bez elektroforezy. Czułość reakcji Real Time PCR jest znacznie większa niż tradycyjnego PCR, a brak elektroforezy skraca czas analizy. Wadą Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi (podobnie jak tradycyjnego PCR) jest ograniczona specyficzność reakcji. W większości przypadków reakcja PCR zachodzi nie tylko w przypadku 100% identyczności sekwencji starterów do sekwencji matrycy lecz również gdy 1-2 nukleotydy są nieidentyczne. Ta właściwość tradycyjnego PCR i Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi wymaga precyzyjnego ustawienia parametrów termicznych reakcji. Ponadto, barwniki fluorescencyjne wiążą się z każdym dwuniciowym fragmentem DNA, powstałym również w wyniku amplifikacji starterów (produkty primer-primer, primer-dimer), co wymaga również starannego doboru odpowiedniego stężenia starterów. Alternatywą dla barwników fluorescencyjnych są sondy DNA znakowane fluorescencyjnie. Są to krótkie odcinki DNA, komplementarne do poszukiwanej sekwencji, które po przyłączeniu do DNA podczas reakcji PCR emitują fluorescencję o określonej długości fali. Obecnie znanych jest kilka rodzajów sond, np.: TaqMan, FRET, molecular beacons czy scorpions. Specyficzność reakcji Real-Time PCR ze znakowanymi sondami jest znacznie wyższa niż z barwnikami fluorescencyjnymi. W odróżnieniu od starterów niedopasowanie jednego nukleotydu w sekwencji sondy prowadzi przeważnie do braku reakcji lub bardzo istotnego zmniejszenia wydajności, co jest łatwe do stwierdzenia podczas monitorowania przebiegu reakcji lub analizy wyników reakcji.
Dotychczas najczęściej stosowaną metodą molekularnej identyfikacji nicieni było PCR. McCuiston J.L., Hudson L.C. Subbotin S.A., Davis E.L., Warfield C.Y. Conventional and PCR Detection of Aphelenchoides fragariae in Diverse Ornamental Host Plant Species. J Nematol. Dec 2007; 39(4): 343-355 opracowali startery do identyfikacji Aphelenchoides fragariae.
PL230 914B1
Stosowano metodę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych PCR-RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism) wykorzystującą enzymy restrykcyjne, które tną nić DNA w specyficznym dla siebie miejscu. Różnice w długości pociętych fragmentów DNA świadczą o zmienności. Burgermeister W., Metge K., Braasch H., Buchbach E. 2005. ITS-RFLP patterns fordifferentiation of 26 Bursaphelenchus species (Nematoda: Parasitaphelenchidae) and observations on their distribution. Russian Journal of Nematology, 13: 29-42 opracowali metodę PCR-RFLP do identyfikacji 44 gatunków Bursaphelenchus między innymi również do identyfikacji Bursaphelenchus mucronatus. Identyfikacja B. mucronatus metodą PCR-RFLP została opisana również w publikacji Zheng J., Subbotin S.A., He S., Gu J., Moens M. 2003. Molecularcharacterisation ofsome Asian isolates of Bursaphelenchus xylophilus and B. mucronatus using PCR-RFLPs and sequences of ribosomal DNA. Russian Journal of Nematology 11 (1): 17-22.
Do identyfikacji B. xylophylus z powodzeniem stosowano metodę Real Time PCR (Cao Α.Χ., Liu Χ.Ζ., Zhu S.F., Lu B.S. Detection ofthe Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus, Using a Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 2005 May;95(5):566-571; Ye W., Giblin-Davis R.M. Molecular characterization and development of real-time PCR assay for pine-wood nematode Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Parasitaphelenchidae). PLoS One. 2013 Nov 11 ;8(11):e78804. doi: 10.1371/journal.pone.0078804).
Identyfikację Mesocriconema xenoplax poprzez sekwencjonowanie DNA opisano w publikacji Cordero M.A., Robbins R.T., Szalanski A.L. 2012. Taxonomic and Molecular Identification of Mesocriconema and Criconemoides Species (Nematoda: Criconematidae). Journal of Nematology 44(4):399-426. Podobnie, identyfikację Rotylenchus uniformis poprzez sekwencjonowanie DNA opisano w pracach Bae C.H., Szalanski A.L., Robbins R.T. 2009 Phylogenetic Analysis ofthe Hoplolaiminae Inferred from Combined D2 and D3 Expansion Segments of 28S rDNA. Journal of Nematology 41(1):28-34. oraz Cantalapiedra-Navarretea C, Navas-Cortesa J.A., Liebanasb G., Vovlasc N., Subbotin S.A., Palomares-Riusa J.E., Castillo P. 2013. Comparative molecular and morphological characterisations in the nematode genus Rotylenchus·. Rotylenchus paravitis n. sp., an example of cryptic speciation. Zoologischer Anzeiger252: 246-268.
W stanie techniki istnieje nadal potrzeba dostarczenia narzędzia umożliwiającego detekcję wybranych gatunków nicieni nieidentyfikowanych metodami genetycznymi, jak również dostarczenia udoskonalonego sposobu identyfikacji tych gatunków nicieni, które są wykrywane znanymi technikami genetycznymi natomiast nie zapewniają wysokiej precyzyjności i nie wykluczają błędów w analizie.
Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu umożliwiającego identyfikację gatunków nicieni z dużą czułością i specyficznością. Celem wynalazku jest również dostarczenie sposobu identyfikacji nicieni, które nie były dotychczas wykrywane metodami analizy materiału genetycznego badanych gatunków. Celem wynalazku jest również dostarczenie nowych sekwencji nukleotydowych starterów i sond bądź nieoczywistego wyboru znanych sekwencji i sond, mających zastosowanie w sposobie wykrywania nicieni techniką PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Powyższe cele zrealizowano w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji nicieni w próbce gleby wybranych z grupy zawierającej gatunki Bursaphelenchus mucronatus, Mesocriconema xenoplax oraz Rotylenchus uniformis, obejmujący następujące etapy:
a) dostarczenie próbki gleby zawierającej nicienie do identyfikacji;
b) wypłukanie nicieni z gleby;
c) izolację DNA;
d) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3’ i 5’ oraz sondy;
e) e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji PCR, zwłaszcza, Real-Time PCR stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę wybrane z listy:
| Galunek | 5‘ starter | 3’ starter | Sonda | |||
| Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | |
| fiiirsapheienchits mucrrmaius | Bmucfv | gatgcglfttltagaggac | Bmuerv | ggaagitacglagagcaca | Bmuc | aa caccgac cc acc cgał aa |
| feso c h eon en i a xe 11 oplti. v | Mxefv | cllgętęglat.lgglctg | Mxerv | cagellctacaccgagae | Mxe | ccUcEegLeełcttetcaa |
| Koiyleftchtts im ifonnis | Runfv | acggaccaaggagtltag | Runrv | cceaggatcacacatcag | Run | caggggagacettcaetucaii |
PL230 914B1
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Bursaphelenchus mucronatus, Mesocriconema xenoplax, oraz Rotylenchus uniformis, metodą PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę wybrane z listy:
| Gatunek | 5' starter | 3' starter | Sonda | |||
| Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | |
| BursaphetendiHS mucnmiłlttx | Braucfv | galgcglgtilagaggac | Bntucrv | ggaagaacgiagagcaca | Bmuc | aacaccgacccaccccaiaa |
| Mesttcriconenta xenoplax | Mxefv | cttgctcgtaclggti.lg | Mxerv | cagcitctacaccgugag | Mxe | ccigctcgtgct attateaa |
| Roiyłencłtus uniformis | Runfv | aeggaeeaaggaguia.£ | Runrv | cccaggatcacaeatcng | Run | caggggagaccltcactttcatt |
Mieszanina reakcyjna zawiera bufor, termostabilnąTaq polimerazę, jony magnezu, startery i sondę. Stężenie starterów w mieszaninie reakcyjnej wynosi 1-2 μΜ, sondy 50-100 nM, jonów magnezu 2-5 mM. Reakcję prowadzi się przy temperaturze przyłączania starterów i 55-60°C, w objętości mieszaniny reakcyjnej 10-20 μΙ, przy zastosowaniu od 35 do 40 cykli reakcji. Identyfikacji produktów dokonuje się poprzez porównanie krzywych amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej.
Nazwom sekwencji starterów oraz sond odpowiadają kolejne numery sekwencji: Bmucfv (SEKW NR ID: 1), Bmucrv (SEKW NR ID: 2), Bmuc (SEKW NR ID: 3), Mxefv (SEKW NR ID: 4), Mxerv (SEKW NR ID: 5), Mxe (SEKW NR ID: 6), Runfv (SEKW NR ID: 7), Runrv (SEKW NR ID: 8), Run (SEKW NR ID: 9).
Fig. 1 Przedstawia krzywe amplifikacji dla Bursaphelenchus mucronatus.
Fig. 2 Przedstawia krzywe amplifikacji dla Mesocriconema xenoplax.
Fig. 3 Przedstawia krzywe amplifikacji dla Rotylenchus uniformis.
Poniżej podano przykłady identyfikacji każdego z wchodzących w skład zestawu gatunków nicieni. Każdorazowo identycznym warunkom izolacji i amplifikacji poddawano próbę zerową (dejonizowana H2O wolna od nukleaz) oraz próbę ujemną. Materiałem dla próby ujemnej było DNA gatunku nicienia należącego do tego samego rodzaju co badany, mieszanina równych ilości DNA nicieni należących do tego samego gatunku co badany gatunek lub w przypadku braku gatunków należących do tego samego rodzaju, gatunek z tej samej rodziny.
Przykład 1
Identyfikacja nicieni z gatunku Bursaphelenchus mucronatus.
DNA izolowano przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji DNA NucleoSpin Tissue XS firmy Macherey-Nagel. W reakcji użyto starterów i sondy o następujących sekwencjach:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Bmucfv | gatgcglgtuagaggac |
| Bmucrv | ggaagaacgtagagcaca |
| Bmuc | aaeaccgaeccaccegaiaa |
Reakcję Real-Time PCR przeprowadzano w mieszaninie o objętości 20 μΙ w aparacie RotorGene 6000 firmy Qiagen przy użyciu odczynników z zestawu LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich) w następujących ilościach:
- H2O wolna od nukleaz do objętości 20 μΙ,
- 2 μ110,0 μΜ każdego ze starterów Bmucfv i Bmucrv,
- 1 μΙ 4,0 μΜ sondy Bmuc znakowanej na końcu 5’ barwnikiem JOE, a 3’-końcu wygaszaczem HBQ1,
- 10 μΙ 2X LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich),
- 2 μΙ DNA.
Mieszaninę reakcyjną umieszczano w probówce o objętości 20 μΙ, umieszczano w rotorze termocyklera RotorGene 6000 i przeprowadzano reakcję amplifikacji w 40 cyklach w następujących warunkach:
| Etap | Temperatura f°Cl | Czas |s| | Pomiar lluorescencji | |
| Prc-inkubacja | 95 | ISO | - | |
| Amplifikacja | denaturacja | 95 | 30 | - |
| przyłączanie | 55 | 30 | pojedynczy | |
| synteza | 72 | 30 | - | |
| Chłodzenie | 40 | 20 | - |
PL230 914B1
Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Bursaphelenchus crenati, Bursaphelenchus fraudulentus i Bursaphelenchus tiliae.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 1. Przykład 2
Identyfikacja nicieni z gatunku Mesocriconema xenoplax.
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Mxcfv | cttgctcgtactggtctg |
| Mxerv | cagcitetacaecgagag |
| Mxe | cctgetcgtgctgtlgtcaa |
Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Mesocriconema curvatum i Mesocriconema rusticum. Krzywe amplifikacji uzyskane wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 2. Przykład 3
Identyfikacja nicieni z gatunku Rotylenchus uniformis.
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Runfv | aeggaceaaggagtttag |
| Rnnrv | eecaggateaeaealcag |
| Run | caggggagacctteacttlcatl |
Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Rotylenchus agnetis, Rotylenchus buxophilus i Rotylenchus robustus.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 3.
Rozwiązanie według wynalazku pozwala na wykrycie nicieni w glebie w przeciągu kilku godzin, uwzględniając w tym etapy przygotowania prób, izolacji DNA oraz reakcji Real-Time PCR. Metodę według wynalazku, można zastosować do identyfikacji wyżej wymienionych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Proponowany zestaw sond pozwala identyfikować wyżej wymienione gatunki nicieni w reakcji Real-Time PCR, która jest znacznie czulsza i szybsza od innych metod PCR. Zastosowanie w reakcji Real-Time PCR sond znacznie zwiększa specyficzność reakcji w stosunku do reakcji Real-Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi.
Claims (2)
1. Sposób identyfikacji gatunków nicieni Bursaphelenchus mucronatus, Mesocriconema xenoplax, oraz Rotylenchus uniformis w próbce gleby, obejmujący następujące etapy:
a) dostarczenie próbki gleby zawierającej nicienie do identyfikacji;
b) wypłukanie nicieni z gleby;
c) izolację DNA;
d) przeprowadzenie reakcji Real-Time PCR z zastosowaniem pary starterów 3’ i 5’ oraz sondy;
e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji Real-Time PCR, stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondy wybrane z listy:
PL230 914B1
2. Zestaw do identyfikacji gatunków nicieni Bursaphelenchus mucronatus, Mesocriconema xenoplax, oraz Rotylenchus uniformis metodą Real-Time PCR zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondy wybrane i listy:
Rysunki
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410982A PL230914B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin leśnych, metodą Real Time PCR |
| EP15744709.5A EP3245297B1 (en) | 2015-01-16 | 2015-06-11 | Method and kit for identification of nematodes, forest plant pests, by real-time pcr |
| PCT/PL2015/000092 WO2016114675A1 (en) | 2015-01-16 | 2015-06-11 | Method and kit for identification of nematodes, forest plant pests, by real-time pcr |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410982A PL230914B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin leśnych, metodą Real Time PCR |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL410982A1 PL410982A1 (pl) | 2016-07-18 |
| PL230914B1 true PL230914B1 (pl) | 2019-01-31 |
Family
ID=53762267
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL410982A PL230914B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin leśnych, metodą Real Time PCR |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3245297B1 (pl) |
| PL (1) | PL230914B1 (pl) |
| WO (1) | WO2016114675A1 (pl) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113957153A (zh) * | 2021-07-07 | 2022-01-21 | 重庆市渝东南农业科学院 | 一种新型松材线虫检测方法 |
| CN120400366A (zh) * | 2025-05-13 | 2025-08-01 | 南京闪检生命科技有限公司 | 一种高效检测松材线虫的引物及探针 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE432996T1 (de) * | 2003-04-14 | 2009-06-15 | Bedrijfslaboratorium Voor Gron | Verfahren zur bestimmung des bodenzustands |
| KR20100019645A (ko) * | 2008-08-11 | 2010-02-19 | 경상북도 | Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ＰＣＲ을 이용한 소나무재선충(Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ)과 유사재선충(Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ)의 분석 방법 |
-
2015
- 2015-01-16 PL PL410982A patent/PL230914B1/pl unknown
- 2015-06-11 EP EP15744709.5A patent/EP3245297B1/en active Active
- 2015-06-11 WO PCT/PL2015/000092 patent/WO2016114675A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2016114675A1 (en) | 2016-07-21 |
| EP3245297B1 (en) | 2020-01-01 |
| PL410982A1 (pl) | 2016-07-18 |
| EP3245297A1 (en) | 2017-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106893764A (zh) | 一种青枯菌的lamp检测引物组合及其lamp检测试剂盒和lamp方法 | |
| PL230914B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| RU2612137C1 (ru) | Способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica и Francisella tularensis subsp. holarctica | |
| KR102258934B1 (ko) | 라임병 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트 | |
| KR20190121600A (ko) | 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 뎅기 바이러스 혈청형 검출세트 및 검출방법 | |
| KR102654269B1 (ko) | 노제마병, 석고병 및 백묵병의 꿀벌 질병 진단 키트 및 진단 방법 | |
| PL233890B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Rotylenchus buxophilus, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233891B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Mesocriconema curvatum, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| KR101745969B1 (ko) | 수족구병 원인 바이러스 검출용 조성물, 이를 이용한 검출 방법 및 진단키트 | |
| PL232391B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Bursaphelenchus hofmanni, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL232392B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Bursaphelenchus fraudulentus, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL231511B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Bursaphelenchus tiliae, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233886B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Geocenamus longus, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL231510B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Rotylenchus capitatus, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL230913B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników grzybów, metodą Real Time PCR | |
| PL233889B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paraphelenchus myceliophthorus, szkodnika grzybów, metodą Real Time PCR | |
| PL233892B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus eonymus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233837B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow upraw roslin motylkowych, metoda Real Time PCR | |
| PL232394B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Xiphinema diversicaudatum, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL231509B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paraphelenchus tritici, szkodników grzybów, metodą Real Time PCR | |
| Lee et al. | Development of in-field-diagnosis of Aspergillus flavus by Loop-Mediated Isothermal Amplification in Honeybee | |
| PL233887B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Aphelenchoides sacchari, szkodnika grzybów, metodą Real Time PCR | |
| PL231513B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus poessneckensis, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233888B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL231512B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus intermedius, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR |