PL236281B1 - Przeciwciało formatu scFv, stanowiące inhibitor białka VEG F-C, sposób wyodrębniania i wykrywania VEG F-C oraz zastosowanie tego przeciwciała - Google Patents
Przeciwciało formatu scFv, stanowiące inhibitor białka VEG F-C, sposób wyodrębniania i wykrywania VEG F-C oraz zastosowanie tego przeciwciała Download PDFInfo
- Publication number
- PL236281B1 PL236281B1 PL415391A PL41539115A PL236281B1 PL 236281 B1 PL236281 B1 PL 236281B1 PL 415391 A PL415391 A PL 415391A PL 41539115 A PL41539115 A PL 41539115A PL 236281 B1 PL236281 B1 PL 236281B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- vegf
- protein
- seq
- sequence
- antibody
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title abstract description 10
- 101000742596 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor C Proteins 0.000 title description 11
- 101000742595 Mus musculus Vascular endothelial growth factor C Proteins 0.000 title description 2
- 108010073923 Vascular Endothelial Growth Factor C Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 102000009520 Vascular Endothelial Growth Factor C Human genes 0.000 claims abstract 16
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 abstract description 16
- 101600105505 Mus musculus Vascular endothelial growth factor C (isoform 1) Proteins 0.000 abstract 1
- 102100038232 Vascular endothelial growth factor C Human genes 0.000 description 65
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 7
- BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 1-[4-[6-amino-5-[(Z)-methoxyiminomethyl]pyrimidin-4-yl]oxy-2-chlorophenyl]-3-ethylurea Chemical compound CCNC(=O)Nc1ccc(Oc2ncnc(N)c2\C=N/OC)cc1Cl BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 0.000 description 6
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 6
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 6
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 5
- 108010073919 Vascular Endothelial Growth Factor D Proteins 0.000 description 5
- 102100038234 Vascular endothelial growth factor D Human genes 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000035168 lymphangiogenesis Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101000595923 Homo sapiens Placenta growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 description 2
- 102000001999 Transcription Factor Pit-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010040742 Transcription Factor Pit-1 Proteins 0.000 description 2
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010053100 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 Proteins 0.000 description 2
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100033179 Vascular endothelial growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000005073 lymphatic endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 229940124676 vascular endothelial growth factor receptor Drugs 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101000724404 Homo sapiens Saccharopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000012214 Immunoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010036650 Immunoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000002111 Neuropilin Human genes 0.000 description 1
- 108050009450 Neuropilin Proteins 0.000 description 1
- 102100028492 Neuropilin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000770 Neuropilin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N Phenanthrene Natural products C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=CC2=C1 YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100040681 Platelet-derived growth factor C Human genes 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102100028294 Saccharopine dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101710105463 Snake venom vascular endothelial growth factor toxin Proteins 0.000 description 1
- 108010073925 Vascular Endothelial Growth Factor B Proteins 0.000 description 1
- 102100038217 Vascular endothelial growth factor B Human genes 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007435 diagnostic evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000000492 lymphangiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 108010017992 platelet-derived growth factor C Proteins 0.000 description 1
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Zgłoszenie dotyczy nowych sekwencji białkowych, oddziałujących specyficznie z ludzkim i mysim czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego C (VEGF-C). W szczególności, sekwencje białkowe stanowiące jednołańcuchowe fragmenty ludzkich przeciwciał (scFv). Zgłoszenie obejmuje sposób wyodrębnienia VEGF-C z roztworu, zwłaszcza z roztworu wodnego, oraz zastosowanie sekwencji białkowych do otrzymywania preparatów białka VEGF-C.
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy przeciwciała formatu scFv, stanowiącego inhibitor białka będącego czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego C (VEGF-C). W szczególności, sekwencje białkowe według wynalazku stanowią jednołańcuchowe fragmenty ludzkich przeciwciał (scFv). Celem wynalazku jest zapewnienie cząsteczek, które mogą wydajnie i specyficznie wiązać ludzkie i mysie białko VEGF-C. Dodatkowym celem wynalazku jest dostarczenie sposobu wykrywania ludzkiego i mysiego białka VEGF-C oraz oznaczania jego ilości i/lub stężenia.
Nowotwory są jedną z głównych przyczyn zgonów na świecie. Skuteczna terapia, związana z chirurgicznym usunięciem czy też naświetlaniem guzów pierwotnych, jest często niemożliwa ze względu na migrację komórek nowotworowych z pierwotnego środowiska do innych narządów i tkanek w organizmie. Do tworzenia przerzutów nowotwory złośliwe wykorzystują zarówno naczynia krwionośne, jak i limfatyczne (Bzowska M et al., Acta Biochim Pol 2013, 60(3):263-75). Do tej pory centrum zainteresowania badaczy stanowiło zjawisko angiogenezy, czyli powstawania nowych naczyń krwionośnych. Stało się ono głównym celem terapii hamujących przerzutowanie nowotworów, choć ich skuteczność okazała się mniejsza od spodziewanej. Jedną z wielu możliwych przyczyn niepowodzenia tego typu terapii jest zaniedbanie wpływu naczyń limfatycznych jako alternatywnej drogi ucieczki komórek nowotworowych z guza pierwotnego (Potente M et al. Cell 2011; 146(6): 873-87). Najbardziej obiecujący cel dla hamowania zjawiska limfangiogenezy stanowi blokada osi sygnałowej pomiędzy białkiem VEGF-C (ang. vascular endothelial growth factor C; czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego C) a jego receptorami VEGFR-2 oraz VEGFR-3 (ang. vascular endothelial growth factor receptor; receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego) (Stacker SA et al. Nat Rev Cancer 2014; 14(3): 159-72). VEGF-C należy do rodziny czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego, składającej się z siedmiu białek: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F oraz PIGF (ang. placental growth factor, łożyskowy czynnik wzrostu). Odkryte w 1996 roku białko VEGF-C zostało opisane jako niekowalencyjny homodimer, będący ligandem dla VEGFR-2 i VEGFR-3 (Joukov V et al. EMBO J. 1996; 15(7):290-298), choć niektóre doniesienia informują również o występowaniu kowalencyjnie połączonych dimerów VEGF-C (Leppanen V-M et al. Proc. Natl Acad Sci USA 2009; 107(6):2425-2430). Jego powinowactwo względem receptorów regulowane jest przez wielostopniową obróbkę proteolityczną, podczas której siła oddziaływania kolejno powstających form VEGF-C z VEGFR-3 wzrasta. Z kolei VEGFR-2 może rozpoznawać tylko dojrzałą formę VEGF-C (Joukov V et al. EMBO J 1997; 16(13):3898-3911). Sekwencje dojrzałej formy ludzkiego i mysiego białka VEGF-C różnią się tylko dwoma resztami aminokwasowymi (rekordy bazy danych UniProtKB/Swiss-Prot o numerach P97953 i P49767 odpowiednio dla mysiego i ludzkiego VEGF-C). VEGFR-2 i VEGFR-3 to receptory o aktywności kinazy tyrozynowej, które w wyniku związania liganda zostają aktywowane - ulegają dimeryzacji i wzajemnej fosforylacji domen cytoplazmatycznych (Joukov 1996, op. cit.). Pod wpływem oddziaływania VEGF-C z jego receptorami może dochodzić do powstania jedynie homodimerów VEGFR-3 lub heterodimerów VEGFR-2/3 (Nilsson I et al. EMBO J 2010; 29(8):1377-88). Prawdopodobnie ważną rolę w osi sygnałowej pomiędzy VEGF-C a jego receptorami odgrywają również nieposiadające aktywności enzymatycznej neuropiliny, które pełnią funkcję koreceptorów dla VEGFR-2 i VEGFR-3 (Karpanen T et al. FASEB J 2006; 20(9): 1462-72).
VEGF-C pełni istotną rolę w limfangiogenezie, a zatem bierze udział w wielu różnorodnych procesach fizjologicznych i patologicznych takich jak np.: rozwój układu limfatycznego w trakcie embriogenezy, gojenie ran, przewlekłe stany zapalne, choroby autoimmunologiczne czy przerzutowanie nowotworów (Chachaj A i Szuba A [w:] Angiogenesis and Vascularisation Dulak J et al. (eds.); Springer Vienna 2013, pp. 27-66). VEGF-C poprzez aktywację VEGFR-3 stymuluje proliferację oraz migrację komórek śródbłonka limfatycznego, a także dostarcza im sygnał przetrwania (Makinen T et al. EMBO J 2001; 20(17):4762-4773). Ponadto, chociaż głównym pro-angiogennym czynnikiem pozostaje VEGF-A, VEGF-C także może stymulować angiogenezę przez oddziaływanie z heterodimerami VEGFR-2/3 (Nilsson 2010, op. cit.).
Głównymi czynnikami pro-limfangiogennymi o kluczowym znaczeniu w przerzutowaniu nowotworów są białka VEGF-C i VEGF-D, które indukują powstawanie nowych naczyń limfatycznych w okolicy guza przez aktywację VEGFR-3 i koreceptora neuropiliny-2 (Karpanen 2006; op. cit.; Mandriota SJ et al. EMBO J 2001; 20(4):672-82; Chen Z et al. Cancer Res 2005; 65(19):9004-9011; Xu Y et al. J Cell Biol 2010; 188(1):115-30). W ten sposób komórki nowotworowe wydzielając VEGF-C zapewniają sobie drogę ucieczki do pobliskiego węzła limfatycznego, z którego mogą rozprzestrzeniać się dalej zarówno drogą limfatyczną, jak i krwionośną (Stacker SA et al. Nat Rev Cancer 2002; 2(8):573-583). Zasadniczą
PL 236 281 B1 rolę VEGF-C w limfangiogenezie związanej z nowotworami potwierdziły eksperymenty in vivo, w których zablokowanie tego czynnika hamowało przerzutowanie komórek nowotworowych (Chen 2005; op. cit.; Wang F et al. Exp Ther Med 2010; 1(5):899-904).
Ocena obecności i/lub poziomu białka VEGF-C w materiale biologicznym może mieć zatem znaczenie diagnostyczne w medycynie. Opis patentowy US20100317533 ujawnia panel biomarkerów służących do diagnostyki i monitorowania przebiegu choroby nowotworowej; jednym ze składników panelu jest VEGF-C, którego obecność jest związana z potencjałem nowotworu do tworzenia przerzutów. W opisie patentowym US2012231480 został z kolei ujawniony sposób oceny diagnostycznej zmian w obrębie trzustki za pomocą pomiaru poziomu białek VEGF-A i VEGF-C oraz prostaglandyny E2.
Do oznaczania białka VEGF-C w materiale biologicznym mogą służyć m.in. przeciwciała, a zwłaszcza przeciwciała monoklonalne. Przeciwciało klasy IgG specyficzne względem VEGF-C zostało ujawnione w opisie patentowym US2011143428. Przeciwciała to cząsteczki o stosunkowo dużym rozmiarze, co może ograniczać ich stosowanie analityczne i diagnostyczne. Ponadto, produkcja przeciwciał monoklonalnych jest kosztowna (m.in. wymaga stosowania hodowli komórek eukariotycznych). Wad tych pozbawione są przeciwciała jednołańcuchowe (ang. single-chain variable fragment, scFv), które są ok. 6 razy mniejsze od przeciwciał klasy IgG oraz mogą być wytwarzane z użyciem prokariotycznych systemów ekspresyjnych.
Ze stanu techniki znane są przeciwciała scFv specyficznie oddziałujące z białkiem VEGF-C (Rinderknecht M et al. PLoS One 2010; 5(8):e11941). Opisane przeciwciała posiadają jednak szereg ograniczeń. Białko wykorzystane do selekcji przeciwciał scFv pochodziło z organizmu drożdży, bowiem wytwarzane było w układzie wykorzystującym komórki Pichia pastoris. W związku z tym białko to charakteryzowało się m.in. wzorem glikozylacji różnym od występującego w białku VEGF-C obecnym w organizmach ssaków. Co więcej, nie została potwierdzona aktywność biologiczna białka wykorzystanego do selekcji przeciwciał scFv.
Celem wynalazku jest zapewnienie cząsteczek, które mogą wydajnie i specyficznie oddziaływać z aktywnym biologicznie białkiem VEGF-C. Dodatkowym celem wynalazku jest dostarczenie metody oczyszczania, wykrywania i/lub oznaczania ilości białka VEGF-C.
Istotą wynalazku jest przeciwciało formatu scFv, stanowiące inhibitor białka VEGF-C obejmujące sekwencję aminokwasową wybraną z następującej grupy: Sekw. nr 14, Sekw. nr 15, Sekw. nr 16, Sekw. nr 17, Sekw. nr 18, Sekw. nr 19, Sekw. nr 20, Sekw. nr 21, Sekw. nr 22, Sekw. nr 23, Sekw. nr 24, Sekw. nr 25, Sekw. nr 26.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wyodrębniania VEGF-C z roztworu, zwłaszcza roztworu wodnego, charakteryzujący się tym, że:
(a) kontaktuje się sekwencję białkową według wynalazku z roztworem zawierającym białko VEGF-C w celu uzyskania kompleksu białkowego zawierającego sekwencję białkową według wynalazku i związane z tym przeciwciałem niekowalencyjnie białko VEGF-C;
(b) wydziela się z roztworu uzyskany kompleks białkowy;
(c) z uzyskanego kompleksu białkowego oddysocjowuje się białko VEGF-C;
(d) z roztworu po dysocjacji wyodrębnia się białko VEGF-C.
Korzystnie, gdy w etapie (b) wyżej opisanego sposobu wyodrębnianie VEGF-C z roztworu prowadzi się metodą chromatografii powinowactwa, przy czym jako złoże stosuje się nośnik chromatograficzny zawierający immobilizowaną sekwencję białkową według wynalazku.
W innym aspekcie, wynalazek także dotyczy sposobu wykrywania obecności VEGF-C w materiale biologicznym, charakteryzującego się tym, że:
(a) kontaktuje się sekwencję białkową według wynalazku z materiałem biologicznym w celu uzyskania kompleksu białkowego zawierającego sekwencję białkową według wynalazku i związane z tym przeciwciałem niekowalencyjnie białko VEGF-C;
(b) wykrywa się uzyskany kompleks białkowy za pomocą pośrednich lub bezpośrednich biochemicznych metod detekcji.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób oznaczania stężenia VEGF-C w roztworze wodnym, zwłaszcza płynie fizjologicznym, charakteryzujący się tym, że:
(a) kontaktuje się sekwencję białkową według wynalazku z roztworem wodnym zawierającym VEGF-C w celu uzyskania kompleksu białkowego zawierającego sekwencję białkową według wynalazku i związane z tym przeciwciałem niekowalencyjnie białko VEGF-C;
(b) oznacza się stężenie uzyskanego kompleksu białkowego za pomocą pośrednich lub bezpośrednich biochemicznych metod detekcji.
PL 236 281 B1
W innym aspekcie, wynalazek także dotyczy zastosowania sekwencji białkowej według wynalazku do otrzymywania preparatów białka VEGF-C.
Wynalazek obejmuje także zastosowanie sekwencji białkowej według wynalazku do wykrywania białka VEGF-C w materiale biologicznym.
Wynalazek obejmuje także zastosowanie sekwencji białkowej według wynalazku do oznaczania stężenia białka VEGF-C w roztworze wodnym.
Przedmiot wynalazku przedstawiony jest w przykładach realizacji nie ograniczając jego zakresu oraz na rysunku, na którym:
fig. 1 ilustruje, że wyselekcjonowane przeciwciała monoklonalne są specyficzne zarówno względem mysiego VEGF-C (A), jak i ludzkiego VEGF-C (B);
fig. 2 ilustruje wiązanie antygenu przez wybrane rozpuszczalne przeciwciała scFv anty-
VEGF-C;
fig. 3 ilustruje, że przeciwciała 1F2, 1F5 oraz 1F6 są specyficzne wyłącznie względem VEGF-C;
fig. 4 ilustruje sekwencje aminokwasowe przeciwciał wyodrębnionych z biblioteki fagemido- wej uzbieżnione w postaci MSA (ang. Multi-Sequence Alignment).
P r z y k ł a d wykonania
Wyodrębnienie fagów wykazujących ekspresję rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych formatu scFv specyficznych względem mysiego i ludzkiego białka VEGF-C
Do otrzymania przeciwciał wybrano metodę ekspresji fagowej opartą o wykorzystanie fagemidowej biblioteki ludzkich rekombinowanych przeciwciał formatu scFv Tomlinson I+J. Wykorzystując poliklonalne fagi przeprowadzono trzy rundy selekcyjne na immobilizowanym mysim białku VEGF-C wyprodukowanym przez ssacze komórki (antygenem było więc dojrzałe rekombinowane białko VEGF-Canac). Aktywność biologiczna białka użytego do selekcji została wcześniej potwierdzona metodami biologicznymi z wykorzystaniem hodowli komórek in vitro. W tym celu wykorzystano test tworzenia tubuli na podłożu zawierającym matrigel przez komórki ludzkiego śródbłonka naczyń limfatycznych (ang. immortalized human Lymphatic Endothelial Cells, ihLEC) pod wpływem aktywnego biologicznie białka VEGF-C. W wyniku selekcji na antygenie uzyskano fagi wykazujące na swej powierzchni ekspresję przeciwciał zdolnych do wiązania mysiego rekombinowanego białka VEGF-C (fig. 1A). Mimo, iż selekcję fagów biblioteki przeprowadzono wykorzystując jako antygen mysie białko VEGF-C, potwierdzono, iż przeciwciała ulegające ekspresji na powierzchni wyodrębnionych fagów wiążą również ludzki VEGF-C (fig. 1B). Wyselekcjonowane przeciwciała są zatem specyficzne zarówno względem mysiego, jak i ludzkiego białka VEGF-C.
Uzyskanie rozpuszczalnych przeciwciał formatu scFv wiążących mysi i ludzki VEGF-C
Przeciwciało ulegające ekspresji na powierzchni faga filamentowego nie jest rozpuszczalnym białkiem - jest ono produkowane jako białko fuzyjne razem z białkiem pIII, strukturalnym białkiem płaszcza faga. W celu uzyskania ekspresji rozpuszczalnych przeciwciał scFv przeklonowano sekwencję kodującą wybrane przeciwciało do wektora ekspresyjnego pETscFv. Ekspresję rozpuszczalnych przeciwciał anty-VEGF-C uzyskano w bakteriach E. coli Rosetta Blue. Przeciwciała izolowano z obszaru peryplazmatycznego bakterii i oczyszczano wykorzystując metodę chromatografii powinowactwa z użyciem białka A. Na fig. 2 przedstawiono wiązanie wybranych przeciwciał monoklonalnych formatu scFv do antygenu.
Potwierdzenie specyficzności względem białka VEGF-C
Ponieważ białka należące do rodziny VEGF wykazują duże podobieństwo w obrębie sekwencji aminokwasowej, potwierdzono wykorzystując test ELISA, iż uzyskane przeciwciała 1F5, 1F6 i 1F2 rozpoznają i wiążą VEGF-C nie wykazując jednocześnie powinowactwa ani względem VEGF-A, ani względem VEGF-D (fig. 3).
Uzyskanie sekwencji przeciwciał formatu scFv wiążących mysi i ludzki VEGF-C
Wektory fagemidowe pIT2 kodujące przeciwciała prezentowane na powierzchni wyodrębnionych fagów zostały poddane sekwencjonowaniu w celu uzyskania sekwencji aminokwasowej kodowanych przeciwciał. Otrzymane sekwencje zostały następnie uzbieżnione w postaci MSA (ang. Multi-Sequence Alignment) i przedstawione na fig. 4. W ich obrębie można wyróżnić regiony CDR, które odpowiadają za wiązanie sekwencji białkowej do antygenu.
Poszczególne regiony CDR w sekwencji przeciwciał mogą być traktowane jako fragmenty wymienne, ponieważ jak pokazano na fig. 4 dla sekwencji przeciwciał 1F5 i 1F10 sekwencje CDRH2
PL 236 281 B1 i CDRH3 są identyczne, choć odpowiednie sekwencje CDRL2 i CDRL3 są różne; analogicznie sekwencje 1F5 i 1G4 posiadają identyczny fragment CDRL2, lecz różne fragmenty CDRH2, CDRH3 i CDRL3.
Ponadto, powyższe sekwencje zawierające fragmenty łańcucha ciężkiego oraz fragmenty łańcucha lekkiego mogą być poddane dalszej optymalizacji; w szczególności, można je doprowadzić do postaci pojedynczego łańcucha ciężkiego (ang. camelid heavy chain antibodies), która charakteryzuje naturalnie występujące immunoproteiny (Hamers-Casterman et al. Nature 1993; 363:446-448, Muyldermans S and Lauwereys M. J Mol Recognit 1999; 12:131-140). W takim przypadku do wiązania antygenu nie jest konieczna cała sekwencja białkowa stanowiąca przeciwciało scFv, a jedynie jej fragment (stanowiący pojedynczy łańcuch). Tym samym użycie takiego fragmentu będzie wystarczające dla zachowania zdolności sekwencji białkowej do wiązania antygenu. Zastosowanie takiej strategii optymalizacyjnej względem przeciwciał formatu scFv jest znane z literatury (Rinderknecht M et al., op. cit.).
Wyselekcjonowane przeciwciała monoklonalne są specyficzne zarówno względem mysiego, jak i ludzkiego VEGF-C, jak przedstawiono odpowiednio na fig. 1A i 1B. Analizę przeprowadzono wykorzystując test ELISA. Płytki opłaszczone antygenami (mysim lub ludzkim VEGF-C) inkubowano z wyodrębnionymi fagami i fagiem niewiążącym VEGF-C, kontrola negatywna kn. Uzyskany wynik potwierdza, że 1) przeciwciała są zdolne do rozpoznania i specyficznego wiązania mysiego białka VEGF-C i ludzkiego białka VEGF-C oraz 2) przeciwciała mogą być stosowane do wykrywania VEGF-C zarówno w próbkach mysich, jak i w materiale ludzkim.
Wiązanie antygenu przez wybrane rozpuszczalne przeciwciała scFv anty-VEGF-C ilustruje fig. 2. Analizę przeprowadzono stosując test ELISA. Ekspresję przeciwciał anty-VEGF-C uzyskano w bakteriach E. coli Rosetta blue. Przeciwciała izolowano z obszaru peryplazmatycznego bakterii. Przeciwciała wiązano do antygenu immobilizowanego do płytki przeznaczonej do testów ELISA. Detekcji scFv związanych do antygenu dokonano wykorzystując roztwór białka L-HRP (białko L znakowane peroksydazą chrzanową), ponieważ wiąże się ono z łańcuchem lekkim scFv. kn oznacza przeciwciało niespecyficzne względem VEGF-C. Uzyskany wynik potwierdza, że do wiązania białka VEGF-C są zdolne nie tylko przeciwciała ulegające ekspresji na powierzchni wyselekcjonowanych fagów, ale również odpowiadające im rozpuszczalne przeciwciała, które wyprodukowano wykorzystując bakteryjny system ekspresji oparty o wektor pETscFv.
Wybrane przeciwciała 1F2, 1F5 oraz 1F6 zostały zbadane pod kątem specyficzności oddziaływania z VEGF-C (fig. 3). Analizę przeprowadzono z zastosowaniem testu ELISA. Płytkę pokryto białkiem VEGF-C, VEGF-A i VEGF-D w stężeniu 2 pg/ml. Wszystkie przeciwciała rozcieńczono do stężenia 5 pg/ml w buforze PBS zawierającym 3% albuminy wołowej. Detekcji scFv związanych do antygenu dokonano za pomocą białka L-HRP. K - kontrolne przeciwciała scFv specyficzne dla białka innego niż VEGF-C. Uzyskany wynik potwierdza, że otrzymane przeciwciała scFv są specyficzne wyłącznie względem białka VEGF-C. Białko VEGF-C jest bardzo podobne do innych białek rodziny VEGF (na przykład do VEGF-A lub VEGF-D), a zatem przeciwciała te są bardzo cennym narzędziem służącym do specyficznej detekcji i wybiórczego wiązania VEGF-C.
Sekwencje przeciwciał (fig. 4) zostały ustalone za pomocą sekwencjonowania wektorów fagemidowych. Jako matryce do sekwencjonowania wykorzystano wyizolowane z bakterii TOP10 fagemidy pIT2 zawierające sekwencje poszczególnych wyselekcjonowanych przeciwciał. W procesie sekwencjonowania wykorzystano startery LMB3 (5’ CAG GAA ACA GCT ATG AC 3’) i pHEN (5’ CTA TGC GGC CCC ATT CA 3’). Do analiz uzyskanych sekwencji wykorzystano programy znajdujące się na platformie internetowej Mobyle@Pasteur (revseq, transeq, needle), ClustalX oraz Jalview.
PL 236 281 Β1
Sekwencj e
Sekwencja nr la: 1D2_CDRH2 AIDSKGSFTV Sekwencja nr Ib: >1D2_CDRH3 EGLRF
Sekwencja nr lc: >1D2_CDRL2 HASH
Sekwencja nr ld: >1D2_CDRL3 GPIDPQ
Sekwencja nr 2a: >1E7_CDRH2 AISAQGTSTL
Sekwencja nr 2b: >1E7_CDRH3 KYHMF
Sekwencja nr 2c: >1E7_CDRL2 HAST
Sekwencja nr 2d: >1E7_CDRL3 RRAMPT
Sekwencja nr 3a: >1F2_CDRH2 SIQAAGPTTD
Sekwencja nr 3b: >1F2_CDRH3 ADWEF
Sekwencja nr 3c: >1F2_CDRL2 GASV
Sekwencja nr 3d: >1F2_CDRL3 ALRVPS
PL 236 281 Β1
Sekwencja nr 4a: >1F5_CDRH2 SILDHGQGTQ
Sekwencja nr 4b:
>1F5_CDRH3
EGTML
Sekwencja nr 4c:
>1F5_CDRL2
RASR
Sekwencja nr 4d: >1F5_CDRL3
LRASPR
Sekwencja nr 5a: >1F6_CDRH2
SITGHGSTTE
Sekwencja nr 5b: >1F6_CDRH3
EGAVF
Sekwencja nr 5c: >1F6_CDRL2
QASS
Sekwencja nr 5d: >1F6_CDRL3
TARYFD
Sekwencja nr 6a: >1F1O_CDRH2 SILDHGQGTQ Sekwencja nr 6b: >1F1O_CDRH3 EGTML
Sekwencja nr 6c: >1F1O_CDRL2 YASS
Sekwencja nr 6d: >1F1O_CDRL3 PSVGPK
PL 236 281 Β1
Sekwencja nr 7a: >1G2_CDRH2 DIQPKGTATN
Sekwencja nr 7b: >1G2_CDRH3 STNQF
Sekwencja nr 7c: >1G2_CDRL2 PASQ
Sekwencja nr 7d: >1G2_CDRL3 QFRNPV
Sekwencja nr 8a:
>1G4_CDRH2
SIAAQGSPTA
Sekwencja nr 8b:
>1G4_CDRH3
EGTNF
Sekwencja nr 8c:
>1G4_CDRL2
RASR
Sekwencja nr 8d:
>1G4_CDRL3
PASWPP
Sekwencja nr 9a: >1G5_CDRH2 SITQGGTLTQ Sekwencja nr 9b: >1G5_CDRH3 PGLAF
Sekwencja nr 9c: >1G5_CDRL2 GASA
Sekwencja nr 9d: >1G5_CDRL3 TSRRPK
PL 236 281 Β1
Sekwencja nr lOa: >1G6_CDRH2 TITDSGYQTL·
Sekwencja nr lOb:
>1G6_CDRE3
EALHF
Sekwencja nr lOc: >1G6_CDRL2
HASR
Sekwencja nr lOd: >1G6_CDRL3 LPPSPK
Sekwencja nr lla: >1G8_CDRH2 SITHKGGLTQ
Sekwencja nr llb:
>1G8_CDRE3
EGAPF
Sekwencja nr lic: >1G8_CDRL2
AASS
Sekwencja nr lid: >1G8_CDRL3
SY3TPN
Sekwencja nr 12a: >1G1O_CDRH2 TIALDGQRTN
Sekwencja nr 12b:
>1G1O_CDRH3
HWAPF
Sekwencja nr 12c: >1G1O_CDRL2
TASS
Sekwencja nr 12d:
>1G1O CDRL3
LAQFPP
PL 236 281 Β1
Sekwencja nr 13a:
>2F10_CDRH2
HIMQSGYTTV
Sekwencja nr 13b:
>2F10_CDRH3
YSPKF
Sekwencja nr 13c:
>2F10_CDRL2
VASQ
Sekwencja nr 13d:
>2F10_CDRL3
AQEPPS
Sekwencja nr 14:
>1D2
MKYLLPTAAAGLLLIAAQPAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS3YAMSWVR QAPGKGLEWVS AlDS KGS FTYYAD SVKGRFTIS RDN S KNT LYLQMNS L RAEDTAYYYCAK EGLRFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS QSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYHASHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQQGPIDPQTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH
Sekwencja nr 15:
>1E7
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVR QAP GKGLEWYSAlS AQGT Ξ T L YAD SVKGRFT13 RDN SKNT LY LQMN3 L RAEDT AVYYCAK KYHMFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS QSIS3YLNWYQQKPGKAPKLLIYHASTLQSGVPSRFSGSG3GTDFTLTISSLQPEDFATY YCQQRRAMPTTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH
Sekwencja nr 16:
>1F2
MKYLLPTAAAGLLLLAAOPAMAEYGLLESGGGLYOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWYR QAPGKGLEWVSSIQAAGPTTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK ADWEFDYWGQGTLWVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS QSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASVLQSGVPTRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQQALRVPSTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH
Sekwencja nr 17:
>1F5
PL 236 281 Β1
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVR QAPGKGLEWVSSILDHGQGTQYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK EGTMLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS QSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQQLRASPRTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH
Sekwencja nr 18:
>1F6
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLΞCAASGFTFSSYAMSWVR QAPGKGLEWVSSITGHGSTTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK EGAVFDYWGQGTLVTVSSGGGG3GGGGSGGGGSTDIQMTQSP33LSASVGDRVTITCRAS QSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYQASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQQTARYPDTFGQGTKVETKRAAAHHHHHH
Sekwencja nr 19:
>1F1O
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRL3CAASGFTFS3YAMSWYR QAPGKGLEWVSSILDHGQGTQYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK EGTMLDYWGQGTLVTVS3GGGG3GGGGSGGGGSTDIQMTQSP33LSASVGDRVTITCRAS 03Ι33ΥΕΝΜΥΰ2ΚΡ6ΚΑΡΚΕΕΙΥΥΑ33Ε036νΡ3ΕΡ36303ΘΤ0ΡΤΕΤΙ33Ε0ΡΕ0ΡΑΤΥ YCQQPSVGPKTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH
Sekwencja nr 20:
>1G2
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVR QAPGKGLEWVSDIQPKGTATNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK STNQFDYWGQGTLVTVSSGGGG3GGGGSGGGG3TDIQITQSP33L3ASVGDRVTITCRAS QSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYPASQLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQQQFRNPVTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH
Sekwencja nr 21:
>1G4
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVR QAPGKGLEWVSSIAAQGSPTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNΞLRAEDTAVYYCAK EGTNFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS 03Ι33ΥΕΝΜΥ0ΩΚΡΟΚΑΡΚΕΕΙΥΡΑ3ΚΕ03θνΡ3ΕΚ3Ο303&ΤΟΡΤΕΤΙ33Ε0ΡΕϋΕΑΤΥ YCQQPASWPPTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH
PL 236 281 Β1
Sekwencja nr 22:
>1G5
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWYR QAPGKGLEWVS ΞITQGGT LTQYADSVKGRFTIS RDN S KNT LYLQMN 3 LRAEDTAVYYCAK PGLAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS ς3Ι33ΥΕΝΉΥ2ςΚΡ6ΚΑΡΚΕΕΙΥΰΑ3ΑΕς36νΡ3ΗΡ36363&ΤΏΡΤΕΤΙ33Ε2ΡΕΏΕΑΤΥ YCQQTSRRPKTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH
Sekwencja nr 23:
>1G6
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVR QAPGKGLEWVS TIT DS GYQT LYADSVKGRFTIS RDN S KNT LYLQMN S LRAEDTAVYYCAK EALHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRWITCRAS QSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYHASRLQSGVP3RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQQLPPSPKTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH
Sekwencja nr 24:
>1G8
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVR QAPGKGLEWVSSITHKGGLTQYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK EGAPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS GSISSYLNWYGeKPGKAPKLLIYAASSLGSGYPSRFSGSGSGTDFTLTISSLGPEDFATY YCQQSYSTPNTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH
Sekwencja nr 25:
>1G1O
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYANSWVR QAPGKGLEWVS TIALDGQRTNYADSVKGRFTIS RDN S KNTLYLQMN S LRAEDTAVYYCAK HWAPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS QSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTTSSLQPEDFATY YCQQLAQFPPTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH
Sekwencja nr 26:
>2F10
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVR QAPGKGLEWVSHTMQSGYTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK YSPKFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRWITCRAS QSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASQLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQQAQEPPSTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHH
Claims (8)
- Zastrzeżenia patentowe1. Przeciwciało formatu scFv, stanowiące inhibitor białka VEGF-C obejmujące sekwencję aminokwasową wybraną z następującej grupy: Sekw. nr 14, Sekw. nr 15, Sekw. nr 16, Sekw. nr 17, Sekw. nr 18, Sekw. nr 19, Sekw. nr 20, Sekw. nr 21, Sekw. nr 22, Sekw. nr 23, Sekw. nr 24, Sekw. nr 25, Sekw. nr 26.
- 2. Sposób wyodrębniania VEGF-C z roztworu, zwłaszcza roztworu wodnego, znamienny tym, że:(a) kontaktuje się przeciwciało określone w zastrz. 1 z roztworem zawierającym białko VEGF-C w celu uzyskania kompleksu białkowego zawierającego przeciwciało określone w zastrz. 1 i związane z tym przeciwciałem niekowalencyjnie białko VEGF-C;(b) wydziela się z roztworu uzyskany kompleks białkowy;(c) z uzyskanego kompleksu białkowego oddysocjowuje się białko VEGF-C;(d) z roztworu po dysocjacji wyodrębnia się białko VEGF-C.
- 3. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że w etapie (b) wyodrębnianie prowadzi się metodą chromatografii powinowactwa, przy czym jako złoże stosuje się nośnik chromatograficzny zawierający immobilizowane przeciwciało określone w zastrz. 1.
- 4. Sposób wykrywania obecności VEGF-C w materiale biologicznym, znamienny tym, że:(a) kontaktuje się przeciwciało określone w zastrz. 1 z materiałem biologicznym w celu uzyskania kompleksu białkowego zawierającego przeciwciało określone w zastrz. 1 i związane z tym przeciwciałem niekowalencyjnie białko VEGF-C;(b) wykrywa się uzyskany kompleks białkowy za pomocą pośrednich lub bezpośrednich biochemicznych metod detekcji.
- 5. Sposób oznaczania stężenia VEGF-C w roztworze wodnym, zwłaszcza płynie fizjologicznym, znamienny tym, że:(a) kontaktuje się przeciwciało określone w zastrz. 1 z roztworem wodnym zawierającym VEGF-C w celu uzyskania kompleksu białkowego zawierającego przeciwciało określone w zastrz. 1 i związane z tym przeciwciałem niekowalencyjnie białko VEGF-C;(b) oznacza się stężenie uzyskanego kompleksu białkowego za pomocą pośrednich lub bezpośrednich biochemicznych metod detekcji.
- 6. Zastosowanie przeciwciała określonego w zastrz. 1 do otrzymywania preparatów białka VEGF-C.
- 7. Zastosowanie in vitro przeciwciała określonego w zastrz. 1 do wykrywania białka VEGF-C w materiale biologicznym.
- 8. Zastosowanie przeciwciała określonego w zastrz. 1 do oznaczania stężenia białka VEGF-C w roztworze wodnym.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415391A PL236281B1 (pl) | 2015-12-28 | 2015-12-28 | Przeciwciało formatu scFv, stanowiące inhibitor białka VEG F-C, sposób wyodrębniania i wykrywania VEG F-C oraz zastosowanie tego przeciwciała |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415391A PL236281B1 (pl) | 2015-12-28 | 2015-12-28 | Przeciwciało formatu scFv, stanowiące inhibitor białka VEG F-C, sposób wyodrębniania i wykrywania VEG F-C oraz zastosowanie tego przeciwciała |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL415391A1 PL415391A1 (pl) | 2017-07-03 |
| PL236281B1 true PL236281B1 (pl) | 2020-12-28 |
Family
ID=59201259
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL415391A PL236281B1 (pl) | 2015-12-28 | 2015-12-28 | Przeciwciało formatu scFv, stanowiące inhibitor białka VEG F-C, sposób wyodrębniania i wykrywania VEG F-C oraz zastosowanie tego przeciwciała |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL236281B1 (pl) |
-
2015
- 2015-12-28 PL PL415391A patent/PL236281B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL415391A1 (pl) | 2017-07-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20260008841A1 (en) | Monoclonal antibodies to growth and differentiation factor 15 (gdf-15), and uses thereof for treating cancer cachexia and cancer | |
| RU2651513C2 (ru) | Новое антитело для диагностики и (или) прогнозирования рака | |
| RU2636345C2 (ru) | Новое антитело к cxcr4 и его применение для выявления и диагностики рака | |
| US20070269835A1 (en) | Reagent for determining laminin 5 antigen in biological sample and assay method | |
| CN106164672B (zh) | 用于诊断的细胞表面前列腺癌抗原 | |
| KR20130132739A (ko) | 혈관 내피 성장인자 2(ｖｅｇｆｒ-2/ｋｄｒ)에 결합하여 그것의 활성을 차단하는 재조합 항체 구조 | |
| CN107880130A (zh) | 一种具有高亲和力的抗癌胚抗原纳米抗体及应用 | |
| KR20140047127A (ko) | 암의 검출 및 진단을 위한 항체 i-3859의 용도 | |
| KR20210114922A (ko) | 항-인간 n-말단 프로 뇌 나트륨 이뇨 펩티드의 재조합 항체 | |
| JP6707660B2 (ja) | 抗ポドカリキシン様タンパク質前駆体サブタイプ２モノクローナル抗体とその生成方法及び使用 | |
| CN104837867A (zh) | 特异性结合tm4sf5蛋白的新型单克隆抗体及其应用 | |
| CN120718148A (zh) | 一种抗cd38纳米抗体及其制备方法与应用 | |
| Tang et al. | Single chain fragment variable antibodies developed by using as target the 3rd fibronectin type III homologous repeat fragment of human neural cell adhesion molecule L1 promote cell migration and neuritogenesis | |
| JP2023515875A (ja) | 抗ｃｄ１２３抗体またはキメラ抗原受容体（ｃａｒ）に結合する抗イディオタイプ抗体、およびそれを使用する方法 | |
| WO2025025731A1 (zh) | 一种适用于免疫组化检测cd228的诊断抗体 | |
| JP2010254682A (ja) | 抗フィブロネクチンフラグメントモノクローナル抗体 | |
| CN117964771A (zh) | 一种特异性结合mmp7的抗体及其应用 | |
| PL234874B1 (pl) | Przeciwciało formatu scFv, stanowiące inhibitor białka VEGF-C oraz jego zastosowanie | |
| CN112279917A (zh) | 可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞表面糖蛋白cd138的单克隆抗体 | |
| TWI869740B (zh) | 一種體外檢測ｓＴＮＦＲ２蛋白濃度的方法及其檢測試劑和檢測試劑盒 | |
| US20230417753A1 (en) | Methods and kits for classifying solid cancer-afflicted patients based on relb labelling | |
| CN121008043A (zh) | Axl-gas6复合物的检测方法及在心肌梗死患者中的应用 | |
| TW202221036A (zh) | 抗人類trpv2抗體 | |
| HK1231096B (en) | Monoclonal antibodies to growth and differentiation factor 15 (gdf-15), and uses thereof for treating cancer cachexia and cancer | |
| HK1210950A1 (en) | Monoclonal antibodies to growth and differentiation factor 15 (gdf-15) |