PL231885B1 - Sposób wytwarzania soli 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-di onu z metalami alkalicznymi, ich kompozycje farmaceutyczne i ich zastosowanie - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest nowy sposób wytwarzania soli metali alkalicznych 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu, w tym soli sodowej, potasowej i litowej. Przedstawiono także kompozycję farmaceutyczną, która zawiera sól 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu z metalami alkalicznymi wytworzoną sposobem według wynalazku. Przedstawiono również zastosowanie soli sodowej 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu do wytwarzania leku do wytwarzania leku o właściwościach regulacji procesów biosyntetycznych w komórkach, w szczególności w systemie makrofagów i w szpiku kostnym, do leczenia chorób trzustki, w szczególności stanów zapalnych trzustki, i cukrzycy.

5-Amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dion (przedstawiony poniżej związek I, dalej określany również jako luminol), pierścieniowy hydrazyd kwasu 3-amino-ftalowego znany jest jako odczynnik do chemoluminescencyjnego wykrywania Co, Fe, Mn i innych związków (Encyklopedyczny Słownik Chemiczny, M., Encyklopedia Radziecka, 1983, str.306). Sam luminol słabo rozpuszcza się w wodzie, dlatego też nie byłstosowany w medycynie, natomiast sole metali alkalicznych 5-arrono-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu są łatwo rozpuszczalne w wodzie i w soli fizjologicznej. Sole 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu były stosowane w medycynie jako środki o działaniu immunomodulującym, przeciwzapalnym i antyoksydacyjnym.

I. Wytwarzanie soli 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu z metalami alkalicznymi

Substancją wyjściową stosowaną do wytwarzania soli luminolu znanymi metodami był sam luminol (patrz, na przykład publikacje Seo E.T., Kuwana T. Polarography of cyclic hydrazides. J. Electroanal. Chem., 1963, tom 6, N5, strony 417-418; Huntress E.H., Stanly L.N., Parker A.S. The Preparation of 3-Aminophthalhydrazide for the use in the demonstration of Chemiluminescence. J. Amer. Chem. Soc., 1934, tom 56, strony 241-242; Babko A.K., Dubowenko L.I., Łukowskaia L.M. Analiza Chemoluminescencji, Kijów, 1966, strony 82-83).

Związek I Związek II (luminol) sól, gdzie M oznacza kation Li, Na, K

Sposób wytwarzania luminolu opisany w świadectwie autorskim ZSRR 130903 (zgłoszonym 21.11.1959), według autorów przebiega praktycznie w jednym etapie i obejmuje wytworzenie kwasu 3-nitroftalowego w środowisku wody amoniakalnej i hydratu hydrazyny, w obecności szkieletowego niklowego katalizatora w temperaturze 80°C. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną odfiltrowuje się od katalizatora do drugiego zbiornika a wodną mieszaninę amoniaku i hydratu hydrazyny odparowuje się. Do pozostałości kadziowej dodaje się aktywowany węgiel i ponowne filtruje się na węglu. Filtrat przenosi się do następnego zbiornika, do którego dodaje się hydrat hydrazyny, ogrzewa w temperaturze 120°C przez 2 godziny dla zamknięcia pierścienia kwasu 3-aminoftalowego (cyklizacja), a następnie dodaje się bezwodnik kwasu octowego po czym z mieszaniny reakcyjnej usuwa się mieszaninę wody i kwasu octowego. Pozostałość rozcieńcza się wodą, schładza do temperatury 5°C, a wydzielony osad oddziela się przez wirowanie.

Do opisu tego wynalazku nie włączono etapu wytwarzania szkieletowego katalizatora niklowego, obejmującego rozpuszczenie stopu niklowo-glinowego w wodnym roztworze zasadowym i wielokrotne przemywanie wytworzonego katalizatora Ni-Raneya wodą destylowaną, oraz długotrwałe osadzanie drobno dyspersyjnego katalizatora w odstojniku, przy czym część katalizatora jest tracona ze ściekami. Strata katalizatora w procesie wytwarzania luminolu, według tego opisu to 0,5 kg na 2,5 kg produktu, ta ilość jest nie do odzyskania.

Zatem sposób wytwarzania luminolu opisany w tej publikacji nie jest prosty, ponieważ obejmuje 3 etapy chemicznych reakcji, 2 procesy filtracji, wirowanie i inne operacje technologiczne. Stosuje się

PL 231 885 Β1 trzykrotnie większą ilość hydratu hydrazyny w porównaniu do ilości stechiometrycznej. Podczas rozkładu hydratu hydrazyny tworzy się duża ilość gazów, co powoduje pienienie mieszaniny reakcyjnej, oraz znaczące ulatnianie się amoniaku i hydratu hydrazyny razem z wydzielanym azotem. Ponadto, odparowywanie wodnego roztworu zawierającego amoniak i hydrat hydrazyny prowadzi się w otwartej kadzi, co zgodnie ze współczesnymi zasadami techniki bezpieczeństwa jest absolutnie niedopuszczalne. [Maksymalne dopuszczalne stężenie hydratu hydrazyny w powietrzu w strefie pracy wynosi 0,1 mg/m³, (patrz „Substancje szkodliwe w przemyśle”, Chemia, T.3, 1977, str.95)j.

Przy stosowaniu sposobu opisanego w tej publikacji przy wytwarzaniu 2,5 kg luminolu powstają duże ilości odpadów - około 110 litrów wód ściekowych zanieczyszczonych hydratem hydrazyny, amoniakiem, związkami glinu, niklem, 0,7 kg stałych odpadów, w tym 0,2 kg przerobionego aktywowanego węgla, oraz 0,5 kg katalizatora niklowego o właściwościach powodowania samozapłonu w powietrzu.

Zatem ta technologia wytwarzania luminolu nie może być stosowana na skalę przemysłową ze względu na zwiększające się wymagania ekologiczne (normy ochrony środowiska) i bezpieczeństwo przeciwpożarowe.

Inne, znane sposoby wytwarzania luminolu obejmują kondensację kwasu 3-nitroftalowego z hydrazyną z wytworzeniem produktu kondensacji z użyciem siarczku amonu, jak również ogrzewanie amidu kwasu 3-nitroftalowego z hydrazyną. Straty w takich sposobach wynoszą nie mniej niż 60%.

Znane są sposoby wytwarzania soli 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu. W znanym sposobie wytwarzania soli sodowej luminolu z użyciem wodnego roztworu wodorotlenku sodu wykorzystanie soli sodowej nie przekracza 75%, z uwagi na jej dobrą rozpuszczalność w wodzie (Journal ofthe Chemical Society, 1938, strona 791-793).

Znany sposób wytwarzania soli alkalicznych 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu (związek II) obejmuje reakcję luminolu (związek I) z wodorotlenkami metali alkalicznych w wodnym roztworze, z wydzielaniem mi kro kryształów z okresowym odparowaniem i filtrowaniem wodnych roztworów, patrz patenty RU-2223227, RU-2233161.

Istotnym brakiem znanych sposobów wytwarzania soli 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu jest konieczność stosowania długotrwałego odparowywania wodnych roztworów wytworzonych soli luminolu w wysokiej temperaturze, do 95°C. W procesie usuwania wody następuje zakwaszenie soli luminolu, czemu towarzyszy powstanie trudnych do oddzielenia produktów ubocznych, roztwór uzyskuje ciemne zabarwienie, a otrzymany produkt krystaliczny ma odcień zielonkawy, nawet przy barbotowaniu azotem mieszaniny reakcyjnej podczas usuwania wody.

W patencie RU-2169139 opisano sposób wytwarzania soli alkalicznych i soli ziem alkalicznych 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu w reakcji luminolu z alkoholanami metali alkalicznych i ziem alkalicznych, metodą ogrzewania w bezwodnym alkoholowym środowisku. Zaproponowano stosowanie tak wytworzonych soli w medycynie jako środków przeciwzapalnych, antytoksycznych, immunomodulujących. W podanych w tej publikacji przykładach, alkoholany wytwarzano w reakcji metalu alkalicznego z bezwodnym alkoholem, takiej reakcji towarzyszy wydzielanie się wybuchowego wodoru. Proces jest nadzwyczaj niebezpieczny, gdyż stosowane metale alkaliczne bardzo reagują na wilgotność powietrza i szybko ulegają zakwaszeniu. W jednym z przykładów opisanych w patencie RU-2169139 proponuje się wytwarzanie etanolanu przez gotowanie przez 3 godziny proszku wodorotlenku sodu w absolutnym etanolu, a następnie dodawanie 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu przez 1,5 godziny, i dalsze gotowanie mieszaniny reakcyjnej przez 3 godziny, otrzymuje się sól sodową luminolu. Wodorotlenek sodu w postaci proszku nie jest produkowany przemysłowo z powodu jego higroskopijności i skłonności do rozpuszczania się w powietrzu (patrz, na przykład dane techniczne produktu „Soda żrąca techniczna” SP 2263-79). Dlatego wymagane jest dodatkowe wyposażenie w urządzenie do mielenia granulowanego NaOH dla wytworzenia proszku, a dokładne dozowanie sproszkowanego NaOH w skali przemysłowej jest trudne z powodu przylepiania się rozpuszczonego wodorotlenku. Operacja ładowania sproszkowanej sody żrącej jest niebezpieczna dla zdrowia dla pracowników ze względu na niebezpieczeństwo kontaktu pyłu ze skórą, śluzówką, układem oddechowym personelu. [Maksymalne Dopuszczalne Stężenie (PDK) sody żrącej w powietrzu w strefie pracy w pomieszczeniach przemysłowych wynosi 0,5 mg/m³. Substancje szkodliwe w przemyśle, Chemia, T.3, 1977, str.324)]. Podczas rozpuszczania sody żrącej w bezwodnym etanolu roztwór osiąga równowagę zgodnie z poniższą reakcją (reakcja 1).

C₂H₅OH + NaOH C₂H₅ONa + H₂ O (1)

PL 231 885 Β1

Powyżej podano, że długotrwałe gotowanie 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu w wodnych roztworach prowadzi do powstawania produktów ubocznych, zanieczyszczających alkaliczne sole luminolu. W Przykładzie 1 patentu RU-2169139 stosowano długie gotowanie, co prowadzi do powstania zanieczyszczających produktów ubocznych, w tym przypadku powstają kryształy o odcieniu beżowym.

Główną wadą sposobu wytwarzania soli metali alkalicznych i ziem alkalicznych 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu w reakcji z alkoholanami w środowisku bezwodnego alkoholu, jest brak możliwości otrzymania czystych soli tworzących wodne roztwory bliskie obojętnego pH, co jest ważnym parametrem w przypadku ich terapeutycznego stosowania przez wstrzykiwanie. Jest to uwarunkowane niską rozpuszczalnością w alkoholach zarówno wyjściowego luminolu, jak i produktów reakcji - soli alkalicznych. Przy dodawaniu proszku 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu do alkoholowych roztworów metali alkalicznych i ziem alkalicznych następuje tworzenie się słabo rozpuszczalnych w alkoholach krystalicznych soli 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu. Krystalizacja produktu rozpoczyna się z roztworów zawierających silnie alkalicznie alkoholany, a podczas filtrowania zawiesiny część alkoholanów i alkaliów wytrąca się na kryształach alkalicznych soli luminolu. Inną istotną wadą znanego sposobu wytwarzania soli alkalicznych poprzez obróbkę luminolu bezwodnymi alkoholanami jest brak etapu oczyszczania surowca i produktu końcowego, a także pełne uzależnienie od jakości dostarczanego luminolu, którego jakość przy wytwarzaniu różnymi technologiami, przy pozyskiwaniu od różnych dostawców, a nawet w zależności od partii produktu może zmieniać się w szerokim zakresie, przy czym wszystkie nierozpuszczalne w alkoholu chemiczne i mechaniczne zanieczyszczenia wyjściowego luminolu dostają się do wytwarzanych soli alkalicznych. W związku z powyższym, sole alkaliczne i ziem alkalicznych 5-amino-2,3-dihydroftalhydrazyno-1,4-dionu, otrzymywane zgodnie ze sposobem według RU-2169139, nie nadają się do wykorzystywania w celach medycznych.

Sposób wytwarzania stosowanego w medycynie w charakterze środka immunomodulującego dihydratu soli sodowej 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu jest opisany w patencie RU-2113222. Tę syntezę prowadzi się w wodnym roztworze, przy czym dwie reakcje chemiczne zachodzą jednocześnie w jednym reaktorze. Ogrzewaniu stopu niklowo-glinowego w wodnym roztworze alkalicznym towarzyszy rozpuszczanie glinu, wydzielenie wodoru i tworzenie szkieletowego katalizatora niklowego (reakcja 2).

NiAJz + 6 NaOH —Ni + 2 NaaAlOj + 3 H₂ (2)

Jednocześnie w środowisku alkalicznym 2-nitroftalhydrazynę redukuje się wodorem na katalizatorze Ni-Raneya z wytworzeniem soli sodowej 2-amino-1,2,3,4-tetrahydro-ftalazyno-1,4-dionu (III) (reakcja 3).

Związek ill

Związek III ma postać jasnożółtego łatwo rozpuszczającego się w wodzie proszku i nosi nazwę Galavit Katalizator niklowy pozostaje w roztworze produktu.

W patencie RU-2138264 opisano sposób wytwarzania Galavitu, tj. dihydratu soli sodowej 2-amino-1,2,3,4-tetrahydroftalazyno-1,4-dionu, i obejmuje przekształcanie bezwodnika kwasu 3-nitroftalowego za pomocą hydratu hydrazyny w 2-nitroftalowy hydrazyd, który przekształca się w 3-aminoftalohydrazyd za pomocą hydratu hydrazyny w środowisku alkalicznym w obecności stopu niklowo-glinowego, a następnie prowadzi się cząsteczkowe przegrupowanie do 2-aminoftalohydrazydu za pomocą bromu, pod ciśnieniem. W etapie końcowym miesza się 2-aminoftalohydrazyd i roztwór NaOH w temperaturze do 85°C, a potem filtruje i odparowuje dla otrzymania dihydratu soli sodowej 2-amino-1,2,3,4-tetrahydro-1,4-ftalazynodionu.

W Euroazjatyckim patencie EA-004056 zaproponowano sposób wytwarzania soli sodowej 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu, wykorzystywanej w charakterze preparatu leczniczego pod nazwą Tamerit® (5-aminio-1,4-diokso-1,2,3,4-tetrahydroftalazyn-2-id Na, zgodnie z Farmakopeą radziecką) o działaniu immunomodelującym, przeciwzapalnym i antyoksydacyjnym. Ten sposób składa

PL 231 885 Β1 się z: przekształcania bezwodnika kwasu 3-nitroftalowego w 3-nitroftalohydrazyd w reakcji z hydratem hydrazyny (reakcja 4), przekształcania 3-nitroftalohydrazydu w 3-aminoftalohydrazyd (luminol) za pomocą wodoru otrzymanego z rozkładu hydratu hydrazyny na katalizatorze Ni-Raneya (reakcja 5), i wytworzenie soli sodowej przez obróbkę 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu wodnym roztworem wodorotlenku sodu z wydzieleniem produktu w środowisku alkoholu lub ketonu (reakcja 6).

NO

Q

,0 + ₂HNNH₂

NO O 2

NH

I

NH + H₂O (4)

NO O 2

II Γ ₊ JŁ hnnh

NH 2 ² 2

NaOH

+ 2H O + — N (5 ) 2 2 ² + H₂O (6) (II)

W tym patencie nie opisano etapu wytwarzania katalizatora Ni-Raneya w reakcji stopu niklowo-glinowego z wodnym roztworem wodorotlenku sodu, która prowadzi do powstawania glinu w wodach ściekowych.

Jedną z istotnych cech tego sposobu jest wykorzystanie w etapie wytwarzania 3-nitroftalohydrazydu reakcji rozkładania hydratu hydrazyny na katalizatorze Ni-Raneya, przy czym katalizator stanowiący zawiesinę niejednorodnych, pod względem składu granulometrycznego, drobno dyspersyjnych cząstek szkieletowego niklu w wodzie, dodaje się do reaktora w niewielkich porcjach. Precyzyjne dozowanie niewielkich ilości zawiesiny szkieletowego katalizatora niklowego jest trudne technologicznie ze względu na osiadanie stałych cząstek katalizatora na dnie naczynia i przylepianie do ścianek. Dodawanie świeżej porcji katalizatora prowadzi do burzliwego pienienia roztworu i unoszenia się hydratu hydrazyny z uchodzącymi gazami, co może prowadzić nawet do wyrzucenia mieszaniny reakcyjnej z reaktora. Dla oddzielenia katalizatora niezbędne jest filtrowanie masy reakcyjnej. Operacja filtrowania kończy się wymianą płótna filtracyjnego z osadzonym zużytym katalizatorem. Po otwarciu filtra katalizator kontaktuje się z tlenem z powietrza, który powoduje jego rozkład na filtrze tkaninowym, co grozi pożarem.

W etapie wydzielania soli sodowej według sposobu opisanego w patencie EA-004056 stosuje się dużą ilość łatwo palnych roztworów organicznych, na przykład dla wydzielenia 40 g soli sodowej niezbędne są 2 litry alkoholu izopropylowego. To powoduje powstawanie odpadów organicznych zawierających mieszaninę alkoholi, lub ketonów, z wodą i organicznymi domieszkami. Zwykłą destylacją nie można zregenerować tych rozpuszczalników ze względu na tworzenie się roztworów azeotropowych. Problem regeneracji organicznych rozpuszczalników w tym sposobie nie został rozwiązany, nie opisano metody jakościowej i ilościowej analizy otrzymanego produktu.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania soli 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu z metalami alkalicznymi o wzorze II

PL 231 885 Β1

(gdzie M oznacza kation Li, Na, albo K) obejmujący następujące etapy:

(i) bezwodnik kwasu 3-nitroftalowego poddaje się reakcji z hydratem hydrazyny w bezwodnym kwasie octowym w temperaturze 100-110°C z oddestylowaniem mieszaniny kwasu octowego i wody wytwarza się 5-nitro-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dion, a następnie (ii) 5-nitro-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dion przeprowadza się w sól 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu z metalem alkalicznym, przy czym w etapie (ii) 5-nitro-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dion rozpuszcza się w wodnym roztworze MOH, gdzie M ma znaczenie podane wyżej, z wytworzeniem roztworu soli alkalicznej 5-nitro-2,3-dihydro-1,4-ftalazynodionu, którą katalitycznie przekształca się w sól 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu w temperaturze 40-90°C za pomocą wodoru pod ciśnieniem 1-4 MPa, w obecności katalizatora z metalu przejściowego, wybranego spośród Pt i Pd, osadzonego na węglu aktywowanym, a wydzielanie krystalicznej soli 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu prowadzi się przez rozcieńczenie wodnego roztworu niższym alkoholem lub cyklicznym niższym eterem przy schłodzeniu do temperatury -5°C do -15°C.

Korzystnie sposobem według wynalazku wytwarza się sól sodową 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu. Jest ona określana nazwą handlową Tamerit®.

Również korzystnie sposobem według wynalazku wytwarza się sól litową 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu.

Korzystnie, po wytworzeniu 5-nitro-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu mieszaninę kwasu octowego z wodą obrabia się bezwodnikiem octowym dla zregenerowania bezwodnego kwasu octowego.

Korzystnie, bezwodne niższe alkohole lub cykliczne niższe etery regeneruje się przez obróbkę wodnych filtratów alkaliami, z rozdzieleniem warstw wodnej i organicznej, oraz destylowaniem warstwy organicznej.

Obecnie proponowany sposób obejmuje dwa etapy przedstawione poniżej (reakcja 7 i 8).

CH COOH + 3H₂O (7) (8)

Jako surowiec wyjściowy stosuje się bezwodnik kwasu 3-nitroftalowego, który poddaje się reakcji z hydratem hydrazyny w bezwodnym kwasie octowym w temperaturze 100-110°C, a po krystalizacji i przemyciu kwasem octowym i wodą, kryształy 5-nitro-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu odfiltrowuje się. Z filtratu destyluje się rozcieńczony kwas octowy, destylację prowadzi się z bezwodnikiem octowym (reakcja 7).

PL 231 885 B1

W odróżnieniu od rozwiązania opisanego w patencie EA-004056 sposobem według niniejszego wynalazku syntezę prowadzi się z regeneracją bezwodnego kwasu octowego, co powoduje, że ilość odpadów organicznych i wydatek surowca zmniejsza się kilkakrotnie.

W drugim etapie rozpuszcza się 5-nitro-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dion w wodnym roztworze alkalicznym (MOH), a sól alkaliczną 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu wytwarza się w reakcji z wodorem pod ciśnieniem (1-4 MPa) w obecności katalizatora z metalu przejściowego (Pd, Pt) (reakcja 8).

Sól krystaliczną 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu z metalami alkalicznymi (sól luminolu) wydziela się przez dodanie niższego (C1-C6) alkoholu, jak alkohol etylowy czy izopropylowy, lub cyklicznego niższego (C3-C6) eteru, jak dioksan, a następnie chłodzenie, krystalizację i filtrację. Przed dodaniem organicznego rozpuszczalnika kontroluje się i koryguje wartość pH wodnego roztworu, które powinno być nie wyższe niż 9,5 i nie niższe niż 8,3. Ma to istotne znaczenie dla terapeutycznego stosowania wytworzonej soli ponieważ przy wyższych wartościach pH przy podawaniu przez wstrzykiwanie może wystąpić martwica tkanek, natomiast przy wartościach niższych niż 8,3 następuje wytrącanie luminolu.

Wszystkie opisywane wcześniej sposoby wytwarzania soli luminolu były oparte na reakcji luminolu z alkalicznymi reagentami, na przykład alkaliami lub alkoholanami. Przeciwnie do tego w sposobie według niniejszego wynalazku nie ma etapu wytwarzania i wydzielania luminolu, wydajność otrzymanej soli zwiększa się, a cały sposób wytwarzania jest znacznie prostszy i bardziej ekonomiczny.

Obecnie zaproponowany sposób ma wiele korzyści. W nowym sposobie jako katalizator w etapie katalitycznego uwodorniania stosuje się metale przejściowe (Pt, Pd) osadzone na węglu aktywowanym. W odróżnieniu od wcześniej stosowanego katalizatora (Ni-Raneya) takie katalizatory łatwo oddzielają się od mieszaniny reakcyjnej i nie płoną na powietrzu, dlatego technologiczna operacja zmiany filtra nie grozi pożarem. Podczas tej reakcji katalitycznego uwodorniania nie tworzy się azot w postaci gazowej i nie występuje pienienie mieszaniny reakcyjnej, a całą ilość katalizatora wprowadza się w porcji przed syntezą, dlatego nie ma żadnego problemu z jego dozowaniem. Obecnie zastrzegany sposób prowadzi się w hermetycznie zamkniętym aparacie, a w wyniku syntezy do powietrza nie przedostaje się toksyczny hydrat hydrazyny, ponieważ w etapie tworzenia soli ten reagent nie jest stosowany.

Krystaliczne sole 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu wydziela się przez dodawanie do wodnego roztworu niższego alkoholu, lub cyklicznego niższego eteru, z następną krystalizacją przez schłodzenie do temperatury -5°C do -15°C. Głębsze chłodzenie wpływa na zwiększenie wydajności soli o 58%. Wytworzone kryształy oddziela się przez filtrację, filtrat poddaje się obróbce alkaliami, oddziela się warstwę organiczną i destyluje dla odzyskania bezwodnych rozpuszczalników. We wcześniej opisywanych sposobach otrzymywania soli luminolu odwodnione rozpuszczalniki organiczne po wydzieleniu soli stanowiły odpady produkcyjne, zaśmiecały środowisko i były przyczyną wysokiego zagrożenia pożarowego.

Wodny roztwór wytworzony w sposobie według wynalazku, zawierający około 10% sody żrącej (w przypadku wytwarzania soli sodowej), może być wykorzystywany w zakładach chemicznych do neutralizacji kwaśnych ścieków, przed ich skierowaniem do biologicznych oczyszczalni. Zawarty w wodnym roztworze alkohol izopropylowy o stężeniu do 50%, po jego dalszym rozcieńczeniu wodami ściekowymi, jest łatwo biodegradowalny, dlatego nie wpływa negatywnie na pracę oczyszczalni biologicznych.

Poniżej przedstawiono przykłady ilustrujące wytwarzanie soli 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu z metalami alkalicznymi sposobem według wynalazku.

Do analizy otrzymywanych produktów stosowano niżej podane metody.

Udział masowy pierwiastków C, H, N w związkach był określany za pomocą urządzenia do analizy elementarnej f-my Carbo Erba (Włochy). Zawartość metali alkalicznych (Li, Na, K) w solach określano za pomocą spektrometru emisyjnego IRIS f-my Thermo Jarrell Ash (USA). Analizy spektralne 1H NMR prowadzono za pomocą urządzenia Bruker AC-200. Chromatografię wykonywano na wysokosprawnym cieczowym chromatografie HPLC Agilent 1100 (USA), faza ruchoma = woda-metanol.

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie 5-nitro-2,3-dihydroftalazyno- 1,4-dionu

Szklaną kolbę o pojemności 1 litra, wyposażoną w mieszadło, termometr, chłodnicę i kapilarę napełniono 600 ml lodowatego kwasu octowego i 154,5 g (0,8 mola) bezwodnika kwasu 3-nitroftalowego, ogrzewano do temperatury 110°C i stopniowo dodawano 44,1 g (0,88 mola) hydratu hydrazyny. Po czym mieszaninę reakcyjną utrzymywano w stanie wrzenia przez 30 minut, a następnie ochłodzono do temperatury 80°C, odfiltrowano kryształy 5-nitro-2,3-dihydro-1,4-ftalazynodionu, osad przemywano

PL 231 885 B1 na filtrze 50 ml kwasu octowego, i dwukrotnie po 40 ml wody destylowanej. Łączna ilość 5-nitro-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu wynosiła 228,7 g, wydajność 92%.

Analiza elementarna dla C8H5N3O4: znaleziono w % - C 46,34, H 2,49, N 20,37; wyliczono w % - C 46,38, H 2,44, N 20,29.

Filtrat destylowano dla oddzielenia kwasu octowego, destylat mieszano i przemywano kwasem octowym, otrzymano 683 g kwasu octowego (93,7%).

Dla regeneracji bezwodnego kwasu octowego rozcieńczony kwas octowy ogrzewano do temperatury 45°C i stopniowo dodawano 244 g bezwodnika octowego, po 3 godzinach reakcji otrzymano 927 g zregenerowanego bezwodnego kwasu octowego.

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie soli litowej

Autoklaw o pojemności 1 litra, wyposażony w wężownicę z wymiennikiem ciepła, termoparę, mieszalnik, napełniano 550 ml wody destylowanej, 9,8 g (0,4 mola) chemicznie czystego wodorotlenku litu, o zawartości składnika aktywnego nie mniejszej niż 98%, 82,9 g (0,4 mola) 5-nitro-2,3-dihydroftalazyno1,4-dionu, 2 g katalizatora platynowego (Pt osadzona na węglu aktywowanym). Następnie autoklaw dwukrotnie przedmuchiwano wodorem dla usunięcia tlenu z powietrza, i przez reduktor wpuszczano wodór, utrzymując ciśnienie w granicach 3-3,5 MPa. Do wężownicy dostarczano chłodzoną wodę utrzymując temperaturę mieszaniny reakcyjnej w granicach 40-60°C. Po zakończeniu chłodzenia (3-5 godzin) katalizator oddzielano przez filtrowanie pod ciśnieniem, w atmosferze azotu, filtrat obrabiano 10 g aktywowanego węgla w temperaturze 30°C w ciągu 20 min, kontrolując alkaliczność mieszaniny reakcyjnej (pH nie wyższe niż 9,5), a następnie aktywowany węgiel odfiltrowano pod ciśnieniem, w atmosferze azotu. Do otrzymanego oczyszczonego filtratu dolewano 900 ml 1,4 dioksanu, mieszaninę ochłodzono do temperatury -5°C. Uzyskany krystaliczny hydrat soli litowej 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu odfiltrowano, przemywano dioksanem (2 razy po 100 ml), wysuszono w atmosferze azotu przez 2 godziny w temperaturze 85-90°C. Otrzymano 69,6 g białych kryształów, wydajność 95%.

Analiza elementarna dla C8H6NaO2Li:

znaleziono w % - C 52,45, H 3,26, N 23,02, Li 3,84;

wyliczono w % - C 52,47, H 3,31, N 22,95, Li 3,79.

Budowę produktu potwierdzono za pomocą spektroskopii 1H NMR (D2O).

Według danych z analizy HPLC udział soli litowej 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu wynosił

98,2%.

P r z y k ł a d 3

Wytwarzanie soli sodowej

W aparacie, opisanym w Przykładzie 2, umieszczano 540 ml wody destylowanej, 16,2 g (0,4 mola) technicznej, granulowanej żrącej sody (TR) (nie mniej niż 98,5% wodorotlenku sodu (SP 2263-79), 82,9 g (0,4 mola) 5-nitro-2,3-dihydro-1,4-ftalazynodionu, 1 g palladowego katalizatora (Pd osadzony na węglu aktywowanym), a następnie dwukrotnie przedmuchiwano wodorem dla usunięcia tlenu z powietrza, i do autoklawu wpuszczano wodór, utrzymując ciśnienie w granicach 1-2 MPa. Temperaturę mieszaniny reakcyjnej utrzymywano w granicach 75-90°C, regulując ją przez podawanie wody do wymiennika ciepła. Po 5-6 godzinach, po zakończeniu chłodzenia, katalizator oddzielano przez filtrowanie mieszaniny reakcyjnej w atmosferze azotu.

Kontrolowano alkaliczności filtratu (pH nie więcej niż 9,5), dodawano 10 g aktywowanego węgla i utrzymywano przez 20 minut w temperaturze 30°C, następnie odfiltrowano węgiel. Do oczyszczonego filtratu dolewano 1 I chemicznie czystego alkoholu izopropylowego, a uzyskaną mieszaninę ochłodzono do temperatury -15°C. Otrzymany dihydrat soli sodowej przemywano alkoholem izopropylowym (2 razy po 100 ml), wysuszono w atmosferze azotu przez 2 godziny, w temperaturze 90°C. Otrzymano 74,9 g białego proszku soli sodowej 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu, temp. top. z rozkładem powyżej 300°C. Wydajność 94%.

Analiza elementarna dla C8H6N3O2Na:

znaleziono w % - C 48,23, H 3,05, N 21,07, Na 11,61;

wyliczono w % - C 48,24, H 3,04, N 21,10, Na 11,55.

Budowę produktu potwierdzono metodą spektroskopii 1H NMR (D2O). Według danych z analizy HPLC udział soli sodowej 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu wynosił 99,0%.

PL 231 885 B1

Filtraty podstawowy i przemywany połączono w aparacie o pojemności 2 litrów, wyposażonym w mieszalnik i dolny spust, otrzymano 1450 g 63% wodnego roztworu alkoholu izopropylowego. Do aparatu wprowadzano 50 g granulowanej sody żrącej (SP 2263-79) i mieszano do całkowitego rozpuszczenia, wytworzyła się wodna i organiczna warstwa, warstwę wodną odlewano za pomocą dolnego spustu. Do organicznej warstwy dodawano jeszcze 15 g sody żrącej i mieszano do rozpuszczenia, dolną warstwę odlewano. Pozostałą warstwę organiczną destylowano i otrzymano 860 g (1095 ml) zregenerowanego bezwodnego alkoholu izopropylowego, który można wykorzystywać do kolejnych syntez.

P r z y k ł a d 4

Wytwarzanie soli potasowej

W aparacie, opisanym w Przykładzie 2, umieszczano 520 ml wody destylowanej, 41,5 g 54% roztworu (0,4 mola) wodorotlenku potasu (SP9285-78), 82,9 g (0,4 mola) 5-nitro-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu, 4 g palladowego katalizatora (Pd osadzony na węglu aktywowanym), następnie dwukrotnie przedmuchiwano wodorem dla usunięcia tlenu z powietrza, i do autoklawu wpuszczano wodór, utrzymując ciśnienie w granicach 4 MPa. Temperaturę mieszaniny reakcyjnej utrzymywano w granicach 75-85°C, regulując ją podawaniem wody do wymiennika ciepła. Po zakończeniu chłodzenia (5-6 godz.) katalizator oddzielano przez filtrowanie mieszaniny reakcyjnej. Alkaliczność roztworu ustalano w granicach pH 9,2-9,5, a do oczyszczonego filtratu dolewano 1,2 I oczyszczonego absolutnego alkoholu etylowego, a otrzymaną ciecz ochłodzono do temperatury -15°C. Otrzymany trihydrat soli potasowej przemywano alkoholem etylowym (2 razy po 100 ml), wysuszono w atmosferze azotu przez 2 godziny, w temperaturze 85°C. Otrzymano 79,2 g białego proszku soli potasowej 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu, wydajność 92%.

Analiza elementarna dla C8H6N3O2K:

znaleziono w % - C 44,57, H 2,87, N 19,45, K 18,25;

wyliczono w % - C 44,63, H 2,82, N 19,52, K 18,16.

Budowę produktu potwierdzono metodą spektroskopii 1H NMR (D2O). Według danych z analizy HPLC udział soli potasowej 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu wynosił 97,8%.

Obecnie zaproponowana synteza soli 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu z metalami alkalicznymi jest prostsza technologicznie i bezpieczniejsza dla środowiska, a wytwarzana substancja biologicznie czynna jest mniej toksyczna, ponieważ pomija się etap wytwarzania luminalu, zatem w produkcie nie ma śladu tego związku. Wytworzona sposobem według wynalazku sól jest doskonale rozpuszczalna w wodzie i soli fizjologicznej, jest bardziej stabilna niż wytwarzana innymi znanymi sposobami, a w postaci farmaceutycznej kompozycji ma przedłużone działanie i nie wykazuje efektów alergizujących, teratogennych i mutagennych.

Badania farmakologiczne soli wytworzonych sposobem według wynalazku wykazały, że najbardziej skuteczna terapeutycznie spośród soli litowej, sodowej i potasowej jest sól sodowa, a w przypadku chorób układu nerwowego i chorób psychicznych sól sodowa ewentualnie w kombinacji z solą litową.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest farmaceutyczna kompozycja zawierająca sól 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu z metalami alkalicznymi wytworzoną wyżej opisanym sposobem. Korzystnie kompozycja jako składnik aktywny zawiera kombinację soli sodowej i litowej. Takie kompozycje mogą mieć konwencjonalną postać i wytwarza się je konwencjonalnymi metodami, znanymi specjalistom w tej dziedzinie. Najbardziej korzystnym sposobem podawania farmaceutycznej kompozycji jest wstrzykiwanie domięśniowe.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie soli sodowej 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu do wytwarzania leku o właściwościach regulacji procesów biosyntetycznych w komórkach, w szczególności w systemie makrofagów i w szpiku kostnym, do leczenia chorób trzustki, w szczególności stanów zapalnych trzustki, i cukrzycy.

Niniejszy opis ujawnia także sposób leczenia chorób serca, w szczególności zawału i zapalenia mięśnia sercowego, polegający na podawaniu potrzebującemu tego pacjentowi skutecznej ilości soli sodowej 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu.

Niniejszy opis ujawnia także sposób leczenia chorób trzustki, w szczególności stanów zapalnych trzustki, i cukrzycy, polegający na podawaniu potrzebującemu tego pacjentowi skutecznej ilości soli sodowej 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu.

Niniejszy opis ujawnia także sposób leczenia chorób układu nerwowego, w szczególności stwardnienia rozsianego, choroby Alzheimera, oraz chorób psychicznych, w szczególności zespołów depresyjnych i stanów lękowych, polegający na podawaniu potrzebującemu tego pacjentowi skutecznej ilości

PL 231 885 B1 soli sodowej 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu, ewentualnie w kombinacji z solą litową 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu.

II. Zastosowanie Tameritu® w leczeniu zawału mięśnia sercowego

Zawał serca jest na całym świecie wciąż jedną z najpoważniejszych przyczyn zgonów i dotyczy między 100 a 330 mężczyzn na 100.000 oraz 50-154 kobiety na 100.000. Leczenie zawału nadal jest jednym z największych problemów współczesnej medycyny. W rekomendacjach Europejskiego Towarzystwa Kardiologicznego (2000) leczenie zawału oparte jest na stosowaniu inhibitorów trom biny (heparyna), środków hamujących agregację płytek (aspiryna, tienopirydyny, blokery określonych receptorów płytek krwi), nitratów i antagonistów wapnia. Nowoczesne podejście do leczenia jest kompleksowe, uwzględnia zróżnicowaną patogenezę choroby i mechanizmy działania poszczególnych leków. Wiedząc o tym, że przy zaburzeniach krążenia wieńcowego patologia dotyczy nie tylko obszaru niedokrwienia, lecz także całego mięśnia sercowego, ważne jest przeciwdziałanie patologicznym procesom w różnych aspektach.

Niedokrwienie mięśnia sercowego powoduje hiperaktywację makrofagów, które przyciągają leukocyty i limfocyty do ogniska zawału i jednocześnie produkują pozapalne cytokiny (IL-1,2,6) i TNF alfa. Leuko- i limfocyty przyspieszają procesy martwicze, a powstające w tym czasie wolne rodniki obkurczają wszystkie naczynia włosowate w mięśniu sercowym (nie tylko w ognisku zawału). Pozapalna reakcja humoralna typu TH-1 dodatkowo pogarsza warunki hemodynamiczne w sercu i przyspiesza apoptozę komórek mięśnia sercowego.

Stosowane leczenie konwencjonalne jest leczeniem objawowym i nie ma wpływu na opisany powyżej patologiczny proces hiperaktywacji makrofagów.

Stosowanie Tameritu® w leczeniu chorób serca, zwłaszcza mięśnia sercowego, a w szczególności zawału mięśnia sercowego - spełnia warunki leczenia przyczynowego. Jak wynika z przeprowadzonych badań Tamerit®:

1) stabilizuje układ makrofagów, co wpływa na zahamowanie reakcji leuko- i limfocytarnej oraz hamuje wyrzut patologicznych cytokin;

2) jako silny antyoksydant działa przeciw powstającym wolnym rodnikom i rozszerza naczynia krwionośne;

3) stymulując komórki macierzyste w szpiku kostnym powoduje przyspieszenie regeneracji śródbłonka (endotelium) naczyń włosowatych i stymuluje neoangiogenezę w ognisku zawału. Ponadto stabilizacja makrofagów hamuje procesy apoptozy, czyli wpływa pozytywnie na regenerację uszkodzonej tkanki.

Przykład biologiczny 1 - wpływ Tameritu® na dynamikę zawału mięśnia sercowego w modelu zwierzęcym

W badaniach eksperymentalnych na szczurach badano dynamikę zawału mięśnia sercowego bez leków oraz po podaniu Tameritu®. U 30 szczurów eksperymentalnie wywołano zawał serca. Zwierzęta o masie od 230 do 258 g poddano narkozie eterowej na okres 1-3 minut. Następnie metodą torakotomii uzyskiwano dostęp do przedniej gałęzi tętnicy wieńcowej i elektrodą zamykano jej światło. Ranę zamykano atraumatycznymi szwami. Po 10 minutach zwierzęta powracały do stanu ogólnego sprzed operacji. Nie zaobserwowano ani jednego zejścia śmiertelnego. Szczury podzielono na 2 grupy: połowa osobników o masie 248 +/- 10 gramów otrzymywała Tamerit® w dawce 5 mg/kg masy ciała/dobę domięśniowo, a druga połowa osobników o masie 241 +/- 12 gramów otrzymywała roztwór 0,9% NaCI, również domięśniowo (wszystkie osobniki płci męskiej).

Zwierzęta obserwowano przez 24 godziny (każde w osobnej klatce) - zachowywały się normalnie. Pierwszą grupę 10 szczurów (po 5 z każdej grupy) zabito (dekapitacja w narkozie) po 24 godzinach, stwierdzając u wszystkich makroskopowe cechy zawału mięśnia sercowego. Drugą grupę 10 szczurów (po 5 z każdej grupy) zabito po 5 dniach, a trzecią - również 10 zwierząt (po 5 z każdej grupy) - po 7 dniach. U wszystkich szczurów pośmiertnie oceniano makroskopowo serce, opłucną i narządy jamy brzusznej, pobierano tkanki z ogniska zawału do badania mikroskopowego, utrwalając je w formalinie i konwencjonalnie barwiąc HE. Krew do badań biochemicznych pobierano przez punkcję serca, w objętości 3 ml. U szczurów, które otrzymywały Tamerit®, nie zaobserwowano ani jednej reakcji bólowej, ani miejscowego stanu zapalnego w miejscu iniekcji, nie stwierdzono też duszności, ropienia rany pooperacyjnej, ani ropniaków opłucnej.

Wyniki badania pokazują, że już w 1 dobie po zawale wystąpiły znaczące zmiany nie tylko w strefie zawału, lecz także w pozostałych rejonach mięśnia sercowego. Zaobserwowano obrzęk podścieliska komórek, zatarcie struktury miofibryli, kardiolizę, plazmolizę i głębokie zmiany destrukcyjne. W strefie

PL 231 885 B1 martwicy zmiany charakteryzowały się rozprzestrzenianiem się procesu przez ciągłość. Wyraźnie zaznaczona strefa demarkacji. Tkanki przylegające do strefy zawału cechowały się częściową atrofią miokardiocytów i zmianami strukturalnymi podobnymi do zmian w ognisku zawału, głównie w okolicy przedniej ściany lewej komory serca, aż do dystroficznych i martwiczych zmian w poszczególnych włóknach mięśniowych. W tkankach przyległych obserwowano obrzęk, przekrwienie bierne naczyń śród mięśniowych i zakrzepy.

W grupie szczurów otrzymujących Tamerit® uwidoczniono wyraźnie widoczną strefę zawału w bocznych ścianach lewej i prawej komory serca, jednakże bez sformowania wału demarkacyjnego. Stwierdzono występujące cechy kariolizy, w strefie przylegającej niewielki obrzęk tkanek i podminowanie naczyń krwionośnych. Nie stwierdzono migracji leukocytów. Nie stwierdzono makroskopowych zmian w wątrobie, płucach, nerkach i śledzionie.

W 5-tej dobie po zawale nie stwierdzono zmian w zachowaniu zwierząt, ani zaburzeń w zapotrzebowaniu na jedzenie i wodę. Rana pooperacyjna goiła się przez rychłozrost (per primam) u 4 szczurów bez Tameritu® (podskórny naciek z płynem surowiczym) i u wszystkich 5 szczurów leczonych Tameritem®. U szczurów w grupie kontrolnej zabitych w 5-tej dobie stwierdzono zawał podwsierdziowy lub śródścienny, martwicze kardiomiocyty otoczone wałem demarkacyjnym, obecne cechy granulacji tkanek i fibroblasty, hemokapilary w mięśniach, a w tkankach przylegających liczne nacieki. U szczurów leczonych Tameritem® stwierdzono zawał w bocznej ścianie lewej komory serca. Obecne martwiczo zmienione kardiomiocyty, kardio- i plazmoliza. Widoczne prawidłowe naczynia włosowate o typie siatki sinusoidalnej, jak w prawidłowych tkankach. Na obwodzie widoczne zgrupowanie makrofagów i limfocytów, proliferacja fibroblastów. W tkankach przylegających do strefy zawału widoczny średnio nasilony obrzęk i prawidłowe naczynia krwionośne. W strefie demarkacji nie stwierdzono polimorficznych-jądrzastych leukocytów (Fig. 1). Na bocznej ścianie prawej komory serca kardiomiocyty prawidłowe, obecne liczne prawidłowe kapilary z szerokim światłem. W obu grupach nie stwierdzono makroskopowych zmian w innych narządach, ale w grupie leczonej Tameritem® ich ukrwienie było większe.

W 7-ej dobie nadal nie stwierdzano zmian w zachowaniu zwierząt. Nie stwierdzono też makroskopowych zmian narządowych. U 1 szczura z grupy kontrolnej stwierdzono ropne powikłania w obrębie rany pooperacyjnej. W obu grupach zaobserwowano liczne zrosty w opłucnej w okolicy blizny po operacji. Strefa zawału u zwierząt grupy kontrolnej zlokalizowana śródściennie w ścianie lewej komory serca. Widoczne cechy organizacji blizny - dezintegracja komórek mięśniowych i nacieki z granulocytów z dużą liczbą makrofagów i fibroblastów oraz sinusoidalnych hemokapilar. Liczne i obfite nacieki limfocytarne i granulocytarne (obojętnochłonne). W naczyniach grupy leukocytów położonych obwodowo. U szczurów leczonych Tameritem strefa zawału była zlokalizowana podwsierdziowo na bocznej ścianie lewej komory serca. Widoczna ziarnista tkanka złożona z proliferacyjnych fibroblastów i makrofagów. Naczynia włosowate prawidłowe, typu sinusoidalnego, z prawidłowo uformowaną ścianą z wyraźnie zaznaczonym śródbłonkiem i błoną podstawową. W ścianki naczyń wchodzą komórki mięśni gładkich. W strefie blizny umiarkowane nacieki limfocytarne i niewielka liczba makrofagów. W bocznej ścianie prawego przedsionka prawidłowe kardiomiocyty, naczynia śródmięśniowe także prawidłowe, o szerokim świetle.

Jak widać, dzięki podaniu Tameritu® uzyskano pozytywny wpływ na procesy regeneracyjne uszkodzonych tkanek w modelu eksperymentalnego zawału mięśnia sercowego. W strefie martwiczej pojawia się wczesna proliferacja fibroblastów i szybka neoangiogeneza, nastąpiło szybkie oczyszczanie strefy z elementów martwiczych, wskutek prawidłowej reakcji makrofagów. Nie stwierdzono rozszerzania się strefy martwicy przez ciągłość, za to szybko uformowała się tkanka ziarnista bez cech włóknienia.

Przykład biologiczny 2 - wpływ Tameritu® na leczenie zawału mięśnia sercowego w modelu zwierzęcym

W kolejnym badaniu dodatkową grupę szczurów po eksperymentalnym wywołaniu zawału mięśnia sercowego (jak w Przykładzie 1) leczonych Tameritem® w dawce 5 mg/kg masy ciała /dzień zabito w 14 dobie po operacji (metodyka jak opisana w Przykładzie 1). Stwierdzono strefę zawału zlokalizowaną podosierdziowo. Obecna tkanka ziarnista z rozszerzonymi prawidłowymi naczyniami włosowatymi. Obfita tkanka łączna z miernymi naciekami limfatycznymi. Obecne aktywne fibroblasty. Kardiomiocyty zlokalizowane obwodowo do strefy zawału z objawami destrukcji w postaci lizy sarkoplazmy i piknotycznymi jądrami. Wokół obficie rozwinięta sieć naczyń krwionośnych z dobrze rozwiniętą błoną mięśniową. Umiarkowana liczba makrofagów i limfocytów. Nie stwierdzono polimorficzno-jądrzastych leukocytów. Przy barwieniu metodą Weinerta stwierdzono sieć włókien elastyny i kolagenowych o różnym

PL 231 885 Β1 stopniu dojrzałości oraz nieliczne tylko cechy włóknienia (Fig. 2 do Fig. 5). Oznacza to korzystne dla funkcji mięśnia sercowego niepowstawanie sztywnej i niefunkcjonalnej blizny po zawale.

Przykład biologiczny 3 - ocena parametrów biochemicznych zawału mięśnia sercowego w modelu zwierzęcym

V\i badaniach biochemicznych oceniano poziom kinazy kreatyninowej (CPK), dehydrogenazy mleczanowej (LDH 1-2), transaminazy asparaginianowej (AST) i alaninowej (ALT) przed zawałem oraz w 1,5 i 7 dobie po zawale (Aparatura „Immunochemistry System”, Beckman Coulter; „DSL”, „Multiscan”, Labsystem; „Glycomat DS5”, Drew). Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 1.

Tabela 1 - Wpływ Tameritu® na badane parametry krwi u szczurów z eksperymentalnym zawałem mięśnia sercowego

Enzym	Szczury zdrowe	Grupy zwierząt w zależności od doby zakończenia eksperymentu
1. doba	5. doba	7. doba
Nieleczone	Tamerit	nieleczone	Tamerit	nieleczone	Tamerit
(n = 4)	(n = 5)	(n = 5)	(n = 5)	(rt = 5)	(n = 5)	(n = 5)
CPK	146,92	234,9	322,56	168,54	405,28	248,12	291,35
(mcmol/l)	±22,6	±60,1	±43,79*	±21,6*	±27,84·**	±41,5*	±18,9’
AST	0,193	0,415	0,254	0,290	0,204	0,288	0,225
(mcmol/l)	±0,014	±0,033*	+0,034”	±0,05	±0,03”	±0,023*	±0,024”
ALT	0,175	0,395	0,178	0,312	0,271	0,292	0,24
(Mcmol/l)	±0,28	±0,062*	±0,028”	±0,055*	±0,059 **	±0,026*	±0,024
LDH u	165,15	515,82	248,84	262,28	187,94	346,46	175,5
(Mcmol/l)	±34,6	±60,1*	±41,10”	±22,1*	±34,37	±52,9*	±25,89”

* Wynik znamienny statystycznie do grupy zwierząt zdrowych - p<0,05 ** Wynik znamienny statystycznie w stosunku do zwierząt nieleczonych - p<0,05.

Jak widać, zastosowanie Tameritu® spowodowało szybszą normalizację wszystkich badanych parametrów.

Z powyższych danych biologicznych wynika, że nowe zastosowanie Tameritu® w eksperymentalnym modelu zawału mięśnia sercowego u szczurów pozwala na uzyskanie szybszej regeneracji uszkodzonych tkanek, niepostawanie sztywnej blizny, aktywację neoangiogenezy z prawidłowymi komórkami mięśni gładkich (czego w ogóle nie obserwuje się w przypadkach typowego przebiegu po zawale) i prawidłowe ukrwienie tkanek przylegających do strefy martwicy, szybsze usuwanie elementów martwiczych oraz stabilizację enzymów - markerów zawału serca. Zatem mechanizm działania Tameritu® - stabilizacja układu makrofagów, efekt antyoksydacyjny i angiogenetyczny - ma wpływ na skuteczność leczenia zawału mięśnia sercowego.

Przykład biologiczny 4 - leczenie zawału mięśnia sercowego u ludzi

Tamerit® stosowano także do leczenia ludzi po zawale mięśnia sercowego. U 15 pacjentów od 1-ej doby po zawale stosowano Tamerit® w dawce 100-200 mg/dobę, w zastrzykach domięśniowych przez 7 dni, obok typowej konwencjonalnej terapii. W porównaniu z grupą kontrolną uzyskano szybsze zmniejszenie się dolegliwości bólowych w klatce piersiowej, szybszą normalizację parametrów biochemicznych krwi (CPK, LDH, ALT, AST) i obrazu EKG. U żadnego pacjenta nie wystąpiły objawy uboczne z powodu podawania leku.

Jak wynika z tych badań sposób leczenia zawału mięśnia sercowego za pomocą Tameritu® wyróżnia się tym, że:

1. normalizuje procesy biosyntezy w hiperaktywowanych makrofagach, reguluje infiltrację komórek systemu immunologicznego do ogniska zawału, zapobiega powstaniu nadtlenku azotu, obniżając ich potencjał destrukcyjny; zmniejsza obrzęk tkanek i rozprzestrzenianie się ogniska martwicy;

PL 231 885 B1

2. hamuje produkcję TNFalfa, a co za tym idzie obniża apoptozę komórek mięśnia sercowego;

3. normalizuje poziomy enzymów, uczestniczących w procesach martwiczych i zapalnych;

4. w związku z aktywacją procesów regeneracyjnych zapobiega powstawaniu grubej i sztywnej blizny;

5. nasila neoangiogenezę poprzez pobudzenie produkcji śródbłonkowych komórek macierzystych w szpiku kostnym;

6. u chorych z chorobami serca, szczególnie z chorobą niedokrwienną, zapaleniem mięśnia sercowego i z zawałem powoduje szybkie ustępowanie objawów chorobowych, normalizację funkcji serca i badań biochemicznych.

III. Zastosowanie Tameritu® do leczenia chorób zapalnych trzustki

Trzustka i jej choroby (ostre i przewlekłe zapalenie trzustki martwica trzustki, autoimmunologiczne zapalenie trzustki, cukrzyca, itp.) wzbudzają ogromne zainteresowanie w świecie, zarówno wśród lekarzy, jak i w ośrodkach badań eksperymentalnych i klinicznych, ponieważ systematycznie na całym świecie wzrasta liczba zachorowań na takie choroby. Szczególnie aktualne są zagadnienia związane ze stanami zapalnymi trzustki powstałymi na skutek procesów zapalnych i autoimmunologicznych w trzustce. Wielorodna etiologia i różnorodność form klinicznych stanów zapalnych trzustki wymagają stosowania kompleksowej terapii obejmującej wiele różnych metod leczenia.

Tradycyjny, zachowawczy sposób leczenia ostrego zapalenia trzustki obejmuje, w zależności od stanu klinicznego i wyników badań laboratoryjnych (l.l. Diegtariewa, Kliniczeskaja gastroentero logia, podręcznik dla lekarzy, Medicinskoje Informacjonnyje Agenstwo, 2004; 313-335; J.A. Niesterienko, W.W. Łaptiew, S.W. Michajłusow, Diagnostika i leczenie destruktiwnych pankreatitow, Moskwa, Binom Press, 2004, 129-187):

1. leczenie antysekrecyjne - inhibitory proteaz, inhibitory syntezy enzymów proteolitycznych, inhibitory receptora H2 w żołądku;

2. leczenie reologiczne - infuzje odpowiednimi płynami i żywienie pozajelitowe;

3. leczenie przeciwzapalne - antybiotyki i NLPZ;

4. leczenie spazmolityczne i przeciwbólowe;

5. leczenie sedatywne i antyhistaminowe;

6. profilaktyka powikłań zapalnych, w szczególności stanów septycznych - preparaty immunosupresyjne, w tym sterydy i antybiotyki;

7. kontrolowana forsowana diureza w wielu przypadkach;

8. w przypadkach wstrząsu septycznego - leczenie immunoglobuliną ludzką.

Niestety, mimo coraz bardziej nowoczesnego leczenia i coraz lepszych metod diagnostycznych, odsetek powikłań i zgonów pozostaje cały czas niepokojąco wysoki. Problemy dotyczą głównie zatrzymania procesu autologicznego i skurczu naczyń zaopatrujących gruczoł, oraz niewielkiej skuteczności środków przeciwbólowych.

W rozwoju przewlekłego zapaleniu trzustki ważną rolę odgrywają procesy zapalne i zmiany włókniste, prowadzące do postępującego procesu obniżenia egzo- i endokrynnej funkcji gruczołu, powolnego zastępowania tkanki gruczołowej przez tkankę łączną, pojawienia się zwapnień, blizn pozapalnych i pseudotorbieli. W patogenezie ważną rolę odgrywają zaburzenia regionalnego krążenia - skurcz naczyń i hipoksja, arterioskleroza, rozszerzenie naczyń z zastojem krwi, mikroangiopatie, spadek mikrokrążenia, itd..

Tradycyjne leczenie takich stanów obejmuje:

1. Stworzenie dogodnych warunków dla pracy gruczołu - dieta i nawodnienie;

2. Leki przeciwbólowe, spazmolityki;

3. Leki przeciwhistaminowe;

4. Preparaty substytucyjne;

5. Infuzje i żywienie pozajelitowe;

6. Antybiotykoterapia w celu powstrzymania procesu zapalnego i profilaktyki powikłań, jak choćby zapalenia powstających pseudotorbieli.

Jednak i w przypadkach przewlekłego zapalenia trzustki odsetek powodzeń terapii nie wzrasta mimo postępów w diagnostyce i stosowania nowych lekarstw - nie udaje się przedłużyć okresu remisji i zapobiec wielu powikłaniom. Prawdopodobną przyczyną jest fakt, iż wszystkie opisane powyżej metody leczenia działają wyłącznie objawowo i nie likwidują pierwotnej przyczyny choroby.

PL 231 885 Β1

Celem proponowanego leczenia chorób trzustki, w szczególności stanów zapalnych trzustki, jest działanie na przyczynę powstawania choroby na poziomie komórkowym - co pozwala na uniknięcie wielu powikłań i przedłużenie okresów remisji.

Udowodniono, że za zmiany zapalne w komórkach odpowiadają hiperaktywowane makrofagi i ich produkty (cytokiny z grupy TH-1, wolne rodniki, białka ostrej fazy) oraz pobudzone przez makrofagi limfocyty z antygenami cytotoksycznymi i komórki NKT. Od ich aktywności zależy początek choroby i jej przebieg. Hiperaktywowane makrofagi przekazują nieprawidłową informację całemu systemowi immunologicznemu, co może prowadzić do uogólnionej reakcji immunologicznej, prowadzącej do ostrej martwicy trzustki lub/i wstrząsu, a także do reakcji autoimmunologicznej działającej nawet przez wiele miesięcy. Ponadto makrofagi biorą udział w regulacji poziomu glukozy poprzez syntezę czynników insulino podobnych IGF-1 i IGF-2. Zapalenie powoduje zmniejszenie produkcji insuliny, co zwiększa produkcję IGF. W związku z powyższymi przesłankami jedyną efektywną metodą wydaje się być ustabilizowanie systemu makrofagów i ich pochodnych.

W chwili obecnej jedynymi preparatami o takim działaniu są: TAMERIT®, oraz GALAVIT®. Tamerit® stabilizuje procesy biosyntezy w makrofagach, cały układ makrofagów, normalizuje nieprawidłowe reakcje immunologiczne, autoimmunologiczne a przez to zachowuje prawidłową czynność komórek trzustki, włącznie z komórkami beta wysepek Langerhansa, co skutkuje prawidłową syntezą insuliny.

Przykład biologiczny 6 - badania doświadczalne i kliniczne stosowania Tameritu® w leczeniu chorób trzustki

W przeprowadzonych badaniach doświadczalnych i klinicznych zastosowano terapię konwencjonalną z dodatkowym podawaniem Tameritu® (20-30 zastrzyków domięśniowych po 0,1 —1 g/dawkę, połowę zastrzyków codziennie, drugą połowę co drugi dzień), a także w badaniach doświadczalnych na szczurach stosowano monoterapię Tameritem® w dawce 5 mg/kg masy ciała/dobę, przez miesiąc.

Po zastosowaniu Tameritu® zaobserwowano hamowanie procesów zapalnych i martwiczych w trzustce, spadek powikłań septycznych, ochronę komórek beta trzustki, wzrost syntezy insuliny i stabilizację mikrokrążenia.

Stabilizując procesy biosyntezy w makrofagach, Tamerit® przerywa patogenetyczny łańcuch prowadzący do uszkodzenia trzustki i pomaga przywrócić prawidłową funkcję gruczołu. Nadto podtrzymuje homeostazę, regenerację tkanek i ma wpływ na prawidłowe wydzielanie czynników wzrostu FGF, TGF alfa i beta, IGF, i in., przy czym należy podkreślić że TGF alfa i beta są czynnikami najsilniej pobudzającymi regenerację uszkodzonych tkanek.

W badaniach doświadczalnych na szczurach uzyskano wyniki potwierdzające skuteczność leczenia Tameritem®. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 2.

Tabela 2. Wyniki badań biochemicznych u szczurów z cukrzycą alloksanową po leczeniu Tameritem®

Badana substancja	Grupa kontrolna	Cukrzyca niweczona	Cukrzyca leczona Tameritem
Glukoza mmol/l	3,83 +/-0,302	9,07 +/- 0,45*	4,16+/- 0.56*
Glikozowana hemoglobina (HbA1C)%	2,30 +/- 0,07	13,56 +/-0,35*	9,05 +/- 0,58*
IGF-2 w ng/ml	46,2 +/- 3,09	59,5+/-13,56	37,0+/-1,65*
IGF-1 w ng/ml	981,66 +/-73,7	327,84 +/- 66,74 *	699,13+/- 81,4*
IGF-1/IGF-2	24,02 +/- 3,93	5,95 +/-1,04*	16,2 +/- 2,4 *
Insulina mg/ml	1,043 +/- 0,18	0,496 +/- 0,09*	0,724 +/-0,08*

* Wyniki znamienne statystycznie, p<0,05

W badaniach klinicznych na 25 przypadkach pacjentów z ostrym i przewlekłym zapaleniem trzustki, wśród których było 5 pacjentów z zaczynającą się martwicą trzustki, stwierdzono: powikłania septyczne wystąpiły u 1 pacjenta; u 2 pacjentów z początkiem formowania pseudotorbieli, zniknęły one

PL 231 885 B1 po leczeniu Tameritem®; na początku leczenia u 15 pacjentów stwierdzono obniżenie poziomu insuliny (stosowano insulinę do 40 lU/dzień), po 2 tygodniach terapii Tameritem® uzyskano obniżenie Hb1AC u 6 pacjentów do normy, spadek poziomu glukozy 2x, a podawanie insuliny obniżono do 10 IU/dzień; podniósł się prawie do normy poziom insuliny. Objawy bólowe u wszystkich pacjentów zmniejszyły się już po 2 dobie leczenia, a u wszystkich zniknęły po 7 dniach (w grupie kontrolnej bóle o różnym nasileniu utrzymywały się ponad 2 tygodnie). Po 3 tygodniach leczenia 20 pacjentów mogło powrócić do odżywiania per os, po miesiącu nastąpiła normalizacja wyników badań laboratoryjnych u 22 pacjentów. Nie zaobserwowano istotnych objawów ubocznych. Poniżej podano dwa szczegółowe przykłady:

1. Mężczyzna S., 42 lata;

Przyjęty w stanie ogólnym ciężkim, temp. 38,1°C, z silnymi bólami brzucha i wymiotami, dusznością, sinicą obwodową, tachykardią i oligurią. W badaniach laboratoryjnych: leukocyty 20.000/m m³, z przesunięciem w rozmazie w lewo, amylaza 85% mg, transaminazy w normie, bilirubina 1,4% mg. Po badaniu USG i CT rozpoznano ostre zapalenie trzustki z obrzękiem. Zastosowano: pełne żywienie pozajelitowe, insulina 8 lU/d, furosemid 1 g, 0,25% nowokainy, papawerynę, no-spa i leki przeciwbólowe. Nie zastosowano antybiotyku, a podano Tamerit® w dawce 0,1 g/dobę przez 10 dni (10 zastrzyków), a później jeszcze 15 zastrzyków po 0,1 g co drugi dzień. Pacjent został wypisany ze szpitala po 6 tygodniach, w stanie dobrym, przy całkowitej normalizacji wyników laboratoryjnych. Obserwowany przez 10 miesięcy - całkowita remisja choroby i całkowite przywrócenie czynności trzustki.

2. Kobieta K., lat 55;

Pacjentka chorująca na przewlekłe zapalenie trzustki od 10 lat, wiele razy leczona tradycyjnie, uzyskano tylko krótkotrwałe remisje, trwające nie dłużej niż 3-4 miesiące. Obserwowano okresowe podwyższenie poziomu glukozy do 200% mg, leczone doustnymi preparatami przeciwcukrzycowymi, przewlekłe bóle brzucha o różnym nasileniu, nudności oraz cechy angiopatii w kończynach dolnych. Laboratoryjne i obrazowe badania diagnostyczne potwierdziły rozpoznanie przewlekłego zapalenia trzustki oraz cukrzycy II typu. Tym razem zastosowano nawodnienie oraz monoterapię Tameritem®: 0,1 g /dzień przez 15 dni, potem 5 zastrzyków 0,1 g co drugi dzień i 5 co trzeci dzień. W końcu leczenia uzyskano normalizację badań laboratoryjnych, w USG obraz i rozmiary trzustki prawidłowe, poziom glukozy w normie bez konieczności stosowania leków przeciwcukrzycowych, pacjentka nie zgłaszała żadnych dolegliwości bólowych. Obserwowana potem przez 11 miesięcy - stwierdzono całkowitą remisję.

Jak wynika z powyższych doświadczeń i prób klinicznych stosowanie Tameritu® w ostrych i przewlekłych stanach zapalnych trzustki, poprzez jego wpływ na układ immunologiczny i przyczynę choroby, pozwala na szybsze wyleczenie i długotrwałą remisję, stabilizuje układ immunologiczny, zapobiega powikłaniom i reakcjom autoimmunologicznym, pobudza procesy regeneracyjne w gruczole. Pacjenci leczeni klinicznie Tameritem® czują się zdrowi i nie cierpią na przewlekłe zespoły bólowe.

IV. Stosowanie Tameritu® w leczeniu cukrzycy

W cukrzycy typu I stosowanie insuliny i diety nie prowadzi do remisji choroby, jest terapią objawową - substytucją zmniejszonej produkcji hormonu przez uszkodzone komórki beta wysp Langerhansa. Mimo leczenia u chorych z wieloletnią cukrzycą dochodzi do poważnych powikłań narządowych w postaci retinopatii, angiopatii, nefropatii i in., które często stają się nawet przyczyną zgonu chorych.

W cukrzycy typu II stosowanie diety oraz leków hipoglikemicznych także zazwyczaj nie prowadzi do całkowitego wyleczenia, a chorzy narażeni są na poważne powikłania naczyniowe. Ostatnie badania nad patogenezą cukrzycy wykazały, że poważną role w rozwoju choroby (oprócz udowodnionych już czynników, choćby genetycznych) mogą odgrywać procesy autoimmunologiczne oraz przewlekłe stany zapalne trzustki. Ponadto, szczególnie w cukrzycy typu II duże znaczenie odgrywa stres oksydacyjny, którego skutkiem jest między innymi uszkodzenie komórek beta trzustki.

Jak wynika z przeprowadzonych badań Tamerit® jako lek immunomodulacyjny i przeciwzapalny ma szanse być kluczowym lekiem, który może doprowadzić do długotrwałej remisji choroby, tzn. do obniżenia poziomu glukozy we krwi oraz wzrostu produkcji endogennej insuliny. Stabilizując układ makrofagów doprowadza do wzrostu i stałej produkcji czynników wzrostu o silnym działaniu regeneracyjnym na komórki beta: transformujące czynniki wzrostu - TGF alfa i beta, płytkowo-pochodny czynnik wzrostu PDGF, czynnik wzrostu fibroblastów - FGF oraz oba insulino podobne czynniki wzrostu - IGF-1 i IGF-2. Ponadto ogranicza odczyn zapalny w trzustce poprzez normalizację produkcji odpowiednich cytokin (IL-1, IL-2, IL-6). W dodatku działanie antyoksydacyjne zmniejsza niedokrwienie tkanek i skutki działania stresu oksydacyjnego.

PL 231 885 Β1

Przykład biologiczny 7 - stosowanie Tameritu® u szczurów z ailoksanową cukrzycą Zastosowany u szczurów z ailoksanową cukrzycą Tamerit® znacząco poprawił produkcję endogennej insuliny oraz obniżył poziom glukozy i glikozylowanej hemoglobiny. Wyniki badania przedstawiono w poniższej tabeli 3.

Tabela 3. Parametry biochemiczne krwi szczurów zdrowych i z ailoksanową cukrzycą po zastosowaniu Tameritu

Badany parametr	Szczury zdrowe	Szczury z cukrzycą alioksanowąnieleczone	Szczury z cukrzycą ailoksanową leczone Tameritem
Glukoza, mmol/l	3,83+0,302	9,07+0,45*	4,16+0,56***
Hemoglobina glikozylowana HbA1C w %	2,30+0,07	13,56+0,35*	9,05+0,58* **
IGF - 2,mcg/l	46,2+3,09	59,5+13,56	37,9+1,65***
Insulina, mcg/l	1,043+0,18	0,496+0,09*	0,724+0,08***

* - (p < 0,05) znamienne statystycznie do grupy szczurów zdrowych ** - (p < 0,05) znamienne statystycznie do grupy szczurów z cukrzycą

Dodatkowo Tamerit® regeneruje mikrokrążenie w okolicy uszkodzonych wysp Langerhansa. Z innego badania wynika, że zastosowanie Tameritu® u zwierząt z eksperymentalnie wywołanym niedokrwieniem mięśni w znaczący sposób poprawia neoangiogeneza. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 4.

Tabela 4. Regeneracja naczyń włosowatych w rejonie niedokrwienia mięśni u szczurów po zastosowaniu Tameritu®

	Szczury zdrowe	Ischemia -12 dni	Ischemia - 29 dni
Grupa kontrolna	Tamerit®	Grupa kontrolna	Tamerit®
Liczba kapilarów w 1 mm3	138,8±12,0	29,8±3 4	152,3±12,7	31+3,2	236,4+16,9

* - (p < 0,05) znamienne statystycznie do grupy szczurów zdrowych ** - (p < 0,05) znamienne statystycznie do grupy kontrolne (zamiast Tameritu sól fizj.)

Przykład biologiczny 8 - stosowanie Tameritu® u szczurów z cukrzycą wywołaną przez streptocynę

Zastosowano Tamerit® u szczurów ze sztucznie wywołaną cukrzycą przez podawanie dootrzewnowo streptozotocyny (STZ), porównując wyniki z zastosowanym także Rosiglitazonem, znanym lekiem hipoglikemicznym. U szczurów z cukrzycą STZ glikemia wzrosła do 420% w porównaniu z grupą kontrolną. Po podaniu Rosiglitazonu glikemia spadła do 55% w porównaniu z grupą szczurów STS nieleczonych, a po podaniu Tameritu®-do 62% w porównaniu do grupy szczurów nieleczonych. Oba wyniki są znamienne statystycznie na poziomie p<0,01. Badany poziom dwualdehydu malonowego (MDA) jako markera stresu oksydacyjnego także najpierw wzrósł u szczurów STZ do 378% w porównaniu z grupą kontrolną, a następnie obniżył się po podaniu obu leków: po Rosiglitazonie do 54%, a po Tamericie® do 48,7% w porównaniu z grupą szczurów STZ nieleczonych. Poziom kolejnego markera stresu oksydacyjnego - glutationu (GSH) - nie zmienia się podczas leczenia Tameritem®, a wzrasta u szczurów STZ nieleczonych i podczas leczenia Rosiglitazonem do 127% w porównaniu do szczurów zdrowych.

PL 231 885 B1

Przykład biologiczny 9 - badania kliniczne stosowania Tameritu® u chorych na cukrzycę typu I i II

W badaniach klinicznych zastosowano Tamerit® u chorych na cukrzycę typu I i II w dawce 100 mg w zastrzykach domięśniowych: 10 zastrzyków codziennie i kolejnych 10 co drugi dzień. Po tygodniu leczenia uzyskano znormalizowanie poziomu glikemii z 7,5 mmol/l do 5,1 mmol/l oraz możliwość zmniejszenia dawki insuliny z 45 IU do 15 IU/dziennie. U chorych z cukrzycą typu II dodatkowo uzyskano niewielkie obniżenie poziomu cholesterolu.

Jak wynika z tych badań Tamerit® jest lekiem, który ze względu na swój unikalny sposób działania może zdecydowanie poprawić wyniki konwencjonalnego leczenia cukrzycy i w przyszłości obniżyć częstość poważnych powikłań narządowych. Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzić, że Tamerit® w leczeniu cukrzycy:

1. normalizuje procesy biosyntezy w hiperaktywowanych makrofagach, zmniejsza uszkodzenie, odczyn zapalny i obrzęk komórek beta wysp Langerhansa, zapobiega powstawaniu martwicy i reakcji autoimmunologicznych w trzustce;

2. zapobiega powstawaniu nadtlenku azotu, co w konsekwencji poprawia transport glukozy do tkanek i zapobiega rozwojowi insulinooporności;

3. poprzez stabilizację układu makrofagów wpływa na wzrost syntezy IGF-1 i IGF-2, co także poprawia utylizację glukozy;

4. nasila migrację monocytów do trzustki, gdzie przeobrażają się one w komórki beta wysp Langerhansa, co prowadzi do nasilenia procesów regeneracyjnych;

5. wskutek działania opisanego w p. 4, nasila się też synteza endogennej insuliny;

6. normalizuje pracę narządów układu limfatycznego, gruczołów wydzielania wewnętrznego i stabilizuje komórki układu immunologicznego;

7. u chorych z ciężkimi postaciami cukrzycy zapobiega powstawaniu poważnych powikłań narządowych w postaci angiopatii i zaburzeń troficznych;

8. pozwala na obniżenie dawki egzogennej insuliny w leczeniu cukrzycy typu I.

V. Zastosowanie Tameritu® w leczeniu chorób układu nerwowego oraz chorób psychicznych Układ nerwowy, endokrynny i immunologiczny są ze sobą ściśle powiązane i współpracują ze sobą, synchronicznie odpowiadając na wszelkie bodźce zewnętrzne i wewnętrzne. Możemy założyć, że centralne miejsce w tym sposobie odpowiedzi zajmuje system makrofagów - w układzie nerwowym obejmuje to komórki mikrogleju, dendrytyczne, astrocyty i in. Każdy rodzaj komórek jest zaadaptowany do funkcjonowania w narządzie, w którym się znajduje, jakkolwiek podlega kontroli reakcji immunologicznych zachodzących w całym organizmie. Rolę regulacyjną odgrywają tu cytokiny. Każde naruszenie równowagi w organizmie może prowadzić do różnego stopnia zaburzeń, pierwotnie wsk utek hiperaktywację makrofagów, potem wskutek wyrzutu pozapalnych cytokin (IL-1, IL-2, IL-6, TNF-alfa, INF-gamma) i aktywnych form tlenu. Wcześniej wykazano (patrz publikacja M.T. Abidov, „Patogeneza zapalenia na tle infekcji i metody jego leczenia”, praca doktorska, Moskiewska Akademia Medyczna, Moskwa,1994), że za ostry początek stanu zapalnego odpowiadają właśnie te pozapalne cytokiny. Ciężkość i przebieg choroby zależą od stopnia hiperaktywacji makrofagów. Wykazano też (tamże), że na skutek długotrwałej hiperaktywacji makrofagów i nieprawidłowej odpowiedzi komórkowej i humoralnej może rozwinąć się nieprawidłowa reakcja autoimmunologiczna, prowadząca do wielu chorób z autoagresji (np. reumatoidalne zapalenie stawów, choroba Hashimoto, łuszczyca, SLE, itp.). Powstające wtedy autoprzeciwciała mogą zainicjować uszkodzenie także w układzie nerwowym i zaburzenia psychiczne. Wynikiem tego jest choćby stwardnienie rozsiane, a także poważny udział w patogenezie takich chorób jak choroba Alzheimera, zespoły depresyjne i stany lękowe. Zainicjowana nadaktywnością makrofagów produkcja aktywnych form tlenu pogarsza dodatkowo przebieg choroby. W końcu wszystkie te czynniki zaburzają biosyntetyczne procesy w komórkach i inicjują apoptozę komórek - co może prowadzić do nieodwracalnych zmian w chorobach neurologicznych i psychicznych (choćby w chorobie Alzheimera).

Jak wynika z przeprowadzonych badań Tamerit® stabilizuje błonę komórkową makrofagów, hamuje uruchomienie produkcji kwasu arachidonowego i kaskady produkcji oksydantów, a także blokuje wyrzut pozapalnych cytokin i przekazywanie informacji do układu limfocytów (zwiększenie indeksu immunologicznego CD4/CD8). W mechanizmie molekularnym Tamerit® wykazuje hamujące działanie w reakcjach z tlenem, nadtlenkiem wodoru i podchlorynem sodu, tzn. powstrzymuje utlenowanie komórki za pomocą atomów wodoru, znajdujących się w cząsteczce leku. Ponadto lek dostaje się do mitochondrium komórki, gdzie w układzie cytochromów hamuje łączenie się dodatkowych elektronów, powstałych przy zaburzeniach hemostazy komórki, z tlenem. Tam też właśnie zachodzą reakcje z aktywnymi formami tlenu i innymi utleniaczami. Drugim elementem mechanizmu tego działania Tameritu®

PL 231 885 Β1 jest unikalna zdolność do wypuszczenia kwantu niebiesko-fioletowego światła (również w mitochondrium komórki) - jest to zjawisko chemoluminescencji. Światło jest absorbowane na białkach zawierających flawony, co powoduje pobudzenie białek do prawidłowej funkcji i hamuje rozwój łańcucha nieprawidłowych reakcji, przywraca prawidłową funkcję transportu elektronów i hamuje syntezę utleniaczy. Ponadto Tamerit® ma zasadowe pH ok. 9, co ma dodatkowo korzystne działanie w ognisku zapalenia, gdzie komórki są zakwaszone, bo pH może spaść nawet poniżej 6,5, co wiąże się z nieuchronną śmiercią komórki.

Jak widać istnieją poważne przesłanki teoretyczne do zastosowania Tameritu® u chorych na stwardnienie rozsiane i chorobę Alzheimera. W rosyjskich badaniach klinicznych wykazano także, że u chorych z zaostrzeniem reakcji lękowych i zespołów depresyjnych pojawia się w organizmie prozapalna reakcja cytokin typu TH-1 i odpowiednie zmiany w profilu limfocytów.

U chorych w badaniach klinicznych stosowano Tamerit® w dawce 100 mg/dobę domięśniowo przez 30 dni. U chorych psychicznie w kombinacji z konwencjonalną terapią, a chorych neurologicznych jako monoterapię. Zaobserwowano normalizację profilu limfocytarnego i cytokin, korelowało to z redukcją objawów chorobowych. U chorych ze stwardnieniem rozsianym szczególnie odnosi się to do zdolności koncentracji i mowy. Jednakże ci chorzy wymagali dłuższego leczenia, aż do 60-90 dni. U chorych w okresie remisji zastosowano Tamerit® także profilaktycznie w okresie wiosny i jesieni (100 mg/d - 10 zastrzyków codziennie i co drugi dzień), co pozwoliło na uzyskanie długotrwałej remisji.

Korzystając z pozytywnych doświadczeń zastosowania soli litu w psychiatrii, stworzono kombinację Tameritu® 80% z 20% soli litowej 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu i zastosowano ją u niektórych pacjentów - ochotników, którzy zgodzili się na udział w badaniu. Nie stwierdzono żadnych objawów ubocznych terapii kombinacją soli, dotyczących zaburzeń układu sercowo-naczyniowego, oddechowego i wegetatywnego. Kombinacja była dobrze tolerowana i zaobserwowano znaczną redukcję objawów chorobowych, a także podobne do monoterapii Tameritem® korzystne zmiany w układzie cytokin i profilu limfocytarnym.

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania soli 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu z metalami alkalicznymi o wzorze II nh₂ o i II

   NH N M (gdzie M oznacza kation Li, Na, albo K) obejmujący następujące etapy:

   (i) bezwodnik kwasu 3-nitroftalowego poddaje się reakcji z hydratem hydrazyny w bezwodnym kwasie octowym w temperaturze 100-110°C z oddestylowaniem mieszaniny kwasu octowego i wody wytwarza się 5-nitro-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dion, a następnie (ii) 5-nitro-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dion przeprowadza się w sól 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu z metalem alkalicznym, znamienny tym, że w etapie (ii) 5-nitro-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dion rozpuszcza się w wodnym roztworze MOH, gdzie M ma znaczenie podane wyżej, z wytworzeniem roztworu soli alkalicznej 5-nitro-2,3-dihydro-1,4-ftalazynodionu, którą katalitycznie przekształca się w sól 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu w temperaturze 40-90°C za pomocą wodoru pod ciśnieniem 1-4 MPa, w obecności katalizatora z metalu przejściowego, wybranego spośród Pt i Pd, osadzonego na węglu aktywowanym, a wydzielanie krystalicznej soli 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu prowadzi się przez rozcieńczenie wodnego roztworu niższym alkoholem lub cyklicznym niższym eterem przy schłodzeniu do temperatury -5°C do -15°C,

   PL 231 885 B1
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarza się sól sodową 5-amino-2,3-dihydroftaIazyno-1,4-dionu,
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarza się sól litową 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, że po wytworzeniu 5-nitro-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu mieszaninę kwasu octowego z wodą obrabia się bezwodnikiem octowym dla zregenerowania bezwodnego kwasu octowego,
5. 5. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że bezwodne niższe alkohole lub cykliczne niższe etery regeneruje się przez obróbkę wodnych filtratów alkaliami, z rozdzieleniem warstw wodnej i organicznej, oraz destylowaniem warstwy organicznej.
6. 6. Farmaceutyczna kompozycja zawierająca sól 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu z metalami alkalicznymi wytworzoną sposobem według dowolnego z zastrzeżeń 1-5.
7. 7. Farmaceutyczna kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że zawiera kombinację soli sodowej i litowej.
8. 8. Zastosowanie soli sodowej 5-amino-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dionu do wytwarzania leku o właściwościach regulacji procesów biosyntetycznych w komórkach, w szczególności w systemie makrofagów i w szpiku kostnym, do leczenia chorób trzustki, w szczególności stanów zapalnych trzustki, i cukrzycy.