PL240947B1

PL240947B1 - Sposób wytwarzania 5’-O-β-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)- 2’-metoksyflawonu

Info

Publication number: PL240947B1
Application number: PL428746A
Authority: PL
Inventors: Mateusz Łużny; Ewa Kozłowska; Jarosław Popłoński; Marcelina Mazur; Tomasz Tronina; Edyta Kostrzewa-Susłow; Tomasz Janeczko
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2022-07-04
Also published as: PL428746A1

Abstract

Wynalazek dotyczy 5'-O-ß-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-2'-metoksyflawonu i sposób wytwarzania 5'-O-ß-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-2'-metoksyflawonu o wzorze 2. W wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Beauveria bassiana KCh J1.5, następuje O-demetylacja i 4"-O-metyloglikozylacja. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Description

PL 240 947 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 5’-O-e-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-2’-metoksyflawonu.

Metoda, według wynalazku może znaleźć zastosowanie w farmaceutycznym do wytwarzania składników preparatów poprawiających funkcjonowanie przewodu pokarmowego.

Flawony są syntezowane przez rośliny i stanowią składnik naszej diety o wysokim potencjale antyoksydacyjnym oraz zdolności do modulowania wielu układów enzymatycznych związanych z wieloma chorobami (Mughal E.U., Ayaz M., Hussain Z., Hasan A., Sadiq A., Riaz M., Malik A., Hussain S., Choudhary M.l. 2006. Synthesis and antibacterial activity of substituted flavones, 4-thioflavones and 4-iminoflavones. Bioorg. Med. Chem. 14: 4704-4711). Różne naturalne, półsyntetyczne i syntetyczne flawony zostały scharakteryzowane pod kątem szeregu działań terapeutycznych, takich jak działania przeciwzapalne, przeciwestrogenowe, przeciwdrobnoustrojowe (Cushnie T.P.T., Lamb A.J. 2005. Antimicrobial activity of flavonoids. Int. J. Antimicrol. Agents 26: 343-35), przeciwalergiczne, przeciwutleniające, przeciwnowotworowe czy też cytotoksyczne (Havsteen B. 1983. Flavonoids, a class of natural products of high pharmacological potency. Biochem. Pharmacol. 32: 1141-1148; Aregawi M., Williams R., Dye C., Cibulskis R., Otten M. 2008. World Malaria 2008, World Health Organization (WHO): Geneva). 2’,5’-dimetoksyflawon był wyizolowany z kultury tkankowej rośliny leczniczej Primula veris, z której wykonuje się preparaty wykrztuśne (Jaromir Budzianowski, Maria Morozowska, Maria Wesołowska. Lipophilic flavones of Primula veris L. from field cultivation and in vitro cultures. Phytochemistry 66 (2005) 1033-1039). 2’-metoksyflawon jest aktywnym czynnikiem wywołującym apoptozę indukowaną przez TRAIL w ludzkich białaczkowych komórkach MOLT-4 (Benjawan Wudtiwai, Bungorn Sripanidkulchai, Prachya Kongtawelert, Ratana Banjerdpongchai. Methoxyflavone derivatives modulate the effect of TRAIL-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Journal of Hematology & Oncology 2011, 4:52). 2’-metoksy-5’-halogenoflawony wykazują aktywność odwrotnych agonistów kluczowego receptora sygnałowego US28 ludzkiego wirusa cytomegalii (Ana Kralj, Mai-Thao Nguyen, Nuska Tschammer, Nicolette Ocampo, Quinto Gesiotto, Markus R. Heinrich, Otto Phanstiel, Development of Flavonoid-Based Inverse Agonists of the Key Signaling Receptor US28 of Human Cytomegalovirus. J Med Chem. 2013 Jun 27; 56(12): 5019-32).Obecność jednostki cukrowej ma wpływ na stabilność i rozpuszczalność flawonoidów, a często także wpływa na ich biodostępność i bioaktywność (Wang X. Structure, mechanism and engineering of plant natural product glycosyltransferases. FEBS Lett. 2009; 583(20):3303-9; Wang L, Han W, Xie C, Hou J, Fang Q, Gu J, et al. Comparing the acceptor promiscuity of a Rosa hybrid a glucosyltransferase RhGT1 and an engineered microbial glucosyltransferase OleDPSA toward a small flavonoid library. Carbohydr Res. 2013; 368:73-7; Pandey RP, Gurung RB, Parajuli P, Koirala N, Tuoi LT, Sohng JK. Assessing acceptor substrate promiscuity of YjiC-mediated glycosylation toward flavonoids. Carbohydr Res. 2014; 393:26-31).

W literaturze nie ma doniesień dotyczących uzyskania 5’-O-e-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-2’-metoksyflawonu przy udziale systemu enzymatycznego Beauveria bassiana KCh J1.5.

Szczep Beauveria bassiana KCh J1.5 był wcześniej ujawniony w literaturze (Kozłowska E, Urbaniak M, Hoc N, Grzeszczuk J, Dymarska M, Stępień Ł, Pląskowska E, Kostrzewa-Susłow E, Janeczko T. (2018) Cascade biotransformation of dehydroepiandrosterone (DHEA) by Beauveria species. Scientific Reports, 8:13449).

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCh J1.5. Po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 2’,5’-dimetoksyflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 1 dobę. Kolejno produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

W wyniku regioselektywnej O-demetylacji 4-O-metyloglikozylacji otrzymuje się 5’-O-e-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-2’-metoksyflawon, a reakcję prowadzi się w wodnej kulturze szczepu Beauveria bassiana KCh J1.5. Produkt znajduje się we frakcji o niższej polarności.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 g : 1 L.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 3 dni.

Claims

PL 240 947 B1

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Beauveria bassiana KCh J1.5, następuje regiose lektywna O-demetylacja i 4”-O-metyloglukozylacja substratu. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą.

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 5’-O-e-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-2’-metoksyflawonu, z wydajnością izolowaną na poziomie 40% (konwersją według HPLC = 58%), w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

P r z y k ł a d

Do kolby Erlenmajera o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 5 g aminobaku i 15 g glukozy, wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCh J1.5. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 100 mg 2’,5’-dimetoksyflawonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 2 cm³ dimetylosuflotlenku (DMSO). Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 3 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny chloroform i metanol 9:1. Produkt znajduje się we frakcji o niższej polarności.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi:

¹H NMR (600 MHz) (DMSO) δ (ppm): 3.02 (t, 1H, J = 9.4 Hz, H-4”), 3.26 (td, 1H, J = 9.0, 4.0 Hz, H-2”), 3.40-3.45 (m, 2H, H-3”, H-5”), 3.46 (s, 3H, C-4”-OCH3), 3.53 (ddd, 1H, J = 11.6, 6.2, 5.8 Hz, one of H-6”), 3.67 (ddd, 1H, J = 11.4, 4.7, 1.4 Hz, one of H-6”), 3.90 (s, 3H, C-2”-OCH3), 4.77 (t, 1H, J = 5.7 Hz, C-6”-OH), 4.87 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1”), 5.29 (d, 1H, J = 5.4 Hz, C- 3”-OH), 5.43 (d, 1H, J = 4.5 Hz, C-2”-

-OH), 6.99 (s, 1H, H-3), 7.20 (d, 1H, J = 9.2 Hz, H-3’), 7.27 (dd, 1H, J = 9.1,3.1 Hz, H-4’), 7.50 (ddd,

1H, J = 8.0, 7.0, 1.0 Hz, H-6), 7.63 (dd, 1H, J = 3.0, Hz, H-6’), 7.76 (dd, 1H, J = 7.9, 0.6 Hz, H-8), 7.83 (ddd, 1H, J = 8.6, 7.0, 1.6 Hz, H-7), 8.05 (dd, 1H, J = 7.9, 1.6 Hz, H-5).

¹³C NMR (151 MHz, DMSO) δ = 56.39 (C-2’-OCH3), 59.71 (C-4”-QCHs), 60.39 (C-6”), 73.48 (C-2”),

75.73 (C-5”), 76.28 (C-3”), 79.20 (C-4”), 101.11 (C-1”), 111.71 (C-3), 113.68 (C-3’), 116.93 (C-6’),

118.61 (C-8), 120.14 (C- 1’), 120.88 (C-4’), 123.10 (C-4a), 124.71 (C-5), 125.45 (C-6), 134.33 (C-7), 151.17 (C-5’), 152.88 (C-2’), 155.91 (C-8a), 160.05 (C-2), 177.18 (C-4).

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania 5’-O-e-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-2’-metoksyflawonu, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów stępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCh J1.5, następnie po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 2’,5’-dimetoksyflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, przy czym transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 1 dobę, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, produkt znajduje się we frakcji o niższej polarności.
2. Sposób według zastrz. 1., znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 g : 1 L.
3. Sposób według zastrz. 1., znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
4. Sposób według zastrzeżenia 1., znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 3 dni.