PL235026B1

PL235026B1 - 3'-O-β-D-gentiobiosyl-4"-hydroxyflavone and method for producing 3'-O-β-D-gentiobiosyl-4"-hydroxyflavone

Info

Publication number: PL235026B1
Application number: PL421052A
Authority: PL
Inventors: Monika Dymarska; Edyta Kostrzewa-Susłow; Tomasz Janeczko; Czko Tomasz Jane
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2017-03-29
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2020-05-18
Also published as: PL421052A1

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest 3-O-^-D-gencjobiozylo-4'-hydroksyflawon i sposób wytwarzania 3-O-^-D-gencjobiozylo-4'-hydroksyflawonu o wzorze 2, przedstawionym na rysunku.The present invention relates to 3-O - ^ - D-genciobiosyl-4'-hydroxy flavone and the method of producing 3-O - ^ - D-genciobiosyl-4'-hydroxy flavone of the formula 2 shown in the drawing.

Związek ten może znaleźć zastosowanie jako antyoksydant w przemyśle spożywczym oraz jako składnik środków farmaceutycznych i kosmetycznych, a także dodatek do pasz.This compound can be used as an antioxidant in the food industry and as a component of pharmaceuticals and cosmetics, as well as a feed additive.

Większość prozdrowotnych korzyści ze spożywania związków flawonoidowych wynika z ich aktywności przeciwutleniającej i zdolności do chelatowania jonów metali (Heim, K. E.; Tagliaferro, A. R.; Bobilya, D. J. Flavonoid antioxidants: Chemistry, metabolism and structure-activity relationships. J. Nutr. Biochem. 2002, 13, 572-584). Szereg badań dowodzi wagi obecności w cząsteczce związku flawonoidowego grupy hydroksylowej w pozycji 3, szczególnie w przypadku wyłapywania wolnych rodników tlenowych, czy chelatowaniu jonów żelaza. Uważa się, że wolna grupa 3-OH zwiększa stabilność rodników flawonoidowych.Most of the health benefits of consuming flavonoid compounds are due to their antioxidant activity and ability to chelate metal ions (Heim, KE; Tagliaferro, AR; Bobilya, DJ Flavonoid antioxidants: Chemistry, metabolism and structure-activity relationships. J. Nutr. Biochem. 2002, 13, 572-584). A number of studies prove the importance of the presence of a hydroxyl group in the 3-position in a flavonoid compound, especially in the case of capturing oxygen free radicals or chelating iron ions. The free 3-OH group is believed to increase the stability of flavonoid radicals.

Wykazywana przez związki flawonoidowe wysoka aktywność biologiczna jest silnie związana również z ich zdolnością do wiązania się z błonami biologicznymi (Tsuchiya, H. Structure-dependent membrane interaction of flavonoids associated with their bioactivity. Food Chem. 2010, 120, 1089-1096). 3-Hydroksyflawon posiada potencjał wiązania się z biomakromolekułami. Związek ten wykazuje silną aktywność przeciwutleniającą wewnątrz błon, co sugeruje, że może on dzięki temu wykazywać działanie terapeutyczne (Jana, B.; Senapati, S.; Ghosh, D.; Bose, D.; Chattopadhyay, N. Spectroscopic exploration of mode of binding of ctDNA with 3-hydroxyflavone: A contrast to the mode of binding with flavonoids having additional hydroxyl groups. J. Phys. Chem. B 2012, 116, 639-645).The high biological activity of flavonoid compounds is also strongly related to their ability to bind to biological membranes (Tsuchiya, H. Structure-dependent membrane interaction of flavonoids associated with their bioactivity. Food Chem. 2010, 120, 1089-1096). 3-Hydroxy flavone has the potential to bind to biomacromolecules. This compound exhibits strong antioxidant activity inside the membranes, which suggests that it may therefore have a therapeutic effect (Jana, B .; Senapati, S .; Ghosh, D .; Bose, D .; Chattopadhyay, N. Spectroscopic exploration of mode of mode of binding of ctDNA with 3-hydroxyflavone: A contrast to the mode of binding with flavonoids having additional hydroxyl groups. J. Phys. Chem. B 2012, 116, 639-645).

Kwercetyna (3,5,7,3',4'-pentahydroksyflawon) jest jednym z najsilniej przeciwcukrzycowo działających flawonoidów. Badania prowadzone na szczurach z wywołaną insulinoo pornością dowodzą, że otrzymane na drodze syntezy chemicznej analogi 3-hydroksyflawonu (posiadające dodatkowe grupy metylowe, etylowe, hydroksylowe i dimetyloaminowe w różnej liczbie i pozycjach) znoszą insulinooporność, redukują hiperglikemię, dyslipidemię i wzmagają obronę antyoksydacyjną (Nayak, Y.; Venkatachalam, H.; Daroji, V. K.; Mathew, G.; Jayashree, B. S.; Unnikrishnan, M. K. Antidiabetic activity of 3-hydroxyflavone analogues in high fructose fed insulin resistant rats. EXCLI J. 2014, 13, 1055-1074). 3-Hydroksyflawon podawany chorym na cukrzycę szczurom w dawce 50 mg/kg masy ciała wykazywał silne działanie hipoglikemiczne i antydiabetyczne (Kim, J. H.; Song, M.; Kang, G. H.; Lee, E. R.; Choi, H. Y; Lee, C.; Kim, J. H.; Kim, Y; Koo, B. N.; Cho, S. G. Combined treatment of 3-hydroxyflavone and imatinib mesylate increases apoptotic cell death of imatinib mesylate-resistant leukemia cells. Leuk. Res. 2012, 36, 1157-1164).Quercetin (3,5,7,3 ', 4'-pentahydroxyflavone) is one of the strongest anti-diabetic flavonoids. Studies conducted on rats with insulin-induced resistance prove that the chemically synthesized analogs of 3-hydroxy flavone (with additional methyl, ethyl, hydroxyl and dimethylamine groups in various numbers and positions) suppress insulin resistance, reduce hyperglycemia, dyslipidemia and enhance antioxidant defense (Na , Y .; Venkatachalam, H .; Daroji, VK; Mathew, G .; Jayashree, BS; Unnikrishnan, MK Antidiabetic activity of 3-hydroxyflavone analogues in high fructose fed insulin resistant rats. EXCLI J. 2014, 13, 1055-1074 ). 3-Hydroxyflavone administered to diabetic rats at a dose of 50 mg / kg body weight showed a strong hypoglycemic and anti-diabetic effect (Kim, JH; Song, M .; Kang, GH; Lee, ER; Choi, H. Y; Lee, C. ; Kim, JH; Kim, Y; Koo, BN; Cho, SG Combined treatment of 3-hydroxyflavone and imatinib mesylate increases apoptotic cell death of imatinib mesylate-resistant leukemia cells. Leuk. Res. 2012, 36, 1157-1164).

W badaniach prowadzonych przez koreańskich naukowców 3-hydroksyflawon wykazał się najsilniejszą aktywnością przeciwnowotworową spośród dziewięciu testowanych związków, w stosunku do linii nowotworowych A549 (nowotwór płuc), B16F10 (czerniak mysi) i K562 (białaczka) i brakiem cytotoksyczności w stosunku do dwóch linii prawidłowych komórek.In studies conducted by Korean scientists, 3-hydroxy flavone showed the strongest anti-cancer activity among the nine tested compounds, against the tumor lines A549 (lung cancer), B16F10 (murine melanoma) and K562 (leukemia) and no cytotoxicity in relation to two normal cell lines .

Mezylan imatynibu jest lekiem stosowanym w terapii nowotworów. 3-Hydroksyflawon podawany łącznie z tym lekiem wykazywał działanie hamujące wzrost linii komórkowej białaczki odpornej na działanie imatynibu (Kim, J. H.; Song, M.; Kang, G. H.; Lee, E. R.; Choi, H. Y; Lee, C.; Kim, J, H.; Kim, Y; Koo, B. N.; Cho, S. G. Combined treatment of 3-hydroxyflavone and imatinib mesylate increases apoptotic cell death of imatinib mesylate-resistant leukemia cells. Leuk. Res. 2012, 36, 1157-1164).Imatinib mesylate is a drug used in the treatment of cancer. 3-Hydroxyflavone co-administered with this drug has been shown to inhibit the growth of an imatinib-resistant leukemia cell line (Kim, JH; Song, M .; Kang, GH; Lee, ER; Choi, H. Y; Lee, C .; Kim, J, H .; Kim, Y; Koo, BN; Cho, SG Combined treatment of 3-hydroxyflavone and imatinib mesylate increases apoptotic cell death of imatinib mesylate-resistant leukemia cells. Leuk. Res. 2012, 36, 1157-1164).

3-Hydroksyflawon wykazuje silne działanie przeciwko trypanosomozie i leiszmaniozie, chorobom pasożytniczym, na które cierpią miliony osób w Afryce, Azji i Ameryce Południowej. Jest on jednym z najsilniej działających związków spośród grupy badanych polifenoli, w stosunk u do pasożytów Leishmania donovani i Trypanosoma brucei rhodesiense, dodatkowo wykazującym działanie bójcze w stosunku do Trypanosoma cruzi (Tasdemir, D.; Kaiser, M.; Brun, R.; Yardley, V.; Schmidt, T. J.; Tosun, R; Ruedi, P. Antitrypanosomal and antileishmanial activities of flavonoids and their analogues: in vitro, in vivo, structure-activity relationship, and quantitative structure-activity relationship studies. Antimicrob. Agents Chemother. 2006, 50, 1352-1364).3-Hydroxyflavone is highly effective against trypanosomiasis and leishmaniasis, parasitic diseases that affect millions of people in Africa, Asia and South America. It is one of the most potent compounds from the group of polyphenols studied, in relation to the parasites Leishmania donovani and Trypanosoma brucei rhodesiense, additionally showing a killer activity against Trypanosoma cruzi (Tasdemir, D .; Kaiser, M .; Brun, R .; Yardley , V .; Schmidt, TJ; Tosun, R; Ruedi, P. Antitrypanosomal and antileishmanial activities of flavonoids and their analogues: in vitro, in vivo, structure-activity relationship, and quantitative structure-activity relationship studies. Antimicrob. Agents Chemother. 2006, 50, 1352-1364).

Uważa się, że glikozydy flawonoidowe przed absorpcją w układzie pokarmowym muszą zostać poddane hydrolizie przez mikroflorę jelitową do odpowiednich aglikonów. Dowiedziono jednak, że częściowa absorpcja połączeń cukrowych flawonoidów również jest możliwa.It is believed that the flavonoid glycosides must be hydrolyzed by the intestinal microflora to the appropriate aglycons before being absorbed in the gastrointestinal tract. However, it has been proven that partial absorption of the sugar flavonoid linkages is also possible.

PL 235 026 B1PL 235 026 B1

Cząsteczka glukozy przyłączona w pozycji 3 kwercetyny (3,5,7,3',4'-pentahydroksyflawon) zwiększała absorpcję tego glukozydu w jelicie cienkim do 52%, w porównaniu z 24% absorpcją aglikonu kwercetyny i 17% rutynozydu kwercetyny (Heim, K. E.; Tagliaferro, A. R.; Bobilya, D. J. Flavonoid antioxidants: Chemistry, metabolism and structure-activity relationships. J. Nutr. Biochem. 2002, 13, 572-584, Hollman, P. C.; Bijsman, M. N.; van Gameren, Y; Cnossen, E. R; deVries, J. H.; Katan, M. B. The sugar moiety is a major determinant of the absorption of dietary flavonoid glycosides in man. Free Radio. Res. 1999, 31, 569-573).A glucose molecule attached at position 3 of quercetin (3,5,7,3 ', 4'-pentahydroxyflavone) increased the absorption of this glucoside in the small intestine to 52%, compared with 24% absorption of quercetin aglycone and 17% of quercetin rutinoside (Heim, KE ; Tagliaferro, AR; Bobilya, DJ Flavonoid antioxidants: Chemistry, metabolism and structure-activity relationships. J. Nutr. Biochem. 2002, 13, 572-584, Hollman, PC; Bijsman, MN; van Gameren, Y; Cnossen, E R; deVries, JH; Katan, MB The sugar moiety is a major determinant of the absorption of dietary flavonoid glycosides in man. Free Radio. Res. 1999, 31, 569-573).

Flawonoidy w roślinach występują wyłącznie w połączeniu z jednostkami cukrowymi. Glikozylacja skutkuje wzrostem rozpuszczalności cząsteczki flawonoidu w wodzie i wzrostem jego stabilności. Dzięki temu zwiększa się przyswajalność przyjmowanych z pokarmem związków (J. Xiao, T.S. Muzashvili, M.l. Georgiev, Biotechnology Advances, 2014, 32, 1145-1156, Plaza, M.; Pozzo, T; Liu, J.; Gulshan Ara, K. Z.; Turner, C.; Nordberg Karlsson, E. Substituent effects on in vitro antioxidizing properties, stability, and solubility in flavonoids. J. Agric. Food Chem. 2014, 62,Flavonoids in plants only occur in combination with sugar units. Glycosylation increases the solubility of the flavonoid molecule in water and increases its stability. As a result, the bioavailability of compounds taken with food increases (J. Xiao, TS Muzashvili, Ml Georgiev, Biotechnology Advances, 2014, 32, 1145-1156, Plaza, M; Pozzo, T; Liu, J .; Gulshan Ara, KZ; Turner, C .; Nordberg Karlsson, E. Substituent effects on in vitro antioxidizing properties, stability, and solubility in flavonoids. J. Agric. Food Chem. 2014, 62,

3321-3333).3321-3333).

W dostępnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 3-O-^-D-gencjobiozylo4'-hydroksyflawonu na drodze syntezy chemicznej i biotransformacji.There is no information in the available literature on the preparation of 3-O - ^ - D-gencjobiosyl-4'-hydroxy flavone by chemical synthesis and biotransformation.

W ostatnich latach w leczeniu i prewencji chorób coraz większe znaczenie zyskują związki pochodzenia naturalnego i ich odpowiedniki uzyskane na drodze biotransformacji. Dlatego istotne jest poszukiwanie nowych sposobów wytwarzania związków aktywnych biologicznie, które mogą być wykorzystane w przemyśle farmaceutycznym, ale też kosmetycznym i spożywczym.In recent years, compounds of natural origin and their biotransformation counterparts have become increasingly important in the treatment and prevention of diseases. Therefore, it is important to search for new methods of producing biologically active compounds that can be used in the pharmaceutical, cosmetic and food industries.

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isana fumosorosea KCH J2. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 3-hydroksyflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu co najmniej 96 godzin. Kolejno produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.The essence of the invention consists in introducing the strain Isana fumosorosea KCH J2 into a medium suitable for filamentous fungi. After at least 72 hours, the substrate is introduced into the culture, which is the 3-hydroxy flavone of formula 1, dissolved in a water-miscible organic solvent. The transformation is carried out at a temperature of 20 to 30 degrees Celsius with continuous shaking for at least 96 hours. Subsequently, the product is extracted with a water-immiscible organic solvent and purified by chromatography.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg : 1 mL.Preferably, the ratio of the weight of the substrate added to the culture volume is 0.1 mg: 1 mL.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.It is also preferred that the process is carried out at a temperature of 25 degrees Celsius.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 168 godzin.Additionally, it is preferable for the transformation to be carried out for 168 hours.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Isaria fumosorosea KCH J2, następuje przyłączenie cząsteczki gencjobiozy przy C-3. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).Proceeding according to the invention, as a result of the action of the enzyme system contained in the cells of the strain Isaria fumosorosea KCH J2, the attachment of the genciobiose molecule at C-3 takes place. The product obtained in this way is separated from the aqueous culture of the microorganism by a known method by extraction with a water-immiscible organic solvent (ethyl acetate).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 3-O-^-D-gencjobiozylo-4'-hydroksyflawonu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu wykorzystując mikroorganizm niebędący patogenem ludzkim.The main advantage of the invention is the preparation of 3-O - 4'-D-genciobiosyl-4'-hydroxy flavone at room temperature and at the natural pH of the strain using a microorganism that is not a human pathogen.

Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umożliwia, w sposób przyjazny dla środowiska, uzyskanie związków o wyższej biodostępności i aktywności biologicznej, niż użyte substraty (E. Kostrzewa-Susłow, J. Dmochowska-Gładysz, J. Oszmiański, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007, 49 (1-4), 113-117, W. A. Loughlin, Bioresource Technology, 2000, 74, 49-62).The use of biotransformation, instead of chemical synthesis, allows in an environmentally friendly manner to obtain compounds with higher bioavailability and biological activity than the substrates used (E. Kostrzewa-Susłow, J. Dmochowska-Gładysz, J. Oszmiański, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007, 49 (1-4), 113-117, WA Loughlin, Bioresource Technology, 2000, 74, 49-62).

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.The invention is explained in more detail using an exemplary embodiment.

P r z y k ł a d. Do kolby Erlenmajera o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g glukozy, wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2 ujawniony w zgłoszeniu patentowym o numerze P.416996. Po 96 godzinach jego wzrostu dodaje się 50 mg 3-hydroksyflawonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ tetrahydrofuranu. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 7 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku 9:1.Example d. To the Erlenmeyer flask with a capacity of 2,000 cm ^3, which is 500 cm ^{3 of} a sterile medium containing 10 g aminobaku and 30 g of glucose, the strain is introduced Isaria fumosorosea MSDS J2 disclosed in Patent Application P.416996. After 96 hours of its growth, 50 mg of 3-hydroxy flavone of formula I, dissolved in 1 cm ^{3 of} tetrahydrofuran, are added. The transformation is carried out at 25 degrees Celsius with continuous shaking for 7 days. Then, the reaction mixture was extracted three times with ethyl acetate, dried with anhydrous magnesium sulfate and the solvent was evaporated. The extract obtained is purified by chromatography using a 9: 1 mixture of chloroform and methanol as eluent.

Na tej drodze otrzymuje się 4 mg 3-O-^-D-gencjobiozylo-4'-hydroksyflawonu (wydajność 3,4%). Stopień konwersji substratu wedłu g HPLC >99.In this way, 4 mg of 3-O - 1 - D-gencibiosyl-4'-hydroxy flavone are obtained (3.4% yield). The degree of conversion of the substrate by g HPLC> 99.

PL 235 026 B1PL 235 026 B1

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi.The obtained product is characterized by the following spectral data.

Opis sygnałów pochodzących z widma ¹H NMR (600 MHz, Aceton-de): δ = 8,27 ppm (2H, d, J₂·, 3·(₆·.5·) = 8,4, H-2', H-6'); δ = 8,22 ppm (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5); δ = 7,88 ppm (1H, t, J = 7,6 Hz, H-7); δ =7,77 ppm (1H, d, J8,7 = 8,5, H-8); δ = 7,56 ppm (1H, t, J = 7,5, H-6); δ = 7,04 ppm (2H, d, J3-,2''(5',6·) 8,2, H-3', H-5'); δ = 5,21 ppm (1H, d, J = 7,1 Hz, H-1); δ = 4,34 ppm (1H, d, J = 7,9 Hz, H-1'); δ = 4,02-3,98 ppm (1H, m, H-6a); δ = 3,91-3,86 ppm (1H, m, H-6'''a); δ = 3,85-3,81 ppm <1H, m, H-6b); δ = 3,69 ppm (1H, m, H- 6'''b); δ = 3,51 ppm (1H, d, J = 8,7, H-3''); δ = 3,43 ppm (1H, d, J = 8,7, H-3'); δ =3,41 ppm (1H, t, J =9,6 Hz, H-4); δ = 3,38-3,33 ppm (1H, m, Hz C-4', C-5''); δ = 3,30 ppm (1H, m, H-5''').Description of the signals from the ¹ H NMR spectrum (600 MHz, Acetone-de): δ = 8.27 ppm (2H, d, J ₂ ·, 3 · ₍₆ .5 · ·) = 8.4, H-2 ' , H-6 '); δ = 8.22 ppm (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5); δ = 7.88 ppm (1H, t, J = 7.6 Hz, H-7); δ = 7.77 ppm (1H, d, J8.7 = 8.5, H-8); δ = 7.56 ppm (1H, t, J = 7.5, H-6); δ = 7.04 ppm (2H, d, J3-, 2 "(5 ', 6 ·) 8.2, H-3', H-5 '); δ = 5.21 ppm (1H, d, J = 7.1 Hz, H-1); δ = 4.34 ppm (1H, d, J = 7.9 Hz, H-1 '); δ = 4.02-3.98 ppm (1H, m, H-6a); δ = 3.91-3.86 ppm (1H, m, H-6 "a); δ = 3.85-3.81 ppm < 1H, m, H-6b); δ = 3.69 ppm (1H, m, H- 6 ""b); δ = 3.51 ppm (1H, d, J = 8.7, H-3 "); δ = 3.43 ppm (1H, d, J = 8.7, H-3 '); δ = 3.41 ppm (1H, t, J = 9.6 Hz, H-4); δ = 3.38-3.33 ppm (1H, m, Hz C-4 ', C-5 "); δ = 3.30 ppm (1H, m, H-5 ").

Claims

1. 3-O - ^ - D-genciobiosyl-4'-hydroxy flavone of formula 2.

2. Method for the production of 3-O - ^ - D-gencjobizyl-4'-hydroxy flavone, characterized in that the Isaria fumosorosea KCH J2 strain is introduced into a medium suitable for filamentous fungi, then, after at least 72 hours, the substrate is introduced into the culture, which is a 3-hydroxy flavone of formula 1, dissolved in a water-miscible organic solvent, the transformation is carried out at a temperature of 20 to 30 degrees Celsius, with continuous shaking for at least 96 hours, after which the product is extracted with a water-immiscible organic solvent and purifies by chromatography.

3. The method according to p. The method of claim 2, wherein the ratio of the weight of the added substrate to the culture volume is 0.1 mg: 1 mL.

4. The method according to p. 2. The process of claim 2, wherein the temperature is 25 degrees Celsius.

5. The method according to claim 2, characterized in that the transformation is carried out for 168 hours.