PL235026B1 - 3-O-β-D-gencjobiozylo-4’-hydroksyflawon i sposób wytwarzania 3-O-β-D-gencjobiozylo-4’-hydroksyflawonu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest 3-O-^-D-gencjobiozylo-4'-hydroksyflawon i sposób wytwarzania 3-O-^-D-gencjobiozylo-4'-hydroksyflawonu o wzorze 2, przedstawionym na rysunku.

Związek ten może znaleźć zastosowanie jako antyoksydant w przemyśle spożywczym oraz jako składnik środków farmaceutycznych i kosmetycznych, a także dodatek do pasz.

Większość prozdrowotnych korzyści ze spożywania związków flawonoidowych wynika z ich aktywności przeciwutleniającej i zdolności do chelatowania jonów metali (Heim, K. E.; Tagliaferro, A. R.; Bobilya, D. J. Flavonoid antioxidants: Chemistry, metabolism and structure-activity relationships. J. Nutr. Biochem. 2002, 13, 572-584). Szereg badań dowodzi wagi obecności w cząsteczce związku flawonoidowego grupy hydroksylowej w pozycji 3, szczególnie w przypadku wyłapywania wolnych rodników tlenowych, czy chelatowaniu jonów żelaza. Uważa się, że wolna grupa 3-OH zwiększa stabilność rodników flawonoidowych.

Wykazywana przez związki flawonoidowe wysoka aktywność biologiczna jest silnie związana również z ich zdolnością do wiązania się z błonami biologicznymi (Tsuchiya, H. Structure-dependent membrane interaction of flavonoids associated with their bioactivity. Food Chem. 2010, 120, 1089-1096). 3-Hydroksyflawon posiada potencjał wiązania się z biomakromolekułami. Związek ten wykazuje silną aktywność przeciwutleniającą wewnątrz błon, co sugeruje, że może on dzięki temu wykazywać działanie terapeutyczne (Jana, B.; Senapati, S.; Ghosh, D.; Bose, D.; Chattopadhyay, N. Spectroscopic exploration of mode of binding of ctDNA with 3-hydroxyflavone: A contrast to the mode of binding with flavonoids having additional hydroxyl groups. J. Phys. Chem. B 2012, 116, 639-645).

Kwercetyna (3,5,7,3',4'-pentahydroksyflawon) jest jednym z najsilniej przeciwcukrzycowo działających flawonoidów. Badania prowadzone na szczurach z wywołaną insulinoo pornością dowodzą, że otrzymane na drodze syntezy chemicznej analogi 3-hydroksyflawonu (posiadające dodatkowe grupy metylowe, etylowe, hydroksylowe i dimetyloaminowe w różnej liczbie i pozycjach) znoszą insulinooporność, redukują hiperglikemię, dyslipidemię i wzmagają obronę antyoksydacyjną (Nayak, Y.; Venkatachalam, H.; Daroji, V. K.; Mathew, G.; Jayashree, B. S.; Unnikrishnan, M. K. Antidiabetic activity of 3-hydroxyflavone analogues in high fructose fed insulin resistant rats. EXCLI J. 2014, 13, 1055-1074). 3-Hydroksyflawon podawany chorym na cukrzycę szczurom w dawce 50 mg/kg masy ciała wykazywał silne działanie hipoglikemiczne i antydiabetyczne (Kim, J. H.; Song, M.; Kang, G. H.; Lee, E. R.; Choi, H. Y; Lee, C.; Kim, J. H.; Kim, Y; Koo, B. N.; Cho, S. G. Combined treatment of 3-hydroxyflavone and imatinib mesylate increases apoptotic cell death of imatinib mesylate-resistant leukemia cells. Leuk. Res. 2012, 36, 1157-1164).

W badaniach prowadzonych przez koreańskich naukowców 3-hydroksyflawon wykazał się najsilniejszą aktywnością przeciwnowotworową spośród dziewięciu testowanych związków, w stosunku do linii nowotworowych A549 (nowotwór płuc), B16F10 (czerniak mysi) i K562 (białaczka) i brakiem cytotoksyczności w stosunku do dwóch linii prawidłowych komórek.

Mezylan imatynibu jest lekiem stosowanym w terapii nowotworów. 3-Hydroksyflawon podawany łącznie z tym lekiem wykazywał działanie hamujące wzrost linii komórkowej białaczki odpornej na działanie imatynibu (Kim, J. H.; Song, M.; Kang, G. H.; Lee, E. R.; Choi, H. Y; Lee, C.; Kim, J, H.; Kim, Y; Koo, B. N.; Cho, S. G. Combined treatment of 3-hydroxyflavone and imatinib mesylate increases apoptotic cell death of imatinib mesylate-resistant leukemia cells. Leuk. Res. 2012, 36, 1157-1164).

3-Hydroksyflawon wykazuje silne działanie przeciwko trypanosomozie i leiszmaniozie, chorobom pasożytniczym, na które cierpią miliony osób w Afryce, Azji i Ameryce Południowej. Jest on jednym z najsilniej działających związków spośród grupy badanych polifenoli, w stosunk u do pasożytów Leishmania donovani i Trypanosoma brucei rhodesiense, dodatkowo wykazującym działanie bójcze w stosunku do Trypanosoma cruzi (Tasdemir, D.; Kaiser, M.; Brun, R.; Yardley, V.; Schmidt, T. J.; Tosun, R; Ruedi, P. Antitrypanosomal and antileishmanial activities of flavonoids and their analogues: in vitro, in vivo, structure-activity relationship, and quantitative structure-activity relationship studies. Antimicrob. Agents Chemother. 2006, 50, 1352-1364).

Uważa się, że glikozydy flawonoidowe przed absorpcją w układzie pokarmowym muszą zostać poddane hydrolizie przez mikroflorę jelitową do odpowiednich aglikonów. Dowiedziono jednak, że częściowa absorpcja połączeń cukrowych flawonoidów również jest możliwa.

PL 235 026 B1

Cząsteczka glukozy przyłączona w pozycji 3 kwercetyny (3,5,7,3',4'-pentahydroksyflawon) zwiększała absorpcję tego glukozydu w jelicie cienkim do 52%, w porównaniu z 24% absorpcją aglikonu kwercetyny i 17% rutynozydu kwercetyny (Heim, K. E.; Tagliaferro, A. R.; Bobilya, D. J. Flavonoid antioxidants: Chemistry, metabolism and structure-activity relationships. J. Nutr. Biochem. 2002, 13, 572-584, Hollman, P. C.; Bijsman, M. N.; van Gameren, Y; Cnossen, E. R; deVries, J. H.; Katan, M. B. The sugar moiety is a major determinant of the absorption of dietary flavonoid glycosides in man. Free Radio. Res. 1999, 31, 569-573).

Flawonoidy w roślinach występują wyłącznie w połączeniu z jednostkami cukrowymi. Glikozylacja skutkuje wzrostem rozpuszczalności cząsteczki flawonoidu w wodzie i wzrostem jego stabilności. Dzięki temu zwiększa się przyswajalność przyjmowanych z pokarmem związków (J. Xiao, T.S. Muzashvili, M.l. Georgiev, Biotechnology Advances, 2014, 32, 1145-1156, Plaza, M.; Pozzo, T; Liu, J.; Gulshan Ara, K. Z.; Turner, C.; Nordberg Karlsson, E. Substituent effects on in vitro antioxidizing properties, stability, and solubility in flavonoids. J. Agric. Food Chem. 2014, 62,

3321-3333).

W dostępnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 3-O-^-D-gencjobiozylo4'-hydroksyflawonu na drodze syntezy chemicznej i biotransformacji.

W ostatnich latach w leczeniu i prewencji chorób coraz większe znaczenie zyskują związki pochodzenia naturalnego i ich odpowiedniki uzyskane na drodze biotransformacji. Dlatego istotne jest poszukiwanie nowych sposobów wytwarzania związków aktywnych biologicznie, które mogą być wykorzystane w przemyśle farmaceutycznym, ale też kosmetycznym i spożywczym.

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isana fumosorosea KCH J2. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 3-hydroksyflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu co najmniej 96 godzin. Kolejno produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg : 1 mL.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 168 godzin.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Isaria fumosorosea KCH J2, następuje przyłączenie cząsteczki gencjobiozy przy C-3. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 3-O-^-D-gencjobiozylo-4'-hydroksyflawonu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu wykorzystując mikroorganizm niebędący patogenem ludzkim.

Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umożliwia, w sposób przyjazny dla środowiska, uzyskanie związków o wyższej biodostępności i aktywności biologicznej, niż użyte substraty (E. Kostrzewa-Susłow, J. Dmochowska-Gładysz, J. Oszmiański, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007, 49 (1-4), 113-117, W. A. Loughlin, Bioresource Technology, 2000, 74, 49-62).

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

P r z y k ł a d. Do kolby Erlenmajera o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g glukozy, wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2 ujawniony w zgłoszeniu patentowym o numerze P.416996. Po 96 godzinach jego wzrostu dodaje się 50 mg 3-hydroksyflawonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ tetrahydrofuranu. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 7 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku 9:1.

Na tej drodze otrzymuje się 4 mg 3-O-^-D-gencjobiozylo-4'-hydroksyflawonu (wydajność 3,4%). Stopień konwersji substratu wedłu g HPLC >99.

PL 235 026 B1

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi.

Opis sygnałów pochodzących z widma ¹H NMR (600 MHz, Aceton-de): δ = 8,27 ppm (2H, d, J₂·, 3·(₆·.5·) = 8,4, H-2', H-6'); δ = 8,22 ppm (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5); δ = 7,88 ppm (1H, t, J = 7,6 Hz, H-7); δ =7,77 ppm (1H, d, J8,7 = 8,5, H-8); δ = 7,56 ppm (1H, t, J = 7,5, H-6); δ = 7,04 ppm (2H, d, J3-,2''(5',6·) 8,2, H-3', H-5'); δ = 5,21 ppm (1H, d, J = 7,1 Hz, H-1); δ = 4,34 ppm (1H, d, J = 7,9 Hz, H-1'); δ = 4,02-3,98 ppm (1H, m, H-6a); δ = 3,91-3,86 ppm (1H, m, H-6'''a); δ = 3,85-3,81 ppm <1H, m, H-6b); δ = 3,69 ppm (1H, m, H- 6'''b); δ = 3,51 ppm (1H, d, J = 8,7, H-3''); δ = 3,43 ppm (1H, d, J = 8,7, H-3'); δ =3,41 ppm (1H, t, J =9,6 Hz, H-4); δ = 3,38-3,33 ppm (1H, m, Hz C-4', C-5''); δ = 3,30 ppm (1H, m, H-5''').

Claims (5)

1. 3-O-^-D-gencjobiozylo-4'-hydroksyflawon o wzorze 2.

2. Sposób wytwarzania 3-O-^-D-gencjobiozylo-4'-hydroksyflawonu, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 3-hydroksyflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg : 1 mL.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

5. Sposób według zastrzeżenia 2, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 168 godzin.