PL239566B1 - Sposób wytwarzania 3’-O-β-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)- flawonu - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy 3'-O-ß-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu i sposobu wytwarzania 3'-O-ß-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu. W wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Isaria fumosorosea KCh J2, następuje O-demetylacja i 4"-O-metyloglikozylacja. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Description

Metoda, według wynalazku może znaleźć zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym do wytwarzania składników preparatów poprawiających funkcjonowanie przewodu pokarmowego.

Flawony są syntezowane przez rośliny i stanowią składnik naszej diety o wysokim potencjale antyoksydacyjnym oraz zdolności do modulowania różnych układów enzymatycznych związanych z wieloma chorobami (Mughal E.U., Ayaz M., Hussain Z., Hasan A., Sadiq A., Riaz M., Malik A., Hussain S., Choudhary M.l. 2006. Synthesis and antibacterial activity of substituted flavones, 4-thioflavones and 4-iminoflavones. Bioorg. Med. Chem. 14: 4704-4711). Zarówno naturalne, półsyntetyczne i syntetyczne flawony zostały scharakteryzowane pod kątem szeregu działań terapeutycznych, takich jak działania przeciwzapalne, przeciwestrogenowe, przeciwdrobnoustrojowe (Cushnie T.P.T., Lamb A.J. 2005. Antimicrobialactivity of flavonoids. Int. J. Antimicrol. Agents 26: 343-35), przeciwalergiczne, przeciwutleniające, przeciwnowotworowe czy też cytotoksyczne (Havsteen B. 1983. Flavonoids, a class of natural products of high pharmacological potency. Biochem. Pharmacol. 32: 1141-1148; Aregawi M., Williams R., Dye C., Cibulskis R., Otten M. 2008. World Malaria 2008, World Health Organization (WHO): Geneva). 3'-metoksyflawon był wyizolowany z kultury tkankowej rośliny leczniczej Primulaveris z której wykonuje się preparaty wykrztuśne (Jaromir Budzianowski, Maria Morozowska, Maria Wesołowska. Lipophilic flavones of Primula veris L. from field cultivation and in vitro cultures. Phytochemistry 66 (2005) 1033-1039). Obecność jednostki cukrowej ma wpływ na stabilność i rozpuszczalność flawonoidów, a często także wpływa na ich biodostępność i bioaktywność (Wang X. Structure, mechanism and engineering of plant natural product glycosyltransferases. FEBS Lett. 2009; 583(20): 3303-9; Wang L, Han W, Xie C, Hou J, Fang Q, Gu J, et al. Comparing the acceptor promiscuity of a Rosa hybrid aglucosyltransferase RhGT1 and an engineered microbial glucosyl transferase OleDPSA toward a small flavonoid library. Carbohydr Res. 2013; 368: 73-7; Pandey RP, Gurung RB, Parajuli P, Koirala N, Tuoi LT, Sohng JK. Assessing acceptor substrate promiscuity of Yji C-mediated glycosylation toward flavonoids. Carbohydr Res. 2014; 393: 26-31).

Szczep Isaria fumosorosea KCh J2 był wcześniej ujawniony w literaturze (Dymarska M., Grzeszczuk J., Urbaniak M., Janeczko T., Pląskowska E., Stępień Ł., Kostrzewa-Susłow E.; (2017) The newstrain of Isaria fumosorosea KCH J2 efficiently biocatalyses glycosylation of 6-methylflavone. Plos One. 12, e.0184885; Kozłowska E., Dymarska M., Kostrzewa-Susłow E.; Janeczko T., (2017) Isaria fumosorosea KCh J2 entomopathogenic strain as an effective biocatalyst for steroid compound transformations. Molecules, 22, 1511, doi:10.3390.).

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się Isaria fumosorosea KCh J2. Po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 3’-metoksyflawon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 1 dobę. Kolejno produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

W wyniku regioselektywnej O-demetylacji i 4”-O-metyloglkozylacji otrzymuje się 3’-O-e-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon, a reakcję prowadzi się w wodnej kulturze szczepu Isaria fumosorosea KCh J2.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 g : 1 L.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 3 dni.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Isaria fumosorosea KCh J2, następuje regioselektywna O-demetylacja i 4-O-metyloglukozylacja substratu. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu). Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 3’-O-e-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu, z wydajnością izolowaną na poziomie 20% (konwersją według HPLC > 99%), w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

P r z y k ł a d. Do kolby Erlenmajera o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 5 g aminobaku i 15 g glukozy, wprowadza się szczep Isaria fumosorosea

PL 239 566 B1

KCh J2. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 100 mg 3’-metoksyflawonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 2 cm³ dimetylosuflotlenku (DMSO). Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 3 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny chloroform i metanol 9:1.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi:

¹H NMR (600 MHz) (DMSO) δ (ppm): 3.05 (t, iH, J = 9.2 Hz, H-4”), 3.25-3.34 (m, 1 H, H-2”), 3.423.57 (m, 3H, H-3”, H-5” and one of H-6”), 3.47 (s, 3H, C-3”-OCH3), 3.68 (dd, 1H, J = 10.0, 4.9 Hz, one of H-6”), 4.80 (t, 1H, J = 5.2 Hz, C-6”-OH), 5.07 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1”), 5.31 (d, 1H, J = 5.5 Hz, C-3”OH), 5.46 (d, 1H, J = 5.2 Hz, C-2”-OH), 7.07 (s, 1H, H-3), 7.26 (dd, 1 H, J = 8.2, 2.4 Hz, H-4’), 7.47-7.55 (m, 2H, H-5’ and H-6), 7.73 (d, 1H, J = 2.0 Hz, H-2’), 7.76 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-8), 7.79-7.87 (m, 2H, H-6’ and H-7), 8.06 (d, 1H, J = 7.9 Hz, H-5).

¹³C NMR (151 MHz, DMSO) δ = 59.76 (C-4”-OCHs), 60.35 (C-6”), 73.48 (C-2”), 75.75 (C-5”), 76.34 (C-3”), 79.19 (C-4”), 100.02 (C-1”), 107.24 (C-3), 113.84 (C-2’), 118.69 (C-6’), 119.79 (C-4’), 120.00 (C-8), 123.36 (C-4a), 124.81 (C-5), 125.63 (C-6), 130.31 (C-5’), 132.52 (C-1’), 134.43 (C-7), 155.72 (C-8a), 157.81 (C-3’), 162.25 (C-2), 177.23 (C-4).

Zastrzeżenia patentowe

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania 3’-O-e-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów stępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCh J2, następnie po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 3’-metoksyflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 1 dobę, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.
2. 2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 g : 1 L.
3. 3. Sposób według zastrzeżenia 2, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
4. 4. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 3 dni.
5. 5. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że mieszaninę poreakcyjną oczyszcza się, używając jako eluentu mieszaniny chloroform i metanol 9:1.