PL240082B1

PL240082B1 - Biologiczna membrana separacyjna

Info

Publication number: PL240082B1
Application number: PL427554A
Authority: PL
Inventors: Julia ROGOWSKA-TYLMAN; Julia Rogowska-Tylman; Giuseppino Fortunato; Bartosz WOŹNIAK; Bartosz Woźniak; Agnieszka CHODARA; Agnieszka Chodara; Witold ŁOJKOWSKI; Witold Łojkowski
Original assignee: Inst Wysokich Cisnien Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2022-02-14
Also published as: EP3870133A1; WO2020085927A1; PL427554A1; EP3870133B1

Description

PL 240 082 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest biologiczna membrana separacyjna służąca w medycynie do separowania tkanek, zwłaszcza w trakcie i po stomatologicznych zabiegach chirurgicznych.

Powszechnie wiadomo, że w stomatologii i chirurgii stomatologicznej często występują uszkodzenia przyzębia, przy leczeniu których niezbędne jest odseparowanie tkanek przy użyciu membrany barierowej. Uszkodzenia te są wywołane chorobami, wiekiem lub urazami, albo mają podłoże genetyczne, i prowadzą do dysfunkcji fizycznej i estetycznej narządu żucia. Jedną z przyczyn uszkodzeń przyzębia są stany zapalne, które powodują zniszczenie tkanek utrzymujących zęby. Wspierająca ząb tkanka zanika i aparat więzadłowy zęba wraz z otaczającą go kością zostają zniszczone. Użycie membrany separacyjnej jest wskazane również przy uszkodzeniach kości szczęki i żuchwy na skutek nieprawidłowego usuwania zębów lub potrzeby wkręcenia implantu tytanowego w kość pacjenta. W takim przypadku po wprowadzeniu implantu obsypuje się ubytek naturalną lub syntetyczną sproszkowaną substancją kostną, osłaniając ją membraną separacyjną i unieruchamiając całość specjalnymi pinami. W ubytek kostny można wprowadzić też materiał kościozastępczy w formie granulek lub porowatych bloczków. Pokrycie ubytku membraną separacyjną zapobiega wrastaniu komórek nabłonka w miejsce mającej się odbudować tkanki kostnej. Po około sześciu miesiącach ubytek kostny się wypełnia, natomiast membrana separacyjna powinna ulegać stopniowemu rozkładowi. Procedura użycia membrany barierowej do separacji tkanki nosi nazwę sterowanej regeneracji tkankowej (ang. Guided Tissue Regeneration, GTR) lub sterowanej regeneracji kostnej (ang. Guided Bone Regeneration, GBR). Membrany separacyjne stosowane do takich celów powinny charakteryzować się przede wszystkim kontrolowaną biodegradacją pozwalającą na odbudowę tkanek po obu jej stronach, a także stanowić przyjazne podłoże do wzrostu komórek, przy jednoczesnym stałym ich odżywieniu poprzez swobodny przepływ substancji odżywczych oraz tlenu przez strukturę membrany. W praktyce terapeutycznej stosuje membrany separacyjne zarówno nierozpuszczalne w organizmie jak i w nim w pełni biodegradowalne. Biodegradowalne membrany separacyjne wytwarza się między innymi z materiałów kolagenowych pochodzenia zwierzęcego, typu I i III, pochodzenia świńskiego i krowiego. Są one nieporowate lub z naturalną porowatością i dostępne w wielu rozmiarach oraz o grubościach od 0,3 do 2 mm. Membrany takie są obecnie najczęściej stosowanymi klinicznie. Charakteryzuje je łagodny profil degradacji oraz zadowalający wzrost tkanek. Zapewniają stabilne utrzymanie na podłożu, choć niekiedy istnieje potrzeba użycia szwów/pinów mocujących aby przeciwdziałać ślizganiu się materiału bariery po tkankach. Niedogodnością takich membran separacyjnych jest potrzeba ekstrakcji z tkanek odzwierzęcych oraz towarzyszący jej długotrwały proces oczyszczania z lipidów, resztek proteinowych lub potencjalnych odzwierzęcych czynników chorobotwórczych. Aby wyeliminować potrzebę korzystania z tkanek pochodzenia zwierzęcego opracowano membrany separacyjne wykonane z syntetycznych biodegradowalnych polimerów. Najczęściej wykorzystuje się do tych celów krystaliczny polilaktyd (PLA), semi-krystaliczny poli-L-laktyd PLLA, amorficzny poli-D,L-laktyd PDLLA, poliglikolid (PGA), ko-polimer polilaktyd-glikolid (PLGA) oraz polikaprolakton (PCL), uzyskując z tych materiałów membrany separacyjne lite włókniste lub w formie siatki. Zapewniają one dobre utrzymanie na podłożu, a porowatość stanowi względną barierę komórek i ochronę przed wnikaniem bakterii. Produkty rozkładu membran separacyjnych z opisanych wyżej polimerów biodegradowalnych ulegają pełnemu metabolizmowi w organizmie. Istnieje jednak zwiększone ryzyko występowania stanów zapalnych podczas biodegradacji wynikające z lokalnie występującego spadku pH w tkankach. Publikacja US6031148 ujawnia materiał separacyjny wykonany z PLGA, składający się z litej warstwy tego materiału, pokrytej z obu stron włóknami o średnicy od 25 do 30 μm. W publikacji WO2015/172212 opisano materiał separacyjny z kompozytu PGA/PLLA uzyskany metodą odparowania rozpuszczalnika z roztworu wlanego do formy, w wyniku czego można uzyskać lite płytki o grubości od 0,0001 do 10 mm.

Znane i stosowane jest także pokrywanie implantów medycznych nanocząstkami hydroksyapatytu w celu zwiększenia powinowactwa tkankowego takiego implantu. W inżynierii tkankowej znane i stosowane są implanty włókniste o spontanicznie ułożonych włóknach otrzymanych z biodegradowalnych polimerów metodą elektroprzędzenia (ang. electrospinning), w tym takie implanty, które zawierają nanocząstki hydroksyapatytu przytwierdzone do jego włókien. Sygnalne doniesienie o implantach tkankowych z włókien polimerowych pokrytych hydroskyapatytem ujawniono w publikacji autorstwa R. Tavakoli-Darestani i wsp., p.t. „Poly (lactideco-glycolide) nanofibers coated with collagen and nanohydroxyapatite for bone tissue engineering” [Novelty in Biomedicine, Vol. 1, Nr 1, 2013, str. 8-15(8)]. W publikacji tej ujawniono proces wytwarzania struktury elektroprzędzonej z polimeru PLGA pokrywanej

PL 240 082 B1 następnie kolagenem i nanocząstkami hydroksyapatytu. Strukturę włóknistą (włókninę) otrzymano w procesie elektroprzędzenia z 15% roztworu PLGA w mieszaninie rozpuszczalników DMF/tetrahydrofuran (THF), uzyskując włókna o średnicy 887 nm (± 57 nm). Pokrywanie tej włókniny kolagenem i hydroskyapatytem zostało wykonane kolejno metodami plazmowymi oraz przez zanurzenie i pozostawieniem na noc włókniny w 1 % wodnej zawiesinie nanohydroksyapatytu (nHA). Uzyskana w ten sposób membrana charakteryzowała się siecią włókien PLGA z obecnymi na powierzchni dużymi aglomeratami kolagenowohydroksyapatytowymi o dużym rozproszeniu.

W publikacji autorstwa L. Qiang, i wsp., p.t. „Electrospun Porous PDLLA Fiber Membrane Coated with nHA” [Applied Sciences 2018, 8(5), str. 831] ujawniono natomiast proces wytwarzania włóknistej struktury(włókniny) elektroprzędzonej z polimeru PDLLA, modyfikowanej cząstkami hydroksyapatytem o rozmiarze poniżej 100 nm. Włóknina ta miała średnią grubością włókien przed pokrywaniem równą 1,2 μm. Etap modyfikacji obejmował zanurzenie polimerowej włókniny w alkoholu etylowym z dodatkiem nanohydroksyapatytu. Materiał włókniny ulegał skurczeniu pod wpływem alkoholu etylowego, zaś uzyskana struktura ma polimerowe włókna PDLLA z osadzonymi na nich luźno dużymi aglomeratami hyroskyapatytu, zatykającymi pory struktury włóknistej. Zawartość wagowa hydroksyapatytu wynosiła od 4,1 do 11,2%. Zaobserwowano spadek wytrzymałości mechanicznej materiału przy próbie zwiększania zawartości hydroksyapatytu wynikający ze skurczu materiału i ekspozycji na alkohol etylowy.

Celem wynalazku było uzyskanie membrany separacyjnej o lepszych niż dotychczas znane właściwościach.

Cel taki spełnia membrana według wynalazku w postaci cienkiej, porowatej i elastycznej struktury włóknistej ze spontanicznie rozmieszczonych włókien polimerowych, wytworzonych z roztworu polimeru biodegradowalnego metodą elektroprzędzenia. W strukturze tej tworzące ją włókna polimerowe mają grubość od 1 do 3 μm i pokryte są nanocząstkami hydroksyapatytu, o rozmiarze nie przekraczającym wartości 100 nm i stosunku molowym wapnia do fosforu (Ca/P) z zakresu od 1,56 do 1,66. Wynalazek polega na tym. że materiał włókien polimerowych, stanowi mieszanina poli-DL-laktydu (PDLLA) i poliaktydu-glikolidu (PLGA), grubość włókien polimerowych wynosi od 1 do 3 μm, a zawartość hydroksyapatytu w membranie wynosi od 10 do 25% wagowo. Pokrycie włókien polimerowych hydroksyapatytem ma postać osnowy tych włókien, o grubości wynoszącej od 10 do 300 nm, korzystnie od 10 do 50 nm, przy czym średni rozmiar cząstek hyroksyapatytu osnowy wynosi nie więcej niż 50 nm. Porowatość membrany wynosi od 50 do 95%, korzystnie od 60 do 90%, przy czym wielkość porów membrany wynosi 5 do 30 μm, korzystnie od 5 do 20 μm. Nasiąkliwość membrany wynosi od 300 do 600%, korzystnie od 450%do 600%. Stopień pokrycia włókien polimerowych cząstkami hydroksyapatytu wynosi nie mniej niż 40%. Powierzchnia właściwa materiału membrany wynosi od 5 m²/g do 20m²/g, korzystnie od 15 do 20 m²/g.

W jednym z wariantów membrany według wynalazku udział wagowy obu polimerów w materiale włókien struktury włóknistej jest równy.

W kolejnym wariancie membrany według wynalazku udział wagowy poli-DL-laktydu (PDLLA) w materiale włókien struktury włóknistej wynosi co najmniej 5 %.

W kolejnym wariancie membrany według wynalazku udział wagowy poliaktydu-glikolidu (PLGA) w materiale włókien struktury włóknistej wynosi co najmniej 5 %.

W kolejnym wariancie membrany według wynalazku osnowa włókien składa się z dwóch warstw hydroksyapatytu, utworzonych z ziaren hydroksyapatytu o dwóch różnych rozmiarach.

W kolejnym wariancie membrany według wynalazku zewnętrzną warstwę osnowy stanowią ziarna hydroksyapatytu o rozmiarze nie większym niż 20 nm.

W innym wariancie membrany według wynalazku, jej grubość w stanie suchym wynosi od 0,1 mm do 2 mm, korzystnie od 0,3 do 1 mm.

Sposób według wynalazku zawiera pierwszy etap, w którym wytwarza się cienką, porowatą i elastyczną strukturę włóknistą ze spontanicznie rozmieszczonych włókien polimerowych o grubości od 1 do 3 μm, metodą elektroprzędzenia ich z roztworu polimeru biodegradowalnego, oraz drugi etap, w którym pokrywa się warstwą hydroksyapatytu włókna polimerowe wytworzonej w pierwszym etapie struktury włóknistej, poprzez zanurzenie wytworzonej struktury włóknistej w zawiesinie, którą to zawiesinę tworzą ciekła faza rozpraszająca oraz faza rozpraszana w postaci ziaren syntetycznego hydroksyapatytu o średnim rozmiarze nie większym niż 100 nm i stosunku molowym wapnia do fosforu (Ca/P) z zakresu od 1,56 do 1,66. Wynalazek polega na tym, że w pierwszym etapie, do wytworzenia struktury włóknistej stosuje się roztwór sporządzony z mieszaniny poli-DL-laktydu (PDLLA) i poliaktydu-glikolidu (PLGA), poprzez rozpuszczenie jednej części wagowej mieszaniny tych polimerów w pięciu częściach wagowych rozpuszczalnika lotnego. Z takiego roztworu wytwarza się strukturę włóknistą o porowatości

PL 240 082 B1 od 50 do 95%, korzystnie od 60 do 90%, która ma pory o wielkości od 5 do 30 μm, korzystnie od 5 do 20 μm. W drugim etapie tego sposobu wytwarza się zawiesinę, w której fazę rozpraszającą stanowi woda, zaś fazę rozpraszaną są cząstki hydroksyapatytu o średnim rozmiarze nie większym niż 50 nm, przy czym udział wagowy fazy rozpraszanej w całości zawiesiny wynosi nie więcej niż 0,5 %, oraz utrzymuje się temperaturę tej zawiesiny nie większą niż 30°C. Po zanurzeniu w sporządzonej zawiesinie struktury włóknistej wytworzonej w pierwszym etapie, w sąsiedztwie włókien polimerowych tej struktury, wytwarza się falę ultradźwiękową o intensywności mocy z zakresu od 3 do 15 W/cm² i trwającą przez co najmniej cztery minuty.

W jednym z wariantów sposobu według wynalazku częstotliwość fali ultradźwiękowej wytwarzanej w zawiesinie wynosi 20 kHz (± 2kHz).

W kolejnym wariancie sposobu według wynalazku rozpuszczalnik polimerów stanowi mieszanina dziewięciu części chloroformu (CHCI3) i jednej części dimetyloformamidu (DMF).

W kolejnym wariancie sposobu według wynalazku udział wagowy obu polimerów (PDLLA i PLGA) w mieszaninie polimerów, z której w pierwszym etapie sporządza się roztwór do wytwarzania włókien struktury włóknistej, jest równy.

W kolejnym wariancie sposobu według wynalazku udział wagowy poli-DL-Iaktydu (PDLLA) w mieszaninie polimerów, z której w pierwszym etapie sporządza się roztwór do wytwarzania włókien struktury włóknistej, wynosi co najmniej 5%.

W kolejnym wariancie sposobu według wynalazku udział wagowy poliaktydu-glikolidu (PLGA) w mieszaninie polimerów, z której w pierwszym etapie sporządza się roztwór do wytwarzania włókien struktury włóknistej, wynosi co najmniej 5%.

W kolejnym wariancie sposobu według wynalazku, w drugim etapie sporządza się pierwszą i drugą zawiesinę, w których kolejno zanurza się wytworzoną w pierwszym etapie strukturę włóknistą, a następnie w zawiesinach tych, w sąsiedztwie zanurzonych w nich włókien polimerowych, wytwarza się falę ultradźwiękową, przy czym średni rozmiar cząstek hydroksyapatytu pierwszej zawiesiny różni się od średniego rozmiaru cząstek hydroksyapatytu drugiej zawiesiny.

W kolejnym wariancie sposobu według wynalazku średni rozmiar cząstek hydroksyapatytu drugiej zawiesiny nie przekracza 20 nm.

W kolejnym wariancie sposobu według wynalazku w drugim etapie, po zakończeniu wytwarzania fali ultradźwiękowej w pierwszej zawiesinie, strukturę włóknistą przemywa się wodą dejonizowaną.

W innym wariancie sposobu według wynalazku, w pierwszym etapie wytwarza się strukturę włóknistą o grubości w stanie suchym od 0,1 mm do 2 mm, korzystnie o grubości od 0,3 do 1 mm.

Struktura i materiał membrany według wynalazku ma za zadanie blokować przechodzenie przez nią komórek separowanych tkanek, a jednoczenie pozwala na ich swobodny wzrost na powierzchni dzięki stwierdzonemu swobodnemu przepływowi przez nią substancji odżywczych. Membrana taka wykazuje także bardzo dużą zwilżalność (chłonność) solą fizjologiczną, przekraczającą nawet poziom 500%, dzięki uzyskiwanej porowatości i dużemu wzrostowi powierzchni właściwej w porównaniu z włókninami polimerowymi bez pokrycia hydroksyapatytem. Zwilżony materiał membrany charakteryzuje się właściwościami mechanicznymi niemal identycznymi z właściwościami tkanek naturalnego dziąsła, przy czym poddaje się uginaniu, szyciu, zwijaniu i cięciu w temperaturze 37°C, bez utraty pokrycia włókien hydroksyapatytem. Osadzone na włóknach polimerowych cząstki hydroskyapatytu w trakcie procesu degradacji tych włókien neutralizują spadek pH w otaczających je tkankach. Ponieważ czas degradacji włókna polimeru pokrytego hydroskyapatytem jest wolniejszy niż obserwowany w przypadku takich samych włókien ale niepokrytych oraz wolniejszy jest też spadek pH, zastosowanie membrany według wynalazku dłużej chroni przez potencjalnym wystąpieniem reakcji zapalnej w tkankach.

Nieoczekiwanie okazało się, że sposób według wynalazku zachowuje pożądaną strukturę włókniny, w tym nie niszczy jej bardzo cienkich włókien, przy jednoczesnym dużym i równomiernym pokryciu ich hydroksyapatytem oraz radykalnym skróceniu procesu wytwarzania gotowej membrany. Dodatkowo, poprzez dobór proporcji obu polimerów, z których powstają włókna, wybór rodzaju proszku hydroksyapatytowego użytego do sporządzenia zawiesiny oraz dobór parametrów fali ultradźwiękowej można w prosty sposób sterować okresem biodegradacji membrany w organizmie.

Wynalazek został schematycznie przedstawiony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat stanowiska do pokrywania włókien polimerowych hydroksyapatytem zastosowanego w przykładzie pierwszym, trzecim i czwartym. Fig. 2 przedstawia fotografię włókien polimerowych pokrytych hydroksyapatytem

PL 240 082 B1 w pierwszym przykładzie, uzyskana ze skaningowego mikroskopu elektronowego przy powiększeniu 5000 x. Fig. 3 przedstawia wykres zależności naprężenia od wydłużenia próbki membrany z przykładu drugiego, uzyskany w wyniku testu jednoosiowego rozciągania tej próbki. Figury 4 przedstawiają złożenie fotografii ze skaningowego mikroskopu elektronowego struktury z przykładu pierwszego i fotografii z mikroskopu optyczne podczas pomiaru kąta zwilżania, przy czym fig. 4A dotyczy czystej włókniny otrzymanej pierwszy etapie procesu wytwarzania membrany, a fig.4B dotyczy gotowej już membrany. Fig. 5 przedstawia schemat stanowiska do pokrywania włókien polimerowych hydroksyapatytem zastosowanego w drugim przykładzie. Fig. 6 przedstawia schemat dwuwarstwowej osnowy włókna polimerowego z drugiego przykładu, zaś fig. 7 przedstawia fotografię tej osnowy uzyskaną z skaningowego mikroskopu elektronowego.

Poniżej zostaną opisane cztery przykłady realizacji wynalazku. Proces wytwarzania czterech przykładowych membran według wynalazku w każdym przypadku składa się z etapu wytwarzania struktury włóknistej oraz następującego po nim etapu pokrywania tej struktury cząsteczkami hydroksyapatytu (HAp).

Do wytworzenia czterech niżej opisanych struktur włóknistych metodą elektroprzędzenia (ang. electrospinning) użyto dwóch polimerów biodegradowalnych należących do grupy poliestrów alifatycznych, a mianowicie poli-DL-laktydu (PDLLA) czyli poli-kwasu mlekowego, oraz polilaktyd-glikolidu (PLGA), czyli kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego. Do opisanych celów jako polimeru PLGA użyto tego polimeru o proporcji laktydu do glikolidu wynoszącej 50 : 50 oraz masie cząsteczkowej 30 000-40 000 Da, a jako polimeru PDLLA - substancji o masie cząsteczkowej 300 000 Da, obu produkcji firmy Polysciences z USA. W celu uzyskania roztworu, z którego następnie wytwarzano włókna polimerowe, odważano 1,5 g mieszaniny polimerów o podanych niżej proporcjach i zalewano 9 ml chloroformu (CHCl3) oraz 1 ml dimetyloformamidu (DMF), po czym całość mieszano na mieszadle magnetycznym w zamkniętym naczyniu przez około cztery godziny. Uzyskany 15% roztwór mieszaniny polimerów umieszczano w strzykawce jednorazowej o pojemności 10 ml, którą następnie zamocowywano w pompie strzykawkowej z nastawioną prędkością wypychania cieczy równą 50 μl na minutę. Całość układu umieszczano w komorze o przepływie laminarnym, w której utrzymywano temperaturę od 22 do 25°C i wilgotność powietrza w zakresie od 20 do 40%. Następnie do strzykawki podłączano igłę metalową o średnicy 0,8 mm i przykładano do tej igły napięcie wynoszące 12-14 kV. Formujące się włókna zbierano na obrotowy walcowy uziemiony kolektor, ulokowany w odległości 20 cm od wspomnianej metalowej igły, do momentu uzyskania na nim struktury włóknistej (włókniny) o grubości ok. 1 mm. Po zakończeniu procesu elektroprzędzenia włókninę w postaci rurki otaczającej kolektor rozcinano wzdłuż jego osi i cięto na skrawki o wymiarach 5 cm x 5 cm, które następnie dwukrotnie obmywano wodą dejonizowaną oraz pozostawiano do całkowitego wyschnięcia na 24 godziny w komorze o laminarnym przepływie powietrza. Wysuszone skrawki włókniny ważono na wadze analitycznej z dokładnością do czwartego miejsca po przecinku.

W etapie pokrywania włókien polimerowych wytworzonej włókniny używano syntetycznego sproszkowanego hydroksyapatytu, czyli związku chemicznego o wzorze Ca10(PO4)6(OH)2, w którym stosunek wapnia do fosforu (Ca/P) jest większy niż 1,55 ale mniejszy niż 1,67. W poniższych przykładach użyto dwóch odmian proszku hydroksyapatytowego o wspólnej nazwie handlowej GoHAP, czyli GoHAP typ 3 (dalej GoHAP3) i GoHAP typ 6 (G0HAP6). Proszek GoHAP3 charakteryzował się średnią wielkością ziarna wynoszącą 19 nm ± 2 nm, powierzchnią właściwą - 110 m²/g ± 11 m²/g i gęstością szkieletową - 2,88 g/cm³ ± 0,03 g/cm³, zaś proszek GoHAP 6 charakteryzował się średnią wielkością ziarna wynoszącą 41 nm ±6 nm, powierzchnią właściwą - 49 m²/g ± 5 m²/g oraz gęstością szkieletową - 3,00 g/cm³ ± 0,09 g/cm³.

Średni rozmiar tych nanocząstek wyznaczano na podstawie analizy obrazu uzyskanego na elektronowym mikroskopie transmisyjnym (TEM) metodą ciemnego pola dla co najmniej 200 cząstek, przy czym średnim rozmiarem była średnica okręgu obrysowującego kształt ziarna. Powierzchnia właściwa jest tu rozumiana, jako parametr skalarny wyrażający wielkość powierzchni substancji przypadającej na jego ilość, mierzona za pomocą analizy izoterm adsorpcji BET (izoterma Brunauera-Emmetta-Tellera).

W poniższych przykładach podano cechy uzyskanych membran separacyjnych zdefiniowane poniżej: - nasiąkliwość membrany to jej zdolność do wchłaniania wody, wyrażana jako procentowy stosunek masy wody pochłoniętej przez membranę do masy tej membrany w stanie suchym;

- porowatość membrany określa udział porów, czyli pustych przestrzeni w jej strukturze, określony liczbowo jako stosunek sumarycznej objętości tych pustych przestrzeni (porów) do całej objętości membrany, wyrażony w procentach; przy określaniu porowatości otwartej, istotnej z punktu widzenia nasiąkliwości, bierze się pod uwagę tylko objętość porów otwartych;

PL 240 082 B1

- wielkość porów porowatej membrany określa najdłuższa zmierzona przekątna wielokąta tworzonego przez sieć włókien w obrazie mikroskopii skaningowej (2D) oraz średnia wielkość tych porów zmierzona przy użyciu porometrii przepływowej (Capillary Flow Porometry);

- stopień pokrycia włókien polimerowych membrany przez cząstki hydrosyapatytu to procentowy ułamek powierzchni zewnętrznej tych włókien zajęty przez te cząstki; w poniższych przykładach określano ją poprzez analizę skaningowym mikroskopem elektronowym (SEM) jako pomiar z dwudziestu obszarów próbki przy powiększeniu 5000 x.

P r z y k ł a d 1

W pierwszym etapie, w celu przygotowania roztworu polimerów do elektroprzędzenia, odważono 0,75 g polimeru PDLLA i 0,75 g polimeru PLGA, po czym zalano je opisanym wyżej rozpuszczalnikiem, natomiast tworzące się włókna zbierano na kolektor w postaci rurki o średnicy 2 cm i obracający się z prędkością 50 obr/min.

W drugim etapie sporządzono zawiesinę 1, w której fazą rozpraszającą była woda, a fazą rozpraszaną był proszek GoHAP3 w ilości 0,1% wagowo. Wysuszone skrawki włókniny 2 unieruchomiono na siatce 3 ze stali nierdzewnej, po czym siatkę 3 ze skrawkami włókniny 2 zanurzono w sporządzonej zawiesinie 1, o objętości 3750 ml, znajdującej się w zbiorniku 4. W zbiorniku 4 znajdowały się także człony mieszające 5 nieuwidocznionego na rysunku mieszadła magnetycznego w celu utrzymywania jednorodnej zawiesiny. Następnie, w zawiesinie 1 umieszczono sonotrodę 6 w kształcie litery T, podłączoną do nieuwidocznionego na rysunku generatora ultradźwiękowego. Powierzchnię czołową 7 sonotrody 6, o długość 200 mm i szerokości 5 cm, umieszczono naprzeciwko skrawków włókniny 2 i przez dziesięć minut poddawano je działaniu fali ultradźwiękowej 8 o częstotliwości 20 kHz (+/-2kHz) i o intensywności mocy 3W/cm² (+/- 2W/cm²). Temperaturę zawiesiny 1 utrzymywano na poziomie 28-30°C poprzez przepływowy system chłodzący w ściankach zbiornika 4. Temperaturę cieczy w zbiorniku 4 stale kontrolowano przy użyciu nieuwidocznionej na rysunku termopary. Po zakończeniu procesu, pokryte hydroksyapatytem skrawki włókniny 2 wyjęto z zawiesiny 1 i obmyto je wodą dejonizowaną, po czym pozostawiono do wyschnięcia na okres 24 godzin. Wyschnięte membrany przechowywano w eksykatorze z granulatem pochłaniającym wilgoć do czasu wykonania charakteryzacji otrzymanego materiału.

Otrzymana w tym przykładzie membrana charakteryzowała się:

- zawartością wagową hydroksyapatytu równą 20%,

- jednorodnością uzyskanej warstwy hydroskyapatytu,

- stopniem pokrycia hydroksyapatytem równym 95%,

- nasiąkliwością na poziomie 500% i kątem zwilżania wynoszącym 0°(± 1°, fig. 4B),

- średnią porowatością na poziomie 80-90%,

- średnią grubość włókien wynoszącą 2 μm (± 0.5 μm),

- średnią grubością warstwy hyrosksyapatytu równą 200 nm (± 50 nm),

- średnią wielkością porów na poziomie 10 μm (± 5 μm),

- całkowitym czas degradacji w mediach PBS i TRIS HCl w temperaturze 37°C wynoszącym pięć miesięcy,

- powierzchnię właściwą równą 15,26 m²/g (± 027 m²/g).

Materiał membrany został poddany testom cytotoksyczności komórkowej. W badaniu cytotoksyczności wg. normy PN-EN ISO 10993-5:2009 wykorzystano komórki linii fibroblastów mysich NCTC klon 929 na podłożu MEM (Lonza), surowicy płodowej bydlęcej FBS (Euroclone) z roztworem antybiotyków (Lonza). Procedura pomiaru obejmowała badania na wyciągach po hodowli w pożywce z surowicą w 37°C ± 1°C po 24 godzinach ekspozycji. Zastosowano kontrolę hodowli, negatywną, pozytywną i odczynnikową. Według ekspertyzy badawczej próbkę uznano za nietoksyczną dla komórek.

P r z y k ł a d 2

W pierwszym etapie, z roztworu polimerów PLGA i PDLLA opisanym w pierwszym przykładzie wykonano włókninę, zbierając włókna na kolektorze w postaci bębna o średnicy 20 cm i obracającego się z prędkością 100 obr/min.

W drugim etapie sporządzono pierwszą wodna zawiesinę 1’, w której fazą rozpraszaną był GoHAP6 w ilości 0,1% wagowo, oraz drugą wodną zawiesinę 1” zawierającą 0,1% wagowo proszku GoHAP3, czyli analogiczną do zawiesiny 1 z pierwszego przykładu. Wysuszony skrawek włókniny 2’ unieruchomiono na siatce ze stali nierdzewnej 3’ i zanurzono w zbiorniku 4’ z takiego samego materiału.

PL 240 082 B1

Zbiornik 4’ wyposażony był w analogiczny jak w pierwszym przykładzie układ stabilizowania temperatury cieczy, miał wewnątrz człon mieszający 5 mieszadła magnetycznego oraz zawierał 450 ml pierwszej zawiesiny 1’ (GoHAP6). Następnie do skrawka włókniny 2’ zbliżono czoło 7 walcowej sonotrody 6’ o średnicy 2 cm, połączonej z nieuwidocznionym na rysunku generatorem ultradźwiękowego, po czym ten skrawek włókniny 2’ poddano przez pięć minut działaniu fali ultradźwiękowej 8’ o częstotliwości 20 kHz (± 2kHz) i intensywności mocy 12W/cm² (± 2W/cm²). Następnie skrawek włókniny 2’ pokryty już pierwszym rodzajem hydroksyapatytu wyjęto z zawiesiny 1’ i obmyto wodą dejonizowaną, po czym powtórzono pokrywanie ultradźwiękowe tworzonej membrany w drugiej zawiesinie 1” (GoHAP3), w takich samych warunkach i przez kolejne pięć minut. Po wyjęciu gotowej membrany z drugiej zawiesiny 1” obmyto ją jednokrotnie wodą dejonizowaną, po czym pozostawiono do wyschnięcia przez 24 godziny. Do czasu zbadania właściwości uzyskanej membrany przechowywano ją w eksykatorze z granulatem pochłaniającym wilgoć.

Wytworzona w tym przykładzie membrana separacyjna miała na polimerowych włóknach 9 dwuwarstwową osnowę, która stanowiły wewnętrzna warstwa 10 z hydroksyapatytu GoHAP6 i zewnętrzna warstwa 11 z hydroksyapatytu GoHAP3. Membrana ta charakteryzowała się następującymi właściwościami: - stopień pokrycia hydroksyapatytem równy 85%, - zawartość wagową hydroksyapatytu równa 15%, - stwierdzono absorpcję soli fizjologicznej i nasiąkliwość na poziomie 550%, - średnia porowatość otwartą wynosiła 80-90%, - średnia grubość jej włókien wynosiła 2,5 μm (± 1 μm), - średnia grubość warstwy hydroksyapatytu wyniosła 150 nm (± 50 nm), - wytrzymałość doraźna w teście rozciągania jednoosiowego równa 3,6 MPa i maksymalne wydłużenie na poziomie 100-120% (fig. 3).

P r z y k ł a d 3

W pierwszym etapie wytworzono 15% roztwór polimerów z ich mieszaniny zawierającej 95% (czyli 1,425 g) polimeru PDLLA oraz 5% (0,075 g) polimeru PLGA. Wytworzenie z tego roztworu włókniny metodą elektroprzędzenia nastąpiło w takich samych warunkach jak w przykładzie drugim.

W drugim etapie pokryto ultradźwiękowo uzyskane skrawki włókniny 2 w tych samych warunkach (zawiesina GoHAP3) co w przykładzie pierwszym i po przemyciu gotowej membrany wodą dejonizowaną pozostawiono do wyschnięcia przez 24 godziny. Wytworzona w tym przykładzie membrana charakteryzowała się następującymi właściwościami:

- stopień pokrycia włókien hydroksyapatytem na poziomie 87%,

- zawartość wagowa hydrosyapatytu wyniosła 14%,

- absorpcja soli fizjologicznej i nasiąkliwość na poziomie 500%,

- średnia porowatość otwarta na poziomie 80-90%,

- średnia grubość włókien wyniosła 2 μm (± 1 μm),

- średnia grubość warstwy hydroskyapatytu na włóknach polimerowych wyniosła 150 nm (± 50 nm).

P r z y k ł a d 4

W pierwszym etapie wytworzono włókninę z mieszaniny zawierającej 95% (czyli 1,425 g) polimeru PLGA oraz 5% (0,075 g) polimeru PDLLA,. Wytworzenie z tego roztworu włókniny metodą elektroprzędzenia nastąpiło w takich samych warunkach jak w przykładzie drugim i trzecim.

W drugim etapie pokryto ultradźwiękowo uzyskane skrawki włókniny 2 w tych samych warunkach co w przykładzie pierwszym i trzecim, przy czym jako źródło hydroskyapatu posłużyła 0,1% wodna zawiesina proszku GoHAP6, czyli pierwsza zawiesina 1” z przykładu drugiego. Przemyta wodą dejonizowaną, wysuszona i przechowywana w warunkach opisanych w poprzednich przykładach gotowa membrana miała następujące właściwości:

- stopień pokrycia włókien hydroksyapatytem równy 90%,

- zawartość wagowa hydroksyapatytu na poziomie 15%,

- stwierdzono absorpcję soli fizjologicznej oraz nasiąkliwość na poziomie 500%,

- średnią porowatość otwartą 80-90%,

- średnia grubość włókien wyniosła 2 μm (± 1 μm),

- średnia grubość warstwy hydroskyapatytu na włóknach polimerowych wyniosła 150 nm

Claims

PL 240 082 B1

Zastrzeżenia patentowe

1. Biologiczna membrana separacyjna, w postaci cienkiej, porowatej i elastycznej struktury włóknistej ze spontanicznie rozmieszczonych włókien polimerowych, wytworzonej z roztworu polimeru biodegradowalnego metodą elektroprzędzenia, w której tworzące ją włókna polimerowe mają grubość od 0,5 do 4 μm i pokryte są nanocząstkami hydroksyapatytu, o rozmiarze nie przekraczającym wartości 100 nm i stosunku molowym wapnia do fosforu (Ca/P) z zakresu od 1,56 do 1,66, znamienna tym, że,

- materiał włókien polimerowych (9) stanowi mieszanina poli-DL-laktydu (PDLLA) i poliaktyduglikolidu (PLGA),

- grubość włókien polimerowych (9) wynosi od 1 do 3 μm,

- zawartość hydroksyapatytu w membranie wynosi od 10 do 25% wagowo,

- pokrycie włókien polimerowych (9) hydroksyapatytem ma postać osnowy tych włókien (9), której grubość wynosi od 10 do 300 nm, korzystnie od 10 do 50 nm,

- średni rozmiar cząstek hyroksyapatytu wynosi nie więcej niż 50 nm,

- porowatość membrany wynosi od 50 do 95%, korzystnie od 60 do 90%, przy czym wielkość porów membrany wynosi 5 do 30 μm, korzystnie od 5 do 20 μm,

- nasiąkliwość membrany wynosi od 300 do 600%, korzystnie od 450% do 600%,

- stopień pokrycia włókien polimerowych cząstkami hydroksyapatytu wynosi nie mniej niż 40%, - powierzchnia właściwa materiału membrany wynosi od 5 m²/g do 20 m²/g, korzystnie od 15 m²/g do 20 m²/g.
2. Membrana według zastrz. 1, znamienna tym, że udział wagowy obu polimerów w materiale włókien struktury włóknistej jest równy.
3. Membrana według zastrz 1. znamienna tym, że udział wagowy poli-DL-laktydu (PDLLA) w materiale włókien struktury włóknistej wynosi co najmniej 5 %.
4. Membrana według zastrz 1. znamienna tym, że udział wagowy poliaktydu-glikolidu (PLGA) w materiale włókien struktury włóknistej wynosi co najmniej 5 %.
5. Membrana według jednego z zastrz. od 1 albo 4, znamienna tym, że osnowa włókien (9) składa się z dwóch warstw (10, 11) hydroksyapatytu, utworzonych z ziaren hydroksyapatytu o dwóch różnych rozmiarach.
6. Membrana według zastrz.5, znamienna tym, że zewnętrzną warstwę (11) osnowy stanowią ziarna hydroksyapatytu o rozmiarze nie większym niż 20 nm.
7. Membrana według jednego z zastrz. od 1 do 6, znamienna tym, że jej grubość w stanie suchym wynosi od 0,1 mm do 2 mm, korzystnie od 0,3 do 1 mm.
8. Sposób wytwarzania biologicznej membrany separacyjnej, zawierający pierwszy etap, w którym wytwarza się cienką, porowatą i elastyczną strukturę włóknistą ze spontanicznie rozmieszczonych włókien polimerowych o grubości od 1 do 3 μm, wytworzonych metodą elektroprzędzenia z roztworu polimeru biodegradowalnego, oraz drugi etap, w którym pokrywa się warstwą hydroksyapatytu włókna polimerowe wytworzonej w pierwszym etapie struktury włóknistej, poprzez zanurzenie wytworzonej struktury włóknistej w zawiesinie, którą to zawiesinę tworzą ciekła faza rozpraszająca oraz faza rozpraszana w postaci ziaren syntetycznego hydroksyapatytu o średnim rozmiarze nie większym niż 100 nm i stosunku molowym wapnia do fosforu (Ca/P) z zakresu od 1,56 do 1,66, znamienny tym, że w pierwszym etapie, do wytworzenia struktury włóknistej stosuje się roztwór sporządzony z mieszaniny poli-DL-laktydu (PDLLA) i poliaktyduglikolidu (PLGA), poprzez rozpuszczenie jednej części wagowej mieszaniny tych polimerów w pięciu częściach wagowych rozpuszczalnika lotnego, wytwarza się strukturę włóknistą o porowatości od 50 do 95%, korzystnie od 60 do 90%, i mającą pory o wielkości od 5 do 30 μm, korzystnie o wielkości od 20 do 30 μm, zaś w drugim etapie wytwarza się zawiesinę, w której fazę rozpraszającą stanowi woda zaś fazę rozpraszaną są cząstki hydroksyapatytu o średnim rozmiarze nie większym niż 50 nm, przy czym udział wagowy fazy rozpraszanej w całości zawiesiny wynosi nie więcej niż 0,5%, utrzymuje się temperaturę zawiesiny nie większą niż 30°C, natomiast po zanurzeniu wytworzonej w pierwszym etapie struktury włóknistej w zawiesinie, w sąsiedztwie włókien polimerowych tej struktury, wytwarza się falę ultradźwiękową o intensywności mocy z zakresu od 3 do 15 W/cm² i trwającą przez co najmniej cztery minuty.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że częstotliwość fali ultradźwiękowej wytwarzanej w zawiesinie wynosi 20 kHz (± 2kHz).

PL 240 082 B1
10. Sposób według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że rozpuszczalnik stanowi mieszanina dziewięciu części chloroformu (CHCH) i jednej części dimetyloformamidu (DMF).
11. Sposób według jednego z zastrz. od 8 do 10, znamienny tym, że udział wagowy obu polimerów (PDLLA i PLGA) w mieszaninie polimerów, z której w pierwszym etapie sporządza się roztwór do wytwarzania włókien struktury włóknistej, jest równy.
12. Sposób według jednego z zastrz. od 8 do 10, znamienny tym, że udział wagowy poli-DLlaktydu (PDLLA) w mieszaninie polimerów, z której w pierwszym etapie sporządza się roztwór do wytwarzania włókien struktury włóknistej, wynosi co najmniej 5%.
13. Sposób według jednego z zastrz. od 8 do 10, znamienny tym, że udział wagowy poliaktyduglikolidu (PLGA) w mieszaninie polimerów, z której w pierwszym etapie sporządza się roztwór do wytwarzania włókien struktury włóknistej, wynosi co najmniej 5%.
14. Sposób według jednego z zastrz. od 8 do 13, znamienny tym, że w drugim etapie sporządza się pierwszą i drugą zawiesinę, w których kolejno zanurza się wytworzoną w pierwszym etapie strukturę włóknistą, a następnie w zawiesinach tych, w sąsiedztwie zanurzonych w nich włókien polimerowych, wytwarza się falę ultradźwiękową, przy czym średni rozmiar cząstek hydroksyapatytu pierwszej zawiesiny różni się od średniego rozmiaru cząstek hydroksyapatytu drugiej zawiesiny.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że średni rozmiar cząstek hydro-ksyapatytu drugiej zawiesiny nie przekracza 20 nm.
16. Sposób według zastrz. 14 albo 15, znamienny tym, że w drugim etapie, po zakończeniu wytwarzania fali ultradźwiękowej w pierwszej zawiesinie, strukturę włóknistą przemywa się wodą dejonizowaną.
17. Sposób według jednego z zastrz. od 8 do 16, znamienny tym, że w pierwszym etapie wytwarza się strukturę włóknistą o grubości w stanie suchym od 0,1 mm do 2 mm, korzystnie o grubości od 0,3 do 1 mm.