PL233837B1 - Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow upraw roslin motylkowych, metoda Real Time PCR - Google Patents
Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow upraw roslin motylkowych, metoda Real Time PCR Download PDFInfo
- Publication number
- PL233837B1 PL233837B1 PL410977A PL41097715A PL233837B1 PL 233837 B1 PL233837 B1 PL 233837B1 PL 410977 A PL410977 A PL 410977A PL 41097715 A PL41097715 A PL 41097715A PL 233837 B1 PL233837 B1 PL 233837B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- species
- identification
- nematodes
- time pcr
- heterodera
- Prior art date
Links
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 title abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 43
- 241000243787 Meloidogyne hapla Species 0.000 claims abstract description 19
- 241000399949 Ditylenchus dipsaci Species 0.000 claims abstract description 18
- 241000418378 Paratylenchus projectus Species 0.000 claims abstract description 17
- 241000040487 Heterodera trifolii Species 0.000 claims abstract description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 24
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 24
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 18
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 12
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 6
- 241001480224 Heterodera Species 0.000 claims description 5
- 101100366282 Mus musculus Spats1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims description 4
- 241001143352 Meloidogyne Species 0.000 claims description 3
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 6
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 26
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 5
- 241000680417 Aphelenchoides ritzemabosi Species 0.000 description 4
- 241001220357 Longidorus elongatus Species 0.000 description 4
- 241001540472 Mesocriconema xenoplax Species 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 4
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 3
- 241001148650 Paratylenchus Species 0.000 description 3
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000196509 Anguinidae Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000379510 Heterodera schachtii Species 0.000 description 2
- 241000243783 Heteroderidae Species 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 241001540466 Tylenchulidae Species 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 2
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 235000021537 Beetroot Nutrition 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 241000399934 Ditylenchus Species 0.000 description 1
- 241000399948 Ditylenchus destructor Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102100030378 Hemoglobin subunit theta-1 Human genes 0.000 description 1
- 241001481225 Heterodera avenae Species 0.000 description 1
- 241000040429 Heterodera humuli Species 0.000 description 1
- 101000843063 Homo sapiens Hemoglobin subunit theta-1 Proteins 0.000 description 1
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 description 1
- 241000611260 Meloidogyne chitwoodi Species 0.000 description 1
- 241001237450 Meloidogyne fallax Species 0.000 description 1
- 241000243785 Meloidogyne javanica Species 0.000 description 1
- 241000648114 Meloidogyne minor Species 0.000 description 1
- 241001287835 Meloidogynidae Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241001148649 Paratylenchidae Species 0.000 description 1
- 241000588906 Paratylenchus aquaticus Species 0.000 description 1
- 241000710403 Paratylenchus dianthus Species 0.000 description 1
- 241000588907 Paratylenchus hamatus Species 0.000 description 1
- 241001268457 Paratylenchus nanus Species 0.000 description 1
- 241001148645 Paratylenchus straeleni Species 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 241000243782 Tylenchida Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000024293 detection of nematode Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000008659 phytopathology Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Ujawniono zarówno sposób jak i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników upraw roślin motylkowych, metodą Real Time PCR, w szczególności wynalazek dotyczy sposobu i zestawu do identyfikacji nicieni obejmujących gatunki Ditylenchus dipsaci, Heterodera trifolii, Meloidogyne hapla, Paratylenchus projectus. Dzięki specyficznie dobranym starterom i sondom rozwiązanie umożliwia precyzyjną identyfikację wskazanych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników upraw roślin motylkowych, metodą Real Time PCR, w szczególności wynalazek dotyczy sposobu i zestawu do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Ditylenchus dipsaci z rodziny Anguinidae, Heterodera trifolii z rodziny Heteroderidae, Meloidogyne hapla z rodziny Meloidogynidae, Paratylenchus projectus z rodziny Tylenchulidae.
Niszczyk zjadliwy (Ditylenchus dipsaci) powoduje zasychanie roślin. Żeruje na roślinach motylkowych, zbożach, marchwi, cebuli. Liczba pokoleń w ciągu roku: 4-6. Rozwój jednego pokolenia trwa 19-30 dni. Jaja składane są wewnątrz roślin. Zimuje larwa inwazyjna w resztkach roślin. Wiosną następuje wnikanie przez podziemne części roślin (łodygi, bulwy, cebule). Nicienie z rodzaju Meloidogyne są pasożytami roślin o znaczeniu gospodarczym, w uprawie których mogą powodować olbrzymie straty. Do chwili obecnej na obszarze Europy stwierdzono obecność 15 gatunków Meloidogyne (Karssen G., Block R.J., van Aelst A.C., van den Beld I., Kox L.F.F., Korthals G., Molendijk L., Zijstra C., van Hoof R., Cook R. 2004. Description of Meloidogyne minor n. sp. (Nematoda: Meloidogynine), a root - knot nematode associated with yellow patch disease in golf courses. Nematology 6 (1): 59-72). Występowanie 8 z nich stwierdzono na terenie Polski (Karssen G., Brzeski M.W. 1998. Meloidogyne Goldi, 1892. s. 242-263. W: Nematodes of Tylenchina in Poland and Temperate Europe (M.W. Brzeski, red.) Muzeum i Instytut Zoologii PAN, Warszawa). M. hapla występuje powszechnie na obszarze Polski i jest szkodnikiem upraw roślin dwuliściennych (Głąba B. 1990. Występowanie guzaka północnego w uprawach ziemniaka, buraka i koniczny w województwie gdańskim. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 391: 39-51).
Identyfikacja gatunków nicieni oparta jest na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych, w tym diagnozowane są m.in.: zabarwienie samicy na poszczególnych etapach rozwojowych, kształt cysty, długość i kształt guzów sztyletu, długość larwy inwazyjnej, wzór na płytce perinealnej. Jest to jednak analiza bardzo pracochłonna i czasochłonna. Wymaga dużo wiedzy i doświadczenia w pracy z materiałem biologicznym. Ponadto, istnieje możliwość nachodzenia na siebie wymiarów różnych gatunków. Metody opartej na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych nie można zastosować do identyfikacji młodocianych osobników, u których cechy morfologiczne nie są jeszcze wykształcone.
Obecnie w diagnostyce nematologicznej coraz częściej stosowane są techniki oparte na analizie kwasów nukleinowych, w tym wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Podstawą techniki PCR jest powielenie fragmentu/ów DNA, specyficznego dla określonego organizmu, do poziomu umożliwiającego jego szybką i prostą detekcję przy użyciu elektroforezy. Uzyskuje się to stosując krótkie jednoniciowe oligonukleotydy (12-40 nukleotydów), tzw. startery, specyficzne dla powielanego fragmentu DNA oraz enzym - termostabilną polimerazę, która umożliwia powielenie żądanego fragmentu w cyklicznej, trzyetapowej reakcji, złożonej z denaturacji, wiązania starterów oraz syntezy DNA. Zazwyczaj po około 30 cyklach reakcji uzyskuje się ponad milion kopii powielanego fragmentu DNA, co pozwala zidentyfikować go techniką elektroforezy żelowej.
Udoskonaleniem łańcuchowej reakcji polimerazy jest Real Time PCR, to jest rekcji PCR z pomiarem ilości powielonego fragmentu w każdym cyklu reakcji. Do pomiaru ilości powielonego fragmentu wykorzystuje się fluorochromy (barwniki fluorescencyjne), np.: SYBR Green I, SYTO9, Eva Green, SYBR Gold, których fluorescencja jest proporcjonalna do ilości powielonego fragmentu. Identyfikację powstałych produktów przeprowadza się poprzez pomiar wielkości fluorescencji oraz analizę krzywej topnienia produktów reakcji bez elektroforezy. Czułość reakcji Real Time PCR jest znacznie większa niż tradycyjnego PCR, a brak elektroforezy skraca czas analizy. Wadą Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi (podobnie jak tradycyjnego PCR) jest ograniczona specyficzność reakcji. W większości przypadków reakcja PCR zachodzi nie tylko w przypadku 100% identyczności sekwencji starterów do sekwencji matrycy, lecz również gdy 1-2 nukleotydy są nieidentyczne. Ta właściwość tradycyjnego PCR i Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi wymaga precyzyjnego ustawienia parametrów termicznych reakcji. Ponadto, barwniki fluorescencyjne wiążą się z każdym dwuniciowym fragmentem DNA, powstałym również w wyniku amplifikacji starterów (produkty primer-primer, primer-dimer), co wymaga również starannego doboru odpowiedniego stężenia starterów.
Alternatywą dla barwników fluorescencyjnych są sondy DNA znakowane fluorescencyjnie. Są to krótkie odcinki DNA, komplementarne do poszukiwanej sekwencji, które po przyłączeniu do DNA podczas reakcji PCR emitują fluorescencję o określonej długości fali. Obecnie znanych jest kilka rodzajów sond, np.: TaqMan, FRET, molecular beacons czy scorpions. Specyficzność reakcji Real Time PCR ze znakowanymi sondami jest znacznie wyższa niż z barwnikami fluorescencyjnymi. W odróżnieniu od
PL 233 837 B1 starterów niedopasowanie jednego nukleotydu w sekwencji sondy prowadzi przeważnie do braku reakcji lub bardzo istotnego zmniejszenia wydajności, co jest łatwe do stwierdzenia podczas monitorowania przebiegu reakcji lub analizy wyników reakcji.
Dotychczas najczęściej stosowaną metodą molekularnej identyfikacji nicieni było PCR-RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism). Metoda polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych wykorzystuje enzymy restrykcyjne, które tną nić DNA w specyficznym dla siebie miejscu. Różnice w długości pociętych fragmentów DNA świadczą o zmienności. W pracach Wendt K.R., Vrain T.C. & Webster J.M. (1993). Separation of three species of Ditylenchus and some host races of D. dipsaci by restriction fragment length polymorphism. Journal of Nematology 25, 555-563 oraz Marek M., Zouhar M., Rysanek P. & Havranek P. (2005). Analysis of ITS sequences of nuclear rDNA and development of a PCR-based assay for the rapid identification of the stem nematode Ditylenchus dipsaci (Nematoda: Anguinidae) in plant tissues. Helminthologia 42, 49-56 zostały opisane startery i enzymy restrykcyjne do identyfikacji Ditylenchus dipsaci. Subbotin S.A., Waeyenberge L. i Moens M. użyli w swojej publikacji Identification of cyst forming nematodes of the genus Heterodera (Nematoda: Heteroderidae) based on the ribosomal DNA-RFLP, Nematology (2000), 2 (2): 153-164 aż 26 różnych enzymów restrykcyjnych: Alul, Aval, BamHI, BglI, BsiZI, BsuRI, Bsh1236I, Bsp143I, CfoI, DdeI, EcoRI, HpaII, HindIII, HinfI, KpnI, MvaI, PstI, PvuII, PsaI, SalI, SfuI, SspI, ScrFI, TaqI, Tru9I i Xbal, dzięki czemu wyodrębnili 27 różnych gatunków i typów nicieni w próbie, między innymi również Heterodera trifolii. Podobnie Amiri S., Subbotin S.A. i Moens M., Identification of the beet cyst nematode Heterodera schachtii by PCR, European Journal of Plant Pathology (2002), 108: 497-506 analizowali tą metodą łącznie prawie 60 populacji tworzących cysty nicieni i również znaleźli odpowiednie enzymy restrykcyjne do identyfikacji Heterodera trifolii. Wishart J., Phillips M.S., Blok V.C., Ribosomal Intergenic Spacer: A Polymerase Chain Reaction Diagnostic for Meloidogyne chitwoodi, M. fallax, and M. hopla, Phytopathology. 2002 Aug; 92(8): 884-92 opracowali startery do identyfikacji M. hapla.
W 2014 Berg E., Tiedt L.R. Subbotin S.A. 2014 Morphological and molecular characterisation of several Paratylenchus Micoletzky, 1922 (Tylenchida: Paratylenchidae) species from South Africa and USA, together with some taxonomic notes. Nematology 16: 323-358 opisali startery do identyfikacji pięciu gatunków Paratylenchus (P. aquaticus, P. dianthus, P. hamatus, P. nanus and P. straeleni). Identyfikację P. projectus prowadzi się jednak w oparciu o cechy morfologiczne (Brzeski M., Hanel L. Paratylenchinae: evaluation of diagnostic morpho-biometrical characters of females in the genus Paratylenchus Micoletzky, 1922 (Nematoda: Tylenchulidae). Nematology 2: 253-261).
W stanie techniki istnieje nadal potrzeba dostarczenia narzędzia umożliwiającego detekcję wybranych gatunków nicieni nie identyfikowanych metodami genetycznymi, jak również dostarczenia udoskonalonego sposobu identyfikacji tych gatunków nicieni, które są wykrywane znanymi technikami genetycznymi, natomiast nie zapewniają wysokiej precyzyjności i nie wykluczają błędów w analizie.
Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu umożliwiającego identyfikację gatunków nicieni z dużą czułością i specyficznością. Celem wynalazku jest również dostarczenie sposobu identyfikacji nicieni, które nie były dotychczas wykrywane metodami analizy materiału genetycznego badanych gatunków. Celem wynalazku jest również dostarczenie nowych sekwencji nukleotydowych starterów i sond bądź nieoczywistego wyboru znanych sekwencji i sond, mających zastosowanie w sposobie wykrywania nicieni techniką PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Powyższe cele zrealizowano w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji nicieni w próbce gleby wybranych z grupy zawierającej gatunki Ditylenchus dipsaci, Heterodera trifolii, Meloidogyne hapla, Paratylenchus projectus, obejmujący następujące etapy:
1) dostarczenie próbki gleby zawierającej nicienie do identyfikacji;
2) wypłukanie nicieni z gleby;
3) izolację DNA;
4) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3' i 5' oraz sondy;
5) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3' i 5' oraz sondę wybrane z listy:
PL 233 837 Β1
| Gatunek | Nazwa | 5’ starter Sekwencja | Nazwa | 3’ starter Sekwencja | Nazwa | Sonda Sekwencja |
| Ditylenchus dipsaci Heterodera trifolii Meloidogyne hapla Paratylenchus projectus | Ddipfy Htrifv Mhafv Pprfy | ctaggagtgtggcttacg acggaccaaggagtttag cggaccaaggagtttatc cttggatacctgtggtaa | Ddipry Htrirv Mharv Pprfy | ccacaggcagtaacagtc ccagggatcacacatcag gcacatcagactctaaaga atgcgatcagcttagtta | Ddip Htri Mhas Ppr | atccaccgcagagcaagaag agccttcactttcattacgcctttg tcatttactttcatttcgcttctaggt caccgaagttgttccttgcg |
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Ditylenchus dipsaci, Heterodera trifolii, Meloidogyne hapla, Paratylenchus projectus, metodą PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3' i 5' oraz sondę wybrane z listy:
| Gatunek | Nazwa | 5* starter Sekwencja | Nazwa | 3’ starter Sekwencja | Nazwa | Sonda Sekwencja |
| Ditylenchus dipsaci Heterodera trifolii Meloidogyne hapla Paratylenchus projectus | Ddipfv Htrifv Mhafv Pprfv | ctaggagtgtggcttacg acggaccaaggagtttag cggaccaaggagtttatc cttggatacctgtggtaa | Ddiprv Htrirv Mharv Pprrv | ccacaggcagtaacagtc ccagggatcacacatcag gcacatcagactctaaaga atgcgatcagcttagtta | Ddip Htri Mhas Ppr | atccaccgcagagcaagaag agccttcactttcattacgcctttg tcatttactttcatttcgcttctaggt caccgaagttgttccttgcg |
Mieszanina reakcyjna zawiera bufor, termostabilną Taq polimerazę, jony magnezu, startery i sondę. Stężenie starterów w mieszaninie reakcyjnej wynosi 1-2 μΜ, sondy 50-100 nM, jonów magnezu 2-5 mM. Reakcję prowadzi się przy temperaturze przyłączania starterów 55-60°C, w objętości mieszaniny reakcyjnej 10-20 μΙ, przy zastosowaniu od 35 do 40 cykli reakcji. Identyfikacji produktów dokonuje się poprzez porównanie krzywych amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej.
Nazwom sekwencji starterów oraz sond odpowiadają kolejne numery sekwencji: Ddipfv (SEKW NR ID: 1), Ddiprv (SEKW NR ID: 2), Ddip (SEKW NR ID: 3), Htrifv (SEKW NR ID: 4), Htrirv (SEKW NR ID: 5), Htri (SEKW NR ID: 6), Mhafv (SEKW NR ID: 7), Mharv (SEKW NR ID: 8), Mhas (SEKW NR ID: 9), Pprfv(SEKWNR ID: 10), Pprrv(SEKW NR ID: 11), Ppr(SEKWNR ID: 12).
Fig. 1 przedstawia krzywe amplifikacji dla Paratylenchus projectus.
Fig. 2 przedstawia krzywe amplifikacji dla Heterodera trifolii.
Fig. 3 przedstawia krzywe amplifikacji dla Meloidogyne hapla.
Fig. 4 przedstawia krzywe amplifikacji dla Ditylenchus dipsaci.
Poniżej podano przykłady identyfikacji każdego z wchodzących w skład zestawu gatunków nicieni. Każdorazowo identycznym warunkom izolacji i amplifikacji poddawano próbę zerową (dejonizowana H2O wolna od nukleaz) oraz próbę ujemną. Materiałem dla próby ujemnej było DNA gatunku nicienia należącego do tego samego rodzaju co badany, mieszanina równych ilości DNA nicieni należących do tego samego gatunku co badany gatunek lub w przypadku braku gatunków należących do tego samego rodzaju, gatunek z tej samej rodziny.
Przykład 1
Identyfikacja nicieni z gatunku Paratylenchus projectus
DNA izolowano przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji DNA NucleoSpin Tissue XS firmy Macherey-Nagel. W reakcji użyto starterów i sondy o następujących sekwencjach:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Pprfv | CTTGGATACCTGTGGTAA |
| Pprrv | ATGCGATCAGCTTAGTTA |
| Ppr | CACCGAAGTTGTTCCTTGCG |
Reakcję Real Time PCR przeprowadzano w mieszaninie o objętości 20 μΙ w aparacie RotorGene 6000 firmy Qiagen przy użyciu odczynników z zestawu LuminoCt qPCR Ready Mix (Sigma-Aldrich) w następujących ilościach:
- H2O wolna od nukleaz do objętości 20 μΙ,
- 2 μ110,0 μΜ każdego ze starterów Pprfv i Pprrv,
PL 233 837 Β1
- 1 μΙ 4,0 μΜ sondy Ppr znakowanej na końcu 5' barwnikiem JOE, a 3'-końcu wygaszaczem HBQ1,
- 10 μΙ 2X LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich),
- 2 μΙ DNA.
Mieszaninę reakcyjną umieszczano w probówce o objętości 20 μΙ, umieszczano w rotorze termocyklera RotorGene 6000 i przeprowadzano reakcję amplifikacji w 40 cyklach w następujących warunkach:
| Etap | Temperatura [°C] | Czas [s] | Pomiar fluorescencji | |
| Pre-inkubacja | 95 | 180 | - | |
| Amplifikacja | dc na tu racja | 95 | 30 | - |
| przyłączanie | 55 | 30 | pojedynczy | |
| synteza | 72 | 30 | - | |
| Chłodzenie | 40 | 20 | - |
Powyższym warunkom izolacji i amplifikacji poddawano próbę zerową (dejonizowana H2O wolna od nukleaz), kontrolę negatywną (DNA nicieni Meloidogyne hapla), oraz kontrolę pozytywną (DNA Paratylenchus projectus).
Badane próby:
• próba 1. Do reakcji dodano po 2 μΙ DNA każdego z gatunków nicieni: D. dipsaci, H. trifolii, M. hapla i P. projectus.
• próba 2. Do reakcji dodano 2 μΙ DNA otrzymanego z mieszanki równych objętości DNA D. dipsaci, H. trifolii, M. hapla i P. projectus.
• próba 3. Do reakcji dodano 2 μΙ DNA otrzymanego z mieszanki równych objętości DNA D. dipsaci, H. trifolii, M. hapla i 0,2 μΙ P. projectus.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 1. Przykład 2
Identyfikacja nicieni z gatunku Heterodera trifolii
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time POR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Htrifv | acggaccaaggagtttag |
| Htrirv | ccagggatcacacatcag |
| Htri | agccttcactttcattacgcctttg |
Kontrolę negatywną stanowiła mieszanka równych objętości roztworów DNA: Heterodera avenae, Heterodera humuli, Heterodera schachtii.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 2.
Przykład 3
Identyfikacja nicieni z gatunku Meloidogyne hapla
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time POR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Mhafv | cggaccaaggagtttatc |
| Mharv | gcacatcagactctaaaga |
| Mhas | tcatttactttcatttcgcttctaggt |
Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicienia Aphelenchoides ritzemabosi, Longidorus elongatus, Mesocriconema xenoplax.
PL 233 837 Β1
Badane próby:
• próba 1. Do reakcji dodano po 2 μΙ DNA każdego z gatunków nicieni: Aphelenchoides ritzemabosi, Longidorus elongatus, Mesocriconema xenoplax i Meloidogyne hapla.
• próba 2. Do reakcji dodano 2 μΙ DNA otrzymanego z mieszanki równych objętości DNA Aphelenchoides ritzemabosi, Longidorus elongatus, Mesocriconema xenoplax i Meloidogyne hapla.
• próba 3. Do reakcji dodano 2 μΙ DNA otrzymanego z mieszanki równych objętości DNA Aphelenchoides ritzemabosi, Longidorus elongatus, Mesocriconema xenoplax i 0,2 μΙ Meloidogyne hapla.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 3. Przykład 4
Identyfikacja nicieni z gatunku Ditylenchus dipsaci
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Ddipfv | ctaggagtgtggcttacg |
| Ddiprv | ccacaggcagtaacagtc |
| Ddip | atccaccgcagagcaagaag |
Kontrolę negatywną stanowił roztwór DNA Ditylenchus destructor.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 4.
Rozwiązanie według wynalazku pozwala na wykrycie nicieni w glebie w przeciągu kilku godzin, uwzględniając w tym etapy przygotowania prób, izolacji DNA oraz reakcji Real-Time PCR. Metodę według wynalazku można zastosować do identyfikacji wyżej wymienionych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Proponowany zestaw sond pozwala identyfikować wyżej wymienione gatunki nicieni w reakcji Real Time PCR, która jest znacznie czulsza i szybsza od innych metod PCR. Zastosowanie w reakcji Real Time PCR sond znacznie zwiększa specyficzność reakcji w stosunku do reakcji Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi.
Zastrzeżenia patentowe
Claims (2)
1. Sposób identyfikacji gatunków nicieni Ditylenchus dipsaci, Heterodera trifolii, Meloidogyne hapla i Paratylenchus projectus w próbce gleby, obejmujący następujące etapy:
a) dostarczenie próbki gleby zawierającej nicienie do identyfikacji;
b) wypłukanie nicieni z gleby;
c) izolację DNA;
d) przeprowadzenie reakcji Real-Time PCR z zastosowaniem pary starterów 3' i 5' oraz sondy;
e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji Real-Time PCR stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3' i 5' oraz sondy wybrane z listy:
PL 233 837 Β1
2. Zestaw do identyfikacji gatunków nicieni Ditylenchus dipsaci, Heterodera trifolii, Meloidogyne hapla i Paratylenchus projectus metodą Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3' i 5' oraz sondy wybrane z listy:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410977A PL233837B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow upraw roslin motylkowych, metoda Real Time PCR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410977A PL233837B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow upraw roslin motylkowych, metoda Real Time PCR |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL410977A1 PL410977A1 (pl) | 2016-07-18 |
| PL233837B1 true PL233837B1 (pl) | 2019-11-29 |
Family
ID=56370103
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL410977A PL233837B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow upraw roslin motylkowych, metoda Real Time PCR |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL233837B1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114410803B (zh) * | 2022-01-29 | 2023-06-06 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种快速检测鳞球茎线虫的引物、试剂盒及应用 |
-
2015
- 2015-01-16 PL PL410977A patent/PL233837B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL410977A1 (pl) | 2016-07-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102174650B (zh) | 一种象耳豆根结线虫lamp快速检测方法及应用 | |
| CN110951838A (zh) | 基于rpa-lfd技术检测北方根结线虫的引物、探针、试剂盒及应用 | |
| Holeva et al. | Real-time PCR detection and quantification of vector trichodorid nematodes and Tobacco rattle virus | |
| JP2017516466A (ja) | 黄龍病を検出するための組成物および方法 | |
| KR102128651B1 (ko) | 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 뎅기 바이러스 혈청형 검출세트 및 검출방법 | |
| CN110423748A (zh) | 一种快速检测爪哇根结线虫的lamp引物及其应用、检测方法 | |
| PL233837B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow upraw roslin motylkowych, metoda Real Time PCR | |
| Subbotin et al. | Recombinase polymerase amplification assays for detection of the major tropical root-knot nematodes | |
| PL230914B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| Subbotin et al. | Recombinase Polymerase Amplification assay for detection of the British root-knot nematode, Meloidogyne artiellia | |
| KR20160057655A (ko) | 고추 탄저병 검출용 조성물 및 이를 이용한 고추 탄저병 검출 방법 | |
| PL230915B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin okopowych, metodą Real Time PCR | |
| Ammar et al. | Detection of Phytoplasma associated with yellow streak disease of date palms (Phoenix dactylifera L.) in Egypt | |
| CN101545008B (zh) | 马铃薯金线虫检测用引物及探针 | |
| PL233838B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow roslin ozdobnych, metoda Real Time PCR | |
| PL233892B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus eonymus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL231513B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus poessneckensis, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233893B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Heterodera goettingiana, ważnego szkodnika roślin uprawnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233888B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL231512B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus intermedius, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL230912B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników warzyw, metodą Real Time PCR | |
| PL233836B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni szkodzacych drzewom i krzewom owocowym metoda Real Time PCR | |
| PL232393B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paratrichodorus pachydermus, szkodnika roślin, metodą Real Time PCR | |
| PL233889B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paraphelenchus myceliophthorus, szkodnika grzybów, metodą Real Time PCR | |
| PL233887B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Aphelenchoides sacchari, szkodnika grzybów, metodą Real Time PCR |