PL239868B1

PL239868B1 - Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL5 i jego zastosowanie

Info

Publication number: PL239868B1
Application number: PL432920A
Authority: PL
Inventors: Piotr Heczko; Magdalena Strus
Original assignee: Emergopharm Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Spolka Komandytowa
Priority date: 2020-02-17
Filing date: 2020-02-17
Publication date: 2022-01-17
Also published as: PL432920A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus plantarum oznaczony symbolem PL5, zdeponowany zgodnie z traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego, w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu pod numerem depozytowym B/00110 charakteryzujący się wysoką zdolnością do wytwarzania katalazy, enzymu rozkładającego nadtlenek wodoru. Zgłoszenie obejmuje także zastosowanie nowego szczepu Lactobacillus plantarum PL5 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00110 do wytwarzania środka hamującego i wygaszającego stany zapalne w drogach rodnych i w przewodzie pokarmowym.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus plantarum PL5 i jego zastosowanie w leczeniu zakażeń bakteryjnych i grzybiczych.

Patogenne grzyby i chorobotwórcze bakterie są częstą przyczyną poważnych stanów zapalnych przewodu pokarmowego i dróg rodnych człowieka. Z drugiej strony, ludzki przewód pokarmowy i drogi rodne zasiedlone są przez bakterie z rodzaju Lactobacillus spp., które znane są ze swoich właściwości antagonistycznych wobec chorobotwórczych bakterii i grzybów, dzięki pozakomórkowej produkcji kwasów takich jak: kwas mlekowy, octowy, piroglutaminowy, cyklicznych dipeplydów, bakleriocyn i nadtlenku wodoru. Niektóre szczepy takich bakterii są wykorzystywane w medycynie jako tzw. bakterie probiotyczne. Z drugiej strony, nadtlenek wodoru stanowi bardzo silną i czynną biologicznie substancję, która reaguje z lipidami, białkami, kwasami nukleinowymi oraz innymi czynnikami powodując oksydacyjne uszkodzenie komórek i stan zapalny. Duże ilości nadtlenku wodoru na nabłonku, które mogą zapoczątkowywać i podtrzymywać stany zapalne pochodzą albo z pobudzonych komórek układu immunologicznego, albo z niektórych gatunków bakterii z rodzaju Lactobacillus spp. W pewnych okolicznościach produkcja nadtlenku wodoru przez bakterie z rodzaju Lactobacillus spp. może być tak wysoka, że jest równa ilościom produkowanym przez pobudzone komórki układu immunologicznego w toku toczącego się miejscowego stanu zapalnego.

Okazuje się, że niektóre szczepy bakterii kwasu mlekowego wytworzyły mechanizm ochronny przed nadtlenkiem wodoru oparty na syntezie heksamerycznej lub tetramerycznej katalazy. Mechanizm ten może zostać wykorzystany jako sposób wygaszania stanów zapalnych będących wynikiem znacznej nadwyżki reaktywnych form tlenu, a w szczególności nadtlenku wodoru, przez zastosowanie takich szczególnych szczepów jako bakterii probiotycznych.

Ponadto niektóre szczepy bakterii kwasu mlekowego posiadają silne właściwości anlagonislyczne wobec patogennych grzybów drożdżopodobnych powodujących grzybice pochwy i sromu, a także skóry i przewodu pokarmowego. Głównym czynnikiem patogennych takich grzybic jest gatunek Candida albicans.

Najczęstsze stany zapalne pochwy, takie jak bakteryjna waginoza i bakteryjne zapalenie pochwy są powodowane przez tlenowe lub beztlenowe bakterie nadmiernie namnażające się na nabłonku pochwy: Gardnerella vaginalis i inne beztlenowce oraz Streptococcus agalactiae i Escherichia coli. Za pomocą szczególnych szczepów bakterii probiotycznych można uzyskać kontrolę nad nadmiernym przerostem takich bakterii.

Dlatego poszukując nowych alternatywnych sposobów leczenia rozważa się możliwość stosowania preparatów, zawierających szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus spp., wpływających na wygaszanie stanów zapalnych wywołanych przez nadmierny wzrost chorobotwórczych bakterii oraz grzybów szczególnie z rodzaju Candida spp., jak i przez nadprodukcję nadtlenku wodoru przez niektóre bakterie kwasu mlekowego.

Znane jest z opisu patentowego PL203824 zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum zapewniającego zwiększoną ilość kwasu propionowego lub kwasu octowego w okrężnicy do wytwarzania Ieku zmniejszającego jeden lub większą ilość czynników ryzyka związanego z zespołem metabolicznym. Szczep ujawniony w wynalazku to Lactobacillus plantarum 299v, który wykazuje zdolność do przylegania do błony śluzowej jelit.

Znana jest z opisu patentowego USRE 44400 kompozycja zawierająca jeden lub więcej szczepów Lactobacillus plantarum wytwarzających tanazę, enzym degradujący taninę, w połączeniu z samą taniną i farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Szczepy wchodzące, w skład kompozycji są to nowe szczepy Lactobacillus plantarum wyizolowane z błony śluzowej okrężnicy człowieka. Kompozycja wykazuje właściwości przeciwzapalne dzięki działaniu produktów rozkładu taniny. Kompozycja przeznaczona jest do wytwarzania Ieku do leczenia chorób układu pokarmowego i układu naczyniowo-sercowego.

Znany jest z opisu patentowego US20120200943 szczep Lactobacillus plantarum CMU995, który posiada doskonalą zdolność do przylegania do komórek przewodu pokarmowego i dróg oddechowych. Ta właściwość szczepu Lactobacillus plantarum CMU995 zgodnie z wynalazkiem, powoduje hamowanie przylegania patogenów do nabłonka przewodu pokarmowego i moczowego.

Znany jest z opisu patentowego EP 3405263 szczep Lactobacillus plantarum GOS42 DSM 3231 i jego kompozycje przeznaczone do leczenia stanów zapalnych w szczególności jamy ustnej. Opisany szczep posiada zdolność do zmniejszania lub hamowania uwalniania czynników zapalnych takich jak

PL 239 868 B1 interleukina IL-1, IL-6, IL-8, czynniki martwicy nowotworów TNF. Wynalazek zilustrowany jest przykładem przedstawiającym stymulację ludzkich monocytów probiotykami.

Dotychczas znane szczepy Lactobacillus plantarum za względu na poznane, swoiste właściwości stosowane były w biegunkach infekcyjnych i stanach zapalnych przewodu pokarmowego.

Celem wynalazku było wyselekcjonowanie z kolekcji szczepów bakterii z rodzaju Lactobacillus spp. nowego szczepu, który oprócz cech charakterystycznych dla tego gatunku i właściwości probiotycznych posiadałby, zdolność do wygaszania stanów zapalnych w drogach rodnych i w przewodzie pokarmowym.

Istotą wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus plantarum oznaczony symbolem PL5, który został zdeponowany, zgodnie z traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego, w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu (53-114 Wrocław, ul. Rudolfa Weigla 12). Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL5 został zdeponowany w dniu 06.07.2016 r. i otrzymał numer B/00110. Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL5 posiada wysoką zdolność do wytwarzania katalazy, enzymu rozkładającego nadtlenek wodoru.

Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL5 posiada zdolność hamowania wzrostu grzybów drożdżopodobnych powodujących zakażenia dróg rodnych i przewodu pokarmowego.

Nowy szczep Lactobacillus plantarum posiada zdolność hamowania rozwoju patogennych bakterii powodujących stany zapalne pochwy.

Nowy szczep Lactobacillus plantarum posiada w pełni poznaną sekwencję genomową odróżniająca go od innych szczepów bakterii.

Wynalazek obejmuje również zastosowanie nowego szczepu Lactobacillus plantarum PL5 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00110 w produkcie do leczenia stanów zapalnych w drogach rodnych i w przewodzie pokarmowym.

Niniejszy wynalazek przedstawiono na rysunku, na którym:

Fig. 1 przedstawia wynik testu API 50 CH dla szczepu Lactobacillus plantarum PL5.

Fig. 2 przedstawia zdjęcie produktów reakcji PCR w kierunku Lactobacillus plantarum; ścieżki: 1 (szczep Lactobacillus plantarum PL5); 2 - kontrola negatywna; 3 - kontrola pozytywna (szczep Lactobacillus plantarum ATCC 8014); M - marker wielkości.

Fig. 3 przedstawia strefy zahamowania wzrostu szczepu Lactobacillus plantarum PL5 wokół krążków z antybiotykami.

Fig. 4 przedstawia oporność szczepu Lactobacillus plantarum PL5 na sole żółci w stężeniach: 1, 2, 5, 10, 20 g/l.

Fig. 5 przedstawia adherencję szczepu Lactobacillus plantarum PL5 do ludzkiej linii tkankowej A431.

Fig. 6 przedstawia test obrazujący produkcję nadtlenku wodoru przez szczep Lactobacillus plantarum PL5.

Fig. 7 przedstawia antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL5 wobec Candida albicans ATCC 10231 z wykorzystaniem metody półilościowej.

Fig. 8 przedstawia antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL5 wobec wybranych gatunków grzybów drożdżopodobnych z wykorzystaniem metody ilościowej.

Fig. 9 Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL5 wobec wybranych bakterii wskaźnikowych, przy zastosowaniu metody ilościowej. „**” całkowita redukcja liczebności bakterii.

Wynalazek ilustrują wyniki badan opisujące identyfikację i charakterystykę właściwości szczepu Lactobacillius plantarum PL5.

I. Fenotypowa identyfikacja szczepu Lactobacillus plantarum FL5 z wykorzystaniem zestawu API®50 CH firmy bioMerieux.

Identyfikację fenotypową przeprowadzono za pomocą zestawu API 50 CH zgodnie z zaleceniami producenta. Jest to wystandaryzowany zestaw zawierający 50 testów biochemicznych do badania sposobu metabolizmu węglowodanów przez drobnoustroje. API 50 CH firmy bioMerieux wykorzystuje się do identyfikacji bakterii z rodzaju Lactobacillus spp. i rodzajów spokrewnionych w połączeniu z API 50 CUL Medium (bioMerieux; USA).

Wynik testu API 50 CH dla badanego szczepu z rodzaju Lactobacillus spp. przedstawia Tab. 1 i Fig. 1.

PL 239 868 Β1

Tabela 1

Wynik testu API 50 CH dla szczepu Lactobacillus plantarum PL5.

Probówka	TEST	Wynik Szczep PL5
0	KONTROLA	-
1	Glicerol	-
2	Erytrotol	-
3	D-arabinoza	-
4	L-arabinoza	-
5	D-ryboza	+
6	D-ksyloza	-
7	L-ksyloza	-
8	D-adonilol	-
9	Metylo-pD-ksylopiranozyd	-
10	D-galaktoza	+
II	D-glukoza	+
12	D-fruktoza
13	D-mannoza	+
14	L-sorboza	-
15	L-ramnoza	-
16	Dulcytol	-
17	Inozytol	-
18	D-mannitol	+
19	D-sorbitol	+
20	Mclylo-aD-mannopiranozyd	-
21	Metylo-aD-glukopiranozyd	•

PL 239 868 Β1

22	N-acctylo-glukozamina	+
23	Amigdalina	+
24	Arbutyna	+
25	Eskulina Cytrynian żelaza	+
26	Salicyna	+
27	D-celobioza	+
28	D-maltoza	+
29	D-laktoza (wolowa)	+
30	D-melibioza	+
31	D-sacharoza	+
32	D-lrchaloza	+
33	Inulina
34	D-mcIezytoza	-
35	D-rafinoza	*
36	Skrobia	-
37	Glikogcn	-
38	Ksylilol	-
39	Gencjobioza
40	D-luranoza
41	D-liksoza	-
42	D-(agaloza	-
43	D-fukoza	-
44	L-fukoza	-
45	D-arabitol	-
46	L-arabitol	-
47	Glukonian potasu	-
48	2-kcioglukonian potasu	-
49	5-kcioglukonian potasu	•

Na podstawie otrzymanego profilu biochemicznego program apiWeb zidentyfikował szczep PL5 jako Lactobacillus plantarum.

PL 239 868 Β1

II. Identyfikacja szczepu Lactobacillus plantarum PL5 z wykorzystaniem metody PCR (ang. Polymerase Chain Reaction).

11.1. Izolacja genomowego DNA bakterii:

Do izolacji genomowego DNA zastosowano zestaw DNA GeneMATRIX Basic DNA Purification Kit (EURx) wykorzystujący zdolność wiązania się DNA do złóż krzemionkowych w wysokich stężeniach soli chaotropowych. Procedura izolacji DNA przebiegała w następujący sposób:

1. 24-godzinną hodowlę komórek bakteryjnych prowadzoną w płynnym podłożu MRS (Oxoid) odwirowywano w objętości 1 ml (2 min, 12 000 rpm).

2. Supernatant usuwano, a osad dokładnie zawieszano w 250 μΙ buforu do zawieszania Celi R (w zestawie) z dodatkiem 200 μΙ niebieskiego buforu lizującego Lysis Blue (w zestawie), aż do uzyskania jednolitej, niebieskiej zawiesiny.

3. Do zawiesiny komórek dodawano 350 μΙ buforu neutralizującego Neutral B (w zestawie). Dokładnie i powoli mieszano zawartość probówek przez kilkukrotne odwracanie, aż do całkowitego zaniku niebieskiej barwy zawiesiny.

4. Po zakończeniu lizy mieszaninę odwirowywano (7 min, 12 000 rpm), a przesącz nakładano na minikolumnę ze specjalnym złożem krzemionkowym i ponownie wirowano (1 min, 12 000 rpm).

5. Złoże dwukrotnie przepłukiwano: najpierw 500 μΙ buforu płuczącego Wash UX1, a następnie 650 μΙ buforu płuczącego Wash UX2 (w zestawie).

6. Oczyszczone DNA eluowano ze złoża za pomocą 50 μΙ buforu Elution (w zestawie), ogrzanego do temperatury 80°C.

7. Wyizolowane DNA przechowywano w probówce typu Eppendorf w temperaturze 4°C do czasu dalszych analiz.

II.2. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR):

W Tabeli 2 przedstawiono sekwencje użytych starterów oraz wielkość poszczególnych amplikonów.

Tabela 2

Sekwencje starterów i wielkość amplikonów poszukiwanego, gatunku bakterii.

Starter	Sekwencja 5’—»3’	Gatunek	Wielkość amplikonu
Lfpr Planll	GCC GCC ΓΛΑ GGT GGG ACA GAT TTA CCT AAC GGT ΑΑΛ TGC GA	L. plantarum	283 pz

Program amplifikacji dla gatunku Lactobacillus plantarum prowadzony był w termocyklerze S 1000 (BioRad) i przedstawiał się następująco:

1. 92°C - 2 min

2. 95°C - 30 sek ί

3. 55°C - 30 sek l _30χ

4. 72°C - 30 sek J

5. 72°C - 1 min

Amplifikację prowadzono zgodnie z metodą Walter i wsp. (Walter J, Taonock GW, Tilsala-Timisjarvi A, Rodtong S. Loach DM, Munro K, Alatossava T. Detection and Identification of gastrointestinal Lactobacillus species by using denaturing gradient gel electrophoresis and species-specific PCR primers., Appl Environ Microbiol. 2000; 66(1):297-303). Z publikacji tej pochodzą również użyte sekwencje starterów.

Po skończonej reakcji PCR produkty amplifikacji były analizowane w 1,5% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. Próbki nakładano do kieszonek żelu w objętości 7 μΙ z dodatkiem 3 μΙ buforu obciążającego. Elektroforezę prowadzono w buforze TBE o stężeniu 0,5x, przez 1,5 godziny, pod napięciem 80 V, w aparacie do elektroforezy (BioRad).

PL 239 868 B1

Obraz żelu oglądano przy użyciu systemu GelDoc XR + (BioRad), w skład którego wchodził transiluminator UV, kamera zbierająca obraz oraz program komputerowy do dokumentacji i analizy obrazu Image Lab (BioRad).

Obecność produktu PCR o odpowiedniej ilości par zasad uznawany była za pozytywny wynik reakcji. Na każdym żelu umieszczano ponadto kontrolę negatywną, którą stanowiła woda destylowana dodawana do buforu reakcyjnego zamiast genomowego DNA bakterii oraz kontrolę pozytywną, jaką był produkt amplifikacji otrzymany z użyciem DNA szczepu wzorcowego oraz marker wielkości prążków (GeneRuler 100bp, Axygen).

Na podstawie testu PCR szczep Lactobacillus plantarum PL5 zidentyfikowano jako Lactobacillus plantarum.

Fig 2. przedstawia zdjęcie produktów reakcji PCR w kierunku Lactobacillus plantarum; ścieżki: 1 (szczep PL5); 2 - kontrola negatywna; 3 - kontrola pozytywna (szczep Lactobacillus plantarum ATCC 8014); M - marker wielkości.

III. Oznaczenie wrażliwości na antybiotyki szczepu Lactobacillus plantarum PL

W celu zbadania lekoopomości szczepu L. plantarum PL5 metodą dyfuzyjno-krążkową, zawiesinę hodowli (OD = 0,5 w skali McFarlanda) rozprowadzono na podłożu agarowym MRS (Oxoid) na płytce Petriego. Następnie podłoże z naniesioną zawiesiną pozostawiono w temperaturze pokojowej na 15 minut w celu jej wysuszenia. Po tym czasie na płytkę naniesiono za pomocą jałowej pęsety krążki nasączone odpowiednimi antybiotykami. Inkubację prowadzono w warunkach beztlenowych, przez 24 h w temp. 37°C. Po inkubacji zmierzono strefy zahamowanego wzrostu szczepu bakteryjnego wokół krążka z antybiotykiem (w mm). Odczytu lekoopomości różnicującego szczep L. plantarum PL5 na wrażliwy i oporny, dokonano zgodnie z EUCAST. W doświadczeniu wykorzystano następujące antybiotyki: penicylina, ciprofloksacyna, cefaklor, doksacyklina, oksacylina, kotrymoksazol, erytromycyna, ampicylina, klindamycyna, wankomycyna, gentamycyna, metronidazol (Oxoid).

PL 239 868 Β1

Tabela 3

Wielkość stref zahamowania wzrostu otrzymanych dla badanego szczepu L. plantarum PL5 oraz szczepu wzorcowego L. plantarum ATCC 8014.

Antybiotyk Stężenie	L. plantarum PL5	L. plantarum ATCC 8014
Penicylina (P) ¹ PB	14 mm	13 mm
Ciprofloksacyna (CIP) 5 pg	12 mm	11 mm
Cefaklor (CEC) 30 Pg	32 mm	32 mm
Doksycyklina (DO) 30 pg	27 mm	26 mm
Oksacylina (OX) । Pg	12 mm	11 mm
Kotrymoksazol (SXT) 25 pg	16 mm	25 mm
Erytromycyna (E) *5 pg	29 mm	26 mm
Ampicylina (AMP) 2 Pg	32 mm	32 mm
Klindamycyna (DA) 2 pg	18 mm	18 mm
Gentamycyna (CN) 30 pg	17 mm	18 mm
Wankomycyna (VA) 30 pg	6 mm	6 mm
Mctronidazol (MTZ) 5 pg	6 mm	6 mm

Strefy zahamowania wzrostu szczepu Lactobacillus plantarum PL5 wokół krążków z antybiotykami przedstawiono na Fig. 3.

Zakres wrażliwości/oporności badanego szczepu Lactobacillus plantarum PL5 jest zgodny z opisem gatunku.

PL 239 868 Β1

IV. Oznaczenie oporności szczepu Lactobacillus plantarum PL5 na sztuczny sok żołądkowy.

Celem badania było oznaczenie przeżywalności w sztucznym soku żołądkowym nowego szczepu Lactobacillus plantarum PL5. W celu oznaczenia stopnia oporności bakterii z rodzaju Lactobacillus spp. na pH soku żołądkowego posłużono się metodą Clarka, którą zmodyfikowano w ten sposób, iż zamiast stężonego kwasu solnego zastosowano sztuczny sok żołądkowy o pH równym 1,2 według następującego przepisu: 2.0 g NaCI, 3.2 g pepsyny w 7 ml 36% HCI o pH 1.2 rozpuszczono w 1000 ml wody destylowanej. Jałowy (po przesączeniu) sztuczny sok żołądkowy rozlewano po 1 ml do jałowych probówek, a następnie do każdej, z nich kolejno dodawano po 100 μΙ świeżej (24 godzinnej) hodowli szczepu Lactobacillus plantarum PL5 o znanej gęstości. Mieszaninę inkubowano przez 20 min w 37°C w warunkach ściśle beztlenowych. Po upływie wyznaczonego czasu mieszaninę starannie mieszano i wykonywano posiew dziesiętny w celu określenia otrzymanej gęstości końcowej.

Tabela 4

Przeżywalność szczepu Lactobacillus plantarum PL5 w sztucznym soku żołądkowym.

	Gęstość bakterii probiolycznych podana w j.t.k./ml
Nazwa szczepu	Czas wyjściowy	Po 20 min. inkubacji w sztucznym soku żołądkowym o pH 2.5
Laclohdcil/us plantarum PL5	1,3 x 10*	8,0x10⁷

Szczep Lactobacillus plantarum PL5 ma bardzo dobrą przeżywalność: spadek populacji po inkubacji jest w granicach błędu pomiaru.

V. Oznaczenie oporności szczepu Lactobacillus plantarum PL5 na sole żółci.

Celem badania było oznaczenie oporności na sole żółci nowego szczepu Lactobacillus plantarum PL5. Oporność na sole żółci wyznaczono w oparciu o metodę Dashkevicz’a i Feighner’a (Dashkevicz M.P., Feighner S.D. 1989. Development of a differential medium for bite sail hydrolase-active Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 55(1), 1-16). Metoda ta polegała na dodaniu do agaru MRS lub BL barwnika wskaźnikowego - purpury bromokrezolowej (POCH) w ilości 0,17 g/l oraz soli żółci (OXGAL Difco), w pięciu kolejnych stężeniach: 1 g/l, 2 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l. Na tak przygotowane stałe podłoża posiewano metodą redukcyjną po 100 μΙ hodowli szczepu L. plantarum PL5, który następnie inkubowano w standardowych warunkach beztlenowych przez 48 godz. Po zakończonej inkubacji kolonie szczepów opornych na dane stężenie soli żółci nabierały koloru jasno żółtego, jak również podłoże wzrostowe zmieniało swoje zabawienie z fioletowego na żółte. Intensywność wzrostu badanego szczepu i zabarwienia podłoża na kolor żółty oceniono w skali półilościowej od - do +++.

PL 239 868 Β1

Tabela 5

Oporność szczepu Lactobacillus plantarum PL5 na sole żółci w stężeniach: 1,2,5,10, 20 g/l.

Stężenie soli żółci	Lpkmtarun PL5
I g/l	ł ł t
2 g/l	+++
5 g/l	+++
lo g/l	H—Η
20 g/l	4—ł·

Oporność szczepu PL 5 na sole żółci jest wystarczająca do przejścia dwunastnicy.

Oporność szczepu Lactobacillus plantarum PL5 na sole żółci w stężeniach: 1, 2, 5. 10, 20 g/l, przedstawiono na Fig. 4.

VI. Oznaczenie właściwości adherencyjnych szczepu Lactobacillus plantarum PL5 do ludzkiej linii tkankowej A431

Właściwości adherencyjne szczepu L. plantarum PL5 zostały przeprowadzone w odniesieniu do ludzkiej linii komórkowej nabłonka pochwy - A431. W celu zbadania adherencji badanego szczepu, hodowlę ludzkiej linii komórkowej nabłonka pochwy A431 prowadzono w atmosferze zawierającej 10% CO2 oraz w temperaturze 37°C, w podłożu hodowlanym DMEM (Gibco) z dodatkiem 10% surowicy wołowej (FBS, Sigma-Aldrich). Płyny hodowlane wymieniano regularnie co 48 godzin. Po osiągnięciu zlewnego wzrostu hodowli jednowarstwowej, komórki przepłukiwano dwukrotnie PBS (IITD, Wrocław) i przeprowadzono badanie adherencji bakterii probiotycznych. Hodowlę tkankową linii A431 prowadzono dalej na powierzchni jałowych szkiełek podstawowych umieszczonych na dnie 24-dołkowych płytek do osiągnięcia na powierzchni szkiełek podstawowych zlewnego wzrostu. Następnie komórki przepłukiwano PBS bez jonów Ca²⁺ i Mg²⁺ (IITD PAN; Wrocław) i dodawano do kolejnych dołków po 600 μΙ odpowiednio przygotowanej próbki. Szczep L. plantarum PL5 hodowano w 10 ml płynnego podłoża MRS (Oxoid) przez 24 godziny w warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C. Po upływie tego czasu, sprawdzano gęstość hodowli za pomocą rozcieńczeń dziesiętnych. Do każdego dołka zawierającego wyhodowaną tkankę dodawano po 100 μΙ płynnej hodowli bakterii probiotycznych i uzupełniano 900 μΙ świeżego podłoża DMEM. Końcowa gęstość populacji badanej bakterii wynosiła w 1 ml około 1 χ 10⁸ j.t.k. Następnie komórki linii tkankowych wraz z badanym szczepem inkubowano w temp. 37°C w atmosferze o zwiększonej wilgotności i przy 10% zawartości CO2 przez okres 1 godziny. Po tym czasie komórki przepłukiwano PBS w celu usunięcia nie przywartych bakterii, a następnie całość utrwalano 3.7% paraformaldehydem w temperaturze 4°C przez okres 3 godzin. Następnie szkiełka płukano PBS i przeprowadzono ich barwienie metodą Grama. Preparat był oceniany w mikroskopie świetlnym pod powiększeniem 1000x. Komórki badanego szczepu L. plantarum PL5, które zaadherowały do linii, tkankowej były zliczane w 5 polach widzenia preparatu, a następnie wyliczano wynik średni, któremu przyporządkowano odpowiedni, stopień adherencji zgodnie z zakresem podanym poniżej:

+++ bardzo wysoki stopień adherencji (powyżej 80 komórek bakteryjnych w polu widzenia) ++ wysoki stopień adherencji (od 60 do 80 komórek bakteryjnych w polu widzenia)

PL 239 868 Β1 + średni stopień adherencji (od 40 do 60 komórek bakteryjnych w polu widzenia) słaby stopień adherencji (poniżej 40 komórek bakteryjnych w polu widzenia).

Tabela 6

Wyniki adherencji szczepu Lactobacillus plantarum PL5 do ludzkiej linii tkankowej A431.

Nazwa szczepu	Stopień adherencji	P ' . - - -------------- — Średnia liczba komórek bakteryjnych w polu widzenia
L.plantarum PL5	+4-	60-80

Adherencja szczepu Lactobacillus plantarum PL5 do nabłonka pochwy jest bardzo efektywna.

Adherencję szczepu Lactobacillus plantarum PL5 do ludzkiej linii tkankowej A431 przedstawiono na Fig.5.

VII. Badanie właściwości antyoksydacyjnych szczepu Lactobacillus plantarum PL5

VII. 1. Pomiar produkcji nadtlenku wodoru.

W celu dokonania pomiaru produkcji nadtlenku wodoru przez badany szczep wykorzystano test paskowy firmy Merck, który zmienia intensywność zabarwienia w zależności od ilości nadtlenku wodoru uwalnianego do płynnych hodowli lej bakterii (od 0 do 100 mg/ml). Barwę porównywano z odpowiednią skalą kolorymetryczną pozwalającą jednocześnie na wyliczenie przybliżonej wartości wyprodukowanego nadtlenku wodoru (wynik podano w mg/L). Zdolność produkcji nadtlenku wodoru w płynnym podłożu wzrostowym przez szczep Lactobacillus plantarum PL5 badano przez zawieszenie bakterii w 2 ml płynnego podłoża MRS Broth (Oxoid). Gęstość wyjściowa bakterii wyniosła średnio 1x10⁶ j.t.k./ml. Następnie hodowlę inkubowano w warunkach tlenowych w 37°C, intensywnie wytrząsając na wytrząsarce w celu zwiększenia natlenienia komórek bakteryjnych. Pomiar wykonywano dwukrotnie, tj. po upływie 4 i 24 godzin od rozpoczęcia badania.

Gęstość populacji badanych bakterii po 4 godzinach utrzymywała się na poziomie średnio 1 x 10⁶ j.t.k./ml. zaś po 24 godzinach wzrosła do poziomu średnio 1 χ 10⁷ j.t.k./ml. Kontrolnie produkcję H2O2 mierzono również w tym samym podłożu bez bakterii. Wyniki zestawiono w Tabeli nr 7.

Tabela 7

Produkcja nadtlenku wodoru (mg/L) przez szczep Lactobacillus plantarum PL5.

Szczep	4 godziny	24 godziny
Lactobacillus plantarum PL5	0 mg/L	0 mg/L

Szczep Lactobacillus plantarum PL5 nic produkuje nadtlenku wodoru.

Fig.6. przedstawia test obrazujący produkcję nadtlenku wodoru przez szczep Lactobacillus plantarum PL5.

VII. 2. Pomiar kinetyki rozkładu nadtlenku wodoru przez szczep Lactobacillus plantarum PL5 w oparciu o test paskowy firmy Merck.

Do probówek zawierających 2 ml podłoża MRS Broth (Oxoid) dodawano po jednym oczku ezy kalibrowanej (1 μΙ) hodowli badanego szczepu Lactobacillus plantarum PL5 (pobranego z sektora świeżej hodowli na agarze MRS). Następnie probówkę inkubowano przez 24 godziny w temp. 37°C w warunkach tlenowych. Po upływie tego czasu hodowle mieszano z czystym chemicznie nadtlenkiem wodoru, aby jego końcowe stężenie wyniosło 30 mg/L. Jako kontroli używano nieposianego podłoża MRS, do którego również dodawano po 30 mg/L nadtlenku wodoru. Pomiar kinetyki rozkładu nadtlenku wodoru przeprowadzono czterokrotnie w odpowiednich odstępach czaso

PL 239 868 Β1 wych. W celu sprawdzenia liczby mikroorganizmów uzyskanych w hodowli wykonywano posiewy kontrolne na płytki z podłożem MRS (Oxoid). Liczba komórek; bakteryjnych w zawiesinie wyjściowej kształtowała się na poziomie 1 χ 10⁸ j.t.k./ml.

Wyniki pomiaru kinetyki rozkładu H2O2 w oparciu o test paskowy zestawiono w Tabeli nr 8.

Tabela 8

Wyniki pomiarów kinetyki rozkładu nadtlenku wodoru przez szczep Lactobacillus plantarum PL5 w oparciu o metodę paskową.

Badany szczep	0 min.	30 min.	60 min.	90 min.	120 min.	150 min.	180 min.	210 min.	24 godz.
Ilość nadtlenku wodoru (mg/L)
Lactobacillus plantarum PL5	100	10	1	0	0	0	0	0	0

Szczep Lactobacillus plantarum PL5 rozkłada całkowicie 30 mg/L nadtlenku wodoru w ciągu 90 min.

Jak wykazano, szczep bakterii Lactobacillus plantarum PL5 wykazuje aktywny rozkład nadtlenku wodoru. Efekt rozkładu jest związany z produkcją nie tylko katalazy, ale także pseudokatalazy tj. białka które zamiast hemu zawiera jon manganu i wykazuje znaczną aktywność wobec substratu w różnych warunkach środowiskowych. Aktywny rozkład nadtlenku wodoru przez katalazę wyprodukowaną przez L. plantarum PL5 prowadzi do wygaszenia reakcji Fentona, która przebiega w następujący sposób: Fe²⁺ + H2O2 —> ΌΗ + OH' + Fe³⁺

VIII. Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL5 wobec grzybiczych czynników etiologicznych,powodujących zakażenia pochwy i sromu.

VIII. 1. Zmodyfikowana metoda pólilościowa wg Fitzsimmons i Berry.

W badaniu posłużono się zmodyfikowaną metodą półilościową według Fitzsimmons i Berry (Struś M. Kucharska A., Kukla G, Brzychczy-Włoch M., Maresz K., Heczko P.B., The in vitro activity ofvaginal Lactobacillus with probiotic properties against Candida. Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 2005; 13:69-75).

Do badania wybrano szczepy wzorcowe pochodzenia ludzkiego z kolekcji ATCC:

• Candida albicans ATCC 10231 • Candida glabrata ATCC 15126 • Candida krusei ATCC 34135 • Candida tropicalis ATCC 750 • Candida kefyr ATCC 4135.

Metoda polegała na zastosowaniu podłoży dwuwarstwowych. Pierwszą warstwę stanowiło podłoże dla wzrostu bakterii z rodzaju Lactobacillus spp. oparte na związkach chemicznych o składzie:

• Ekstrakt drożdżowy (Argenta) • Bezwodny octan sodu (Argenta) • Cytrynian sodu (Argenta) • Siarczan magnezu (Argenta) • Chlorek manganu (Argenta) • Siarczan amonu (Argenta) • Glukoza (Argenta)

Na podłoże to posiewano w formie paska o szerokości 2 cm badany szczep Lactobacillus plantarum PL5. Po posiewie płytki inkubowano w temp. 37°C, w warunkach beztlenowych przez 48 godzin, a po upływie tego czasu na wierzch wylewano drugie, lekko przestudzone, płynne podłoże Sabouraud Dextrose (Biocorp) w kierunku wzrostu grzybów wskaźnikowych. Po zastygnięciu, na podłoże wysiewano grzyba z rodzaju Candida spp. o gęstości 0,5 MacFarlanda. Następ

PL 239 868 Β1 nie płytki umieszczano na 4 godziny w lodówce (temperatura 4°C), a po upływie tego czasu dalszą inkubację prowadzono już w warunkach tlenowych, w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Uzyskane wyniki oceniono według następującego wzoru:

Brak działania antagonislycznego Lactobacillus wobec szczepu Candida (nie zaobserwowano żadnej strefy zahamowania wzrostu Candida wzdłuż paska z wymazanym szczepem probiotycznym), + Częściowe działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec szczepu Candida (obserwuje się lekkie zahamowania wzrostu Candida jedynie nad paskiem z wymazanym szczepem probiotycznym), ++ Wyraźne działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec szczepu Candida (obserwuje się wyraźne zahamowania wzrostu Candida nad paskiem z wymazanym szczepem probiotycznym czasami wyraźniej w jego górnej i dolnej części), +++ Bardzo silne działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec szczepu Candida (obserwuje się wyraźne zahamowania wzrostu Candida nad paskiem i poza jego powierzchnię wzdłuż całej linii posiewu szczepu probiotycznego).

Tabela 9

Antagonistyczne działanie szczepu bakterii Lactobacillus plantarum PL5 wobec grzybów z rodzaju Candida spp. przy zastosowaniu metody półilościowej.

Szczep	Candida	Candida	Candida	Candida	Candida
bakterii	albicans	glabrata	krusei	tropicalis	kefyr
z rodzaju	ATCC	ATCC	ATCC	ATCC 750	ATCC
Lactobacillus	I023I	15126	34135		4135
PL5	ł ł ΐ	-	+/-		4+4

Szczep Lactobacillus plantarum PL5 wykazuje silne działanie antagonistyczne wobec gatunków C. albicans, C. tropicalis. C. kefur, zaś słabe wobec C. krusei i żądne wobec C. glabrata.

Fig. 7 przedstawia antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL5 wobec Candida albicans MCC 10231 z wykorzystaniem metody półilościowej.

VIII.2. Metoda ilościowa.

W metodzie ilościowej szczep Lpbntarum PL5 oraz szczepy z rodzaju Candida spp. hodowano w tej samej probówce zawierającej po 900 mikrolitrów 24-godzinnej hodowli Lactobacillus o średniej gęstości 1 χ 10⁹ j.t.k/ml oraz 100 mikrolitrów 24-godzinnej hodowli grzyba wskaźnikowego o średniej gęstości 1 χ 10⁶ j.t.k/ml. Całość dalej hodowano, a po upływie 8 i 24 godzin od rozpoczęcia badania materiał posiewano ilościowo na stałe podłoże przeznaczone do wzrostu Lactobacillus oraz na stałe podłoże Sabouraud’a przeznaczone do wzrostu chorobotwórczych grzybów wskaźnikowych. Obliczano liczebność obu populacji, a wynik podawano w jednostkach tworzących kolonie w przeliczeniu na 1 ml (j.t.k./ml).

Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL5 wobec wybranych gatunków grzybów drożdżopodobnych z wykorzystaniem metody ilościowej przedstawiono na Fig. 8.

Wynika z niej, że szczep Lactobacillus plantarum PL5 jest w stanie hamować wzrost badanych gatunków grzybów drożdżopodobnych w wymaganym zakresie 2 log w ciągu 24 godzin. Dla gatunku C. albicans hamowanie wzrostu jest bardzo silne.

IX. Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL5 wobec wybranych bakteryjnych czynników etiologicznych, powodujących zakażenia pochwy i sromu.

Do badania wybrano następujące szczepy wskaźnikowe:

• Escherichia coli ATCC 25922 • Streptococcus agalactiae ATCC 13813 • Gardnerella vaginalis ATCC 14018

PL 239 868 Β1

Szczep Lactobacillus plantarum PL5 zawieszano w 10 ml bulionu MRS, a następnie hodowano, przez 24 godziny w warunkach beztlenowych, w temperaturze 37°C. Po upływie tego czasu sprawdzano gęstość hodowli za pomocą metody, rozcieńczeń dziesiętnych, a następnie z hodowli bakterii pobierano po 0,9 ml i dodawano do nich po 0,1 ml próbek zawierających 24-godzinne, świeże hodowle szczepów bakterii wskaźnikowych. Całość inkubowano w warunkach tlenowych, jedynie w przypadku antagonistycznego działania szczepu Lactobacillus plantarum PL5 na beztlenowy szczep Gardnerella vaginalis ATCC 14018, mieszaninę umieszczano w warunkach ściśle beztlenowych. Po upływie 8 i 24 godzin z każdej z mieszanych hodowli wykonywano rozcieńczenia dziesiętne, wysiewając kolejno po 0,1 ml mieszaniny równolegle na odpowiednie dwa podłoża, zarówno w kierunku bakterii Lactobacillus, jak i bakterii wskaźnikowych. Liczbę kolonii zliczano, a wyniki podano w jednostkach tworzących kolonie w przeliczeniu na 1 ml (j.t.k./ml).

Tabela 10

Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL5 wobec wybranych bakterii wskaźnikowych, przy zastosowaniu metody ilościowej.

Szczep	0 godz. j.l.k7ml	8 godz, j.t.k./ml	24 godz. j.t.k./ml
Escherichia coli ATCC 25922	7,0 x 10⁷	0	0
Stmpiocnccus upalać! iae ATCC 13813	2,0 x 10⁷	0	0
Gardnerdla vapinalis ATCC 14018	6,0 x 10⁶	0	0
Kontrola hodowli Esdwrichia coli ATCC 25922	7,0 x 10⁷	1,0 x 10*	1,0 x IO^S
Kontrola hodowli Strep/ococcus agałactiae ATCC 13813	2,0 x 10⁷	3.0 x 10⁶	3.0 x 10^s
Kontrola hodowli Gardnendla να^ηαΐίχ ATCC 14018	6.0 x I0⁶	1,0 x 10	1,0 x 10

Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL5 wobec wybranych bakterii wskaźnikowych, przy zastosowaniu metody ilościowej przedstawiono na Fig. 9, („**” całkowita redukcja liczebności bakterii).

Szczep Lactobacillus plantarum PL5 wykazuje wybitne działanie wobec najważniejszych czynników patogennych powodujących stany zapalne pochwy.

PL 239 868 Β1

X. Sekwencjonowanie NGS (next generation sequencing) genomu szczepu bakterii Lactobacillus plantarum PL5.

Z uwagi na duże podobieństwo pomiędzy szczepami bakterii probiotycznych pochodzenia ludzkiego metodą, która pozwala na ich zróżnicowanie jest sekwencjonowanie pełnego genomu metodą NGS (next generation sequencing).

Metoda ta opiera się o równoległe, masowe sekwencjonowanie od kilku tysięcy do kilkuset milionów różnych matryc tzw. bibliotek. Tym samym charakteryzuje ją bardzo wysoka przepustowość oraz analiza ogromnej ilości danych w stosunkowo krótkim czasie.

W celu przeprowadzenia sekwencjonowania NGS genomu szczepu Lactobacillus plantarum PL5 wykonano izolację genomowego DNA z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody opartej na zestawie Genomie Midi ΑΧ (A&A Biotechnology), Stężenie genomowego DNA zostało, zmierzone przed procedurą przygotowania bibliotek metodą fluorymetryczną z użyciem odczynnika PicoGreen (Life Technologies, PI 1496, LOT 1597051). Pomiar wykonano na aparacie Infinite firmy Tecan. W Tabeli 11 zestawiono parametry wyizolowanego DNA.

Tabela 11

Charakterystyka wyizolowanego DNA szczepu Lactobacillus plantarum PL5.

Szczep	Stężenie wyizolowanego DNA	A 260/2(0
Lactobacillus plantarum PL5	377 pg/ml	1.84

Genomowe DNA zostało po fragmentowane metodą sonikacji używając Covaris E210 (Covaris, numer seryjny E210-220), zgodnie z parametrami zalecanymi do przygotowania bibliotek do sekwencjonowania w technologii lllumina. Biblioteki zostały przygotowane z użyciem zestawu NEBNext® DNA Library Prep Master Mix Set for lllumina® (New England Biolabs, E6040L, dala ważności 06/16) zgodnie z zaleceniami producenta.

Sekwencjonowanie wykonano z użyciem sekwenatora MiSeq, w technologii parowanych końców (ang.: paired-end; PE), 2x250 nt, z użyciem kitu v2 llluminy, zgodnie z protokołem „Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq” (15039740 rev. D).

Odczyty przefiltrowano programem Cutadapt w wersji 1.16. Mapowanie do genomu referencyjnego Lactobacillus plantarum strain HFC8 (CP012650.1) oraz generowanie sekwencji konsensusową dla badanej próbki przeprowadzono przy pomocy programu CLCGenomicWorkbench.

W wyniku sekwencjonowania uzyskano pliki danych z odczytami sekwencji DNA - po dwa odczyty na każdy sekwencjonowany fragment. Dane zostały automatycznie rozdzielone na próbki z użyciem oprogramowania MiSeq Reporter (wersja 2.3), dostępnego na aparacie MiSeq. Informacje na temat liczby odczytanych surowych, sekwencji i zasad dla badanego szczepu znajdują się w Tabeli 12. Sekwencję genomową szczepu L. plantarum PL5 prezentuje Załącznik w postaci elektronicznej.

Tabela 12

Liczba odczytanych surowych sekwencji i zasad dla szczepu L. plantarum PL5.

Nazwa szczepu	Odczyty surowe	Odczyty przycięte	Zasady surowe \|mln]	Zasady przycięte \|mln]
Lactobacillus plantarum PL5	2168528	2163966	544.300528	502,852599

PL 239 868 Β1

Za pomocą sekwencjonowania całego genomu szczepu PL5 uzyskano pełny wgląd w strukturę genetyczną potwierdzającą jego funkcjonalność. Ponadto poznanie indywidualnych sekwencji umożliwia pełne zabezpieczenie jego tożsamości do celów patentowych.

Podsumowanie wyników badań.

Przeprowadzone badania wykazały, że szczep Lactobacillus plantarum PL5 posiada specyficzne, indywidualne cechy różniące go od pozostałych szczepów probiotycznych:

• posiada wyjątkową cechę jaką jest zdolność do wytwarzania znacznych ilości antyoksydacyjnego enzymu: katalazy, rozkładającej nadtlenek wodoru. Badania jednoznacznie wykazały, że szczep Lactobacillus plantarum PL5 należy do nielicznych szczepów bakterii probiotycznych posiadającej tą pożądaną dla probiotyków zdolność, która ma kluczowe znaczenie w wygaszaniu stanów zapalnych wynikłych z nadprodukcji nadtlenku wodoru pochodzącego z aktywowanych komórek układu immunologicznego bądź będącego wynikiem produkcji przez inne bakterie z rodzaju Lactobacillus spp. szczególnie w drogach rodnych (zjawisko to obserwowane jest w przypadkach np. zapalenia pochwy związanego z przerostem gatunków Lactobacillus produkujących nadtlenek wodoru określanego jako Lactobacillosis):

L. plantarum PL5

W₂O₂ —------------ //_ZO + • jako jeden z pierwszych szczepów pochodzenia ludzkiego, wyizolowanego w Polsce, posiada w pełni poznaną sekwencję genomową wyznaczoną przy pomocy NGS (next generation sequencing) - w chwili obecnej najnowocześniejszej technologii sekwencjonowania, • został wyizolowany z tylnego sklepienia pochwy zdrowej kobiety w wieku rozrodczym i stąd wykazuje wysoki stopień adherencji do ludzkiej linii tkankowej nabłonka pochwy dzięki czemu może blokować adherencję innych bakterii i grzybów chorobotwórczych, • dodatkowo wykazuje dużą oporność na niskie pH i działanie sztucznego soku żołądkowego. Szczep ten po upływie 20 min redukował swoją populację tylko o 1 log, co może świadczyć o jego doskonałym przystosowaniu do niesprzyjających warunków panujących w ludzkim przewodzie pokarmowym, czy niskiego pH w drogach rodnych, stąd może być z powodzeniem stosowany w preparatach doustnych czy dopochwowych, • wykazuje bardzo silne działanie wobec patogennych grzybów z rodzaju Candida spp. (Calbicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis, C. kefyr). Taki efekt działania szczepu Lactobacillus plantarum PL5 może wskazywać na możliwość zastosowania go do zapobiegania i wspomagania leczenia stanów zapalnych dróg rodnych określanych jako grzybica pochwy i sromu, • wykazuje wysoką skuteczność wobec patogennych bakterii powodujących stany zapalne pochwy (Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Gardnerella vaginalis) i może być wykorzystany jako składnik czynny preparatu probiotycznego do dietetycznego postępowania w zaburzeniach flory układu moczowo-płciowego u kobiet.

Przeprowadzone badania uzasadniają wykonanie preparatu w postaci środka spożywczego lub w postaci żelu/maści do użytku miejscowego.

Claims

1. Nowy szczep Lactobacillus plantarum oznaczony symbolem PL5, zdeponowany zgodnie z traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego, w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu pod numerem depozytowym B/00110 charakteryzujący się wysoką zdolnością do wytwarzania katalazy, enzymu rozkładającego nadtlenek wodoru.

2. Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL5 według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada zdolność hamowania wzrostu grzybów drożdżopodobnych powodujących zakażenia dróg rodnych i przewodu pokarmowego.

PL 239 868 B1 17

3. Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL5 według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada zdolność hamowania rozwoju patogennych bakterii powodujących stany zapalne pochwy.

4. Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL5 według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada w pełni poznaną sekwencję genomową odróżniającą go od innych szczepów bakterii.

5. Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL5 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00110 do zastosowania w produkcie do leczenia stanów zapalnych dróg rodnych i przewodu pokarmowego.