PL230913B1 - Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników grzybów, metodą Real Time PCR - Google Patents

Abstract

Ujawniono sposób jak i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników grzybów, metodą Real Time PCR. W szczególności wynalazek dotyczy sposobu i zestawu do identyfikacji nicieni obejmujących gatunki Aphelenchoides composticola i Aphelenchus avenae. Dzięki specyficznie dobranym starterom i sondom rozwiązanie umożliwia precyzyjną identyfikację wskazanych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników grzybów, metodą Real-Time PCR. W szczególności wynalazek dotyczy sposobu i zestawu do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Aphelenchoides composticola z rodziny Aphelenchoididae oraz Aphelenchus avenae z rodziny Aphelenchidae.

Nicienie pasożytnicze żerujące na grzybni są wyposażone w specjalny aparat gębowy, którym wysysają sok komórkowy z grzybni pieczarek, co prowadzi do jej obumierania. Straty widoczne są zwykle dopiero w dalszych rzutach, lecz jeśli podłoże było bardzo zainfekowane w czasie rozrostu grzybni, to mogą one pojawić się wcześniej. W razie występowania nicieni pasożytniczych jedynym sposobem ich eliminacji jest gotowanie podłoża na półkach po zakończeniu uprawy i uprzątnięcie wszelkich jego resztek z pieczarkarni, a drewniane półki należy ponownie impregnować. Najgroźniejszymi dla uprawy pieczarki są Aphelenchoides composticola i Aphelenchus avenae.

Identyfikacja gatunków nicieni oparta jest na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych, w tym diagnozowane są m.in.: zabarwienie samicy na poszczególnych etapach rozwojowych, kształt cysty, długość i kształt guzów sztyletu, długość larwy inwazyjnej, wzór na płytce perinealnej. Jest to jednak analiza bardzo pracochłonna i czasochłonna. Wymaga dużo wiedzy i doświadczenia w pracy z materiałem biologicznym. Ponadto, istnieje możliwość nachodzenia na siebie wymiarów różnych gatunków. Metody opartej na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych nie można zastosować do identyfikacji młodocianych osobników, u których cechy morfologiczne nie są jeszcze wykształcone.

Obecnie w diagnostyce nematologicznej coraz częściej stosowane są techniki oparte na analizie kwasów nukleinowych, w tym wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Podstawą techniki PCR jest powielenie fragmentu/ów DNA, specyficznego dla określonego organizmu, do poziomu umożliwiającego jego szybką i prostą detekcję przy użyciu elektroforezy. Uzyskuje się to stosując krótkie jednoniciowe oligonukleotydy (12-40 nukleotydów), tzw. startery, specyficzne dla powielanego fragmentu DNA oraz enzym - termostabilną polimerazę, którą umożliwia powielenie żądanego fragmentu w cyklicznej, trzyetapowej reakcji, złożonej z denaturacji, wiązania starterów oraz syntezy DNA. Zazwyczaj po około 30 cyklach reakcji uzyskuje się ponad milion kopii powielanego fragmentu DNA, co pozwala zidentyfikować go techniką elektroforezy żelowej.

Udoskonaleniem łańcuchowej reakcji polimerazy jest Real-Time PCR, to jest rekcji PCR z pomiarem ilości powielonego fragmentu w każdym cyklu reakcji. Do pomiaru ilości powielonego fragmentu wykorzystuje się fluorochromy (barwniki fluorescencyjne), np.: SYBR Green I, SYT O9, Eva Green, SYBR Gold, których fluorescencja jest proporcjonalna do ilości powielonego fragmentu. Identyfikację powstałych produktów przeprowadza się poprzez pomiar wielkości fluorescencji oraz analizę krzywej topnienia produktów reakcji bez elektroforezy. Czułość reakcji Real-Time PCR jest znacznie większa niż tradycyjnego PCR, a brak elektroforezy skraca czas analizy. Wadą Real-Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi (podobnie jak tradycyjnego PCR) jest ograniczona specyficzność reakcji. W większości przypadków reakcja PCR zachodzi nie tylko w przypadku 100% identyczności sekwencji starterów do sekwencji matrycy lecz również gdy 1-2 nukleotydy są nieidentyczne. Ta właściwość tradycyjnego PCR i Real-Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi wymaga precyzyjnego ustawienia parametrów termicznych reakcji. Ponadto, barwniki fluorescencyjne wiążą się z każdym dwuniciowym fragmentem DNA, powstałym również w wyniku amplifikacji starterów (produkty primer primer, primer-dimer), co wymaga również starannego doboru odpowiedniego stężenia starterów. Alternatywą dla barwników fluorescencyjnych są sondy DNA znakowane fluorescencyjn ie. Są to krótkie odcinki DNA, komplementarne do poszukiwanej sekwencji, które po przyłączeniu do DNA podczas reakcji PCR emitują fluorescencję o określonej długości fali. Obecnie znanych jest kilka rodzajów sond, np.: TaqMan, FRET, molecular beacons, czy scorpions. Specyficzność reakcji Real-Time PCR ze znakowanymi sondami jest znacznie wyższa niż z barwnikami fluorescencyjnymi. W odróżnieniu od starterów niedopasowanie jednego nukleotydu w sekwencji sondy prowadzi przeważnie do braku reakcji lub bardzo istotnego zmniejszenia wydajności, co jest łatwe do stwierdzenia podczas monitorowania przebiegu reakcji lub analizy wyników reakcji.

Identyfikacja gatunków należących do rodzaju Aphelenchoides (A.besseyi, A.fragariae, A.ritzemabosi, A.subtenuis) metodą Real-Time PCR została opisana w pracy Rybarczyk-Mydłowska K., Mooyman P., van Megen H., van den Elsen S., Vervoort M., Veenhuizen P., van Doorn J., Dees R., Karssen G., Bakker J., Helder J. 2012 Small Subunit Ribosomal DNA-Based Phylogenetic Analysis of Foliar Nematodes (Aphelenchoides spp.) and Their Quantitative Detection in Complex DNA Backgrounds.

PL 230 913 Β1

Nematology 102(12): 1153-1160, natomiast do identyfikacji Aphelenchoides composticola i Aphelenchus avenae stosowano tylko tradycyjne metody morfologiczne i morfometryczne. Identyfikacja tych gatunków za pomocą PCR została zaproponowana przez autorów po raz pierwszy.

W stanie techniki istnieje nadal potrzeba dostarczenia narzędzia umożliwiającego detekcję wybranych gatunków nicieni nieidentyfikowanych metodami genetycznymi, jak również dostarczenia udoskonalonego sposobu identyfikacji tych gatunków nicieni, które są wykrywane znanymi technikami genetycznymi natomiast nie zapewniają wysokiej precyzyjności i nie wykluczają błędów w analizie.

Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu umożliwiającego identyfikację gatunków nicieni z dużą czułością i specyficznością. Celem wynalazku jest również dostarczenie sposobu identyfikacji nicieni, które nie były dotychczas wykrywane metodami analizy materiału genetycznego badanych gatunków. Celem wynalazku jest również dostarczenie nowych sekwencji nukleotydowych starterów i sond bądź nieoczywistego wyboru znanych sekwencji i sond, mających zastosowanie w sposobie wykrywania nicieni techniką PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.

Powyższe cele zrealizowano w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji nicieni w próbce gleby wybranych z grupy zawierającej gatunki Aphelenchoides composticola i Aphelenchus avenae, obejmujący następujące etapy:

a) dostarczenie próbki gleby zawierającej nicienie do identyfikacji;

b) wypłukanie nicieni z gleby;

c) izolację DNA;

d) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3’ i 5’ oraz sondy;

e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji PCR, zwłaszcza, Real-Time PCR stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę wybrane z listy:

Gatunek	5 ‘ starter	3' starter	Sonda
Nazwa	Sekwencja	Nazwa	Sekwencja	Nazwa	Sekwencja
Aphelenchoides composticola	Acomfv	agtggagtattatacagc	Acomre	gcagaattatccagagtia	Acom	aactgcgaacggcicatiacanc
Aphelenchus avenae	Aavcfv	gtgtgEttaggtcatctg	Aaverv	icggaacagrttaceaag	Aave	caactaccaaggclatceaeaag

Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Aphelenchoides composticola i Aphelenchus avenae, metodą PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę wybrane z listy:

Gatunek	5’ starter	3’ starter	Sonda
Nazwa	Sekwencja	Nazwa	Sekwencja	Nazwa	Sekwencja
Aphelenchoides composticola	Acomfv	agtggagtattatacagc	Acomrv	gcagaattatccagagtta	Acom	a.TC[gcgaacggcteatiaeaae
Aphelenchus ayenae	Aavefv	glgtggtta.Egtcatcls	Aaverv	tcggaacagtitaegaag	Aave	caactaecaaggciutccacaug

Mieszanina reakcyjna zawiera bufor, termostabilną Taq polimerazę, jony magnezu, startery i sondę. Stężenie starterów w mieszaninie reakcyjnej wynosi 1-2 μΜ, sondy 50-100 nM, jonów magnezu 2-5 mM. Reakcję prowadzi się przy temperaturze przyłączania starterów 55-60°C, w objętości mieszaniny reakcyjnej 10-20 μΙ, przy zastosowaniu od 35 do 40 cykli reakcji. Identyfikacji produktów dokonuje się poprzez porównanie krzywych amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej.

Nazwom sekwencji starterów oraz sond odpowiadają kolejne numery sekwencji: Acomfv (SEKW NR ID: 1), Acomrv (SEKW NR ID: 2), Acom (SEKW NR ID: 3), Aavefv (SEKW NR ID: 4), Aaverv (SEKW NR ID: 5), Aave (SEKW NR ID: 6).

Fig. 1 przedstawia krzywe amplifikacji dla Aphelenchoides composticola.

Fig. 2 przedstawia krzywe amplifikacji dla Aphelenchus avenae.

Poniżej podano przykłady identyfikacji każdego z wchodzących w skład zestawu gatunków nicieni. Każdorazowo identycznym warunkom izolacji i amplifikacji poddawano próbę zerową (dejonizowana H2O wolna od nukleaz) oraz próbę ujemną. Materiałem dla próby ujemnej było DNA gatunku

PL 230 913 Β1 nicienia należącego do tego samego rodzaju co badany, mieszanina równych ilości DNA nicieni należących do tego samego gatunku co badany gatunek lub w przypadku braku gatunków należących do tego samego rodzaju, gatunek z tej samej rodziny.

Przykład 1

Identyfikacja nicieni z gatunku Aphelenchoides composticola.

DNA izolowano przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji DNA NucleoSpin Tissue i XS firmy Macherey-Nagel. W reakcji użyto starterów i sondy o następujących sekwencjach:

Starter/ sonda	Sekwencja
Acomlv	agtggagtattatacagc
Acomrv	gcagaallatcc agagtla
Acom	aactgcgaacggctcattacaac

Reakcję Real-Time PCR przeprowadzano w mieszaninie o objętości 20 μΙ w aparacie RotorGene 6000 firmy Qiagen przy użyciu odczynników z zestawu LuminoCt qPCR ReadyMix (SigmaAldrich) w następujących ilościach:

- H2O wolna od nukleaz do objętości 20 μΙ,

- 2 μ110,0 μΜ każdego ze starterów Acomfv i Acomrv,

- 1 μΙ 4,0 μΜ sondy Acom znakowanej na końcu 5’ barwnikiem JOE, a 3’-końcu wygaszaczem HBQ1,

- 10 μΙ 2X LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich),

- 2 μΙ DNA.

Mieszaninę reakcyjną umieszczano w probówce o objętości 20 μΙ, umieszczano w rotorze termocyklera RotorGene 6000 i przeprowadzano reakcję amplifikacji w 40 cyklach w następujących warunkach:

Etap	Temperaiura [°C]	Czas [s]	Pomiar fluorescencji
Prc-inkubacja	95	180	-
Amplifikacja	denaluracja	95	30	-
przyłączanie	55	30	pojedynczy
synteza	72	30	-
Chłodzenie	40	20	-

Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Aphelenchoides arcticus, Aphelenchoides besseyi i Aphelenchoides clarolineatus.

Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 1. Przykład 2

Identyfikacja nicieni z gatunku Aphelenchus avenae.

Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1.

W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:

Starter/sonda	Sekwencja
Aavefv	gtgtggttaggteatctg
Aaverv	tcggaacagtttacgaag
Aave	caactaccaaggclatccacaag

Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Bursaphelenchus mucronatus, Seinura citri oraz Seinura linfordi.

Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 2.

PL 230 913 Β1

Rozwiązanie według wynalazku pozwala na wykrycie nicieni w glebie w przeciągu kilku godzin, uwzględniając w tym etapy przygotowania prób, izolacji DNA oraz reakcji Real-Time PCR. Metodę według wynalazku, można zastosować do identyfikacji wyżej wymienionych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.

Proponowany zestaw sond pozwala identyfikować wyżej wymienione gatunki nicienie w reakcji Real-Time PCR, która jest znacznie czulsza i szybsza od innych metod PCR. Zastosowanie w reakcji Real-Time PCR sond znacznie zwiększa specyficzność reakcji w stosunku do reakcji Real-Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi.

Claims (2)

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób identyfikacji nicieni gatunków Aphelenchoides composticola i Aphelenchus avenae w próbce gleby obejmujący następujące etapy:

a) dostarczenie próbki gleby zawierającej nicienie do identyfikacji;

b) wypłukanie nicieni z gleby;

c) izolację DNA;

d) przeprowadzenie reakcji Real-Time PCR z zastosowaniem pary starterów 3’ i 5’ oraz sondy;

e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji Real-Time PCR, stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondy wybrane z listy:

Gatunek 5' starter 3' starter Sonda Nazwa Sekwencja Nazwa Sekwencja Nazwa Sekwencja Aphelenchoides composticola Acomfy agtggagtattatacagc Acomry gcagaattatccagagtta Acom aactgcgaacggctcattacaac Aphelenchus avenae Aavefv gtgtggttaggtcatctg Aaverv tcggaacagtttacgaag Aave caactaccaaggctatccacaag

2. Zestaw do identyfikacji nicieni gatunków Aphelenchoides composticola i Aphelenchus avenae metodą Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondy wybrane z listy:

Gatunek 5' starter 3’ starter Sonda Nazwa Sekwencja Nazwa Sekwencja Nazwa Sekwencja Aphelenchoides composticola Acomfv agtggagtattatacagc Acomrv gcagaattatccagagtta Acom aactgcgaacggctcattacaac Aphelenchus auenae Aavefv gtgtggttaggtcatctg Aaverv tcggaacagtttacgaag Aaye caactaccaaggctatccacaag