PL241065B1 - Zastosowanie fuzyjnej polimerazy DNA Bst-Nec do izotermalnego powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2 - Google Patents
Zastosowanie fuzyjnej polimerazy DNA Bst-Nec do izotermalnego powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2 Download PDFInfo
- Publication number
- PL241065B1 PL241065B1 PL434484A PL43448420A PL241065B1 PL 241065 B1 PL241065 B1 PL 241065B1 PL 434484 A PL434484 A PL 434484A PL 43448420 A PL43448420 A PL 43448420A PL 241065 B1 PL241065 B1 PL 241065B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- reaction
- polymerase
- rna
- bst
- virus
- Prior art date
Links
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 claims description 23
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 3
- 101710116602 DNA-Binding protein G5P Proteins 0.000 claims description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 claims description 3
- 101710162453 Replication factor A Proteins 0.000 claims description 3
- 101710176758 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit Proteins 0.000 claims description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims 1
- 241000711467 Human coronavirus 229E Species 0.000 claims 1
- 241000482741 Human coronavirus NL63 Species 0.000 claims 1
- 241001428935 Human coronavirus OC43 Species 0.000 claims 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims 1
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 claims 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 1
- 239000006163 transport media Substances 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 16
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 230000001036 exonucleolytic effect Effects 0.000 description 5
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 4
- 241000323142 Nanoarchaeum equitans Species 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 241000323143 Ignicoccus hospitalis Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QJZYHAIUNVAGQP-UHFFFAOYSA-N 3-nitrobicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic acid Chemical compound C1C2C=CC1C(C(=O)O)C2(C(O)=O)[N+]([O-])=O QJZYHAIUNVAGQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 102100032241 Lactotransferrin Human genes 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000004021 humic acid Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000013120 recombinational repair Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 108700014590 single-stranded DNA binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest fuzyjna polimeraza DNA Bst-Nec do zastosowania do izotermalnego powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2, charakteryzująca się tym, że wykrywa RNA wirusa z próbki materiału biologicznego bez izolacji RNA.
Description
PL 241 065 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie fuzyjnej polimerazy DNA Bst-Nec do izotermalnego powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2 w celu wykrywania RNA wirusa w badanej próbce. Jest również możliwe bezpośrednie wykrywanie wirusa z wymazu bez konieczności izolacji RNA.
Polimerazy DNA to enzymy, które odgrywają zasadniczą rolę w procesie replikacji i naprawie DNA. Znalazły one szerokie zastosowanie w różnych dziedzinach nauki, z powodzeniem stosowane są w sekwencjonowaniu czy różnych wariantach reakcji PCR (ang. Polymerase Chain Reaction), gdzie katalizują proces syntezy DNA in vitro, który przebiega cyklicznie w ściśle określonych etapach termicznych. Innym podejściem i coraz popularniejszym w ostatnich czasach jest wykorzystanie polimeraz DNA w technikach izotermicznych do amplifikacji DNA, które nie opierają się na termocyklu, a reakcja prowadzona jest w stałej temperaturze wydłużania. Do tej pory opracowano wiele takich technik służących powielaniu zarówno DNA jak i RNA. Dobór odpowiedniej polimerazy do danej techniki uzależniony jest głównie od jej właściwości. Oprócz podstawowej właściwości polimeryzacyjnej mogą one posiadać zdolności do hydrolizy cząsteczek DNA dzięki obecności domeny egzonukleolitycznej czy aktywność odwrotnej transkryptazy. Cechy te determinowane są obecnością w ich budowie odpowiednich domen. Podstawowe domeny jakie występują u tych enzymów to domena polimeryzacyjna oraz 3'-5' i 5'-3' egzonukleolityczna. Znane są polimerazy, u których delecja domeny egzonukleolitycznej prowadzi do uzyskania funkcjonalnego białka o częściowo zmienionych cechach w stosunku do enzymu natywnego. Wśród takich polimeraz najpopularniejsza jest polimeraz Taq wyizolowana z termofilnej bakterii Thermus aquaticus, której odkrycie całkowicie odmieniło oblicze biologii molekularnej. Pozbawiona aktywności 5'-3' egzonukleazy polimeraza Taq Δ289 charakteryzuje się zwiększoną termostabilnością, jednakże wymaga też zwiększonego zapotrzebowania na jony Mg2+, a nowopowstała nić DNA obdarzona jest mniejszą liczbą błędów. Polimerazą, stosowaną w technikach izotermicznej amplifikacji DNA jest polimeraz Bst, której forma natywna posiadająca nieaktywną domenę 3'-5' egzonukleolityczną oraz aktywną 5'-3' egzonukleolityczną, której aktywność może zostać wyłączona za pomocą punktowej mutacji w pozycji 73 (Tyr73^Phe73 and Tyr73^Ala73). Polimeraza ta podobnie jak polimeraza Taq należy do rodzina A, a wyizolowano ją z bakterii Bacillus stearothermophilus. Optymalną aktywność osiąga w temperaturze ok. 60°C, a pozbawiona aktywności egzonukleazy posiada zdolność zastępowania nici (strand displacement activity), która jest niezwykle przydatna w reakcji LAMP - Loop Mediated Isothermal Amplification. Polimeraza wykazuje zwiększoną tolerancję na inhibitory kliniczne czy środowiskowe w porównaniu z innymi polimerazy z tej rodziny, jednak nadal, biorąc pod uwagę aplikacje tej polimerazy, istotne jest poszukiwanie rozwiązań prowadzących do poprawy głównie jej procesywności i odporności na inhibitory.
Białko NeqSSB należy do rodziny białek SSB (ang. Single-Stranded DNA Binding protein). Białka SSB wykazują różnorodność sekwencji aminokwasowych oraz struktury. Mimo to wszystkie posiadają charakterystyczną, silnie zakonserwowaną, ok. 100 - aminokwasową domenę oligonukleotydową OB (ang. Oligonucleotide/Oligosaccharide Binding Fold Domain). Występuje ona powszechnie u białek posiadających zdolności wiązania ssDNA, determinuje, więc tą podstawową i wspólną dla wszystkich białek SSB cechę - niespecyficzne wiązanie jednoniciowej nici DNA, a także, odkryte znacznie później, wiązanie RNA. Białka SSB odgrywają zasadniczą rolę w procesach ściśle związanych z ssDNA. Odgrywają istotną rolę w replikacji, rekombinacji i naprawie DNA. Odpowiadają za interakcje z jednoniciowym DNA, zapobiegają tworzeniu struktur drugorzędowych i chronią przed degradacyjnym działaniem nukleaz.
Odkrycie białek SSB datuje się na połowę lat 60-tych XX wieku. Pierwsze wykryte białka to białko SSB faga T4 oraz E. coli. Odkryto wtedy ich silne właściwości związane z oddziaływaniem z ssDNA oraz elucję białka w złożu ssDNA-celuloza w obecności wysokiego stężenia soli - 2 M NaCI. Zwrócono również uwagę na bardzo wysoką selektywność tego białka do jednoniciowego DNA. Potwierdzeniem fundamentalnej roli białek SSB w procesach związanych z ssDNA jest fakt, iż występują one u wszystkich organizmów żywych, a także u wirusów.
Wiązanie się białka SSB z ssDNA polega na upakowaniu aromatycznych reszt aminokwasowych między zasady w łańcuchu oligonukleotydowym. Ponadto dodatnio naładowane reszt aminokwasowych oddziałują ze szkieletem fosforanowym w cząsteczce ssDNA.
Mimo przynależności białka Neq SSB do rodziny białek SSB odbiega ono swoimi cechami od klasycznych białek SSB, stąd określane jest jako białko NeqSSB-podobne. Białko to pochodzi
PL 241 065 B1 z hipertermofilnego archeona Nanoarchaeum equitans, który pasożytuje w craenarchaeonie Ignicoccus hospitalis. Optymalne warunki wzrostu tego mikroorganizmu wymagają ściśle beztlenowych warunków i temperatury 90°C. Co ciekawe Nanoarchaeum equitans posiada najmniejszy znany genom składający się z 490,885 par zasad. W przeciwieństwie do większości znanych organizmów o obniżonych genomach, posiada pełny zestaw enzymów biorących udział w replikacji, naprawie i rekombinacji DNA, w tym białko SSB.
W przedmiotowym wynalazku została użyta polimeraza, która została zmodfikowana poprzez dołączenie do natywnego enzymu białka NeqSSB. Białko to należy do rodziny białek SSB (ang. SingleStranded DNA Binding protein).
Białka SSB wykazują różnorodność sekwencji aminokwasowych oraz struktury. Mimo to wszystkie posiadają charakterystyczną, silnie zakonserwowaną, ok. 100 - aminokwasową domenę oligonukleotydową OB (ang. Oligonucleotide/Oligosaccharide Binding Fold Domain).
Występuje ona powszechnie u białek posiadających zdolności wiązania ssDNA, determinuje, więc tą podstawową i wspólną dla wszystkich białek SSB cechę - niespecyficzne wiązanie jednoniciowej nici DNA. Białka SSB odgrywają zasadniczą rolę w procesach ściśle związanych z ssDNA takich jak replikacja, rekombinacja i naprawa DNA. Odpowiadająca interakcje z jednoniciowym DNA, zapobiegają tworzeniu struktur drugorzędowych i chronią przed degradacyjnym działaniem nukleaz. Mimo przynależności białka NeqSSB do rodziny białek SSB odbiega ono swoimi cechami od klasycznych białek SSB, stąd określane jest jako białko NeqSSB-podobne. Białko to pochodzi z hipertermofilnego archeona Nanoarchaeum equitans, który pasożytuje w craenarchaeonie Ignicoccus hospitalis. Optymalne warunki wzrostu tego mikroorganizmu wymagają ściśle beztlenowych warunków i temperatury 90°C. Nanoarchaeum equitans posiada najmniejszy znany genom składający się z 490,885 par zasad. W przeciwieństwie do większości znanych organizmów o obniżonych genomach, posiada pełny zestaw enzymów biorących udział w replikacji, naprawie i rekombinacji DNA, w tym białko SSB. Badania wskazują na nietypowe dla innych białek SSB zdolności wiązania wszystkich form DNA (ssDNA, dsDNA) oraz mRNA bez strukturalnych preferencji. Ponadto białko charakteryzuje się wysoką termostabilnością. Czas półtrwania przy zachowaniu aktywności biologicznej wynosi 5 min w 100°C, natomiast temperatura topnienia to 100,2°C. Fuzyjna polimeraza DNA NeqSSB-Bst otrzymana została poprzez połączenie polimerazy Bst z białkiem NeqSSB na N-końcu polimerazy za pomocą 6-aminokwasowego linkera o sekwencji aminokwasowej: Gly-Ser-Gly-Gly-VaI-Asp. Analiza porównawcza właściwości enzymu poddanemu ochronie patentowej z referencyjną polimerazą DNA Bst dostępną komercyjnie wykazała, że obecność dodatkowego białka wiążącego DNA ma pozytywny wpływ na cechy polimerazy DNA. Charakteryzuje się ona podwyższoną termostabilnością, zwiększoną procesywnością, a także zwiększeniem tolerancji na inhibitory takie jak heparyna, laktoferyna, czy kwas humusowy. Innowacyjna, fuzyjna polimeraza DNA wykazuje również zwiększoną czułość i specyficzność reakcji co ma kluczowe znaczenie w diagnostyce molekularnej.
Celem niniejszego wynalazku jest zastosowanie fuzyjnej polimerazy DNA Bst- Nec do wykrywania wirusa bez konieczności izolacji RNA.
Przedmiotem wynalazku jest fuzyjna polimeraza DNA Bst-Nec do zastosowania do izotermalnego powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2. Fuzyjna polimeraza wykrywa RNA wirusa z próbki materiału biologicznego bez izolacji RNA.
Określenia stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:
materiał biologiczny - oznacza próbkę materiału uzyskaną w postaci wymazu z nosa, nosogardzieli.
Opis figur i tabel:
Fig. 1 - przedstawia Rozcieńczenia RNA wirusa SARS-CoV-2 wykrywane w postaci krzywych LOD proponowanego rozwiązania.
Fig. 2 - przedstawia brak odpowiedzi proponowanego wynalazku na RNA innych koronawirusów oraz odpowiedź na RNA SARS-CoV-2 - specyficzność względem SARS-CoV-2.
Fig. 3 - przedstawia analizę próbek klinicznych za pomocą proponowanego rozwiązania.
Tabela 1 - przedstawia seryjne rozcieńczenia RNA wirusa SARS-CoV-2 które zostały wykorzystane do oceny LOD. Odpowiedzi proponowanego wynalazku przedstawiono na figurze 1.
Tabela 2 - przedstawia zestawienie tabelaryczne analizowanych RNA innych koronawirusów oraz SARS-CoV-2 do oceny specyficzności.
Claims (2)
- PL 241 065 B1Tabela 3 - przedstawia zestawienie tabelaryczne analizowanych próbek klinicznych proponowanym rozwiązaniem.Tabela 4 - przedstawia porównanie tabelaryczne wyników uzyskanych za pomocą proponowanego rozwiązania w porównaniu do „złotego standardu” metody RT-PCR.Wynalazek ilustruje następujący przykład wykonania, niestanowiący jego ograniczeniaa)Polimeraza, została zmodfikowana poprzez dołączenie do natywnego enzymu białka NeqSSB. Białko to należy do rodziny białek SSB (ang. Single-Stranded DNA Binding protein).Dzięki temu możliwe jest również przeprowadzenie reakcji bezpośrednio na próbce wymazu nosogardzieli lub gardła bez konieczności oczyszczania RNA.Przeprowadzono badania potwierdzające skuteczność wykorzystania polimerazy Bst-Nec w diagnostyce wirusa SARS CoV2:Wyznaczenie LOD - limit of detectionWykonano seryjne 10-krotne rozcieńczenia RNA wirusa i wyznaczono minimalną ilość kopii RNA wirusa, która jest możliwa do wykrycia.Otrzymane wyniki wskazują na uzyskiwanie pozytywnych wyników reakcji dla 10 kopii wirusa w badanej próbce (fig. 1; tab. 1).b)Wykonano również test specyficzności reakcji. Wyznaczając specyficzność testu przeprowadzono reakcję na 4 różnych wirusach z rodziny koronawirusów: HCoV-NL63, HCoV-283E, HCoV-OC43, HCoV-229E. Miano badanych wirusów znacznie przekroczyło stężenie fizjologiczne i wynosiło ok. 1 x 10 7 PFU. Jako kontroli pozytywnej użyto RNA wirusa SARS-CoV-2 o PFU ok. 1 x 10 4. Reakcję prowadzono 30 min.Otrzymane wyniki wskazują na wysoką specyficzność reakcji z wykorzystaniem polimerazy Bst-Nec (fig. 2; tab. 2) c)Przeprowadzono również reakcję z wykorzystaniem próbek klinicznych. Reakcję przeprowadzono bez izolacji RNA bezpośrednio wykorzystując medium transportowe jako matrycę do reakcji.Badanie wykazało 100% zbieżności wyników testu izotermalnej amplifikacji ze złotym standardem reakcją PCR. Ponadto wyniki otrzymane proponowaną metodą izotermalną wymagają krótszego czasu analizy niż metoda rekomendowana przez WHO (fig. 3; tab. 3-4).d)Reakcja przeprowadzana była w objętości 20 μl. Zastosowano następujący skład mieszaniny reakcyjnej: 10x Isothermal Buffer [200 mM Tris-HCI pH 8.8, 100 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCI, 2 mM MgSO4], 1% Tween 20], 10 mM dNTPs, 100 mM MgSO4, Startery: 1,6 uM FIP/BIP, 0,2 uM F3/B3, 0,4 uM LoopF/B, NeqSSB-GssFull polymerase 0,32 U/ul reakcji, RT 1 U/ul reakcji, Inhibitor RNaz 0,4 U/ul reakcji.Do reakcji zastosowano następujące startery oligonukleotydowe:F3 5’-CCACT AGAGGAGCTACTGTA-3’B3 5’-TGACAAGCTCAACACGT-3’FIP 5’-AGGTGAGGGTTTTCTACATCACTATATTGGAACAAGCAAATTCTATGG-3’BIP 5’-ATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGTGCGAGCAAGAACAAGTG-3’LF 5’-CAGTTTTTAACATGTTGTGCCAACC-3’LB 5’-TAGAGCCATGCCTAA CATGCT-3’Zastrzeżenia patentowe1. Fuzyjna polimeraza DNA Bst-Nec do zastosowania do izotermalnego powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2.
- 2. Fuzyjna polimeraza według zastrz. 1, znamienna tym, że wykrywa RNA wirusa z próbki materiału biologicznego bez izolacji RNA.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL434484A PL241065B1 (pl) | 2020-06-26 | 2020-06-26 | Zastosowanie fuzyjnej polimerazy DNA Bst-Nec do izotermalnego powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2 |
| PCT/PL2020/000074 WO2021262013A1 (en) | 2020-06-26 | 2020-08-31 | Bst-nec dna fusion polymerase for use in isothermal replication of specific sars cov-2 virus sequences |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL434484A PL241065B1 (pl) | 2020-06-26 | 2020-06-26 | Zastosowanie fuzyjnej polimerazy DNA Bst-Nec do izotermalnego powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL434484A1 PL434484A1 (pl) | 2021-12-27 |
| PL241065B1 true PL241065B1 (pl) | 2022-08-01 |
Family
ID=72709833
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL434484A PL241065B1 (pl) | 2020-06-26 | 2020-06-26 | Zastosowanie fuzyjnej polimerazy DNA Bst-Nec do izotermalnego powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL241065B1 (pl) |
| WO (1) | WO2021262013A1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL241698B1 (pl) * | 2021-01-27 | 2022-11-21 | Inst Biotechnologii I Medycyny Molekularnej | Polimeraza Pwo-NeqSSB, sposób jej otrzymywania, plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070059713A1 (en) * | 2005-09-09 | 2007-03-15 | Lee Jun E | SSB-DNA polymerase fusion proteins |
| PL426093A1 (pl) * | 2018-06-27 | 2020-01-02 | Instytut Biotechnologii I Medycyny Molekularnej | Fuzyjna polimeraza kwasu jednołańcuchowego DNA Bst, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fuzyjną polimerazę DNA NeqSSB-Bst, sposób jej otrzymywania oraz zastosowanie |
-
2020
- 2020-06-26 PL PL434484A patent/PL241065B1/pl unknown
- 2020-08-31 WO PCT/PL2020/000074 patent/WO2021262013A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL434484A1 (pl) | 2021-12-27 |
| WO2021262013A1 (en) | 2021-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Moser et al. | Thermostable DNA polymerase from a viral metagenome is a potent RT-PCR enzyme | |
| US10683540B2 (en) | Oligonucleotide inhibitor of DNA polymerases | |
| ES2742186T3 (es) | Exonucleasas termolábiles | |
| JP6583796B2 (ja) | 核酸の増幅方法 | |
| CN106460040B (zh) | 在低盐条件下的等温扩增 | |
| JP7420850B2 (ja) | 熱安定性ポリメラーゼ阻害剤組成物及び方法 | |
| CN103154271A (zh) | 单核苷酸多态性的实时pcr检测 | |
| US10301673B2 (en) | Helicase suppression of non-template amplification | |
| EP1546355B1 (en) | Methods of use for thermostable rna ligases | |
| WO2021259201A1 (zh) | 一种核酸配体及其应用 | |
| PL241065B1 (pl) | Zastosowanie fuzyjnej polimerazy DNA Bst-Nec do izotermalnego powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2 | |
| EP2922965A1 (en) | Method for preventing carry-over contamination in nucleic acid amplification reactions | |
| JP2013509885A (ja) | 熱安定性ポリメラーゼとともに二本鎖核酸複合体を用いてデオキシリボヌクレオチド鎖を合成するための組成物および方法 | |
| EP3645710A1 (en) | Thermophilic dna polymerase mutants | |
| WO2009108949A2 (en) | Cold shock protein compositions and methods and kits for the use thereof | |
| TW202421795A (zh) | 環境溫度核酸擴增及偵測 | |
| JP7111706B2 (ja) | オリゴヌクレオチドの保存方法 | |
| Oscorbin et al. | The attachment of Sso7d-like protein improves processivity and resistance to inhibitors of M-MuLV reverse transcriptase | |
| CN121693563A (zh) | 上调逆转录和降低rna测序中序列偏好性的组合物和方法 | |
| HK1198704A1 (zh) | 具有改进活性的dna聚合酶 |